18/02/2013

1

Aplicações de Espectrometria de Massa

Prof. Alan J A McBride

Proteômica

2012.2

Tipos de MS

• GC-MS - Cromatografia gasosa MS• Separa compostos voláteis na coluna de gás e a identificação é por massa

• LC-MS - Cromatografia líquida MS• Separa compostos delicados em coluna de HPLC e a identificação é por massa

• MS-MS - Espectrometria de massa tandem• Separa fragmentos compostos pelo campo magnético e a identificação é por

massa

Ionização por electronspray (ESI)

• Massas moleculares até ca. 1200 Da• Dar origem a íons com uma única carga (M + H)+ ou (M - H)-

• Exemplo do espectro da leucina encefalina pentapeptídeo, YGGFL• C28H37N5O7 = 555,2692 Da• Íons dominantes: m/z 556,1

• M + H+ = 555,27 + 1

• Boa concordância com o valor teórico• Outros íons de menor intensidade:

• m/z 557,2• 12C foi substituído por um átomo de 13C

• m/z 578,1• Aductos íons de sódio (M + Na)+

ESI

• Massas moleculares > ca. 1200 Da • Dar origem a íons com cargas múltiplas (M + nH)n+ ou (M - nH)n-

• As proteínas têm muitos locais adequados para protonação;

• Exemplo de cargas múltiplas, que é o espectro m/z da proteína lisozima de ovo de galinha branca:• m/z varia entre 1101,5 e 2044,6;

• Cada pico é um molécula de proteína

intacta, um número diferente de cargas.

M. Mann, C. K. Meng, J. B. Fenn, Anal. Chem., 1989, 61, 1702

Exemplo: lisozima

• Os valores m/z são expressadas: • m/z = (MW + nH+)/n

• m/z = a razão massa-carga;

• MW = massa molecular da amostra;

• n = o número inteiro de cargas dos íons;

• H = massa de uma próton = 1,008 Da.

Exemplo: lisozima

• m/z = (MW + nH+)/n• Se os íons m/z = 1431,6 ter "n"• As taxas de íons m/z 1301,4 terá "n +1" cargas, • A equação acima pode ser escrita de novo para estes dois íons:• 1431,6 = (MW + nH+)/n e 1301,4 = [MW + (n+1)H+] /(n+1)

• n(1431,6) - nH+ = (n+1)1301,4 - (n+1)H+

• n(1431,6) = n(1301,4) +1301,4 - H+

• n(1431,6 – 1301,4) = 1301,4 - H+

• n = (1301,4 - H+) / (1431,6 – 1301,4) = 10

• 1431,6 = (MW + nH+)/n• 1431,6 x 10 = MW + (10 x 1,008) • MW = 14,316 – 10,08• MW = 14.305,9 Da

18/02/2013

2

Exemplo: lisozima

• Massa molecular observada, 14.305,9 Da, tem boa concordância com o valor teórico de 14.305,14 Da.

• Precisão usando ionização electrospray ou nanospray:• Dentro de 0,01% da massa molecular

• Representa o ± 1,4 Da

Exemplo: lisozima

• Pode converter o espectro m/z para um perfil de massamolecular:• Dominado pelo pico 14.305,7 Da

• Vários picos menores de massamaior - aductos de sal:• Na (M+23), K (M+39), H2SO4 ou H3PO4

(M+98).

• As massas moleculares podem ser lidos facilmente e sem ambiguidade

• Indicação da pureza da proteína.

Espectrometria de massa tandem

TOF

NANOSPRAY

TIP

ION

SOURCE

HEXAPOLE

COLLISION

CELL

HEXAPOLE

HEXAPOLE

QUADRUPOLE

MCP

DETECTOR

REFLECTRONSKIMMER

PUSHER

Espectrometria de massa tandem

• Finalidade é gerar íons do íon-precursor para fornecer informação estrutural sobre uma molécula.

• Além disso, permite a separação e identificação de compostos em misturas complexas.

