APLICAÇÃO DE CETONAS CÍCLICAS NA PREPARAÇÃO DE 4 ... · de Lisboa, a possibilidade de...

Raquel Alexandra Pinto Castanheiro

Licenciada em Qumica (UP)

APLICAO DE CETONAS CCLICAS NA PREPARAO DE

4-IMIDAZOLIDINONAS DA PRIMAQUINA

Potenciais pr-frmacos para a quimioterapia da malria

Dissertao para mestrado em Qumica pela Faculdade de Cincias da Universidade do Porto

QD262 CASrA

Porto 2003

Raquel Alexandra Pinto Castanheiro

APLICAO DE CETONAS CCLICAS NA PREPARAO DE

4-IMIDAZOLIDINONAS DA PRIMAQUINA

Potenciais pr-frmacos para a quimioterapia da malria

3o A. loo-,

Porto 2003

UNIVERSIDADE DO PORTO

B I B L I O T E C A Sota _ .. coiocTijjr^j N. .k.id&..L..

FACULDADE Dt CINCIAS

I

AGRADECIMENTOS

"Para chegar ao fim das coisas, o primeiro passo julg-las possveis. "

Lus XIV

Doutora Paula Alexandra de Carvalho Gomes, orientadora desta dissertao, os constantes

apoio, incentivo, ensinamentos e disponibilidade prestados ao longo da realizao do trabalho.

Doutora Maria Joo Sinde M. P. Arajo, co-orientadora desta dissertao, toda a ajuda,

encorajamento e ensinamentos durante a realizao do trabalho.

Ao Professor Doutor Rui Ferreira Alves Moreira, da Faculdade de Farmcia da Universidade

de Lisboa, a possibilidade de colaborao neste projecto de investigao de estudo da sntese

de potenciais pr-farmacos na terapia da malria.

Dra. Maria Adelina Macedo, ao Doutor Jim Hey e Doutora Eliandre de Oliveira, pela

realizao dos espectros de RMN e de massa, respectivamente.

Dra. Zlia Azevedo, pela indispensvel ajuda na interpretao dos espectros de RMN.

Aos meus colegas do laboratrio de investigao em sntese orgnica, pela cooperao e

companheirismo que tornaram o ambiente de trabalho mais agradvel e pelos auxlio e

incentivo que me transmitiram.

Aos meus Pais e Amigos, todo o apoio, estmulo e compreenso inesgotveis.

n

NDICE GERAL

Sumrio VT

Abstract V1

CAPTULO I - PARTE GERAL

1. Consideraes sobre a malria

1.1. A malria no mundo actual 1 1.2. Aspectos biolgicos da malria humana 3 1.3. Fnnacos antimalricos

2. Pr-Frmacos da primaquina na quimioterapia da malria

2.1. Efeitos da primaquina no organismo 9 2.2. Pr-frmacos da primaquina *1

3. Importncia biolgica das 4-imidazolidinonas 13

CAPTULO H - ESTUDO DA SNTESE DE 4-BMTOAZOLD3INONAS DA PRIMAQUINA DERIVADAS DE CETONAS CCLICAS

1. mbito do projecto 18

2. Objectivo 1 8

3. Anlise Retrossinttica 1 9

4. Mtodos de Sntese 2 0

4.1. Condensao da primaquina coni a-aminocidos N^Boc-protegidos 20 4.2.Remoo do grupo te/-c-butiloxicarbonilo por acidlise com cido 22 trifluoroactico 4.3. Sntese das 4-imidazolidinonas por ciclizao dos derivados da 23 primaquina com cetonas cclicas

5. Resultados experimentais e Discusso 2 4

5.1. Condensao da primaquina com a-aminocidos IsP-Boc-protegidos 24 5.2. Remoo do grupo Boc por acidlise com TFA 29 5.3. Sntese de 4-imidazolidinonas da primaquina derivadas de cetonas cclicas 32 5.4. Preparao de sais hidrossolveis das 4-imidazolidinonas sintetizadas 39

6. Concluso e Perspectivas 41

7. Parte Experimental 7.1. Notas gerais 44

7.2. Condensao da primaquina com aminocidos ^-Boc-protegidos 7.2.1. Sntese da 4'-N- (terc-butiloxicarbonilglicil) primaquina 46 7.2.2. Sntese da 4'-N- (terc-butiloxicarbonilalanil) primaquina 48 7.2.3. Sntese da 4'-N- (te/r-butUoxicarbonilvalil) primaquina 50

7.2.3.1. Usando DCCI como reagente de condensao 50 7.2.3.1. Usando DIPCI como reagente de condensao 51

7.2.4. Sntese da 4'-N-(terc-butiloxicarbonilfenilalanil) primaquina 53 7.2.4.1. Usando DCCI como reagente de condensao 53 7.2.4.2. Usando DIPCI como reagente de condensao 54

7.3. Remoo do grupo Boc por acidlise com cido trifluoroactico 7.3.1. Sntese da 4'-N-glicilprimaquina 56 7.3.2. Sntese da 4'-N-alanilprimaquina 58 7.3.3. Sntese da 4'-N-valilprimaquina 60 7.3.4. Sntese da 4'-N-fenilalanilprimaquina 62

7.4. Sntese de 4-imidazolidinonas 7.4.1. Por ciclizao com cicloexanona

7.4.1.1. Sntese da 3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-quinolil) 64 aminobutil]-2-espirocicloexano-4-imidazolidinona

7.4.1.2. Sntese da 5-metil-3-[4-metil-4-(6-metoxi- 66 8-quinolil)aminobutil]-2-espirocicloexano-4-imidazolidinona

7.4.1.3. Sntese da 5-isopropil-3-[4-metil-4-(6-metoxi- 68 8-quinolil)aminobutil]-2-espirocicloexano-4-imidazolidinona

7.4.1.4. Sntese da 5-benzil-3-[4-metil-4-(6-metoxi- 70 8-quinolil)aminobutil]-2-espirocicloexano-4-imidazolidinona

7.4.2. Por ciclizao com ciclopentanona 7.4.2.1.Sntese da 3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-quinolil) 72

aminobutil]-2-espirociclopentano-4-imidazolidinona 7.4.2.2. Sntese da 5-metil-3-[4-metil-4-(6-metoxi- 74

8-quinolil)aminobutil]-2-espirociclopentano-4-imidazolidinona

7.4.2.3. Sntese da 5-isopropil-3-[4-metil-4-(6-metoxi- 76 8-quinolil)aminobutil]-2-espirociclopentano-4-imidazolidinona

7.4.2.4. Sntese da 5-benzil-3-[4-metil-4-(6-metoxi- 78 8-quinolil)aminobutil]-2-espirociclopentano-4-imidazolidinona

7.4.3. Por ciclizao com cicloeptanona

7.4.3.1. Sntese da 5-isopropil-3-[4-metil-4-(6-metoxi- 80 8-quinolil) aminobutil] -2-espirocicloeptano-4-imidazolidinona

7.4.3.2. Sntese da 5-benzil-3-[4-metil-4-(6-metoxi- 82 8-quinolil)aminobutil]-2-espirocicloeptano-

4-imidazolidinona

7.5. Preparao dos citratos das 4-imidazolidinonas 84

Referncias Bibliogrficas

Apndices Compostos sintetizados Glossrio ndice de figuras ndice de tabelas

90 91 92 94

V

RESUMO

O principal objectivo do trabalho experimental descrito nesta dissertao consistiu na sntese de 4-imidazolidinonas da primaquina com potencial aplicao como pr-frmacos antimalricos.

A sntese das 4-imidazolidinonas foi conseguida recorrendo a mtodos clssicos de sntese peptdica e envolveu vrios passos. O primeiro passo levou formao de N-acilprimaquinas usando a-aminocidos (Gly, Ala, Vai, Phe) lSP-protegidos com o grupo frc-butiloxicarbonilo (Boc), como agentes adiantes. Neste passo, usou-se a N,N'-dicicloexilcarbodiimida ou a N,N'-diisopropilcarbodiimida como reagentes de condensao e o 1-hidroxibenzotriazole como nuclefilo auxiliar. O passo seguinte consistiu na remoo do grupo Boc por acidlise com cido trifluoroactico. Finalmente, a ciclizao dos derivados de primaquina obtidos com cetonas cclicas (cicloexanona, ciclopentanona e cicloeptanona), na presena de trietilamina, originou as

4-imidazolidinonas pretendidas. A estrutura molecular de todos os compostos isolados foi confirmada usando tcnicas de espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear e espectrometria de massa de alta resoluo.

Em suma, prepararam-se derivados N^-Boc-aa-PQ com rendimentos globais da ordem dos 90%. A remoo do grupo NVBoc-protector destes derivados ocorreu com rendimentos da ordem dos 80-90%, ao passo que as ciclizaes destes ltimos com cetonas cclicas conduziram a rendimentos superiores a 50%.

A aplicabilidade teraputica dos compostos sintetizados est a ser testada atravs de estudos farmacocinticos e biolgicos, realizados no Centro de Estudos de Cincias Farmacuticas da Faculdade de Farmcia da Universidade de Lisboa e no Instituto de Higiene e Medicina Tropical de Lisboa, respectivamente.

O estudo da sntese de sistemas de cedncia da frmacos antimalricos vai prosseguir, no sentido de alargar a investigao a outros aminocidos e dipptidos e tambm a outros compostos carbonlicos.

VI

ABSTRACT

The main objective of the experimental work described in this dissertation consisted in the synthesis of primaquine 4-imidazolidinones, with potential application as antimalarial pro-drugs.

The synthesis of 4-imidazolidinones was achieved applying classical peptide synthesis procedures and involved several steps. The first step led to the formation of N-acylprimaquines using a-amino acids (Gly, Ala, Val, Phe) Nonprotected with the frt-butyloxycarbonyl group (Boc), as acylating agents. In this step, N, N'-dicyclohexylcarbodiimide or N, N'-diisopropilcarbodiimide was used as the coupling reagent and 1-hydroxybenzotriazole as the auxiliary nucleophile. In the next step, removal of the ter/-butyloxycarbonyl group was achieved by acidolysis with TFA. Finally, the cyclization of the primaquine derivatives obtained with cyclic ketones (cyclohexanone, cyclopentanone and cycloheptanone), in the presence of triethylamine, gave the primaquine 4-imidazolidinones required. The molecular structure of all isolated compounds was confirmed by Nuclear Magnetic Resonance and mass spectrometry of high-resolution techniques.

Thus, several N"-Boc-aa-PQ derivatives were prepared in 90% yields. The removal of the N^-Boc-protector group of these derivatives occurs in 80-90% yields, while the cyclization of these last with cyclic ketones led to yields greater than 50%.

Pharmacological and biological studies of the isolated compounds is carried out at "Centro de Estudos de Cincias Farmacuticas da Faculdade de Farmcia da Universidade de Lisboa" and 'Instituto de Higiene e Medicina Tropical de Lisboa", respectively.

The study of the synthesis of antimalarial drug delivery systems will be continued, in the extension of this investigation, by using other amino acids and dipeptides and employing other carbonylic compounds.

Aos meus Pais

CAPITULO I

PARTE GERAL

"...o mais importante na vida dar-se o melhor de si, no importa o resultado final... "

Alar de Sousa

Consideraes sobre a malria

1. CONSIDERAES SOBRE A MALRIA

1.1. A MALRIA NO MUNDO ACTUAL

A malria, tambm conhecida por paludismo, considerada a mais grave doena tropical

causada por um parasita.

Esta infeco, conhecida h milhares de anos, est presente em larga escala nas regies

tropicais e sub-tropicais do planeta, em cerca de 100 pases, especialmente na frica, sia e

Amricas Central e do Sul, pases esses onde a malria endmica. O maior foco de

transmisso a frica sub-Sahariana, onde ocorrem 90% dos casos no mundo1 (Figura 1).

