UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE – FURG

ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS- EQA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA TECNOLÓGICA E AMBIENTAL

– PPGQTA

LABORATÓRIO DE ANÁLISE DE COMPOSTOS ORGÂNICOS E METAIS - LACOM

Maicon Renato Ferreira Sampaio

Orientador: Prof. Dr. Ednei Gilberto Primel

Rio Grande, setembro de 2008

“ESTUDO DE METÓDOS EMPREGANDO DLLME, DSPE HPLC-DAD E LC-

MS NA DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM DERIVADOS DA CANA-

DE-AÇÚCAR”

2

INTRODUÇÃO

Cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L): gramínea, origem asiática,

colmos espessos;

Principais constituintes: Açúcares, Sais orgânicos e inorgânicos, água,

proteínas, amido, gomas, ceras, graxas, corantes.....

O Brasil é o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo, Na média,

55% da cana brasileira transforma-se em álcool e 45%, açúcar.2

Estado de São Paulo: 59,3% da produção brasileira.3 O Rio Grande do

Sul abrange apenas 0,2% da produção atual;

Santo Antônio da Patrulha: 39.302 hab; Derivados da cana: cachaça, a

rapadura, o melado, o açúcar mascavo e o caldo da cana,4

Brasil x consumo de agrotóxicos: soja, cana-de-açúcar, milho e o café.6

3

Derivados da cana-de-açúcar

Caldo de cana Bagaço: rico em fibras

(celulose, hemicelulose,

lignina): geração de

energia/ alimento para gado

Melado ou mel de engenho, rapadura,

açúcar mascavo, acúcar refinado,

aguardente...

Justificativas

• Uso indiscriminado de pesticidas, principalmente herbicidas da classe das

triazinas, presença de pesticidas não autorizados,

• Queima de extensas áreas de cana para facilitar a colheita manual, produzindo,

além, de gases, material particulado contendo altos níveis de hidrocarbonetos

policíclicos aromáticos (HPAs)

• Práticas incorretas de aplicação, não higienização de equipamentos para

processamento da cana, assim como locais de estocagem da cana.

• Problemas de saúde pública como, por exemplo a contaminação ocorrida no

Brasil, no estado de Santa Catarina pelo transmissor da doença de chagas;

5

-A produção de cana-de-açúcar: geração de empregos, situação

financeira favorável;

-Santo Antônio da Patrulha-RS: culturas locais orizicultura, feijão, milho,

fumo, cana-de-açúcar e mandioca, 41,1% zona rural;

- Rapadura, o açúcar mascavo, melado e o caldo da cana in natura X

Álcool, aguardente e açúcar;

- ANVISA: LMR para cana-de-açúcar, e para os derivados consumidos

pelo homem

- Contribuirá para uma legislação específica;

-contribuirá para a consolidação da linha de pesquisa;

SELEÇÃO DOS ANALITOS

Seleção dos

agrotóxicos

Agrotóxicos usados

na culturaTécnica de extração

e AnálisePadrões

EMATER e

recomendações ANVISA

Figura 1: Esquema de seleção dos compostos

7

Quadro 1: Informações sobre os agrotóxicos selecionados31,32

Classe Grupo químico Classificação

toxicológica

LMR

mg/kg

Codex

LMR

mg/kg

Anvisa

Intervalo de

segurança

em dias

2,4-D Herbicida Ácido

ariloxialcanóico

I 0,05 0,1 3

Fipronil Formicida e

cupinicida

Pirazol II - 0,03 30 dias

(foliar)

1 dia (solo)

Diurom Herbicida Uréico III - 0,1 150 dias

AGROTÓXICOS SELECIONADOS

8

Caldo de cana-de-açúcar

- O caldo conserva todos os nutrientes da cana-de-açúcar, entre

eles minerais como ferro, cálcio, potássio, sódio e magnésio, além

de vitaminas de complexo B e C.12

-O pH do caldo varia de 5,2 a 6,8 e a sua proporção produzido pela

moagem é, em litros, de 50 a 100% .11

-Em média, a composição química da cana-de-açúcar é de 65 a

75% de água, principal componente é a sacarose (70% a 91%)

-

MELADO OU MEL DE ENGENHO

O melado é um xarope obtido do caldo de cana-de-açúcar, que é

decantado, filtrado, concentrado até atingir um teor de sólidos (°Brix)

entre 65 e 75%. A temperatura necessária para atingir o teor de sólidos é

de 105 a 110°C, o “ponto” do melado

-Usa-se ácido cítrico na razão de 0,5 a 1,0g por litro de caldo, este

processo é necessário para que ocorra a inversão da sacarose, e não

ocorra a cristalização.

