Apostila Biomedicina2015

8/15/2019 Apostila Biomedicina2015

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UNESP - INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA

CURSO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS- 2º ANO

ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS

- 2015-



LEMBRETES IMPORTANTES

1. Não deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos práticos sãorealizados.

2. Não fume e não coma no laboratório. Evite levar à boca qualquer obeto !lápis"rótulo" etc.#.

$. Não use frascos do laboratório para tomar á%ua.

&. 'omunique imediatamente aos instrutores qualquer acidente !derramamentode culturas sobre a mesa ou assoalho" ferimentos de qualquer esp(cie"aspira)*es de culturas na boca" etc#.

+. 'oloque sempre nos recipientes indicados o material contaminado.

,. -ave bem as mãos com desinfetante antes de deixar o laboratório.

. /ntes de iniciar suas atividades e depois de terminá0las" limpe" comdesinfetante" o seu local de trabalho.

. urante a perman3ncia no laboratório de aulas práticas ( necessário o uso deavental.

MATERIAIS E INSTRUMENTOS COMUMENTE UTILIZADOS NAS AULAS PRÁTICAS DE

MICROBIOLOGIA 1. /l)a e a%ulha de platina2. 4eios de cultura$. 5lacas de 5etri e tubos de ensaio&. 5ipeta 5asteur +. 4icroscópio,. -6minas de vidro. Estufa e banho0maria. /utoclave e 7orno 5asteur

CUIDADOS PARA SE EVITAR CONTAMINAÇÃO DE CULTURAS

1. / al)a e a%ulha de platina devem ser flambadas" isto (" aquecidas na chama dobico de 8unsen at( se tornarem vermelhas" antes e depois de qualquer opera)ão de semeadura. / flamba%em ( mais facilmente conse%uidamantendo0se a a%ulha ou al)a num 6n%ulo de &+9 em rela)ão à mesa detrabalho. /ntes da coleta do material" deve0se resfriar o instrumento" na parededo tubo" no próprio meio est(ril" ou simplesmente a%uardando o seudesaquecimento natural por al%uns se%undos.

2. :elativamente às semeaduras procedidas em tubos de ensaio" exi%e0sefl b b d ó ti d t d l ã d t ã

2



de al%odão. ; tampão de al%odão deve ser se%urado pelo dedo m<nimo damão direita e nunca deixado sobre a mesa de trabalho.

$. /s pipetas são previamente esterilizadas e embrulhadas em papel. 5ara suautiliza)ão e ao mesmo tempo evitar que se contaminem" deve0se torcer o papelna re%ião central da pipeta" retirar primeiramente a parte superior do papel edepois a inferior !ponta da pipeta#. epois de utilizada" a pipeta deverá ser colocada dentro de um recipiente de vidro" contendo solu)ão de desinfetante.

&. =odo recipiente !placas de 5etri ou tubos de ensaio# com cultura ou meio est(rildeverá ser manuseado com cuidado de modo a não ficarem abertos e expostosao ambiente. 'om esta medida e mais a exi%3ncia de abri0los somentepróximo ao bico de 8unsen em tempo suficiente para a semeadura" colheita domaterial ou simples inspe)ão" será evitada a sua contamina)ão por micror%anismos do ar. >ma vez semeados" devem ser incubados em estufa.

/s placas de 5etri devem ser colocadas na estufa com as tampas voltadas

para baixo.

OBSERVAÇÃO DE LÂMINAS AO MICROSCPIO

Nos exerc<cios de bacterioscopia" as l6minas contendo esfre%a)os de materialfixado e corado sempre serão observadas atrav(s de obetiva de imersão. /pós aobserva)ão da l6mina" esta deverá ser colocada em recipiente com deter%ente"especificamente destinado a este fim. epois de utilizados" os microscópios

deverão ser limpos e devidamente acondicionados.

$



acteriologia Geral

MOR!OLOGIA E COLORAÇÃO DAS BACTÉRIAS

I - Morfologia

1. /s bact(rias de um modo %eral" apresentam0se sob a forma de?a# cocos? c(lulas esf(ricasb# bacilos? c(lulas cil<ndricas" em formas de bastonetesc) espirilos? c(lulas espiraladasd) vibri*es

Estas formas básicas estão sueitas a varia)*es" caso em que são denominadas de formaspleomórficas ou formas de involu)ão.