Porm, o aquecimento global e a maior mobilidade das populaes tornam real o risco de

globalizao da doena.

Figura 1: Distribuio da malria no mundo .

A incidncia global anual varia entre 300 a 500 milhes de casos, com cerca de 2 a 3

milhes de bitos, sendo as grvidas e as crianas as pessoas mais vulnerveis doena.

Durante as dcadas de 50 e 60, a Organizao Mundial de Sade tentou erradicar a

malria da maioria das regies onde prevalecia, com o desenvolvimento de compostos como o

DDT (dicloro-difenil-tricloroetano), que apresentava grande actividade insecticida, grande

poder residual e baixo custo e, tambm, com a obteno de antimalricos sintticos altamente

eficazes. Como consequncia, por volta de 1970, os programas de erradicao haviam livrado

do risco da doena cerca de 53% da populao residente em reas malargenas, evitando

Mestrado em Qumica 1


do risco da doena cerca de 53% da populao residente em reas malargenas, evitando milhes de mortes e contribuindo para o desenvolvimento scio-econmico de grandes reas, especialmente sia, sul e sudeste da Europa e Amricas.

Entretanto, devido reduo das actividades de controlo, s crises econmicas, ao aumento do custo dos insecticidas, ao surgimento de resistncia dos mosquitos aos insecticidas e dos parasitas aos antimalricos, a situao deteriorou-se na dcada de oitenta, ocorrendo um aumento progressivo no nmero de casos na maioria dos pases .

A explorao de um novo esquema global de combate doena passa pelo desenvolvimento de mtodos alternativos de maior eficcia, tais como a quimioterapia e a

vacinao. Informaes recentes indicam que, em 2001, os casos de malria diminuram em cerca de

40 a 75% em relao ao ano anterior. Pensa-se que este decrscimo se deve parcialmente reintroduo do insecticida DDT, mas tambm alterao do tratamento e adopo de programas de sade e de actividade de controle da doena. Estas envolvem um diagnstico definitivo, atravs de um kit de diagnstico rpido, seguido de tratamento eficaz e imediato, bem como medidas de controlo do vector por pulverizao do interior das habitaes e impregnao das camas-rede com um insecticida residual .

No entanto, persistem alguns problemas graves ao nvel da quimioterapia, nomeadamente desenvolvimento de resistncias pelos parasitas, rpida eliminao e inactivao metablica dos frmacos e, ainda, toxicidade destes ltimos para os pacientes. Deste modo, o desenvolvimento de frmacos e vacinas eficazes adivinha-se como uma caminhada lenta e rdua, mas que urge percorrer. Da que o estudo da sntese de compostos qumicos com potencial actividade antimalrica seja um desafio irrecusvel.



1.2. ASPECTOS BIOLGICOS DA MALRIA HUMANA

A malria uma doena infecciosa causada por um parasita (protozorio) do gnero

Plasmodium e transmitida ao Homem atravs da picada do mosquito do gnero Anopheles.

Figura 2: Mosquito do gnero Anopheles que transmite a malria ao hospedeiro humano

Esta doena pode ainda ser transmitida por transfuso de sangue ou partilha de agulhas

e seringas infectadas com plasmdios .

Estes parasitas pertencem ao filo Apicomplexa, classe Sporozoea, ordem

Hemosporidiida, famlia Plasmodiidae. So organismos unicelulares eucariontes, sem clios

ou flagelos, excepto nos gmetas .

So quatro as espcies de parasitas que causam a malria humana: Plasmodium

falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale e Plasmodium malariae. Nas quatro

espcies, o ciclo de vida essencialmente o mesmo. Apresentam uma fase sexuada exgena

(esporogonia), com a multiplicao dos parasitas em certos mosquitos do gnero Anopheles, e

uma fase assexuada endgena (esquizogonia), com a multiplicao no hospedeiro humano.

Esta ltima fase inclui o ciclo que ocorre nas clulas do parnquima heptico (esquizogonia

tecidual ou pr-eritroctica) e o ciclo que se desenvolve nos glbulos vermelhos (esquizogonia

eritroctica). O ciclo de vida dos parasitas da malria humana encontra-se esquematizado na

Figura 3.

Ao picar o homem, o mosquito injecta uma pequena quantidade de saliva no sangue

humano para evitar a coagulao do mesmo durante o acto de suco. E juntamente com esta

saliva que, caso o mosquito esteja infectado, so introduzidos na corrente sangunea humana



os parasitas primrios chamados esporozotos. Passado menos de uma hora, os esporozotos

deixam a corrente sangunea e invadem o interior das clulas hepticas. Muitos destes

esporozotos desenvolvem-se em esquizontes teciduais primrios (esquizogonia tecidual), os

quais passam por repetidas divises assexuadas formando milhares de merozotos. Durante

este perodo, os indivduos infectados no evidenciam qualquer sintoma da doena.

Decorridos cerca de 10 a 15 dias no caso do Plasmodium vivax, e 7 a 10 dias no caso

do Plasmodium falciparum, as clulas hepticas sofrem uma ruptura e os merozotos so

libertados na corrente sangunea, onde atacam os eritrcitos, iniciando-se a fase eritroctica do

ciclo.

Alguns esporozotos do Plasmodium vivax e Plasmodium ovale permanecem no

interior do hepatcito em estado de latncia por perodos que podem variar de um ms a

2 anos. Por esta caracterstica recebem o nome de hipnozotos. Estes podem ser reactivados e

causar recidivas da doena clnica a cada 2-3 meses. Esta fase da infeco chamada

esquizogonia exo-eritroctica. Nas infeces dos Plasmodia falciparum e malariae no

ocorrem recadas a partir do fgado, no entanto, a infeco do sangue pode tornar-se crnica e,

se no tratada, pode persistir durante anos, no caso do Plasmodium falciparum e dcadas, no

caso do Plasmodium malariae.

Aps invadir o eritrcito, o merozoto assume uma forma em anel chamada trofozoto

e comea a alimentar-se de hemoglobina. Quando o trofozoto amadurece e comea a

dividir-se torna-se num esquizonte sanguneo. A diviso (esquizogonia eritroctica) continua,

originando o rompimento dos eritrcitos e a libertao de novos merozotos que invadem

novos glbulos vermelhos, reiniciando-se um novo ciclo assexuado. neste momento de

rompimento e reinvaso que ocorrem os sintomas tpicos da malria: febres altas (por vezes

superiores a 40C), calafrios e anemia. Alguns merozotos desenvolvem-se em trofozotos

mas no formam esquizontes; em vez disso o seu ncleo permanece intacto e diferencia-se em

formas sexuais, femininas e masculinas, chamadas gametcitos. Estes no sofrem qualquer

diviso no Homem, mas circulam na corrente sangunea at serem ingeridos por outro

mosquito no momento de nova picada.

Enquanto os Anopheles machos se alimentam somente de nctar e seiva vegetal, as

fmeas necessitam de sangue na sua alimentao para o amadurecimento dos seus ovos e para

possibilitar a oviposio. Assim, aps uma fmea ingerir sangue de um hospedeiro humano

contendo as formas sexuadas do parasita (gametcitos), inicia-se uma fase sexuada no interior

do seu estmago com a fecundao e formao de um ovo ou zigoto.



0 zigoto transforma-se numa estrutura dotada de mobilidade chamada oocineto, o qual

penetra a parede do estmago e forma um ocito que se posiciona entre a parede do estmago

e a sua membrana basal. No seu interior formam-se, por esporogonia, muitos esporozotos.

Quando o ocito rebenta, alguns esporozotos migram para as glndulas salivares do

mosquito, os quais podero, no momento da picada, ser inoculados noutro hospedeiro

humano, iniciando-se novo ciclo e propagando-se a doena.

As quatro espcies de parasitas da malria humana originam ataques

caracteristicamente distintos. Assim, o Plasmodium falciparum responsvel pela chamada

malria ter maligna; os Plasmodia vivax e ovale pela malria ter benigna, enquanto que o

Plasmodium malariae provoca malria quarta benigna. A qualificao ter ou quarta refere-

-se ao intervalo de tempo entre picos de febre do paciente, respectivamente de 48 e de 72

horas1'3'4'5'6'7'16'17'18'20'23.

Os Plasmodia falciparum e vivax so os agentes malricos largamente predominantes.

O Plasmodium falciparum produz, muitas vezes, infeces fulminantes em pacientes no

imunes. Tais infeces podem tornar-se fatais se no forem tratadas a tempo. O Plasmodium

vivax produz ataques mais suaves e possui baixo nvel de mortalidade, mesmo em pacientes

no tratados. Neste caso, as recadas podem ocorrer at dois anos aps a primeira infeco. J

o Plasmodium malariae pode causar recadas vrios anos depois da infeco inicial.

ocito ocito ocito jovem segmentado rebentado

Figura 3: Ciclo de vida dos parasitas da malria humana8.



1.3. FRMACOS ANTIMALRICOS

A evidente necessidade de combater a malria conduziu descoberta e preparao de

numerosos agentes antimalricos, desde a clssica quinina (1), cloroquina (2) e

primaquina (3), entre muitos outros.

Tendo em conta o estgio do ciclo de vida do parasita no qual actuam, os frmacos

antimalricos so classificados como:

> Esquizonticidas teciduais usados para profilaxia causal:

Estes frmacos actuam nos esquizontes teciduais primrios dos Plasmodia, os quais, aps

crescimento, iniciam o estgio eritroctico. Bloqueando este estgio, um desenvolvimento

posterior da infeco pode ser prevenido. O proguanil, pirimetamida e primaquina so

exemplos de frmacos utilizados nesta categoria.

> Esquizonticidas teciduais usados para prevenir recidivas:

Estes agentes actuam nos hipnozotos do P. vivax e P. ovale que permanecem latentes

aps as primeiras formas hepticas serem libertadas na circulao.

Os esquizonticidas que actuam sobre os hipnozotos evitam a maturao destes, pelo que

so usados para profilaxias terminais e curas radicais de infeces que causem recadas. A

primaquina o frmaco mais utilizado neste caso, mas a pirimetamina e a quinocida tambm

possuem esta actividade.



> Esquizonticidas usados para a cura clnica ou supressiva:

Estes frmacos actuam no estgio eritroctico assexuado dos parasitas da malria,

interrompendo a esquizogonia eritroctica e acabando assim com os ataques clnicos da

malria (cura clnica). Tais frmacos podem tambm produzir a cura supressiva, eliminando

completamente os parasitas do corpo atravs de uma terapia contnua. So exemplos a

cloroquina, quinina e a mefloquina.

> Gametocitocidas:

Estes frmacos destroem as formas sexuadas do parasita no sangue, prevenindo, desse

modo, a transmisso da infeco ao mosquito. A cloroquina e quinina possuem actividade

gametocitocida contra o P. vivax e P. malariae, mas no contra o P. falciparum. A

primaquina possui actividade gametocitocida contra todos os Plasmodia, incluindo o P.

falciparum. > Esporontocidas:

Estes agentes, quando administrados no hospedeiro vertebrado infectado previnem ou

inibem a formao de ocitos e esporozotos nos mosquitos que se alimentam do sangue desse

hospedeiro. Frmacos com actividade esporontocida so a primaquina, a pirimetamina e a

quinocida.

Deste modo, um tratamento efectivo da malria deve incluir esquizonticidas sanguneos,

gametocitocidas e esquizonticidas teciduais (no caso do P. vivax e P.ovale). Uma combinao

de cloroquina e primaquina , pois, necessria para o tratamento de todos os casos de

malria9-16'17'18.