Amostra de 100

gramas

Açúcar refinado Rapadura

Sacarose (em g) 99,6 72,0 a 78,0

Frutose/ glucose - 1,5 a 7,0

Potássio (em mg) 0,5 a 1,0 10,0 a 13,0

Cálcio 0,5 a 5,0 40,0 a 100,0

Magnésio - 70,0 a 90,0

Sódio 0,6 a 0,9 19,0 a 30,0

Ferro 0,5 a 1,0 10,0 a 13,0

Vitaminas A - 130,0

Proteína - 280

Água em g - 1,5 a 7,0

Calorias (Kcal) 384 312

Quadro 2: Quadro comparativo da rapadura e

açúcar refinado13

11

Revisão

-ZUIN et al comparou SBSE e MASE para a determinação de 18 resíduos de contaminantes

orgânicos em amostras de caldo de cana provenientes de São Carlos, estado de São Paulo,

sudoeste do Brasil.

Do total dos compostos estudados resíduos de HCB, triazinas e benzopirenos foram encontrados

nas amostras na faixa de 0,004- 0,112 μg L-1 com RSD ≤ 8.2% e por SBSE e entre 0.01–0.15 μg

L− 1 (RSD ≤ 12.9%) por MASE.

- TFOUNI et al amostras de caldo de cana-de-açúcar colhida verde e cana colhida queimada e

produtos intermediários e finais do processo de obtenção do açúcar de cana. Foram analisados 5

HPAs carcinogênicos (benzoantraceno, benzofluoranteno, benzofluoranteno, benzopireno e

dibenzoantraceno. Para a análise dos compostos foi utilizada a técnica de cromatografia líquida de

alta eficiência (CLAE) com detector de fluorescência.

12

- TFOUNI et al desenvolveram um método envolvendo extração líquido–líquido

com cicloexano e dimetilformamida–água (9:1, v/v), clean up em coluna de sílica

gel e determinação por HPLC com detecção por fluorescência. Picos dos HPAs

foram identificados pela confirmação por CG–MS. Níveis dos HPAs detectados

nas amostras analisadas variaram de não detectados a 1,94 μg/L. Os resultados

confirmam a presença destes compostos em cachaça e indicam que a

contaminação da cana pode ser a fonte de HPAs em aguardente de cana.

13

Preparo de amostra

Matriz complexa rica em carboidratos, além de ceras, graxas, vitaminas,

minerais o que demanda métodos eficientes de preparo de amostra tais

como extração e ou pré-concentração para que estes compostos sejam

determinados e que o método seja sensível para atender as exigências

das legislações da área.

14

DLLME

-Desenvolvida por Rezaee e colaboradores.17

-Sistema ternário de extração;

-Miniaturização da extração líquido-líquido;

Figura 3: Etapas envolvidas na DLLME16

(Microextração líquido-líquido dispersiva)

Analitos/

Matriz

Volu

me

da

amos

tra

Volume

do

disperso

r

Volume do

solvente

extrator

Tempo de

centrifug

ação

Volume

da fase

sedimen

tada

R (%) RSD

%

LODm Análise Referê

ncia

Antibiótico

(MEL)

5 mL 1 mL de

ACN

30μL de

tetracloro

etano

2 min/

4000

rpm

30 μL 89,5 e

93,6

4,3 e

6,2

0,6 e 0,1

μg Kg-1

HPLC-

VWD

Chen et

al. 2009

Fungicida

maçãs

5mL 1mL de

acetona

9 μL de

clorobenz

eno

5 min/ 5

rpm

1 μL 93 a

107,7

%

3,8 a

4,9%

Entre 3,0

e 8,0

μg.Kg-1

GC-ECD Zang et

al

2008

Agrotóxico

(melancia e

pepino)