2. /%rupamentos

@e%undo o !s# plano !s# de divisão celular e a disposi)ão das c(lulas entre si" as bact(riaspodem apresentar0se em a%rupamentos?a# diplococosb# estafilococosc# estreptococosd# estreptobacilos

II - Coloração

1. Coloração de Gram

Este m(todo de colora)ão permite a classifica)ão das bact(rias em dois %randes %rupos?Aram positivas e Aram ne%ativas?

Gram positivas? são bact(rias que não se deixam descorar quando submetidas à a)ão desolventes or%6nicos !álcool" (ter" etc.# e permanecem com a cor do cristal violeta.

8act(rias Aram positivas → cor azul

Gram negativas? @ão" portanto" aquelas que se deixam descorar pelo solvente or%6nicotomando a cor do corante de contraste !safranina ou fucsina#.

8act(rias Aram ne%ativas → cor vermelha2. Coloração de Ziehl-Neelsen

'onstitui um m(todo espec<fico para a colora)ão das micobact(rias !ex.? bacilo de Bansen ebacilo da tuberculose#. =ais bact(rias se caracterizam por resistirem à descolora)ão por umamistura de álcool0ácido clor<drico" depois de tratadas com fucsina fenicada e azul demetileno" permanecendo com a cor da primeiro corante. 5or apresentarem estapropriedade" estas bact(rias são denominadas bacilos álcool ácido resistentes !8//:#.

8././.: → cor vermelha

&



ECE:'D';@

A) Coloração de Bactérias pelo Método de Gram

Material

0 'ulturas /"8"'" e E.0 -6minas bem limpas0 /l)a de platina0 @olu)ão fisioló%ica0 8ateria de Aram? violeta %enciana" lu%ol" álcool" fucsina

écnica

1. 'om o aux<lio da al)a de platina" fazer esfre%a)os bem finos sobre a l6mina de microscopia.Esperar secar.

2. 7ixar os esfre%a)os" passando a l6mina tr3s vezes sobre a chama do bico de 8unsen.$. eixar a l6mina esfriar e cobrir os esfre%a)os com a solu)ão de violeta %enciana. Esperar 1

minuto.&. Escorrer a violeta %enciana e cobrir os esfre%a)os com lu%ol. Esperar 1 minuto.+. Escorrer o lu%ol e descorar os esfre%a)os pelo álcool. 5ara isto" deixe o álcool cair" %ota a

%ota" sobre a l6mina" mantendo0a inclinada. 'onsiderar os esfre%a)os suficientementedescorados quando o álcool não mais retirar o corante dos mesmos.

,. -avar a l6mina em á%ua corrente.. 'obrir os esfre%a)os com a solu)ão de fucsina" esperar de $F se%undos a 1 minuto.. -avar a l6mina em á%ua corrente. @ecar com aux<lio de papel de filtro.G. ;bservar ao microscópio e desenhar.

Lâmina A

4orfolo%iaHHHHHHHHHHHH 'olora)ãoHHHHHHHHHHHH /%rupamento HHHHHHHHHHH

Lâmina B Lâmina C

4orfolo%iaHHHHHHHHHHHH 4orfolo%iaHHHHHHHHHHHH

'olora)ãoHHHHHHHHHHHH 'olora)ãoHHHHHHHHHHHH /%rupamentoHHHHHHHHHH /%rupamentoHHHHHHHHHH

+



-6mina -6mina E

4orfolo%iaHHHHHHHHHHHH 4orfolo%iaHHHHHHHHHHHH 'olora)ãoHHHHHHHHHHHH 'olora)ãoHHHHHHHHHHHH /%rupamentoHHHHHHHHHH /%rupamentoHHHHHHHHHH

8# Coloração de Bactérias pelo Método de Ziehl-Neelsen

Material

0 -6mina de microscopia contendo esfre%a)o de escarro 0 8ateria de Iiehl0Neelsen? fucsina fenicada" álcool0ácido e azul de metileno.

