Identificao de protenas

atravs de espectrometria de

massamassa

Proteomica

Durante o curso vimos que possvel realizar medidas de presena e abundancia de molculas de mRNA e deste modo realizar inferncias

sobre a presena de protenas que so os verdadeiros efetores da maioria

dos processos celulares.

Entretanto existem mecanismos ps-transcrionais que podem afetar o Entretanto existem mecanismos ps-transcrionais que podem afetar o nvel de protenas e que no so levados em conta quando medimos o

nvel de mRNAs

Os dados de mRNA do indicao de presena de uma protena, mas no do nenhuma informao sobre a localizao da protena dentro da celula.

Proteomica

Existem metodologias utilizando espectrometria de massa que permitem a identificao de seqncias proticas a partir da medida de sua massa

A conjuno desta metodologia com tcnicas de separao de protenas permitem o estudo do contedo protico de um organismo, constituindo

assim a chamada proteomicaassim a chamada proteomica

Tcnicas de fracionamento celular permitem que diferentes pores da clula sejam separadas e que seu contedo seja determinado

Proteomica

A separao de protenas pode ser

realizada atravs de mtodos

eletroforeticos ou cromatogrficos

Tratamento com proteases permitem

com que peptdeos de pequeno

tamanho sejam formadostamanho sejam formados

Analises com espectrometria de

massa permitem com que estes

peptdeos (e no a protena inteira)

sejam identificados

Eletroforese em duas dimenses

Protenas podem ser separadas pelo seu ponto isoeltrico atravs de um

procedimento inicial de isoeletrofocalizao e depois separados em uma segunda

dimenso pelo seu peso molecular atravs de SDS-PAGE

Eletroforese em duas dimenses

Exemplo de separao em eletroforese em duas dimenses.

Cada ponto representa uma diferente protena que possui PI e

peso molecular determinados

Analise de gis 2D

Programas de reconhecimento de imagem detectam os pontos presente no gel e realizam analises densitomtricas, permitindo a comparao

entre diferentes amostras

Espectrometria de massa

Molculas dos peptdeos so ionizadas utilizando

diferentes mtodos

Molculas ionizadas so aceleradas e diferentes aceleradas e diferentes

mtodos

espectrometricos podem

ser utilizados para

medida da sua massa

Espectrometria de massa

Cada peptdeo gerar diversos picos devido a presena de istopos na

molcula. De modo geral, considera-se a massa monoisotopica como medida

da massa da molcula para analises posteriores

Espectrometria de massa

No entanto para molculas muito grandes muito difcil detectar molculas com a

massa isotopica e por isso a massa mdia passa a ser considerada

Analise de dados de MS

0

20

40

60

80

100

m/z

%T

IC

0

20

40

60

80

100

m/z

%T

IC

MRNSYRFLASSL

SVVVSLLLIPED

VCEKIIGGNEVT

PHSRPYMVLLSL

DRKTICAGALIA

KDWVLTAAHCNL

NKRSQVILGAHS

ITYEEPTKQIML

VKKEFPYPCYDP

ATREGDLKLLQL

LASSLSVVVSLLLIPEDVCEK

IIGGNEVTPHSR

PYMVLLSLDR

TICAGALIAK

DWVLTAAHCNLNKR

ITTTYEEPTK

QIMLVK

EFPYPCYDPATR

A partir dos dados experimentais das massas detectadas para os peptdeos possvel realizar analises comparando o espectro obtido com

os espectros tericos de protenas depositadas em bancos de dados

Apesar deste tipo de analise se til na identificao de protenas ainda podem existir casos muito ambiguos

m/zEGDLKLL

Espectroscopia MS/MS

A espectrometria MS/MS permite a aquisio de maiores informaes sobre o

peptdeo pois inclui uma etapa adicional de coliso do fragmento que permite a

deteco de novos fragmentos formados a partir deste primeiro

Espectroscopia MS/MS

a fragmentao dos peptdeos tende a ocorrer na ligao peptdica fazendo que se formem ons das series b e y.

Espectroscopia MS/MS

Realiza seleo de

fragmento de tamanho

desejado

Cmara de coliso Deteco de fragmento

formados

Espectroscopia MS/MS

Espectro inicial de massa passa a ter

espectros associados

ao resultado da

fragmentao do on

detectadodetectado

Espectro de fragmentao permite seqenciamento do peptdeo

Seqncia obtida muito curta para atribuio de funo- necessidade de

comparao com bases de protenas

Shotgun proteomics

Abordagem que realiza uma tripsinizao de todas as protenas de um extrato protico e realiza posterior separao dos peptdeos gerados

atravs de tcnicas cromatogrficas

Tcnica muito mais simples que separao por eletroforese 2D, mas fornece menos informaes sobre a protena

Busca em banco de dados

Uma analise em larga escala do proteoma de um organismo pode gerar entre centenas e milhares de espectros de massa.

Deste modo so necessrias ferramentas que permitam a interpretao e integrao destes dados

Programas do espectrmetro de massa j analisam o espectro e fornecem uma lista de valores que correspondem a massa apurada para cada on

Programas adicionais iro utilizar estas listas para procurar padres semelhantes em bancos de espectros tericos formados a partir de

bancos de dados de protenas

Programa de busca em bases de dados a partir de um

conjunto de espectros de massa(verso web somente em

bases de dados predefinidas, verso local (Paga) tem

possibilidade de utilizar bases prprias)

MASCOT

Fornece escores de modo que possvel realizar uma

avaliao da significncia do resultado

Permite a integrao de dados em casos de buscas em

experimento de shotgun proteomics

MASCOT

Modificaes existentes

Banco de dados a ser

procurado

Modificaes existentes

nos aminocidos

Taxa de tolerncia de erro

MASCOT

Grfico de escore indica a probabilidade de que as protenas identificadas no so um

evento randmico na seo hachurada

MASCOT

Resultado apresenta todos os espectros que podem ser associados a um peptdeo da sequencia descrita

MASCOT

Seqncias em preto so aquelas que tem um rank maior que 1. Isto existe um peptdeo diferente no banco de dados que possui um escore

melhor em relao a esse espectro do que o mostrado aqui. Deste modo,

improvvel que este predio esteja correta