A rpida emergncia e crescimento dos Plasmodia falciparum resistentes cloroquina

um dos factores que mais afecta os esforos no controlo da malria. A busca de novas

terapias antimalricas, a um custo acessvel, uma tarefa de elevada prioridade para a

erradicao da doena. Estas terapias devem focar-se no desenvolvimento e melhoramento de:

- Agentes gametocitocidas capazes de eliminar o ciclo sexual do parasita no

mosquito e, assim, interromper a transmisso do hospedeiro humano ao mosquito

vector e,

- Potentes esquizonticidas sanguneos efectivos contra as estirpes de Plasmodium

falciparum resistentes cloroquina.



0 controlo da malria tambm tem sido procurado atravs de tcnicas preventivas

como a vacinao18. Esto a ser desenvolvidos trs tipos de vacinas:

a) Vacinas anti-esporozotos que previnem a infeco eritroctica,

b) Vacinas anti-merozotos que resultam no controlo efectivo da infeco e,

c) Vacinas contra as formas esporognicas primitivas do parasita que bloqueiam

a transmisso hospedeiro-mosquito.

O conhecimento do mapa gentico completo do mosquito e do parasita Plasmodium

falciparum, muito recentemente comunicado13'14'15, surge como uma grande esperana na

batalha contra a malria, especialmente ao nvel da concepo mais precisa e racional de

vacinas mais eficazes.


Pr-Frmacos da primaquina na quimioterapia da malria

2. PR-FRMACOS DA PRIMAQUINA NA QUIMIOTERAPIA

DA MALRIA

2.1. EFEITOS DA PRIMAQUINA NO ORGANISMO

A primaquina (3), o nico composto 8-aminoquinolnico utilizado na quimioterapia da

malria. Com a designao cientfica de 8-[(4-amino-l-metilbutil)amino]-6-metoxiquinolina, a

primaquina possui um anel bicclico (grupo quinolina), tal como as restantes

8-aminoquinolinas, com um grupo amino secundrio na posio 8 e um grupo metoxilo na

posio 6, como se pode observar na estrutura representada:

CH3-0

NHCHCH2CH2CH2NH2

CH3

(3)

Actualmente, a primaquina o nico agente antimalrico capaz de bloquear o ciclo reprodutivo dos Plasmodia no Homem, interrompendo a transmisso da doena ao mosquito-vector. Alm da sua actividade gametocitocida, eficaz mesmo contra o Plasmodium falciparum, a primaquina fundamental para a cura radical de recidivas das infeces provocadas pelos Plasmodia vivax e ovale.

A primaquina administrada oralmente e completamente absorvida pelo tracto gastrointestinal. Atinge os picos de concentrao no plasma em 1 a 2 horas, aps o que diminui rapidamente, com um tempo de meia vida de cerca de 3 a 6 horas. Apenas uma pequena poro da dose administrada excretada na urina sem modificao; a maior poro excretada em 24 horas, sob a forma de metabolitos. Aps absoro, a primaquina rapidamente biotransformada em dois passos metablicos. O primeiro passo leva formao de dois metabolitos activos in vivo, 5-hidroxiprimaquina e 5-hidroxi-metilprimaquina. Do segundo passo resulta a formao de N-acetilprimaquina. Esta biotransformao da primaquina gera um metabolito com elevado poder oxidante, aumentando a actividade esquizonticida tecidual. Porm, paralelamente a esta transformao, o grupo amino primrio

" 9 Mestrado em Qumica UNivcneiOADEDOPomo FACULDADE DE CICIAS

B I B L l O T t C A


da primaquina rapidamente removido atravs de um processo oxidativo com a participao

da enzima monoamino oxidase (MAO) e do citocromo P450, originando carboxiprimaquina

(4) que farmacologicamente inactiva (Figura 4).

C H 3 - 0 ^ ^ ^ ^ ^ CH3-O.

m !CHCH2-CH2CH2NH2

CH3

(3)

Citocromo P45( _ ouMAO NHCHCH2-CH2CHO I

CH3

Aldedo Desidrogenase

CH3-C\

NH -CHCH2-CH2COOH I CH3

(4)

Figura 4: Transformao da primaquina em carboxiprimaquina por oxidao enzimtica.

Estratgias para evitar esta inactivao metablica do frmaco podero envolver a

acilao do grupo amino terminal da primaquina, evitando a formao de carboxiprimaquina.

Subsequentemente, e tambm com o intuito de bloquear ou retardar o metabolismo da

primaquina, os derivados acilados podero ser modificados, atravs da ciclizao, por

exemplo a 4-imidazolidinonas cclicas atravs da reaco daqueles derivados com compostos

carbonlicos.

Em doses teraputicas, a primaquina bem tolerada, mas em doses elevadas pode

causar distrbios gastrointestinais e methemoglobinemia ' .

Por outro lado, a primaquina causa hemlise em pacientes com deficincia congnita

na glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) nas hemcias. A G6PD uma enzima que

protege os grupos sulfidrilo da hemoglobina e a membrana dos glbulos vermelhos, dos

efeitos oxidativos dos radicais de oxignio, mantendo o fornecimento intracelular de

glutationa reduzida. Em pessoas com deficincia na G6PD, a oxidao da hemoglobina leva

sua precipitao dentro da clula, produzindo incluses caractersticas chamadas corpos de

Heinz. O aumento do teor de hemoglobina oxidada produz methemoglobinemia, causando um


Pr-Fnmacos da primaquina na quimioterapia da malria

incremento na produo de radicais livres, os quais danificam as clulas. Estes efeitos

causam, por fim, a hemlise11'1 .

2.2. PR-FRMACOS DA PRIMAQUINA1 8

Um pr-frmaco um composto inactivo, que pode ser convertido in vivo numa

substncia farmacologicamente activa, atravs de mecanismos de natureza qumica ou

metablica.

Este conceito pode ser dividido em duas classes: pr-frmacos propriamente ditos e

bioprecursores. Os pr-frmacos propriamente ditos (apenas estes vo ser considerados

posteriormente) resultam de uma ligao temporria entre o frmaco e uma unidade

transportadora, ligao essa que depois qumica ou enzimaticamente hidrolisada in vivo.

Assim, o frmaco mantm as suas propriedades teraputicas, mas s as manifesta quando se

liberta da unidade transportadora.

Devem ser considerados alguns factores importantes na concepo de um

pr-frmaco:

A ligao entre o frmaco e a unidade transportadora deve ser covalente;

O pr-frmaco deve ser inactivo ou menos activo do que o frmaco original;

A sntese do pr-frmaco no dever implicar custos incomportveis;

A ligao entre o frmaco e o transportador deve sofrer clivagem, in vivo, qumica

ou enzimaticamente, isto , o pr-frmaco dever ser um derivado reversvel ou

biorreversvel do frmaco;

A unidade transportadora deve ser no txica e, de preferncia, biologicamente

inactiva;

A libertao do princpio activo dever ser cineticamente controlada, para

assegurar a manuteno da concentrao do frmaco a nveis eficientes no local de

aco, de modo a minimizar sua inactivao metablica.

Os bioprecursores no implicam uma ligao temporria entre o frmaco e a unidade

transportadora, mas resultam de uma modificao molecular do prprio frmaco. Esta

modificao origina um novo composto que actua como substrato em processos enzimticos

que conduzem formao do princpio activo.



L F armai Transportador ) Sntese Qumicg L ^

Pr-Frmaco

Activao in vivo

Aco farmacolgica

Figura 5: Representao esquemtica da formao e aco de um pr-frmaco.

O objectivo do desenvolvimento de pr-frmacos, na maioria dos casos, resolver

problemas farmacuticos ou farmacolgicos especficos. Assim, os objectivos principais do

recurso aos pr-frmacos so:

Modificao das propriedades farmacocinticas do frmaco in vivo para

melhorar a sua absoro, distribuio, biotransformao e excreo, ou por

outras palavras, melhorar a sua biodisponibilidade;

Aumento da estabilidade nas condies fisiolgicas ou alterao conveniente

da solubilidade;

Formulao farmacutica adequada;

Diminuio da toxicidade e reaces adversas;

Maior especificidade relativamente aos tecidos ou rgos alvo da aco

farmacolgica;

Perodos de aco prolongados.

Os frmacos devem possuir grupos susceptveis de modificao qumica reversvel,

permitindo a introduo de unidades transportadoras, por formao de ligaes amida, ster,

acetal, entre muitas outras.

Uma vez que a primaquina possui um grupo amino (-NH2) susceptvel de modificao

qumica reversvel, pode, atravs de uma ligao amida com molculas transportadoras

adequadas (como os aminocidos), transformar-se num potencial pr-frmaco. Assim, poder-

se- aumentar a selectividade e diminuir a extenso de inactivao do frmaco e das reaces

secundrias que este possa causar, aumentando assim, a sua potencialidade como agente

teraputico da malria.


Importncia Biolgica das 4-imidazolidinonas

3. IMPORTNCIA BIOLGICA DAS 4-IMIDAZOLIDINONAS

Tm sido efectuados diversos estudos de concepo e melhoramento de compostos

farmacologicamente activos, baseados na introduo de estruturas do tipo 4-imidazolidinona

(5). Uma 4-imidazolidinona um anel pentagonal heterocclico, O

mais frequentemente encontrada como uma modificao em cadeias polipeptdicas, nas quais

se forma normalmente no extremo N-terminal atravs de uma condensao com um composto

carbonlico (aldedo ou cetona). Por exemplo, a formao de 4-imidazolidinonas por reaco

de pptidos e protenas do organismo com acetaldedo, o principal metabolite do etanol, foi

sugerida como um indicador de consumo abusivo de bebidas alcolicas . Alm disso, a

relativa facilidade com que ocorre esta reaco tem sido tambm relacionada com a alterao

das propriedades farmacolgicas de compostos como a vancomicina, um antibitico peptdico

que sofre modificao espontnea (formao de uma 4-imidazolidinona) quando conservado

em soluo aquosa a pH neutro e temperatura ambiente, na presena de vestgios de

formaldedo ou acetaldedo34.

Um vasto nmero de 4-imidazolidinonas tem revelado uma larga variedade de

propriedades biolgicas e teraputicas, nomeadamente, actividade anti-convulsiva,

anti-depressiva, anti-inflamatria, anti-viral e anti-tumural . tambm notvel, o facto de

estas estruturas constiturem um denominador comum a vrios inibidores da aldose redutase o

que poder ter implicaes no tratamento de tecidos cancerosos .

Algumas 4-imidazolidinonas foram identificadas como inibidoras da reaco de

Maillard in vitro. Este facto torna-as potencialmente teis no tratamento de doenas causadas

por aquelas reaces, como sejam diversas complicaes derivadas da diabetes e dos

processos de envelhecimento ' .

Mas nos peptidomimticos que a introduo de 4-imidazolidinonas comea a tornar-

-se cada vez mais relevante. De facto, o desenvolvimento clnico de pptidos como frmacos

ou como unidades transportadoras de frmacos (em pr-frmacos) implica problemas como

Mestrado em Qumica 13.


seja a permeabilidade limitada das membranas biolgicas ou, mais relevante ainda, a

susceptibilidade degradao enzimtica por aco das peptidases. Assim, cada vez mais

frequente o recurso aos peptidomimticos, que no so mais do que molculas com uma

topologia e constituio muito semelhantes s do pptido bioactivo, mas em que as ligaes

amida so "mascaradas" ou substitudas pelos seus issteros ' . Recentemente, foi publicado

um nmero significativo de trabalhos cientficos em que se descreve a introduo de

modificaes do tipo 4-imidazolidinona em cadeias peptdicas, com o duplo objectivo de

manter ou at melhorar a bioactividade do pptido original e, simultaneamente, eliminar os

problemas do frmaco relacionados com biodisponibilidade, estabilidade enzimtica e

permeabilidade (por exemplo, da barreira hemato-enceflica) ' . Atendendo sua estrutura,

bem como ao efeito causado pela introduo na estrutura secundria das cadeias

polipeptdicas, o anel de 4-imidazolidinona desempenha frequentemente o papel de uma

pseudo-prolina:

J W U H N - C H - C I II R3 O

CHCNH'vw I Ri

Figura 6: 4-imidazolidinona numa sequncia peptdica.