• Utiliza dois ou mais analisadores de massa / filtros separados por uma câmara de colisão cheio com árgon ou xénon.

• Célula de colisão é onde os íons selecionados são encaminhados para uma maior fragmentação.

Espectrometria de massa tandem

• Configurações diferentes de MS-MS:• Quadrupolo-quadrupolo (baixa energia)

• Sector magnético-quadrupolo (alto)

• Quadrupolo-TOF (baixa energia)

• TOF-TOF (baixa energia)

• Experimentos de fragmentação também pode ser realizada em instrumentos analisadores individuais, tais como instrumentos de armadilha de íons e instrumentos TOF equipado com pós-fonte de decomposição.

Caracterização de Proteínas

18/02/2013

3

Por que Proteômica?

• As proteínas são os agentes activos biológicos em células.

• Sequências de DNA não mostram como as proteínas funcionam ou como biológica processos ocorrem.

• Proteínas sofrem modificações pós-transcricionais.

• Estruturas 3D afetar a função da proteína.

• O splicing alternativo.

The Human Proteome Initiative. (2007) http://ca.expasy.org/sprot/hpi/hpi_desc.html Retrieved March 24, 2009.

Desafios

• As análises de misturas complexas não são completas.

• Difícil preparar uma amostra pura.

• A expressão de proteínas é muito sensível às condições ambientais.

• Difícil de utilizar correntes de íons para determinar a abundância de peptídeos.

Perfil de proteínas

• Gerar mapas de proteoma de grande escala.

• Anotar e corrigir sequências genômicas.

• Analisar a expressão da proteína como uma função do estado celular.

MS-MS e Proteômica MS-MS Metodologia

• 2D-GE + MALDI-MS• Peptide Mass Fingerprinting (PMF)

• 2D-GE + MS-MS• Sequence Tag/Fragment Ion Searching

• Multidimensional LC + MS-MS• ICAT (marcação com isótopos)

• MudPIT

• 1D-GE + LC + MS-MS

• De Novo Peptide Sequencing (MS-MS)

18/02/2013

4

MS-MS para identificar proteínas

• As proteínas são isolados (a partir de gel ou HPLC) e submetido a digestão tríptica;

• Peptídeos são enviados através de ionizador e numa célula de colisão, onde os íons duplamente carregados são seleccionados e fragmentados através de decomposição induzido por colisão (CID);

• Os íons resultantes com carga única (íons filha) são analisados para determinar a sequência ou a identidde do peptídeo-precursor.

Porque Tripsina para MS-MS?

• CID de peptídeos menos de 2-3 kDa é mais fiável para estudos MS-MS• A frequência de clivagem tríptica garante que a maioria dos peptídeos será

deste tamanho.

• Tripsina cliva no lado C-terminal da arginina e lisina;

• Os resíduos básicos estão no lado C-terminal;

• Então, os peptídeos fragmentam de um modo mais previsível ao longo do comprimento do peptídeo.

Por que carga dupla?

• É mais fácil de interpretar espectros obtidos a partir de péptideos-precursores duplamente carregadas:• Maioria dos fragmentos de íons têm carga única.

• Precursores com carga dupla fragmenta também de tal modo que a maior parte das ligações peptídicas romper com frequência similar, de fato que é mais provável para derivar uma sequência completa.

MS-MS e Fragmentos de Peptídeos

• Quando os peptídeos ou proteínas são admitidos para uma célula de colisão:• Usualmente fragmenta no ponto mais fraco da ligação (a ligação peptídica);

• Quebra nas ligações CH-NH e CH-CO também ocorre.

• Condições de colisão têm que ser otimizado para cada peptídeo;

• Dois tipos de íons-filha são produzidos:• "b" de íons e "y" de íons.

