Aplicações da Proteômica em diversas linhas de pesquisa na

área BiomédicaAplicações:

- Descoberta de novas drogas, - Estudos em patologia, - Diagnóstico, - Terapias, - Microbiologia,- Bioquímica, - Fisiologia de plantas, - Controle de qualidade.

Abordagens em ProteômicaAbordagens em Proteômica

• Proteômica de ExpressProteômica de Expressãoão– EExpressão Diferenxpressão Diferenccialial

• Proteômica FuncionalProteômica Funcional– Interação Proteina-ProteinaInteração Proteina-Proteina– Vias de SinalizaçãoVias de Sinalização– Modificação PósModificação Pós- traducional- traducional

• Proteômica QuantitativaProteômica Quantitativa

-

Caracterização de

proteínas

BIOINFORMATICA

LABIOS IQ-UFRJ

UMGIBf-UFRJ

LQPPUENF

DBqMEDUFRJ

LTFIOCRUZ

2D

2D

2D

2D

2D

REDE PROTEÔMICA DO RIO DE JANEIROCONFIGURAÇÃO ATUAL - 2005

LBFPUERJ

BIOQUERJ

2D

2DGENUFRJ

2D

Q-TOF - IBqM

MALDI TOF -IBf

Q-TOF - UENF

LABORATORIOS. ASSOCIADOSRMN

ESPEC MASSA – PUCAGROBIOLOGIA-EMBRAPA

INCa

MALDI TOF-TOFIOC

Análise proteômica comparativa de diferentes extratos proteicos

isolados de cepas mutantes e selvagem de C. glabrata

Penha, C. V. L., Bouchara, J. F., Lopes-Bezerra, L. M.

Candida glabrata

Maior obstáculo nas infecções por C. glabrata

resistência adquirida a terapias por azólicos Espécies mais comuns causadoras da candidíase invasiva

Espécies Frequência

Candida albicans 50%

Candida tropicalis 15-30%

Candida glabrata 15-30%

Candida parapsilosis 15-30%

Candida krusei ~1%

Candida lusitaniae ~1%

Potenciais mecanismos moleculares de resistência aos antifúngicos

Alterações no processamento intracelular do antifúngicoModificaçãoDegradação

Alterações da enzima alvoMutação pontualSuperexpressãoAmplificação gênicaConversão gênica ou recombinação mitótica

Alterações de outras enzimas na via da biossíntese do ergosterol

Bombas de efluxoTransportadores ABC“Major” Facilitadores

Objetivo

Contribuir para o entendimento das prováveis modificações envolvidas nas respostas adaptativas dos

fungos frente aos medicamentos antifúngicos

Cepa 1085 S = selvagem Cepa 178 = mutante, resistente a azolicos

Candida glabrata

Parede celular

Microssoma

Citoplasma

Proteínas

Cepa 1085 S = selvagem

Cepa 178 = mutante, resistente a azolicos

Culturas

Cepa 1085 s = selvagem

Cepa 178 = mutante

PMSFEDTAPepstatinaRNAse

Candida glabrata

braunBilhas de

vidro

“ ’’

Centrifugação:

2’ 500 g eliminação das bilhas de vidro

5’ 1000 g pellet - C1 = parede

30’ 12000 g pellet - C2 = mitocôndria

60’ 75000 g pellet - C3 = microssoma

Sobrenadante = proteínas do citosol C4

Solubilização de proteínasC1

C3

“ ’’

on

Sonificação - 3 ciclos de 15’

Chaps

Uréia

DTT

Dosagem de Proteínas = Bradford

C1, C3 e C4

C2

(Strip 18 cm -Gel 12%)

A) 1085-S

IEF

S

DS

3,0 11,0 pI

Mr(kDa)250150

100

37

25

B) 1085-BET

S

DS

IEF

3,0 11,0 pI

Mr(kDa)250150

100

37

25

Eletroforese Bidimensional

Spots 1085-S 1085-BET

Matching Spots

187 110 168

Two-dye overlay (1085-S/1085-BET)

1085-S = azul

1085-BET= vermelho

1 2 3 4 5 67 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 61

58

18 19 2021 22 2324 62

2928272625

32

3331305960

5763

34

35

36 37

56

41 42403938

43 44 45 46 47 48

4950

51

52 53 5455

Identificação por MALDI TOF/TOF Piruvato decarboxilase

Fosfohexose isomerase

Enolase

Frutose 1,6 bifosfato aldolase

Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

3,0 IEF 11,0

“Expressão diferencial de proteínas da parede celular de leveduras e conídios

do fungo dimórfico Sporothrix schenkii”

In collaboration with the Department of Cellular Biology and Genetics

UERJ

- etiological agent of feline and human sporotrichosis

- most common Latin America mycosis

- can affect tissues and internal organs

- dangerous to immunosupressed individuals

- morphological transition is a key factor in virulence

GOALS

- understand the physiopathology of disseminated sporotrichosis

- identify virulence factors/ molecular biomarkers

PREMISES

2D-PAGE dos CWPs obtidos da parede celular de diferentes formas do S.

schenckii3,0 IPG 10,0 3,0 IPG 10,0kDa

190,0

120,0

60,0

50,0

40,0

25,0

15,0

Morfologia n de spots Percentual de proteí nas por faixa de pH a

pI 3,0 – 5,0 pI 5,0 – 7,0 pI 7,0 – 10,0

Levedura 233 18,4% 58,0% 23,6%

Conídio 112 29,5% 54,5% 16,0%

Tabela 1- Quantificação das proteínas expressas (spots ) na parede celular da forma de levedura e de conídios nos géis 2D, e sua distribuição percentual segundo os respectivos pontos isoelétricos.

a - foram utilizadas tiras de focalização isoelétrica em gradiente de pH de 3,0 a 10,0.

Morfologia n de spots Percentual de proteí nas por faixa de pH a

pI 3,0 – 5,0 pI 5,0 – 7,0 pI 7,0 – 10,0

Levedura 233 18,4% 58,0% 23,6%

Conídio 112 29,5% 54,5% 16,0%

Tabela 1- Quantificação das proteínas expressas (spots ) na parede celular da forma de levedura e de conídios nos géis 2D, e sua distribuição percentual segundo os respectivos pontos isoelétricos.

a - foram utilizadas tiras de focalização isoelétrica em gradiente de pH de 3,0 a 10,0.

141 3232

N de Spots

Lev Con

141 3232

N de Spots

Lev Con

AB

Interseção

4,0 IPG 7,0

SD

S

Two-dye overlay (Levedura/Conídio)

levedura - azul

conídio - vermelho

O QUE FOI ENCONTRADO UTILIZANDO PROTEÔMICA?

O QUE FOI ENCONTRADO UTILIZANDO PROTEÔMICA?

SÓ ISSO?!

Uma visão para o futuro....

produtos metabólicosfragmentos gerados enzimáticamente

SELDI - Surface Enhanced Laser Desorption Ionization

Geração sistemática de anticorpos monoespecíficos para explorar o proteoma humano.

- Análise de padrões de expressão protéica e localização subcelular;

- Investigação de vias de interação;

- Variantes resultantes de splicing;

- Modificações pós-traducionais.

> 400 genes humanos

100-150 aa consecutivos

PERSPECTIVAS

Conjunto de proteínas humanas não-redundantes (proteína representativa por locus genético) estimado em 20 a 25 mil;

Produção de milhares de msAb possível por ano com essa nova técnica;

Previsão para completar o projeto em alguns anos.