O II

/ V A A . H N - C H - C N C H C - N H w u I II R! O

Figura 7: Prolina numa sequncia peptdica.



O papel participativo das 4-imidazolidinonas na actividade teraputica dos pptidos

em que se inserem revela-se tambm ao nvel da posio desta insero. Encontra-se descrita

na literatura uma clara dependncia entre a actividade biolgica e a posio da sequncia

peptdica em que se introduziu o anel .

Do ponto de vista sinttico, as aproximaes mais clssicas correspondem formao

do heterociclo em soluo, atravs da reaco do componente peptdico com o componente

carbonilo, geralmente em meio polar (metanol 39, tampo aquoso ) e eventualmente na

presena de um catalisador bsico como a trietilamina .

Muito recentemente, tm sido descritos mtodos em fase slida de insero de

4-imidazolidinonas em cadeias peptdicas baseadas na formao de um aducto reactivo

resultante da presena do aldedo e de benzotriazole, o qual sofre um processo espontneo de

substituio nuclefila intramolecular, gerando a 4-imidazolidinona e libertando benzotriazole 28,29,30

H2N-Q a.h.c

H2N

"?2 H -O Bt H -O

?VY 1 o R>

O a.b.c

e,c

M H N ^ y -N-

R2>

NH2

Figura 8: Sntese em fase slida de 4-imidazolidinonas anlogas a pptidos: (a) Boc-aa-OH, DIPCI, HOBt, DMF; (b) TFA em DCM; (c) DIEA em DCM; (d) benzotriazole (Bt), formaldedo, DMF, 85C; (e) BF3.Et20, DCM; (f) HF, 0C.



Estes mtodos em fase slida permitem variar facilmente a posio de insero e a

estrutura da 4-imidazolidinona a introduzir e, por outro lado, tornam exequvel o recurso a

largos excessos dos reagentes solveis (benzotriazole, aldedo) para forar a ciclizao

pretendida ^ .

Em suma, as 4-imidazolidinonas revelam-se como estruturas de grande importncia

biolgica, com as evidentes implicaes ao nvel teraputico, e oferecem um vasto campo a

explorar no mbito da Qumica Bioorgnica e Qumica Mdica.

Mestrado em Qumica l

CAPITULO II

ESTUDO DA SNTESE DE 4-IMIDAZOIIDINONAS DA PRIMA QUINA

DERIVADAS DE CETONAS CCLICAS

mbito do Projecto

1. MBITO DO PROJECTO

O trabalho experimental em questo est inserido num projecto de investigao que

tem por fim a sntese qumica e o estudo de derivados da primaquina como potenciais

pr-frmacos na terapia da malria. Este projecto est a ser desenvolvido na linha de Sntese Orgnica de Compostos

Bioactivos (linha 1) do Centro de Investigao em Qumica da Universidade do Porto, sob a orientao das Doutoras Paula Gomes e Maria Joo Arajo.

A aplicabilidade destes compostos como potenciais sistemas de cedncia biorreversvel da primaquina est a ser testada em colaborao com as equipas do Professor Doutor Rui Moreira, do Centro de Estudos de Cincias Farmacuticas da Universidade de Lisboa, e do Professor Doutor Virglio do Rosrio, do Instituto de Higiene e Medicina Tropical de Lisboa, atravs de estudos farmacocinticos e biolgicos, respectivamente.

2. OBJECTIVO

Do exposto no captulo I, em especial no que se refere s propriedades teraputicas da primaquina (3) e s caractersticas biolgicas das 4-imidazolidinonas (5), pensou-se na possibilidade de concepo de novos pr-frmacos antimalricos, atravs da conjugao destas duas estruturas moleculares. Assim, a realizao deste trabalho teve por objectivo a sntese de 4-imidazolidinonas da primaquina derivadas da ciclopentanona, cicloexanona e cicloeptanona, contendo os oc-aminocidos glicina, alanina, valina e fenilalanina (Figura 9).

CH 3 -0 .

o R R= -H, -CH3.

NHCHCH2-CH2CH2N' y -CH (CH3)2,

CH3 ^ \ NH -CH2Ph

n=4,5,6

Figura 9: Estrutura genrica das 4-imidazolidinonas pretendidas.


Anlise retrossinttica

3. ANLISE RETROSSINTTICA

Atendendo estrutura das 4-imidazolidinonas que se pretenderam sintetizar, fez-se a

seguinte anlise retrossinttica: CHs-O^

^

NHCHCH2-CH2CH2N

CH3-O

CH3-O

CH3-O

CH3

(CH2)n.

NH-CH CH2-CH2-CH2NH-C-CH-NH2 + x

CH3 R g (comercial)

R= -H, -CH3, -CH(CH3)2, -CH2Ph

n=4,5,6

NH CHCH 2 -CH 2 -CH 2 NH" H-NH-C-OC(CH3 )3

CH3 A

NHCH-CH2-CH2-CH2-NH2 + (CH3)3CO--NHHCOOH I II I

CH3 (Primaquina comercial na forma ft (Boc-aa-OH de bisdiidrogenofosfato) comercial)

Assim, considerou-se que as 4-imidazolidinonas pretendidas (A), poderiam ser

obtidas atravs da ciclizao, com cetonas cclicas, de derivados neutros da primaquina

contendo resduos de a-aminocidos (B) => passo 3. Estes, por sua vez, obter-se-iam por

simples condensao da primaquina com a-aminocidos devidamente protegidos, atravs da

formao de uma ligao amida => passo 1. O grupo lST-protector seria removido numa etapa

intermdia entre a Ia fase de condensao e a ltima fase de ciclizao => passo2.


Mtodos de Sntese

4. MTODOS DE SNTESE

Atendendo anlise retrossinttica descrita no ponto anterior, os derivados acilados da

primaquina foram preparados por condensao desta com quatro a-aminocidos

Na-Boc-protegidos diferentes (passo 1), aps o que se removeu o grupo ^-protector

(passo 2) e, por ltimo, se procedeu ciclizao com trs cetonas cclicas distintas (passo 3).

4.1. Condensao da Primaquina com a-aminocidos lS^-Boc-protegidos

A condensao da primaquina com os a-aminocidos fez-se atravs da formao de uma ligao amida. Esta forma-se pelo ataque do grupo amino primrio da primaquina ao grupo carboxilo do a-aminocido I^-Boc-protegido, uma vez que o grupo amino primrio da primaquina mais nuclefilo do que o grupo amino secundrio, devido maior basicidade e menor impedimento estereoqumico daquele relativamente a este.

A formao da ligao amida seguiu os mtodos usuais de condensao peptdica j descritos na literatura 45'46,47. Estes mtodos abrangeram a utilizao do grupo frc-butiloxicarbonilo (Boc)45'46-47 para a proteco do grupo Nâmino do a-aminocido a condensar, o recurso a carbodiimidas (6) 45*46,47 como reagentes de condensao (N,N'-dicicloexilcarbodiimida, DCCI e N,N'-diisopropilcarbodiimida, DIPCI) e o uso de 1-hidroxibenzotriazole (HOBt) (7) como nuclefilo auxiliar 4'46,47. O mtodo DCCI/HOBt (Figura 10) continua a ser, actualmente, um dos mais utilizados em sntese peptdica, pois conduz a bons resultados a nvel quantitativo (rendimentos) e qualitativo (bons graus de pureza qumica e ptica dos produtos, por supresso de reaces laterais)45'46,47.


Mtodos de Sntese

(CH3)3CO-C-NHCHC-H + R'N== II I O R

R"N=C-NH-R'

R: -H, -CH3. -CH(CH3)2, -CHrPh

R\- Q - ou -CH(CH3)2

CH3-O

CH3-0

1 oJ (CH3)3CO-~NH CH5C O

NsaN

NHCH-(CH2)3-Nhj CH3

+ R'NH-C-NHR'

N = N O O

NH-CH-(CH2)3'NH-C-CH-NH-C-OC(CH3)3 + HO' CH3 R

Figura 10: Esquema geral da reaco de condensao de um a-aminocido N^Boc-protegido com a primaquina.


Mtodos de Sntese

4.2. Remoo do grupo frc-butiloxicarbonilo por acidlise com cido

trifluoroactico O mtodo utilizado para a remoo do grupo Na-Boc-protector, por acidlise com

cido trifluoroactico, est bem descrito na literatura ' ' .

No presente trabalho experimental procedeu-se remoo do grupo Boc dos derivados

da primaquina por solubilizao directa destes em cido trifluoroactico puro, formando-se,

por conseguinte, os respectivos trifluoroacetatos (Figura 11).

CH 3 -0 ,

O O NH CH-(CH2)3NH C CH-NH C-OC(CH3)3 + 2CF3C00H

CH3 k

CH3-0

NH2-CH-(CH2)3-NH-C-HNH3* CH3 A

CH2 ||

2CF3COO" + c CH3 ' TCHj

+ C0 2

R: -H, -CH3, -CH(CH3)2, -CH2-Ph

Figura 11: Remoo do grupo Boc dos derivados N"-protegidos da primaquina por acidlise com TFA.

Neutralizando estes trifluoroacetatos com soluo aquosa de carbonato de sdio a

30%, obtm-se os compostos totalmente desprotegidos, ou seja, com o grupo amino terminal

livre. Em seguida, estes compostos podem ser isolados mediante uma simples extraco

lquido-lquido. CH3-0

NH2-CH-(CH2)3-NH-C-HNH3* CH3 k

2CF3C00" + Na2C03

CHj-0

NH CH-(CH2)3-NH-C-CHNH2 + H20 + C02 + 2CF3C00Na CH3 J

R: -H, -CH3, -CH(CH3)2, -CH2-Ph

Figura 12: Desproteco total do derivado, com obteno do grupo amino terminal livre.


Mtodos de Sntese

4.3. Sntese das 4-imidazolidinonas por ciclizao dos derivados da

primaquina com cetonas cclicas

A ciclizao dos derivados da primaquina com cetonas cclicas (ciclopentanona,

cicloexanona e cicloeptanona) baseia-se em mtodos descritos na literatura ; . A reaco

de ciclizao faz-se na presena de filtros moleculares, para absorver a gua libertada na

reaco, e de trietilamina como catalisador bsico auxiliar. Um mecanismo proposto para esta

reaco passa pela formao de uma base de Schiff que sofre um rearranjo posterior,

resultando a 4-imidazolidinona pretendida (Figura 13).

CH3-0

CHJ-O

o NHCH-(CH2)3-NH-C-CH NH2 +

NH-CH-(CH2)3-KlH-C-CH-N:

(CH2),

Base de Schiff < C H 2 ) /

C H j - 0

CH3-O

H 2 0

+ H 2 0

^ ( C H 2 W

1\ J NH-CH-(CH2)3-NH-C-CH-N* C "> l kJL

H O 11 11 l-CCHjj-NH-C-CH-N C

H3 l

OH

^ {C2)Z

H'. -H, -CH3, -CH(CH3)2, CH-Ph CH3-O

NHCHCH2-CH2CH2N

C H3 ^ - \ NH

V

H 2 0

Figura 13: Mecanismo proposto para a ciclizao dos derivados da primaquina com cetonas cclicas.