MS-MS Fragmentação de Peptídeos

H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO…CO-NH-CH-CO2H

R1 R2 R3 Rn

yn-1 yn-2 y1

b1 b2 bn-1

b1 y1 b2 y2 b3 y3 b4 y4 b5 y5

MS-MS Fragmentação de Peptídeos

b1 y1 b2 y2 b3 y3 b4 y4 b5 y5

Ala-Gly-His-Leu-……Phe-Glu-Cys-Tyr

18/02/2013

5

MS-MS

• Peptídeos fragmento ao longo esqueleto do aminoácido para dar informação sobre a sequência.

• Peptídeos ca. 2500 Da ou menos produzir os dados mais úteis.

• A quantidade de informação sobre a sequência peptídica varia de um para o outro.

• Alguns peptídeos pode gerar dados suficientes para uma sequência completa de ser determinado, outros podem gerar uma sequência parcial de 4 ou 5 amino ácidos.

• A proteína digerida pode ser analisada como uma mistura de reação total, sem qualquer separação dos produtos, a partir da qual os peptídeos individuais são selecionados e analisados pelo MS para gerar informação sobre a sequência.

• Cerca de 4 µl de solução necessária para a análise da digestão• Proteína original de ca. 1-10 pmol/µl.

• MS-MS sequenciamento é um sensível técnica que consome pouco amostragem.

• As vezes, a sequência da proteína completa pode ser verificada:• Mas, 70-80% cobertura é razoável.

• Muitas vezes, a sequência de uma cauda de 4/5 aminoácidos de um peptídeo proteolítica único é suficiente para identificar a proteína a partir de um banco de dados.

Quando um peptídeo é analisado por MS/MS, a fragmentação gera uma família de

fragmentos peptídicos com massas que vão diferir uma da outra em valores que

correspondem a um íon b, permitindo a identificação de cada aminoácido.

Sequenciamento de novo de proteínas

A sequência obtida pela análise dos íons de uma série pode ser confirmada pela

determinação da sequência feita a partir da série complementar de íons, no caso do

exemplo, os íons y.

Sequenciamento de novo de proteínas

Sequenciamento de novo de Peptídeos (MS-MS)

• Feito quando a amostra não é susceptível de degradação de Edman;

• Feito quando não tem sequência ou perfil de PMF no bancos de dados;

• Requer um analisador de massa de elevada resolução (FT-ICR, QTofou instrumento QStar) com <20 ppm resolução;

• Normalmente exige que digerir várias enzimas;

• Ainda um processo difícil, mas possível de fazer em quantidades muito mais baixas do que degradação de Edman.

Protocolos para Sequenciamento MS-MS

• Normalmente não pode identificar a um íon "b" de um íon "y";

• Assumir a menor massa visível no espectro é uma lisina ou arginina:• É o íon y1

• Tripsina cliva após uma lisina ou arginina

• A massa y1 deve ser 147,113 para a lisina ou arginina para 175,119:• O íon y1 é calculado adicionando 19,018 u (três hidrogênios e um de oxigénio)

para as massas de resíduos de lisina e arginina.

Massas das Amino Ácidos

Glicina 57,02147Alanina 71,03712Serina 87,03203Prolina 97,05277Valina 99,06842Treonina 101,04768Cisteína 103,00919Isoleucina 113,08407Leucina 113,08407Asparagina 114,04293

Aspártico 115,02695Glutamina 128,05858Lisina 128,09497Glutâmico 129,04264Metionina 131,04049Histidina 137,05891Fenilalanina 147,06842Arginina 156,10112Tirosina 163,06333Triptofano 186,07932

Massa monoisotópico

18/02/2013

6

Anotar:

• Gly + Gly = 114.043 u e Asn = 114.043 u

• Ala + Gly = 128.059 u e Gln = 128.059 u and Lys = 128.095 u

• Gly + Val = 156.090 u e Arg = 156.101 u

• Ala + Asp = Glu + Gly = 186.064 e Trp = 186.079 u

• Ser + Val = 186.100 u e Trp = 186.079 u

• Leu = Ile = 113.084u

Protocolo

1. Preparação de amostra

2. Separação

3. Espectrometria de massa

Visão geral

Aebersold, R & Mann, M. (2003). Mass spectrometry based proteomics. Nature. 422, 198-207

Preparação de amostra

• A preparação da amostra inclui tudo o que se encontra entre a amostra e a primeira dimensão do gel 2D:• Células e culturas de células – multiplicar;

• Homogeneização e isolamento das proteínas;

• Remoção de contaminantes / limpeza;

• Fracionamento.