5 mL 1 mL de

ACN

27 μL de

clorobenz

eno

3min/

4000 rpm

1 μL 67 e

111

2 e 9 0,010 e

0,190 μg

Kg-1

GC-FPD Zhao et

al 2007

Agrotóxico

SUCO DE

FRUTAS

5 mL 1mL de

ACN

15μL de

tetracloro

etano

3 min/

3500 rpm

5 μL 80,4 e

117

1,38

e

2,74

12.3 to

16.0 pg

mL−1

HPLC-

FLD

Wang

et al

2008

Quadro : Revisão DLLME para extração de compostos em alimentos:19-26

16

Otimização da separação de M3 10 mg L-1 por HPLC-DAD

Determinação dos LOQ e LOD para os agrotóxicos analisados;

Construção da curva analítica em 6 níveis de concentração

Figura : HPLC-DAD

Resultados HPLC-DAD

17

OTIMIZAÇÃO DA SEPARAÇÃO DE M3 (10 mg L-1) POR

HPLC-DAD

Coluna

analítica

Waters Spherisorb; 5m x 4,6 x 150mm

Thermo hypersil; 5m x 4,6 x 250mm

Fase móvel: MeOH:H2O ultrapura pH 3Variando a composição

em modos de eluição

isocrático e gradiente

vazão 0,8 mL/min e 1 mL/min

18

Proporção da fase móvel Vazão (mL min-1) Tempo de retenção dos

agrotóxicos (min)

Observações

MeOH Água

ultrapura pH

= 3,0

2,4-D Diurom Fipronil

50% 50% 0,8 10,0 19,8 Não eluiu Tempo de corrida

muito longo

60% 40% 0,8 5,3 8,6 Não eluiu Em 9,464 há um

coeluindo com

diuron

65% 35% 0,8 4,1 6,2 18,4 O 2,4-D coelui com

o pico do solvente

68% 32% 1,0 6,7 7,5 16,3 O 2,4-D fica muito

próximo ao diurom

19

Modo de eluição isocrático: 65%MeOH 35%água ultrapura pH=3,0

20

Modo de eluição por gradiente usando MeOH e água sem

acidificar

21

Fase móvel:

MeOH e água

ultrapura

pH= 3,0

Modo de

eluição:

gradiente

OTIMIZAÇÃO DA SEPARAÇÃO DE M3 (10 mg L-1) POR HPLC-DAD

Figura 5 : Cromatograma de separação de M3

por HPLC-DAD

Fase

estacionária:

Coluna

analítica

Thermo

hypersil

Detector por arranjo de diodos

22

Baseada na absorção da luz, onde o sinal é proporcional à concentração do analito. Faz

uma varredura em toda a faixa de absorção do UV e do Vis (190 a 800 nm)

Permite selecionar o comprimento de onda de máxima absorbância de cada um dos

elementos, melhorando a detectabilidade e a sensibilidade.

É possível a construção de espectros tridimensionais:

Figura: Espectro em três dimensões de uma solução analítica 10 mg L-1 dos três compostos

Pureza do pico

23

-Comparação dos espectros em diversos pontos do pico cromatográfico,

como por exemplo, no início, no ápice e no fim. Se eles se sobrepõem o pico

é puro.

-Isso fornece um dado extra para o analista que assim saberá se há ou não

interferentes eluindo no mesmo tempo de retenção do analito.

Otimização da DLLME

24

Seleção do Solvente extrator

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Tetracloroetileno Tetracloreto de carbono

Diclorobenzeno

Diurom

Fipronil

Seleção do solvente dispersor

25

Variação do volume de solvente extrator (μL)

Seleção do volume do Solvente dispersor (mL)

26

Escolha do pH da amostra

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

0 0,25 0,5 0,75 1

2,4-D

Diurom

Fipronil

Teste de adição de NaCl

27

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

Diuron Fipronil

Rec

up

era

çã

o

Agrotóxicos estudados

Recuperação dos compostos, usando 1mL de amostra

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Diuron Fipronil

Rec

up

era

çã

o (

%)

Recuperação dos compostos usando 0,5mL de amostra

Série1

Cachaça: é a denominação típica e exclusiva da aguardente de cana produzida no

Brasil, com graduação alcoólica de trinta e oito a quarenta e oito por cento em volume,

a vinte graus Celsius, obtida pela destilação do mosto fermentado de cana-de-açúcar

com características sensoriais peculiares, podendo ser adicionada de açúcares até

seis gramas por litro, expressos em sacarose.