Resultados Experimentais e Discusso

5. RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSO

5.1. Condensao da primaquina com a-aminocidos KF-Boc-protegidos

Realizaram-se vrias reaces de sntese para cada derivado Boc-aa-PQ, utilizando

como reagente de condensao a DCCI ou a DIPCI, conforme os casos. Os rendimentos

globais foram reprodutveis para o mesmo procedimento experimental e encontram-se

resumidos na Tabela I, que inclui outras observaes experimentais.

Reagente base

Reagente de condensao

Aminocido N"-Boc-

protegido Produto obtido

Tempo reaco (Dias)

Rf (sistema

de eluentes)

Aspecto do produto

Rendimento (%)

Primaquina

DCCI

Glicina 4'-N-(/erc-butiloxicarbonilglicil) primaquina

5

0,56(B)

leo espesso amarelo torrado

96,0

Primaquina

DCCI Alanina 4'-N-(terc-

butiloxicarbonilalanil) primaquina

5 0,68(A)

leo espesso amarelo torrado

93,0

Primaquina

DCCI

Valina 4'-N-(rerc-butiloxicarbonilvalil) primaquina

5

0,29(D) leo

espesso acastanhado

95,0 Primaquina

DCCI

Fenilalanina 4'-N-(terc-

butiloxicarbonilfenilalanil) primaquina

5

0.56(D) leo

espesso amarelo

96,9

Primaquina

DIPCI

Valina 4'-N-(frc-butiloxicarbonilvalil) primaquina 5

0,44(N) leo

espesso amarelo

98,6

Primaquina

DIPCI

Fenilalanina 4'-N-(ferc-

butiloxicarbonilfenilalanil) primaquina

5

0,44(D) leo

espesso amarelo

96,2

Tabela I: Resultados obtidos para a reaco de condensao da primaquina com a-aminocidos Na-Boc-protegidos.

Os rendimentos obtidos para a reaco de condensao dos a-aminocidos

N-Boc-protegidos com a primaquina, na presena de Et3N, DCCI (ou DIPCI) e HOBt, foram

quase quantitativos.

O decurso das reaces foi acompanhado por TLC, tendo-se verificado um aumento

significativo da mancha relativa ao produto principal aps a segunda adio de DCCI



(ou DIPCI). Tambm por TLC se verificou que os compostos sintetizados se encontravam cromatograficamente homogneos, facto que evidenciou uma purificao cromatogrfica aparentemente eficaz.

Como se pde observar, a condensao da primaquina com os a-aminocidos valina e fenilalanina Na-Boc-protegidos efectuou-se utilizando como reagente de condensao a DCCI que, posteriormente, foi substituda por DIPCI. Esta uma carbodiimida lquida, com a mesma eficcia da DCCI como reagente de condensao, e origina uma ureia, a N,N'-diisopropilureia (DIU), mais solvel do que a N,N'-dicicloexilureia (DCU) nos solventes orgnicos correntes. O emprego da DIPCI em substituio da DCCI, na condensao destes a-aminocidos, deveu-se a problemas observados na separao cromatogrfica entre o derivado pretendido e a DCU. De facto, nas primeiras snteses destes derivados utilizando DCCI, constatou-se que a DCU e os produtos apresentavam o mesmo valor de Rf em diversas condies cromatogrficas testadas, havendo pois sobreposio de manchas. Assim, e apesar de muitas vezes os produtos isolados parecerem puros por se apresentarem cromatograficamente homogneos, veio-se a verificar que estavam contaminados com DCU. Esta contaminao s se tornava visvel ou atravs de anlises espectroscpicas dos produtos, ou em reaces posteriores, em que os produtos j apresentavam Rf distintos do da DCU. Deste modo, repetiram-se as snteses utilizando a DIPCI, tendo-se verificado que a respectiva ureia (DIU) apresentava um valor de Rf marcadamente diferente do dos derivados Boc-aa-PQ, possibilitando uma eficaz separao por cromatografia em coluna. Tal como j foi referido, este problema s foi detectado mediante anlises espectroscpicas dos produtos e, tambm, em reaces posteriores. Nomeadamente, foi possvel detectar a impureza durante a reaco de remoo do grupo Boc, porque os Rf dos produtos desprotegidos resultantes eram significativamente afastados do Rf da DCU (seco 5.2.). Deste modo, a tcnica de TLC no foi eficaz na comprovao da pureza dos produtos 4'-N-(/erc-butiloxicarbonilvalil)primaquina e 4'-N-(frc-butiloxicarbonilfenilalanil)primaquina sintetizados utilizando DCCI como reagente de condensao. Por esta razo, os rendimentos calculados para estas snteses no representaram os valores reais, uma vez que os produtos no se encontravam puros, apesar de cromatograficamente homogneos. As restantes reaces de condensao da primaquina com os a-aminocidos valina e fenilalanina IsT-Boc-protegidos foram j efectuadas utilizando a DIPCI como reagente de condensao, no se registando qualquer dificuldade digna de nota.



Uma outra dificuldade encontrada ao nvel experimental centrou-se na relativa

facilidade com que o composto 4'-N-(teAr-butiloxicarbonilglicil)primaquina se decompunha.

Aps permanecer poucos dias no exsicador, este composto j no se encontrava

cromatograficamente homogneo, apresentando sinais de uma possvel reconverso aos

reagentes iniciais Boc-Gly-OH e primaquina.

No entanto, com as devidas precaues, foi possvel trabalhar com os derivados da

glicina sem problemas, com determinaes estruturais correctas e obtendo-se produtos finais

de boa qualidade.

Uma vez optimizados os mtodos de preparao destes compostos, todas as snteses

foram repetidas em maior escala, por forma a obter produtos finais em quantidade suficiente

para posteriores testes farmacocinticos, biolgicos e toxicolgicos. A alterao da escala de

sntese no teve qualquer efeito visvel ao nvel dos resultados, quer qualitativos, quer

quantitativos.

A caracterizao estrutural dos produtos sintetizados, que se apresentaram todos como

leos espessos amarelados, foi feita por espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear

('H e 13C) e por espectrometria de massa de alta resoluo (MALDI-TOF).

Apresenta-se de seguida, e a ttulo de exemplo, o espectro de massa correspondente ao

produto 4'-N-(terc-butiloxicarbonilvalil)primaquina (Figura 14). Os dados relativos aos

espectros de massa dos restantes compostos desta famlia encontram-se registados na Parte

Experimental.

Voyager Spec #1[BP = 458.1, 2864 458.1214

459.1263

1.3E+4

460.1312

119.0 435.4 451.8 468.2 Mass (nVz)

484.6 501.0

Figura 14: Espectro de massa da 4'-N-(terc-butiloxicarbonilvalil)primaquina (MM=458,60 u.m.a.)

Os espectros de massa apresentaram-se totalmente compatveis com as massas

moleculares dos produtos esperados, como se pode ver neste caso, em que a razo m/z

esperada e a observada so praticamente coincidentes.



Os dados relativos aos espectros de Ressonncia Magntica Nuclear deste grupo de

compostos encontram-se igualmente registados na Parte Experimental. No entanto,

apresentam-se de seguida os espectros de 'H-RMN (Figura 15) e de 13C-RMN (Figurai6) do

produto 4'-N-(terc-butiloxicarbonilvalil)primaquina, ilustrativos dos restantes. Tanto estes

espectros como todos os outros foram compatveis com as estruturas esperadas, confirmando

inequivocamente a identidade dos produtos pretendidos.

! P I IIP

1 *

111 II % J '.'> I in n o

ÔH-NHC I p CHCHjg

CHi

-OCCHjfe

r

c b ;:fed;.

I . Lfi

um u 14) 4 1jB L/\_A

u u u

h m

PIP

U U M I U i " " i " ** T , , Av , , , r - , , r " , , * p I I I | I I I I |

Figura 15: Espectro de 'H-RMN da 4'-N-(e/-c-butiloxicarbonilvalil)primaquina em CDC13

*


S I I S S S 9

il vv S CSS* S * = * a * J 5 * d tftfttJ i s u u j i i m i t

S 17 S CH-CH2 CH2-CH2NHC H-NH--OC


5.2. Remoo do grupo Boc por acidlise com cido trifluoroactico

Realizaram-se vrias reaces de remoo do grupo Boc dos derivados da primaquina

obtidos anteriormente, com cido trifluoroactico. Os rendimentos globais obtidos foram

reprodutveis para o mesmo procedimento experimental e encontram-se resumidos na Tabela

II, que inclui outras observaes experimentais.

Composto inicial Produto obtido

Tempo

reaco

(Horas)

(sistema

de

eluentes)

Aspecto do

produto

Rendimento

(%)

4'-N-(frc-butiloxicarbonilglicil) primaquina

4'-N- glicilprimaquina

2

0.06(B)

leo amarelo

torrado

95,6

4'-N-(frc-butiloxicarbonilaIaniI) primaquina

4'-N-alanilprimaquina 2

0.06(C) leo amarelo

torrado

87,3

4'-N-(/erc-butiloxicarbonilvalil) primaquina

4'-N-valilprimaquina

2 0.03(C)

leo amarelo

torrado 94,4

4'-N-(terc-butiloxicarbonilfenilalanil)

primaquina

4'-N-fenilalanilprimaquina

2

0.04(C)

leo amarelo

torrado

88,2

Tabela H: Resultados obtidos para a reaco de remoo do grupo Boc com TF A.

A remoo do grupo Boc por acidlise com TFA uma reaco quantitativa, facto que se evidenciou nos rendimentos observados para as desproteces dos compostos 4'-N-(rerc-butiloxicarbonilglicil)primaquina e 4'-N-(terc-butiloxicarbomlvalil)primaquina. No entanto, os rendimentos da remoo do grupo Boc nos compostos 4'-N-(f/r-butiloxicarbonilalanil)primaquina e 4'-N-(terc-butiloxicarbonilfenilalanil)prirnaquina foram um pouco mais baixos. Este facto deveu-se provavelmente a maiores perdas de produto nas diversas operaes realizadas para isolar os derivados neutros, nomeadamente, extraces e filtrao aps secagem com sulfato de magnsio anidro.

O decurso das reaces de remoo foi acompanhado por TLC, tcnica que permitiu tambm corifirmar que os compostos obtidos eram cromatograficamente homogneos.

Os derivados desprotegidos foram igualmente caracterizados por Ressonncia Magntica Nuclear e espectrometria de massa de alta resoluo.



semelhana do que se fez no ponto anterior, apresentam-se apenas os espectros de um dos

compostos como exemplo representativo de todos os restantes, cujos dados se encontram

descritos na Parte Experimental.

O espectro de massa obtido para a 4'-N-valilprimaquina apresenta-se na Figura 17 e

totalmente compatvel com o valor esperado para a razo m/z da espcie MFT (359,49 uma).

100, 90 sa

I 6a sa s 40 * 30

20 10 0

Voyager Spec #1 [BP =78.1,23647]

358.1878

359.1983

331.0 344.2 ^-kjUy

360.2035

.L. 357.4 4 370.6 383.8

1.5E+4

- 4 0 397.0

Mass (m/z)

Figura 17: Espectro de massa da 4'-N-valilprimaquina (MM=358,49 u.m.a.)

Os espectros de 'H-RMN e de 13C-RMN do produto 4'-N-valilprimaquina,

apresentam-se nas Figuras 18 e 19, respectivamente. Tanto estes espectros como os

correspondentes aos restantes derivados desprotegidos apresentaram-se compatveis com as

estruturas esperadas. Assim, foi tambm possvel confirmar a identidade de todos os

derivados desprotegidos preparados, comprovando o xito deste passo sinttico.