Remoção de contaminantes / limpeza

• Limpeza geral;

• melhorar a resolução;

• Melhorar a reprodutibilidade;

• Fracionamento;

• reduzir a complexidade;

• Melhorar a faixa de detecção;

• Enriqueça proteínas de baixa-abundância.

www.expressionproteomics.com

2. A segunda dimensão (separação por massa)

1. Tira de gel da 1ª dimensão é carregada

num gel de SDS-Page

2. SDS desnatura as proteínas (para

fazer o movimento dependente apenas

da massa, não de forma) e elimina a

efeito de carga.

1. A primeira dimensão (foco isoelétrica)

1. Gel com um gradiente de pH

imobilizado

2. Corrente causa as proteínas carregadas

para se mover até que atinja o ponto

isoeléctrico

Pode discriminar: ~1500-2500 proteínas

Gel SDS-Page em 2D

18/02/2013

7

Marcação

• Coloração:• Prata

• Coomassie blue

• Corantes fluorescentes

• Sypro Ruby• $$$

• Maracação radioisotópica

Movie

http://www.childrenshospital.org/research/_proteomics/index.html

Amostra de peptídeo Identificação dos Peptídeos

MS-MS e Proteômica

Vantagens

• Fornece dados precisos e específico da sequência.

• Mais informativos do que métodos PMF (> 90%).

• Pode ser usado para seqüenciamento de-novo (não totalmente dependente da base de dados).

• Pode ser usado para identificação de modificações.

Prejuízos

• Requer manipulação e manuseio da amostra.

• Requer equipamento mais caro e complicado.

• Exige conhecimentos de alto nível.

• Mais lenta, não geralmente larga-escala.

Quantificação de proteínas

18/02/2013

8

Proteômica Quantitativa Moderno

• Isotope-coded affinity tag (ICAT):• Isótopos pesados ou leves e a cauda de biotina pode modificar peptídeos

contendo cisteína;

• Grupo Aebersold, aplicou esta tecnologia para células de Saccharomyces cerevisiae.

• Proteómica quantitativa é a identificação e quantificação precisa da expressão de proteína total num genoma ou um complexo sistema híbrido:• Detectar as alterações quantitativas nas proteínas.

Descoberta da Proteômica vs. Proteômica Refinada

• Discovery versus targeted proteomics

• Proteômica de descoberta:• Otimiza a identificação de proteínas por gastar mais tempo e esforço por

amostra e reduzir o número de amostras analisadas.

• Proteômica refinada:• Estratégias limita o número de recursos que serão monitorados;

• Otimizar os métodos de cromatografia de afinação e aquisição de alcançar a maior sensibilidade

• Rendimento para centenas ou milhares de amostras

Proteômica Quantitativo Relativo e Absoluto

• MS é inerentemente não quantitativo:• Diferenças na eficiência de ionização;

• Detecção de muitos peptídeos numa determinada amostra

• Provocou o desenvolvimento de métodos para determinar a abundância relativa e absoluta de proteínas em amostras.

• A intensidade de um pico de espectro de massa não é um bom indicador da quantidade de substância a analisar na amostra.

Proteômica Quantitativo Relativo

• Separadamente analisar amostras por MS e comparar o espectro para determinar a abundância de péptidos em uma amostra em relação a um outro:• Estratégias de etiqueta sem quantificação

• Amostras diferentially marcadas são combinados e analisados em conjunto, e as diferenças nas intensidades dos picos dos pares isotópicos refletem com precisão a diferença na abundância das proteínas correspondentes.