écnica

l. 'obrir a l6mina com fucsina fenicada. 'om aux<lio do bico de 8unsen" aquecer a prepara)ãoat( a emissão de vapores. 4anter o aquecimento durante + minutos. Não deixar a fucsina

ferver ou secar.2. Escorrer a fucsina e descorar completamente pelo álcool0ácido.$. -avar em á%ua corrente.&. 'obrir o esfre%a)o com a solu)ão de azul de metileno. Esperar entre $F se%undos a 1

minuto.+. -avar em á%ua corrente e secar com papel de filtro.6. ;bservar ao microscópio e desenhar.

,



ESTRUTURAS DA CÉLULA BACTERIANA

a# !str"t"ras e#ternas• 7la%elos• 7<mbrias ou pili

• 'ápsula• 5arede celular • 4embrana citoplasmática

b# !str"t"ras internas• Esporo• 4esossomos• :ibossomos• 'romossomos• Ar6nulos de reserva• 5lasm<dios

ECE:'D';

$emonstração de alg"mas estr"t"ras da cél"la bacteriana.

;bservar l6minas previamente preparadas das se%uintes estruturas da c(lula bacteriana?parede celular" cápsula e esporos. esenhar.

'ápsula Esporos

MEIOS DE CULTURA E CONDIÇ"ES !#SICAS DE CULTIVO BACTERIANO

/# Meios de C"lt"ra5ara o cultivo e identifica)ão das bact(rias são utilizadas solu)*es e subst6ncias nutritivas"denominadas meios de c"lt"ra que podem ser classificados com base na sua constitui)ão" ousea" quanto às subst6ncias nutritivas que os comp*em" quanto ao seu estado f<sico e quanto àcapacidade seletiva e diferencial que apresentam.

%"anto &s '"bst(ncias N"tritivas)1. Meios 'intéticos) quando as subst6ncias que os comp*em são qu<micamente definidas e a

concentra)ão e caracter<sticas de cada in%rediente são conhecidas com exatidão.2. Meios 'imples) quando constitu<dos somente de subst6ncias essenciais para o crescimento

de al%umas bact(rias.$. Meios Comple#os) quando se adicionam ao meio simples" subst6ncias or%6nicas complexas.



%"anto ao !stado *+sico?1. 4eios -<quidos? tamb(m denominados caldos.2. 4eios @ólidos? quando se adiciona ao caldo l"+J a 2J de á%ar.$. 4eios @emi0sólidos? quando se adiciona á%ar ao caldo" na concentra)ão i%ual ou menor que

F"+J.

%"anto & capacidade seletiva e di,erencial)1. Meios !nri"ecidos) são meios simples adicionados de certas subst6ncias como soro"

san%ue" extrato de levedura" etc. Estes meios servem para o cultivo de bact(rias quenecessitam de substratos complexos. Ex? meios de á%ar san%ue" de á%ar chocolate" de á%ar soro" etc.

2. Meios 'eletivos) são meios de cultura contendo subst6ncias que impedem o crescimento decertas bact(rias sem inibir o crescimento de outras. Ex? 4eios de 4ac'onKeL" de=etrationato" de Merde 8rilhante" etc.

$. Meios $i,erenciais) são aqueles que cont3m subst6ncias que" quando utilizadas" indicamcertas caracter<sticas da bact(ria. Ex? a# ; san%ue quando adicionado ao meio de cultura"indica se uma bact(ria ( hemol<tica ou não. Nesse caso" o meio al(m de enriquecido (tamb(m diferencial. Ex? meio de á%ar0san%ue. b# / lactose quando adicionada ao meio

untamente com um indicador de pB" permite distin%uir as bact(rias que fermentam essea)car das que não o fermentam. Ex? meio de 4ac'onKeL.&. Meios de !nri"ecimento) são aqueles que inibem o crescimento de certas bact(rias" por(m

favorecem o crescimento de outras. Ex? meios de tetrationato e de selenito permitem maior crescimento de bact(rias do %3nero 'almonella.

+. /l(m desses" existem outros meios de cultura" como por exemplo meios para conserva)ãode bact(rias" meios para a conta%em do nmero de bact(rias" etc.