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Figura 18: Espectro de 'H-RMN da 4'-N-valilprimaquina em CDC13

r s a t a s s 5 I S5 2 S i ! VVI !

2 4

10

12 20

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17

CDC1,

W^^H^W

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18

11 15 13 14

19

20

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Figura 19: Espectro de 13C-RMN da 4'-N-valilprimaquina em CDC13



5.3. Sntese de 4-imidazolidinonas da primaquina, derivadas de cetonas cclicas

Na Tabela III encontram-se os resultados das snteses de 4-imidazolidinonas obtidas

por ciclizao dos derivados da primaquina preparados anteriormente com cicloexanona,

ciclopentanona e cicloeptanona:

Composto inicial

Cetona utilizada

Produto obtido Tempo reaco (Dias)

Rf (sistema

de eluentes)

Aspecto do

produto

Rendimento (%)


cicloexanona

3-[4-metiI-4-(6-metoxi-8-quinolil) aminobutil]-2-

espirocicloexano-4-imidazolidinona

3

0.28(E) leo

amarelo torrado

74,7

4'-N-alanilprimaquina cicloexanona 5-metil-3-[4-metil-4-(6-metoxi-

-8-quinolil)aminobutil]-2-espiro-cicloexano-4-imidazolidinona

3 0,44(E) leo

amarelo torrado

69,2


cicloexanona

5-isopropil-3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-quinolil)aminobutil]-

-2-espirocicloexano--4-imidazolidinona

3

0,20(1) leo amarelo 62,5


cicloexanona

5-benzil-3-[4-metil-4-(6-metoxi--8-quinoliI)aminobutil]-2-espiro-

cicloexano-4-imidazolidinona

3

0.37(H) leo amarelo 69,1


ciclopentanona

3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-quinolil) aminobutil]-2-

espirociclopentano-4-imidazolidinona

3

0,16(P) leo amarelo 50,4

4'-N-alanilprimaquina

ciclopentanona

5-metil-3-[4-metil-4-(6-metoxi--8-quinolil)aminobutil]-2-spiro ciclopentano-4-imidazolidinona

3

0,41(L) leo

amarelo torrado

61,2


ciclopentanona 5-isopropil-3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-quinoliI)aminobutil]-

-2-espirociclopentano--4-imidazolidinona

3


4--N-fenilalanilprimaquina

ciclopentanona

5-benzil-3-[4-metil-4-(6-metoxi--8-quinolil)aminobutil]-2-espiro ciclopentano-4-imidazolidinona

3

0.33(G) leo

amarelo torrado

58,6

4'-N-valilprimaquina cicloeptanona

5-isopropil-3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-quinolil)aminobutil]-

-2-espirocicloeptano--4-imidazolidinona 3



cicloeptanona 5-benzil-3-[4-metil-4-(6-metoxi--8-quinolil)aminobutil]-2-espiro cicloeptano-4-imidazolidinona

3


Tabela III: Resultados obtidos para a sntese de 4-imidazolidinonas por ciclizao com cetonas cclicas.



Os rendimentos globais das diferentes ciclizaes efectuadas situaram-se entre os 50 e os 70%, evidenciando que se tratam de reaces com extenso aprecivel. Como se pde observar, os valores de rendimento foram maiores no caso das ciclizaes com cicloexanona, seguindo-se os relativos s reaces com ciclopentanona e, por fim, os correspondentes s ciclizaes com cicloeptanona. Esta observao poder-se- explicar em termos de flexibilidade e tamanho dos anis das cetonas usadas. Assim, os menores rendimentos associados s ciclizaes com cicloeptanona poder-se-o dever ao grande tamanho do anel de sete lados a incorporar molcula. Por outro lado, a maior tenso verificada em anis de cinco carbonos relativamente aos de seis, poder estar na origem de uma menor flexibilidade, logo, menor reactividade da ciclopentanona relativamente cicloexanona.

Observando os valores de rendimento obtidos para o caso da ciclizao com cicloexanona, verificou-se que foi maior no caso da sntese da 3-[4-metil-4-(6-metoxi--8-quinolil)aminobutil]-2-espirocicloexano-4-imidazolidinona, uma vez que o grupo R da glicina (R=H) menos volumoso do que o dos restantes a-aminocidos, sendo portanto mais fcil a sua aproximao ao anel da cetona e posterior formao do anel de 4-imidazolidinona. J no caso da ciclizao com ciclopentanona, constatou-se que, neste caso, o derivado 344-metiI-4-(6-metoxi-8-qumolil)aimnobutil]-2-espirociclopentano^-imidazolidinona era o que apresentava menor rendimento. Este facto poder-se- dever a uma separao cromatogrfica mais difcil, devido ao produto ficar mais retido na coluna, o que se traduziu no menor rendimento observado.

Apesar de fazer parte dos objectivos do presente trabalho, as snteses da 3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-qumolil)ammobutil]-2-espirocicloeptano-4-imidazolidinona e da 5-metil-3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-quinolil)aminobutil]-2-espirocicloeptano-4-imidazolidinona no foram concludas dentro do perodo de preparao desta dissertao.

O decurso das ciclizaes foi acompanhado por TLC, tendo-se verificado que, nas snteses das 5-isopropil-3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-quinolil)aminobutil]-2-espirocicloexano-4-imidazolidinona, 3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-quinolil)aminobutil]-2-espirociclopentano-4-imidazolidinona, 5-isopropil-3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-quinolil)aminobutil]-2-espirociclopentano-4-imidazolidinona, 5-isopropil-3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-quinolil)-aminobutil]-2-espirocicloeptano-4-imidazolidinona e 5-benzil-3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-qumolil)aminobutil]-2-espirocicloeptano-4-imidazolidinona, as respectivas manchas aumentaram ao longo de trs dias sem surgimento de outras manchas de eventuais produtos secundrios. Quanto s snteses das restantes 4-imidazolidinonas, verificou-se que ao fim de dois dias as respectivas manchas no aumentavam visivelmente, pelo que se resolveu parar as



reaces. De notar que em todas as ciclizaes foi adicionado mais um equivalente da

respectiva cetona aps as primeiras 24 horas de reaco.

Todos os produtos finais apresentaram-se como leos amarelados

cromatograficamente homogneos aps uma etapa purificativa por cromatografia lquida em

coluna com gel de slica. A caracterizao estrutural dos compostos cclicos preparados foi igualmente feita por

Ressonncia Magntica Nuclear e por espectrometria de massa de alta resoluo (MALDI-TOF), encontrando-se os dados espectrais de cada composto registados na Parte Experimental. semelhana do que se fez nos pontos 5.1. e 5.2., reproduzem-se alguns dos espectros de massa e de RMN, a ttulo de exemplo. Assim, apresentam-se, por esta ordem, os espectros de massa das 5-isopropil-3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-quinolil)aminobutil]--2-espirocicloexano-4-imidazolidinona (Figura 20), 5-isopropil-3-[4-metil-4-(6-metoxi--8-quinolil)aminobutil]-2-espirociclopentano-4-imidazolidinona (Figura 21) e 5-isopropil-3--[4-metiM-(6-metoxi-8-qumolil)arninobutil]-2-espirocicloeptano-4-imidazolidinona (Figura 22) ilustrativos dos correspondentes aos restantes compostos cclicos.

Voyagar Spec 1->BC>NF0.7[BP - 439, 4092]

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Figura 20: Espectro de massa da 5-isopropil-3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-quinolil)aminobutil]--2-espirocicloexano-4-imidazolidinona (MM=438,62 u.m.a.)


http://R4ifjHM43a.fi


100 90 80

f 60 S 50 * 4 0 * 30

20 10

399.0

Figura 21:

P 409.8

Voyager Spec #1 [BP = 424.2,8794] 424.1883

425.1799

426.1720

420.6 431.4 Mass (m/z)

8794

442.2 453.0

Espectro de massa da 5-isopropil-3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-quinolil)aminobutil]--2-espirociclopentano-4-imidazolidinona (MM=424,59 u.m.a.)

100 90 80

feo | I 40 3? 30

20 10 0 377.0 411.2

Voyager Spec #1[BP = 178.1,794ZJ 452.3847

453.3863

-J.

454.3852

#1.3661

445.4 479.6

Mass (m/z)

6679.4

513.8 548.0

Figura 22: Espectro de massa da 5-isopropil-3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-quinolil)aminobutil]--2-espirocicloeptano-4-imidazolidinona (MM=452,64 uma.)

Como se pode observar nas figuras acima, os espectros de massa obtidos pela tcnica

de MALDI-TOF so perfeitamente compatveis com as massas moleculares dos produtos

analisados. Nas pginas seguintes esto representados exemplos de espectros de 'H-RMN (Figuras

23,25,27) e de 13C-RMN (Figuras 24,26,28) para estes mesmos compostos. Mais uma vez, os

espectros de RMN foram compatveis com as estruturas esperadas, denotando-se algumas

impurezas que se veio a verificar terem origem nos eluentes utilizados para cromatografia em

coluna. Todos os espectros de RMN e de massa dos compostos preparados confirmaram

inequivocamente a identidade dos produtos como sendo as 4-imidazolidinonas pretendidas.

Mestrado em Qumica _ ^


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Figura 25: Espectro de 'H-RMN da 5-isopropiI-3-[4-metiMK6-metoxi-8ûmoliOammbutil]--2-espirociclopentano-4-imidazolidinona em CDC13

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Figura 27: Espectro de 'H-RMN da 5-isopropil-3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-quinolil)aminobutil]--2-espirocicloeptano-4-imidazolidinona em CDC13

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Figura 28: Espectro de 13C-RMN da 5-isopropil-3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-quinolil)aminobutil]--2-espirocicloeptano-4-imidazolidinona em CDC13



5.4. Preparao de sais hidrossolveis das 4-imidazolidinonas sintetizadas

Uma vez sintetizadas e positivamente identificadas as 4-imidazolidinonas pretendidas,

procedeu-se preparao de sais hidrossolveis das mesmas. A converso das

4-imidazolidinonas em formas hidrossolveis visou a preparao de solues daquelas em

tampes aquosos adequados, para estudos do perfil farmacocintico e de actividade biolgica

destes compostos.

Testou-se em primeiro lugar a preparao de metanossulfonatos obtidos por reaco

das 4-imidazolidinonas com uma soluo de cido metanossulfnico em ter etlico anidro.

Apenas se prepararam os metanossulfonatos das 4-imidazolidinonas derivadas da

cicloexanona, conseguindo-se a precipitao de um sal slido unicamente no caso da

5-isopropil-3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-quinolil)aminobutil]-2-espirocicloexano-4-imidazolidinona.

Os restantes metanossulfonatos precipitaram como pastas espessas de cor alaranjada, tendo-se

optado por abandonar este procedimento e tentar, alternativamente, preparar fosfatos das

4-imidazolidinonas.

Os fosfatos foram preparados por adio de cido fosfrico em etanol a solues

etanlicas das 4-imidazolidinonas recuperadas aps neutralizao dos metanossulfonatos

preparados em primeiro lugar. Mais uma vez, no houve precipitao imediata de fosfatos

slidos, observando-se apenas solidificao dos compostos (3-[4-metil-4-(6-metoxi-8-

qumolil)ammobutil]-2-esphocicloexano-4-imidazolidinonae5-benzil-3-[4-metil-4-(6-metoxi-

8-qumolil)aminobutil]-2-espirocicloexano-4-imidazolidinona), aps dois meses em exsicador.

No entanto, estes slidos eram muito higroscpicos, apresentando deliquescncia.

Atendendo s dificuldades observadas nas tentativas de preparao de

metanossulfonatos e fosfatos slidos, estudou-se a possibilidade de preparar os citratos das

4-imidazolidinonas em estudo.