Proteômica QuantitativoRelativo

• SILAC• Stable isotope labeling with amino

acids in cell culture

• ICAT• Isotope-coded affinity tag

• ITRAQ• Isobaric tags for relative and

absolute quantitation

• Marcação enzimática

Proteômica Quantitativo Absoluto

• Selected reaction monitoring (SEM)• Monitoramento de reação selecionada.

• Íon de massa particular é seleccionado na primeira fase de MS-MS• Íon-percursor.

• O íon-produto da fragmentação do íon-precursor é seleccionado para a segunda fase MS para detecção.

• ESI-Quadrupolo triplo MS:• Peptídeos marcados pesados (Ex. D, 13C, or 15N) para formar a curva de

calibração;• Número de cópias por célula do peptídeo nativo leve, e, por extensão, a sua

proteína parental.

18/02/2013

9

Analise de Glicanos

Glicobiologia

• Glicanos N-ligados são extremamente importantes na dobragem de proteínas em células eucarióticas.

• Células tumorais fazer glicanos N-ligados que são anormais e são reconhecidos pelo receptor CD337 nas células NK.

• Glicanos O-ligados são importantes no desenvolvimento de microflora intestinal normal.

• Outro tipo de glicano celular é os glicosaminoglicanos:• Heparina

MS no Glicobiologia

• Predominantemente utilizado na glicobiologia para caracterização e elucidação das estruturas de glicano.

• É um método complementar de HPLC para a análise de glicanos.

• Glicanos intactas são detectadas directamente:• Íons carregados individualmente por MALDI-MS;

• Ou, seguindo permetilação ou peracetylation, por bombardeamento com átomos rápidos de espectrometria de massa (FAB-MS’.

• ESI-MS dá bons sinais para os glicanos menores

Modificações pós-traducionais (PTM)

PTM

• Amino ácido alvos para PTM.

Deteção de Fosfoserina

200 600 1000 1400

m/z

10

30

50

Rela

tive A

bundance 843.9794.7

257.9128.9 445.8686.4

1331.2

174.1559.0 1262.5758.1326.3 1061.6961.4

629.91459.81175.2 1430.1

[M+2H]2+ - 49

y8y7

y6y5

y4

y1

y9

y12y13

y14-H3PO4

y14y10

b1 b2

b3-phos

846.7

y11 y15-H3PO4

b-ions 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

NH- K E s* S N T D S A G A L G T L R -OH

y-ions 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

s* = phosphoserine

18/02/2013

10

Identificação de Patógenos

Identificação de Patógenos

• MALDI-MS para identificar proteínas produzidas por bactérias;

• Bancos de dados de espectros MALDI para identificar as bactérias;

• Neste ponto, não há grande base de dados consistente está disponível.

• Teste respiratório da uréia para identificar Helicobacter pylori• Pacientes engolher uréia marcado com um isótopo raro, ex. 13C;• detecção de CO2 marcado com 13C no ar expirado indica que a ureia foi

clivado, que indica a presença de urease do H. pylori;• 13C é detectado por razão isotopo MS.

Aplicações de GC-MS

• Monitoramento ambiental e limpeza

• Forense criminal

• Antidoping

• Segurança, ex. aeroportos

• Análise de alimentos, bebidas e perfumes

• Astroquímica

• Medicina

GC-MS

• Doenças metabólicas congênitas que afetam os níveis sanguíneos de ácidos orgânicos;

• Sistema de análise integrada GC-MS, que é possível testar um recém-nascido por mais de 100 desordens metabólicas genéticas.

Outras aplicações de MS

• Isótopo datação e rastreamento

• Análise de vestígios de gás

• O mapeamento da localização dos átomos individuais

• Farmacocinética

• Exploração espacial

Conclusões

• Proteômica é extremamente valioso para a compreensão de processos biológicos e avançar o campo da biologia de sistemas.

• O principal objetivo da biologia de sistemas é a integração de dados de estas observações em modelos que possam, eventualmente, representar e simular a fisiologia da célula.