Teste com volumes maiores de extrator

28

Teste realizado para amostra de cachaça com as condições

otimizadas para o melado (nível de fortificação 0,02mg L-1)

DSPE (dispersive solid phase extraction)

30

Desenvolvida por Anastassíades et al;

Baseia-se na extração dos analitos da matriz da amostra com um solvente

orgânico (comumente acetonitrila) seguido da remoção de interferentes usando

um sorvente para cleanup.

O termo “dispersive” refere-se ao processo de limpeza, uma vez que o

adsorvente é adicionado na forma sólida e dispersado na solução orgânica

(usando um vortex), facilitando o contato estreito com as interferências.

31

32

DAGNAC et al desenvolveram um método usando DSPE e LC-MS/MS para a

determinação simultânea de 44 pesticidas em leite bovino. Como as amostras de leite

bovino não percolam através de cartuchos de SPE, usualmente aplicados para extração de

pesticidas de amostras homogêneas de leites pasteurizados. Então, usou-se a técnica

DSPE onde 5 ml de leite cru foram diluídos com 5 ml de um solvente orgânico (metanol ou

acetonitrila) contendo 1% de ácido fórmico e a mistura era agitada por 2 min. Após a

centrifugação, o sobrenadante orgânico era recuperado e seco com sulfato de sódio

anidro. Após, o extrato era colocado em contato com uma mistura dispersiva contendo

sulfato de magnésio/ sílica modificada (C18) / PSA na proporção 6/1/1 in g. Após a mistura

e centrifugação o extrato final era evaporado e com nitrogênio e reconstituído em 1 mL de

metanol.

33

BARAKAT et al desenvolveram um método para determinação de resíduos de

pesticidas em mel, usando dispersive solid phase extraction (DSPE) e determinação

por GC-ECD e GC-NPD. 5g de amostra são dissolvidos em 10ml de água

deionizada. 10 mL de acetonitrila acidificada com ácido acetico, 1.0 g de acetato de

sódio e 4.0 g de sulfato de magnésio anidro são misturados por 1min. Após o

sistema é centrifugado a 4000 rcf for 2 min. 6 ml do sobrenadante é adicionado a um

tubo de polietileno de 15mL contendo 0.4 g de PSA e 0.6 g de sulfato de magnésio

anidro e adiciona-se 50 µL de tetradecano, evapora-se em um rotaevaporador e

reconstitui o extrato em 2mL de solução padrão interna, 1 µL da amostra é injetado

no GC-NPD e GC-ECD.

Otimização do procedimento DSPE

35

36

Tabela - Resultados obtidos para calibração dos agrotóxicos,

empregando DSPE, no sistema HPLC-DAD

Condições: 5g de amostra e 10mL de ACN

AgrotóxicosFaixa Linear (mg L-1)

LOQ

(mg L-1)Curva

analíticar

2,4-D 0,625 – 5,0 0,625Y =3,27.104

-6,36.103 0,99954

Diurom 0,1 – 5,0 0,1Y =9,17.104

- 3,38.102 0,99927

Fipronil 0,25 – 5,0 0,25Y =5,44.104

+7,71.103 0,99870

37

AgrotóxicosFaixa Linear (mg L-1)

LOQi

(mg L-1)Curva analítica r

2,4-D 0,1 – 5,0 0,1Y =4,28.104 -

1,77.103 0,9991

Diurom 0,05 – 5,0 0,05Y =1,02.105 +

5,41.103 0,9990

Fipronil 0,1 – 5,0 0,1Y =6,19.104

+6,91.103 0,9992

Tabela - Resultados obtidos para calibração dos agrotóxicos no sistema

HPLC-DAD

38

CURVA ANALÍTICA

As curvas analíticas para o 2,4-D e fipronil apresentaram linearidade na faixa

de 0,1 a 5 mg L-1 e para o Diurom apresentaram linearidade na faixa de 0,05 a 5

mg L-1. O coeficiente de correlação linear com valores de R2>0,9980

Curva analítica dos padrões

39

Testes de exatidão e precisão em 3 níveis de concentração

10g de amostra e 5ml de

acetonitrila

Relação: massa de

amostra: volume de

solvente 2: 1

Tabela - Limites de detecção e quantificação do método (mg Kg-1)

40

AgrotóxicoLODm LOQm

DSPE

Diurom 0,016 0,05

2,4-D 0,104 0,3125

Fipronil 0,041 0,125

41

Desenvolvimento e validação de um método multiresíduo para determinação

de agrotóxicos por LC-MS/MS

Ministério da Agricultura e da ANVISA: ingredientes ativos autorizados.