8# Condiçes *+sicas de C"ltivo /l(m do meio de cultura" outros fatores devem ser levados em considera)ão para o cultivo debact(rias" tais como?1. p/ do meio de c"lt"ra) deve ser %eralmente em torno de .

2. =emperatura de crescimento? %eralmente $9'Ouando as bact(rias crescem em temperaturas baixas !1F a 2F9'# são denominadas depsicrófilas.Ouando as bact(rias crescem em temperaturas m(dias !2F a &F9'# são denominadas demesófilas.Ouando as bact(rias crescem em temperaturas mais altas !+F a ,F9'# são denominadastermófilas.

$. =eor de ;xi%3nio?a# Bactérias aer0bias estritas) são aquelas que só crescem na presen)a de oxi%3nio.b# Bactérias anaer0bias estritas? crescem somente na aus3ncia de oxi%3nio.c# Bactérias anaer0bias ,ac"ltativas) crescem tanto na presen)a como na aus3ncia de oxi%3nio.d# Bactérias microaer0,ilas? crescem somente em atmosfera com baixo teor de oxi%3nio.

ECE:'D';@ /# Necessidades n"tritivas de alg"mas bactériasMaterial 0 'ultura /0 'ultura 80 'ultura '0 'aldo sint(tico0 'aldo comum0 'aldo %licosado !caldo comum mais %licose#0 /l)a de platina

écnical. @emear cada uma das $ culturas bacterianas nos diferentes meios.2. eixar na estufa a $9' at( o dia se%uinte.



&. /notar os resultados.

'ultura 'rescimento emcaldo sint(tico caldo comum caldo %licosado

/8

'

8# $ependncia do o#ignio para o crescimento bacterianoMaterial

0 4eio de =io%el0 'aldo simples0 'ulturas /" e 70 5ipeta 5asteur 0 /l)a de platina

écnica

'om a pipeta 5asteur" semear cada uma das culturas em tubos de tio%el. Em se%uida" semear a cultura 7" com al)a de platina" em caldo simples. 'olocar todos os tubos na estufa. No diase%uinte" observar os tubos" verificando" no meio de tio%el" a localiza)ão do crescimento e" nocaldo simples" se houve ou não crescimento.

'ulturas 'rescimento -ocal de crescimento no meio de tio%el no caldo simples @uperf<cie =oda extensão do 4eio 8ase do 4eio

/7

ALGUMAS ATIVIDADES BIO$U#MICAS DAS BACTÉRIAS % MOVIMENTO BACTERIANO

epois de estudarmos a forma" colora)ão" necessidades nutritivas e outrascaracter<sticas !temperatura ótima de crescimento" rela)ão com o oxi%3nio" etc.# de umabact(ria" torna0se necessário conhecer as suas atividades bioqu<micas para que possamosdeterminar a fam<lia" %3nero ou esp(cie da bact(ria em estudo. ;s m(todos utilizados paraeste fim são qualitativos e variam de acordo com o tipo de atividade que se pretende pesquisar.Estudaremos aqui al%uns dos m(todos de interesse %eral" deixando para o momento oportuno

aqueles espec<ficos para determinados %rupos de bact(rias.e modo %eral" quando estudamos as atividades bioqu<micas de uma bact(ria"procuramos verificar" tamb(m" se ela ( móvel ou imóvel" o que podemos fazer pela observa)ãodo seu tipo de crescimento em á%ar semi0sólido. Pá vimos que o movimento da maioria dasbact(rias depende de seus fla%elos" e a verifica)ão da presen)a destas estruturas"indiretamente feita pela prova de motilidade" ( bastante importante para a sua identifica)ão.

E&ERC#CIOS

/# 2es"isa da Catalase

2rinc+pio

/ catalase ( uma enzima produzida por certas bact(rias" que desdobra a á%ua oxi%enada!B2;2# em á%ua !B2;# e oxi%3nio !;2#. 5ara pesquisá0la" basta colocar al%umas %otas de á%ua

G



oxi%enada sobre a cultura. Estando a catalase presente" haverá o desprendimento de bolhas"indicando a presen)a de oxi%3nio no meio.