Assim, prepararam-se os citratos de todas as 4-imidazolidinonas sintetizadas por

adio de uma soluo de cido ctrico em ter etlico anidro. Desta feita, os sais precipitaram

facilmente como slidos de cor amarelo-alaranjada intensa, no apresentando deliquescncia

nem carcter higroscpico aparente.

Os citratos foram posteriormente enviados para o Centro de Estudos de Cincias

Farmacuticas da Faculdade de Farmcia da Universidade de Lisboa e para o Instituto de

Higiene e Medicina Tropical de Lisboa, para a serem efectuados estudos farmacocinticos e

biolgicos, respectivamente.



Recentemente, e j durante a redaco desta Dissertao, verificou-se no ser

estritamente necessrio preparar sais das 4-imidazolidinonas, uma vez que estas ltimas so

solveis, mesmo na forma neutra, nos meios utilizados para a realizao dos estudos

farmacocinticos e biolgicos.


Concluso

6. CONCLUSO E PERSPECTIVAS

Neste trabalho experimental props-se aplicar cetonas cclicas (cicloexanona,

ciclopentanona e cicloeptanona) na preparao de 4-imidazolidinonas da primaquina, as quais

se apresentam como potenciais pr-frmacos da primaquina, cuja aplicabilidade na

quimioterapia da malria ser oportunamente testada.

Os mtodos de sntese utilizados para a condensao da primaquina com

a-aminocidos N^Boc-protegidos revelaram-se adequados, conduzindo a excelentes

resultados. O mesmo se pode afirmar quanto s reaces de remoo do grupo sP-protector,

terc-butiloxicarbonilo, e s reaces de ciclizao dos derivados desprotegidos com as

cetonas cicloexanona, ciclopentanona e cicloeptanona.

Os produtos pretendidos foram eficazmente purificados e identificados por

espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear e por espectrometria de massa de alta resoluo.

Os resultados globais deste trabalho podem considerar-se bons, esperando-se que venham a revelar-se teis no s no desenvolvimento de novas estratgias para a terapia da malria, como tambm no estabelecimento de novas metodologias de sntese de 4-imidazolidinonas da primaquina.

A evoluo futura deste trabalho, a curto e a mais longo prazo, passar provavelmente

pelos seguintes pontos:

> Concluso das snteses dos derivados da 4'-N-glicilprimaquina e da 4'-N-alanilprimaquina resultantes da ciclizao com cicloeptanona;

> Estudo de diferentes condies de sntese e isolamento, no sentido de optimizar os rendimentos das ciclizaes e a eficcia das purificaes;

> Alargamento do projecto de investigao a novos derivados, usando outros

a-aminocidos, e outros compostos carbonlicos;

> Estudo da sntese de 4-imidazolidinonas resultantes da ciclizao de

dipeptidilprimaquinas no primeiro ou no segundo cc-aminocido, por forma a avaliar a

influncia desta na actividade teraputica dos derivados obtidos.

Recentes estudos farmacocinticos, em tampo a pH fisiolgico e em plasma humano, de

alguns dos compostos preparados, evidenciaram que estes so demasiado estveis para terem

aplicao como pr-frmacos.


Concluso

No entanto, foram j realizados testes biolgicos sobre esses mesmos compostos, os quais

manifestaram actividades antimalricas comparveis s da prpria primaquina. Estes

resultados, provenientes de ensaios in vivo, usando o vector natural (mosquitos Anopheles) e um mamfero hospedeiro (rato), revestem-se de particular importncia. De facto, a notvel

actividade antimalrica revelada pelas 4-imidazolidinonas testadas, parece indicar que

estamos na presena de uma nova famlia de frmacos antimalricos.


Parte Experimental

7. PARTE EXPERIMENTAL 7.1. Notas Gerais

Os solventes utilizados para a realizao das reaces foram todos de qualidade

pr-anlise. Sempre que necessrio, foram utilizados solventes secos sobre filtros moleculares

(4 , da Merck), sendo estes previamente activados por aquecimento numa mufla a 300C

durante 24 horas. Para o seguimento das reaces, recorreu-se tcnica de cromatografia em camada

fina (TLC), que possibilitou tambm a confirmao da homogeneidade cromatogrfica dos compostos preparados. Utilizaram-se, para isso, placas de alumnio recobertas com gel de slica 60 F254 da Merck, sensveis luz ultravioleta de comprimento de onda 254 nm. Os cromatogramas foram revelados por irradiao com luz UV a 254 nm (lmpada UV: CN-6, da Vilben Lourmat), e tambm por pulverizao com uma soluo de dicarboxidina, aps exposio das placas a atmosfera de cloro 50. As manchas reveladas por este mtodo apresentaram uma colorao avermelhada, que era tanto mais intensa quanto maior a concentrao do composto presente.

Para a purificao dos compostos obtidos, utilizou-se a tcnica de cromatografia

lquida de adsoro em coluna, com coluna de vidro de dimenso 45x3 cm. Utilizou-se gel de

slica chromagel 60 A da SDS (tamanho das partculas: 35-70um, pH=7, superfcie mssica

550 m2/g) como fase estacionria, previamente suspensa no eluente a utilizar. A eluio e

recolha de fraces de eluato foram feitas manualmente.

Os sistemas de solventes utilizados na eluio, quer em placa, quer em coluna,

constam da Tabela IV: Sistemas de eluentes

B

D

G H

M N

Composio (solventes e respectiva proporo volumtrica

CH2Cl2/MeOH10:l CH2Cl2/EtOH15:l CH2Cl2/Me2CQ4:l CH2Cl2/Me2CQ7:l CH2C12 /Me2CO10:l CH?Cl2/Me2C0 15:l

CH2C12/THF2:1 CH2C12/THF 5:1 CH2C12/THF8:1

CH2C12 / THF 10:1 CH2C12 /THF 15:1 CH2C12 / THF 20:1 CH2C12/THF1:5

Tabela IV: Sistema de eluentes cromatogrficos utilizados.

Parte Experimental

Os solventes foram evaporados sob presso reduzida em evaporador rotativo Biichi

B-169. Os espectros de Ressonncia Magntica Nuclear de proto ('H-RMN) e de carbonol3

(13C-RMN) dos diferentes compostos foram traados, alternativamente, em espectrmetro (300 MHz)do Departamento de Qumica da Universidade Aberta do Reino Unido (Doutor Jim Iley), espectrmetro Brucker AMX (300 MHz) do Departamento de Qumica da Universidade de Aveiro (Dr. Hilrio Tavares), espectrmetro Brucker (200 MHz) do Departamento de Qumica da Faculdade de cincias da Universidade do Porto (Dra. Adelina Macedo) e espectrmetro Brucker AMX (300 MHz) da Universidade de Santiago de Compostela

(R.I.A.I.D.T., servio de RMN). Os desvios qumicos observados foram registados relativamente ao padro interno

tetrametilsilano (TMS) e obtidos de solues dos compostos em clorofrmio deuterado

(CDC13). Os dados referentes a cada espectro de proto encontram-se especificados do seguinte

modo: desvio qumico (em ppm), multiplicidade do sinal (s-singuleto, sl-singuleto largo, d-dupleto, dd-duplo dupleto, ds-dupletos sobrepostos, t-tripleto, m-multipleto e ms-multipletos sobrepostos), rea relativa do sinal (nH ou n de protes), localizao do proto na molcula.

A anlise dos produtos finais por espectrometria de massa de alta resoluo MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption ionization - time-of-flight) foi realizada pela Doutora Eliandre de Oliveira no Departamento de Qumica Orgnica da Universidade de Barcelona, em espectrmetros Finnigan MAT Lasermat 2000 ou Brucker II Biflex, utilizando-se como matrizes, alternativamente, cido 2,5-diidroxibenzico (DHB), antraceno e cido a-ciano-4-hidroxicinmico (ACH).

As suspenses dos citratos das 4-imidazolidinonas da primaquina precipitados em ter

etlico, foram centrifugadas a 3000 r.p.m e a 0C, em centrfuga Centurion (srie K2R).


Parte Experimental

7.2. Condensao da primaquina com aminocidos N^Boc-protegidos

7.2.1. Sntese da 4'-N- (terc-butiloxicarbonilglicil) primaquina

CH3-0

NH2*-CH-(CH2)3NH3+

CH3

2H2PO4- + (CH3)3C0-C-NHCH2C00H + ( 3 - ^ ^ v 3 + ^

455,34 175,19 206,33 (3) (8) (9)

CH3-0

( V-NH-CNH-( > + 2{Et3NH+KH2P04'} NHCH-(CH 2 ) 3 -NH-C CH2-NH-C-OC(CH3)3 + \ _ _ / " " " ^ - " " ^ / CH3

416,52 DCU (10)

A uma suspenso de sal de primaquina (3) (l,08g; 2,37mmol) em CH2C12 seco (20,0 mL), adicionou-se Et3N (1,3 mL; 9,4mmol) de modo a que o bisdiidrogenofosfato de primaquina se dissolvesse. A mistura foi mantida com agitao magntica em banho de gelo e ao abrigo da luz, durante cerca de 30 minutos.

Em seguida adicionou-se Boc-Gly-OH (8) (0,64g; 3,7mmol), HOBt (0,35g; 2,6 mmol) e uma soluo de DCCI (9) (0,58g; 2,8mmol) em CH2C12 seco (10,0 mL). Deixou-se a mistura reaccional sempre sob agitao magntica durante cerca de 2 horas, em banho de gelo e ao abrigo da luz, continuando-se depois a reaco temperatura ambiente durante 2 dias.

Adicionou-se novamente uma soluo de DCCI (9) (0,53g; 2.6mmol) em CH2C12 seco (10,0 mL) e deixou-se a reaco decorrer como anteriormente, durante mais 3 dias.

Filtrou-se a mistura obtida, levou-se o filtrado secura, e dissolveu-se o resduo em

acetona a quente, tendo-se colocado a soluo obtida no frigorfico durante 24 h. Repetiu-se

todo o passo anterior obtendo-se como resduo um leo espesso castanho, que por TLC(C) se

verificou estar impuro.

Mestrado em Qumica . 46

Parte Experimental

Procedeu-se, ento, purificao do leo por cromatografia em coluna, usando como

eluenteCH2Cl2/Me2C0 4:l.

Recolheram-se as fraces correspondentes ao produto principal e evaporou-se o

solvente no evaporador rotativo, tendo-se obtido um leo espesso amarelo torrado (0,95g) que

por TLC(C) se verificou estar cromatograficamente homogneo: Rf(10)=0,56.

H (CDCI3, 300MHz) 8,50 (dd, IH, J=4,20Hz, J=l,47Hz, Ar); 7,90 (dd, IH, J=8,22Hz,

J=l,65Hz, Ar); 7,28 (dd, IH, J=8,22Hz, J=4,20Hz, Ar); 6,31 e 6,24 (2d, 2H, J=2,56Hz, Ar),

6,17 (m,lH, CH2-N//-CO); 5,97 (m, IH, -N//-CH); 5,16 (m, IH, -Ntf-COO); 3,87 (s, 3H,

CH3O-); 3,72 (d, 2H, J=5,88Hz, -NHCO-Ctf2-NHCO); 3,61 (m, IH, -CH-); 3,28 (m, 2H, -GH2-NHCO); 1,80 a 1,57 (ms, 4H, -CH2-); 1,40 (s, 9H, (C//3)3-); 1,27 (d, 3H, J=6,24Hz,

C//3-);.

c (CDCI3, 300MHz) 169,3 (CO); 156,0 (C=0-0); 159,4 a 91,7 (ArC); 80,2 (C);

55,2 (CH3O-); 47,8 (-CH-); 44,4 (-NHCO-CH2-NHCO-); 39,3 a 26,2 (-CH2-); 28,3 ((CH3)3-);

20,5 (CH3). m/z (Mir)=417,23 (esperado, 417,52).