Disponibilidade de padrões

Compostos Massa molar

(g.mol-1)

Transição

(m/z)

Íon Precursor

> Íon Produto

Energia de

Colisão

(eV)

Voltagem

do Cone

(V)

Imazapique 275 276>231

276>185

20

30

40

40

Simazina 201 202>132

202>124

18

18

35

35

Carbofurano 221 222>165

222>123

20

20

25

25

Atrazina 215 216>174

216>146

20

22

33

35

Diurom 233 233>72

233>160

20

25

28

28

Clomazone 240 240>125

240>100

20

15

25

30

42

Tiametoxan 291 292>181

292>122

30

31

23

23

Imidacloprido 255 256>209

256>175

256>210

14

14

30

30

Modo de ionização negativo ESI-, para o modo de aquisição MRM

Compostos Massa molar

(g.mol-1)

Transição

(m/z)

Íon Precursor

> Íon Produto

Energia de

Colisão

(eV)

Voltagem

do Cone

(V)

2,4-D 221 219>161

219>89

20

30

15

15

Fipronil 437 435>330

435>250

15

26

30

25

43

Compostos

selecionados

MeOH:água 0,1%

ácido fórmico

50:50

Tempo de corrida:

20 min

MeOH:água

0,1% ácido

fórmico

65:35

MeOH:água

0,1%ácido

fórmico

60:40

MeOH:água 0,1%

ácido acético

65:35

Imazapique 2,15 1,81 1,81 2,76

Simazina 3,72 2,33 2,68 2,42

Carbofurano 3,46 2,15 2,50 2,15

Atrazina 5,90 2,94 3,63 3,02

Diurom 7,55 3,20 4,07 3,29

Clomazona 8,77 3,46 4,50 3,55

Tiametoxam 1,54 1,46 1,46 1,46

Imidacloprido 1,72 1,54 1,54 1,54

2,4-D 8,62 3,83 4,79 11,58

Fipronil Não eluiu em 20

min

7,66 13,15 8,36

44

Quadro : Informações sobre os agrotóxicos selecionados31,32

Classe Grupo químico Classificação

toxicológica

LMR

mg/kg

Anvisa

Carbofurano Acaricida,

nematicida

Metilcarbamato de

benzofuranilaido

Classe I 0,1

Atrazina Herbicida triazina II 0,25

Simazina Herbicida triazina III 0,02

AGROTÓXICOS SELECIONADOS

45

Quadro 1: Informações sobre os agrotóxicos selecionados31,32

Classe Grupo químico Classificação

toxicológica

LMR

mg/kg

Anvisa

Clomazona Herbicida Isoxazolidinona III 0,1

Imazapique Herbicida Imidazolinona II 0,1

Tiametoxam Inseticida Neonicotinóide III 0,02

AGROTÓXICOS SELECIONADOS

Imidacloprido Inseticida Neonicotinóide III 0,05

46

Compostos LQ instrumental [mg L-1] LD instrumental

[mg L-1]

Imazapique 0,05 0,016

Simazina 0,01 0,0033

Imidacloprido 0,001 0,00033

Tiametoxam 0,05 0,016

Atrazina 0,005 0,0016

2,4-D 0,01 0,0033

Fipronil 0,05 0,016

Clomazone 0,0005 0,00016

Carbofurano 0,001 0,00033

Diurom 0,005 0,0016

47

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,00

160,00

180,00

200,00

5mL

10mL

Variação do volume de acetonitrila

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

Sem cleanup

Com cleanup

Avaliação da etapa de clean-up

Testes de otimização DSPE

48

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,00

160,00

MgSO4

MgSO4 + NaCl

Influência do uso de NaCl

49

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,00

160,00

Temperatura 105˚C

Temperatura ambiente

Influência da temperatura no melado

50

Agrotóxico

Ponto

de

fusão

(ºC)

log Kow

Solubilidade em

água (g L-1) Pressão de vapor (mPa)

(25 ºC)

Diurom**158-

159°C2.85 (25 ºC)

0,0364 ()1.1 X10-3

2,4-D 140,52.58-2.83 (pH

1)

0,311 (pH 1), 20,

031 (pH 5), 23,180

(pH 7), 34,196 (pH

9)

1.86 X 10-2

Fipronil * 200-201 4,00,0019 (pH 5),

0,0024 (pH 9)3.7 X10-4

Fonte: The e-Pesticide Manual (thirteenth edition) version 3.0

*slowly hydrolysed at pH 9 (DT50 c. 28 d). Stable to heat. Slowly degrades in sunlight

**Stable in neutral media at normal temperatures, but hydrolysed at elevated temperatures.

Hydrolysed by acids and alkalis. Decomposes at 180-190 ºC.