Material

0 'ultura / em caldo0 'ultura 8 em caldo0 Q%ua oxi%enada a lFJ

écnica

'olocar na cultura / al%umas %otas de á%ua oxi%enada e verificar se há ou não aparecimentode bolhas . /notar os resultados e fazer o mesmo com a cultura 8.

'ultura / 'ultura 8'atalaseA3nero

B3 2es"isa de Citocromo-o#idase

2rinc+pio

/ citocromo0oxidase ( a enzima que oxida o citocromo '. / presen)a do citocromo ' (demonstrada tratando0se a cultura com uma solu)ão de p0fenileno0diamina. Ouando presente"a p0fenileno0diamina ( oxidada e há o sur%imento de cor vermelha que muda %radativamentepara azul" pelo contato com a luz. Ouando ausente" a cor do crescimento não se altera.

Material

0 'ultura ' em á%ar inclinado0 'ultura em á%ar inclinado0 5apel de filtro0 p0fenileno0diamina !solu)ão aquosa a 1J#0 al)a de platina

écnica

1.'om a al)a de platina" retire um pouco do crescimento da cultura ' e coloque sobre o papelde filtro. 7a)a o mesmo com a cultura " em outro ponto do papel.

2.'oloque uma %ota da solu)ão de p0fenileno0diamina em cada uma das culturas$.;bserve a ocorr3ncia de varia)ão de cor nas duas culturas. ; aparecimento da cor vermelha

indica a presen)a de citocromo0oxidase.

'ultura ' 'ultura ;xidaseA3nero

c3 2es"isa do Movimento Bacteriano 4prova de motilidade3

2rinc+pio

1F



/s bact(rias fla%eladas crescem al(m do ponto de inóculo !RpicadaS#" quando semeadas emá%ar semi0sólido com uma a%ulha de platina. /s bact(rias que não possuem fla%elos crescemapenas no ponto de inóculo.

Material

0 =ubo com á%ar semi0sólido0 'ultura '0 'ultura 70 /%ulha de platina

écnica

1. nocular" por RpicadaS" as culturas ' e 7 !uma em cada tubo de á%ar semi0sólido#.2. ncubar a $9' at( o dia se%uinte.$. ;bservar o crescimento.:esultado positivo 0 crescimento bacteriano al(m do ponto de inóculo

ne%ativo 0 crescimento bacteriano apenas no ponto de inóculo

&. /note os resultados.4otilidade %3nero

'ultura ''ultura 7

CONTROLE DE POPULAÇ"ES BACTERIANAS

I - A'() *)+ ,%./%+ +3)+ +)4% ,+ 4,3/6,+; calor e várias formas de radia)ão" bem como outros processos f<sicos" são frequentemente

utilizados com a finalidade de destruir bact(rias e outros micror%anismos. Merificaremos a a)ãodo calor mido sobre duas bact(rias" uma esporulada e outra não esporulada.

ECE:'D';@ 53 5ção da temperat"ra6 em ,"nção do tempo6 sobre c"lt"ra bacteriana não espor"lada

Material 0 'ultura / em á%ar inclinado !bact(ria não esporulada#0 =ubo contendo 1 ml da solu)ão salina esterilizada0 5laca de 5etri contendo á%ar nutriente0 8anho04aria a ,F9 '0 /l)a de 5latina

écnica1. ivida a placa de á%ar nutriente em & quadrantes" anotando diferentes per<odos de tempo

em cada um? FT" 1FT" 2FT e $FT.2. 'oletar com a al)a de platina" um pouco do crescimento da cultura / e passar para o tubo

contendo solu)ão salina. Bomo%eneizar a suspensão.$. nocule !com al)a de platina# a suspensão no quadrante correspondente ao tempo FT.&. 'oloque o tubo com a suspensão em banho0maria a ,F9 ' e" aos 1FU" 2FU e $FU" retire

amostras" inoculando0as nos respectivos quadrantes da placa de 5etri !proceda exatamentecomo no item 2#.