Parte Experimental

7.2.2. Sntese da 4'-N- (terc-butiloxicarbonilalanil) primaquina

CH3-0..

N

NH2-CH-(CH2)3NH3 CH3

455,34 (3)

2H2PCV + (CH3)3CO-C-NHCHCOOH + DCCI + Et3N

O CH3

189,21 (11)

206,33 (9)

CH3-0

HOBt NHCH-(CH2)3NHC CH-NHCOC(CH3)3

CH3 '

+ DCU + 2{Et3NH+KH2P047

CH3

430,55 (12)

A uma suspenso de sal de primaquina (3) (2,12g; 4,66mmol) em CH2C12 seco (40,0 mL), adicionou-se Et3N (1,3 mL; 9,4mmol) de modo a que o bisdiidrogenofosfato de primaquina se dissolvesse. A mistura foi mantida com agitao magntica em banho de gelo e ao abrigo da luz, durante cerca de 30 minutos.

Em seguida adicionou-se Boc-Ala-OH (11) (l,29g; 6,82mmol), HOBt (0,7lg; 5,2mmol) e uma soluo de DCCI (9) (l,07g; 5,19mmol) em CH2C12 seco (20,0 mL). Deixou-se a mistura reaccional sempre sob agitao magntica durante cerca de 2 horas, em banho de gelo e ao abrigo da luz, prolongando-se depois a reaco temperatura ambiente durante mais 2 dias.

Adicionou-se novamente uma soluo de DCCI (9) (l,04g; 5,04mmol) em CH2C12 seco (20,0 mL) e deixou-se reagir como anteriormente, durante mais 3 dias.

Filtrou-se a mistura obtida, levou-se o filtrado secura, e dissolveu-se o resduo em acetona a quente, tendo-se colocado a soluo obtida no frigorfico durante 24 h. Repetiu-se todo o passo anterior obtendo-se como resduo um leo espesso castanho, que por TLC(E) se verificou estar impuro.


eluente CH2Cl2/Me2CO 10:1.


Parte Experimental

Uma vez que o processo no foi eficaz, procedeu-se a uma segunda purificao,

usando CH2Cl2/MeOH 10:1 como eluente.

Recolheram-se as fraces correspondentes ao produto principal e evaporou-se o solvente no

evaporador rotativo, tendo-se obtido um leo espesso amarelo torrado (l,87g) que por

TLC(A) se verificou estar cromatograficamente homogneo: Rf(12)=0,68.

H (CDCb, 200MHz) 8,52 (dd, IH, J=4,22Hz, J=l,64Hz, Ar); 7,87 (dd, IH, J=8,28Hz,

J=l,60Hz, Ar); 7,30 (dd, IH, J=8,25Hz, J=4,23Hz, Ar); 6,47 (m, IH, -CH2-N//-CO); 6,33 e

6,26 (2d, 2H, J=2,48Hz, Ar); 5,98 (d, IH, J=8,25Hz, -N//-CH-); 5,19 (m, IH, -N//-COO-);

4,13 (m, IH, -CO-C//-NH-); 3,68 (s, 3H, CH30-); 3,61 (m, IH, -CH-); 3,26 (m, 2H, -CH2-NHCO); 1,72 a 1,51 (ms, 4H, -CH2-); 1,39 (s, 9H, (C#3)3-); 1,33 a 1,27 (ds, 6H, J=6,46Hz,

c%-). c (CDCI3, 200MHz) 172,6 (CO); 155,5 (C=0-0); 159,3 a 91,6 (ArC); 79,9 (C);

55,1 (CH3O-); 50,0 (-CH-NH-); 47,7 (-CH-); 39,2 a 26,1 (-CH2-); 28,2 ((CH3)3-); 20,5 (CH3);

16,5 (CO-CH-CH3). m/z (MH>431,26 (esperado, 431,55); m/z (MNa+)=453,22 (esperado, 453,55);

m/z (MK+)=469,21 (esperado, 469,55).


Parte Experimental

7.2.3. Sntese da 4'-N- (terc-butiloxicarbonilvalil) primaquina

7.2.3.1. Usando DCCI como reagente de condensao

CH3-0.

S NH2+-CH-(CH2)3NH3+

CH3

2H2P04" +

(CH3)3CO-C-NHCHCOOH II I O CH CH3 +DCCI + EtaN

455,34 (3)

CH3 217,27 (13)

206,33 (9)

CH3-0

NHCH-(CH2)3-NH 6 CH-NH-C-OC(CH3)3 + DCU + 2{Et3NH+KH2P04"} C H 3 CHCH3

CH3

458,60 (14)

A uma suspenso de sal de primaquina (3) (1,18g; 2,59mmol) em CH2C12 seco (20,0 inL), adicionou-se Et3N (1,3 mL; 9,4mmol) de modo a que o bisdiidrogenofosfato de primaquina se dissolvesse. A mistura foi mantida com agitao magntica em banho de gelo e ao abrigo da luz, durante cerca de 30 minutos.

Em seguida adicionou-se Boc-Val-OH (13) (0,62g; 2,9mmol), HOBt (0,42g; 3,lmmol) e uma soluo de DCCI (9) (0,58g; 2,8mmol) em CH2C12 seco (10,0 mL). Deixou-se a mistura reaccional sempre sob agitao magntica durante cerca de 2 horas em banho de gelo e ao abrigo da luz, continuando-se depois temperatura ambiente durante 2 dias.

Adicionou-se novamente uma soluo de DCCI (9) (0,53g; 2,6mmol) em CH2C12 seco (10,0 mL) e deixou-se a reaco decorrer como anteriormente, durante mais 3 dias.

Filtrou-se a mistura obtida, levou-se o filtrado secura, e dissolveu-se o resduo em acetona a quente, tendo-se colocado a soluo obtida no frigorfico durante 24 h. Repetiu-se


Parte Experimental

todo o passo anterior obtendo-se como resduo um leo espesso castanho, que por TLC(F) se




Recolheram-se as fraces correspondentes ao produto principal e evaporou-se o

solvente no evaporador rotativo, tendo-se obtido um leo espesso acastanhado (l,13g) que por

TLC(F) se verificou estar cromatograficamente homogneo: Rf(14)=0,29.

7.2.3.1. Usando DIPCI como reagente de condensao

CH3-0

NH2+-CH-(CH2)3NH3' CH3

455,34 (3)

2H2P04

(CH3)3CO -C -NHCHCOOH II I O CH CH3

CH3

217,27 (13)

H,C

126,20 (15)

+ EtaN H3

CH3-O

HOBt O O H3C

Jl I CH-(CH2)3-NHC CH-NH-C-OC(CH3 )3 + ") N C H3 CH-CH3 H j <

CH3

! / C H 3

H-CNH-< + ZEtaNH^KHzPO} CH3

458,60 (14)

DIU

A uma suspenso de sal de primaquina (3) (2,14g; 4,70mmol) em CH2C12 seco (40,0

mL), adicionou-se Et3N (1,3 mL; 9,4mmol) de modo a que o bisdiidrogenofosfato de

primaquina se dissolvesse. A mistura foi mantida com agitao magntica em banho de gelo e

ao abrigo da luz, durante cerca de 30 minutos.


Parte Experimental

Em seguida adicionou-se Boc-Val-OH (13) (l,14g; 5,24mmol), HOBt (0,72g;

5,3mmol) e DIPCI (15) (0,76mL; 4,9mmol). Deixou-se a mistura reaccional sempre sob

agitao magntica durante cerca de 2 horas em banho de gelo e ao abrigo da luz,

continuando-se depois a reaco temperatura ambiente durante 2 dias.

Adicionou-se novamente DIPCI (15) (0,76mL; 4,9mmol) e deixou-se a reaco

avanar como anteriormente, durante mais 3 dias.

Filtrou-se a mistura obtida, levou-se o filtrado secura, e dissolveu-se o resduo em

acetona a quente, tendo-se colocado a soluo obtida no frigorfico durante 24h. Repetiu-se

todo o passo anterior obtendo-se como resduo um leo espesso castanho, que por TLC(D) se




Recolheram-se as fraces correspondentes ao produto principal e evaporou-se o solvente no

evaporador rotativo, tendo-se obtido um leo espesso amarelo (2,13g) que por TLC(D) se

verificou estar cromatograficamente homogneo: RX14)=0,44.

H (CDC13, 300MHz) 8,52 (dd, IH, J=4,05Hz, J=l,35Hz, Ar); 7,90 (dd, IH, J=8,25Hz,

J=l,35Hz, Ar); 7,28 (dd, IH, J=7,65Hz, J=4,95Hz, Ar); 6,53 (m, IH, CH2-N//); 6,33 e 6,27

(2d, 2H, J=2,10Hz, Ar); 5,99 (d, IH, J=7,20Hz, -NJ-CH); 5,30 (dd, IH, J=8,25Hz,

J=l,95Hz,-N//-COO-); 3,92 (m, IH, NH-CO-C//-NH-CO); 3,87 (s, 3H, CZ/3O-); 3,59 (m,

IH, -Ci/-); 3,25 (m, 2H, -Ctf2-NH); 2,05 (m, IH, --(CH3)2); 1,63 (ms, 4H, -CH2-); 1,39 (s,

9H, (C%)3-); 1,27 (d, 3H, J=6,00Hz, G%-) 0,91 (ds, 6H, J=6,90Hz, (CH3)2-).

Sc (CDCI3, 300MHz) 172,1 (C=0); 156,4 (C=0-0); 159,8 a 92,1 (ArC); 80,1 (C);

60,4 (NHCO-CH-NHCO); 55,6 (CH3O-); 48,2(-CH-); 31,3(-CH-(CH3)2); 39,8 a 26,7 (-CH2-);

28,7 ((CH3)3-); 20,9 (CH3); 19,7 e 18,4 ((CH3)2-). m/z (MH+)=459,13 (esperado, 459,60).


Parte Experimental

7.2.4. Sntese da 4'-N-(terc-butiloxicarbonilfenilalanil) primaquina

7.2.4.1. Usando DCCI como reagente de condensao

CH3-0

NH2+-CH-(CH2)3NH3+

CH3

(CH3)3CO-C-NHCHCOOH O CH2

2H2P04" + + DCCI + EUN

455,34 (3)

265,31 (16)

206,33 (9)

CH3-O.

HOBt , ^ 9 0 NHCH-(CH2)3NHC-H-NH--OC(CH3)3 + DCU + ZEtsNH^hfePO-O

CH3

506,64 (17)

A uma suspenso de sal de primaquina (3) (2,30g; 5,05mmol) em CH2C12 seco (40,0 mL), adicionou-se Et3N (1,3 mL; 9,4mmol) de modo a que o bisdiidrogenofosfato de primaquina se dissolvesse. A mistura foi mantida com agitao magntica em banho de gelo e ao abrigo da luz durante cerca de 30 minutos.

Em seguida adicionou-se Boc-Phe-OH (16) (l,24g; 4,67mmol), HOBt (0,64g; 4,7mmol) e uma soluo de DCCI (9) (0,97g; 4,7mmol) em CH2C12 seco (20,0 mL). Deixou-se a mistura reaccional sempre sob agitao magntica durante cerca de 2 horas em banho de gelo e ao abrigo da luz, continuando-se depois a reaco tem

APLICAÇÃO DE CETONAS CÍCLICAS NA PREPARAÇÃO DE 4 ... · de Lisboa, a possibilidade de...

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