Efeito de matriz

51

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

46,65 61,7491,68

135,16

16,5856,48 74,01

26,54

83,90

209,83

%EM

100 metanol padrão área

matriz padrão área% xEM

KRUVE et al., 2008

52

PRÓXIMOS TESTES

-Curva na matriz para os compostos no HPLC-DAD;

-- Testar etapas de pré-concentração;

-Ensaios de fortificação em níveis menores de concentração;

-Para os compostos no LC-MS

-Ensaios de fortificação nas matrizes de melado, caldo de cana, cachaça

--Curva na matriz para o caldo de cana,

-Avaliação do efeito de matriz em ambas matrizes;

-Testes com líquidos iônicos para a matriz caldo de cana....

53

REFERÊNCIAS

[1] SANTOS, R. V. et al. Composição química da cana-de-açúcar e das silagens com diferentes aditivos em duas idades de corte, Ciênc.

agrotec., Lavras, v. 30, n. 6, p. 1184-1189, nov./dez., 2006

[2] GARBELLINI, Gustavo S. Determinação eletroquímica de pesticidas em amostras dos principais derivados da cana-de-açúcar, dissertação

de mestrado, USP, Instituto de Química de São Carlos, SP, 2005, 164 p.

[3] IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística), Levantamento Sistemático da Produção Agrícola, Rio de Janeiro v.20 n.12 p.1-80

dez.2008.

[4] IBGE, Estimativa das populações residentes segundo os municipios, 07/2008, 104p.

[5] OPAS/OMS (ORGANIZAÇÃO PAN-AMERICANA DE SAÚDE), Manual de Vigilância da Saúde de populações expostas a agrotóxicos,

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[6] SINDAG (SINDICATO NACIONAL DA INDÚSTRIA DE PRODUTOS PARA DEFESA AGRÍCOLA); Vendas, culturas 2007-2008.

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[8] Dados disponíveis no site da prefeitura de Santo Antônio da Patrulha http://www.santoantoniodapatrulha.rs.gov.br, acessado em 16 de julho de

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[10] BARBOSA, EDILENE. Avaliação Fitotécnica de cinco variedades de cana para o município de Salinas – MG, dissertação de mestrado,

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[11] LIMA, URGEL DE ALMEIDA. Tecnologia das fermentações, vol 1, editora EDGARD BLUCHER, 1992, SP, 285 p.

[12] COPERSUCAR (COOPERATIVA DE PRODUTORES DE CANA-DE-AÇÚCAR, AÇÚCAR E ALCOOL DO ESTADO DE SÃO PAULO).

Disponível em http://www.copersucar.com.br/institucional/por/academia/cana_acucar.asp, acessado em 20 de julho de 2009.

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• [26] Wang, X. et al; Dispersive liquid-liquid microextraction followed by gas chromatography-electron capture detection for

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• [27] SKOOG, D.A. et al. Princípios de Análise Instrumental, Quinta edição, Porto Alegre: Bookman, 2002, 836p.

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• [28] COLLINS, C.H.et al. Fundamentos de cromatografia, Campinas, editora da UNICAMP, 2006, 456p

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• [30] RIBANI, M. et al. Validation for chromatographic and electrophoretic methods, Química Nova, v. 27, p.771-780, 2004. ISSN

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• [31] ANVISA: Indice Monográfico de pesticidas. Disponível em http://www.anvisa.gov.br/toxicologia/monografias.htm, acessado em 20 de

julho de 2009.

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• [32] CODEX ALIMENTARIUS: LMRS PARA PESTICIDAS. Disponível em: http://www.codexalimentarius.net/mrls/pestdes/jsp/pest_q-

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• [33] Disponível em http://www.glorinha.rs.gov.br/images/pagemaster/im_6.gif; acesso em 20 de agosto de 2009

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