+. eixe a placa na estufa at( o dia se%uinte.6. ;bserve a varia)ão quantitativa de crescimento nos quadrantes em fun)ão do tempo de

aquecimento da cultura e anote os resultados !de V a VVVV" conforme a intensidade decrescimento#

11



1. ivida a placa de á%ar nutriente em duas partes.2. >mede)a uma zara%atoa em solu)ão salina e esfre%ue0a vi%orosamente no dorso de uma

das mãos" numa extensão de aproximadamente & cm2. nocule" a se%uir" numa dasmetades da placa de á%ar nutriente.

$. >mede)a uma outra zara%atoa com o antiss(ptico e esfre%ue0a no dorso da outra mão" emárea semelhante.

&. Espere + minutos para que haa a)ão do antiss(ptico e seca%em da superf<cie. 5asseentão" nessa área" uma terceira zara%atoa umedecida com salina" tomando cuidado paranão atin%ir a área não tratada. nocule a outra metade da placa de á%ar.

+. eixe a placa na estufa" a $o '" at( o dia se%uinte.,. -eia os resultados" anotando a varia)ão quantitativa de crescimento !V a VVVV#" em fun)ão

da presen)a do antiss(ptico utilizado.

=ratamento@em antiss(ptico 'om antiss(ptico

DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS

/pós o isolamento de uma bact(ria de um processo infeccioso" ( deseável em al%unscasos" conhecer a sua sensibilidade ou resist3ncia a vários antibióticos e quimioterápicos. stose conse%ue com o empre%o de vários m(todos" sendo que o m(todo do disco de papel defiltro impre%nado com solu)ão da dro%a !4(todo de 8auer e WirbL# ( o mais amplamenteutilizado.

ECE:'D';

5ntibiograma pelo Método de Ba"er e :irb;

Material

0 'ultura 8 em caldo 8B !Brain /eart <n,"sion#? cinco colXnias da cultura 8 foram semeadasem caldo 8B e incubadas a $o ' durante & horas.

0 5laca de 5etri contendo meio de 4ueller0Binton0 iscos de papel de filtro impre%nado com solu)*es de dro%as antimicrobianas0 Iara%atoa0 /%ulha est(ril0 Escala F"+ de 4ac7arland0 @olu)ão salina est(ril0 5ipeta est(ril

0 :(%ua

écnica

1. =ransferir" com a pipeta" o crescimento da cultura 8 para o tubo contendo solu)ão salina"austando a concentra)ão de bact(rias" conforme a escala F"+ de 4ac7arland. ; auste deconcentra)ão ( feito por compara)ão da turbidez da cultura com a do tubo da escala.

2. >medecer a zara%atoa neste crescimento de concentra)ão padronizadaY es%otar o excessode cultura na parede do tubo e inocular uniformemente em toda a superf<cie da placa de5etri contendo o meio de 4Zeller0Binton.

$. Esperar secar.&. 'olocar" sobre a superf<cie do á%ar" com o aux<lio de uma a%ulha est(ril" os discos de papel

de filtro impre%nados com as dro%as. / disposi)ão dos discos deve obedecer o esquema dafi%ura abaixo

+ 'olocar a placa de 5etri na estufa a $9 ' at( o dia se%uinte

1$



. 'onsultar a tabela de refer3ncia" fornecida pelo instrutor" para interpretar os resultados eanotar no quadro da pá%ina se%uinte.

1

& + $

2

ro%a 'oncentra)ão!"%[ml#

i6metro do halo deinibi)ão do crescimento

nterpreta)ão\

12$&+

\ @ ] @ens<velY : ] :esistenteY ] ntermediário

STAPHYLOCOCCUS

ECE:'D';@

53 =bservar placas de ágar sang"e semeadas com as c"lt"ras 5 e B. $escrever ascaracter+sticas das col>nias e veri,icar hem0lise.

'ultura 'aracter<sticas das 'olXnias Bemólise

/

8

B3 Corar6 pelo método de Gram6 es,regaços das c"lt"ras 5 e B 4ver ?Mor,ologia e coloração da

bactérias@6 página 13. ;bservar ao microscópio e desenhar.

1&



'ultura / 'ultura 8C3 2rova da Catalase

Colocar sobre as culturas A e B algumas gotas de água oxigenada. Observar a reação e anotar osresultados. Obs.! ver t"cnica na #ágina $%)

'ultura 5rova da 'atalase

/8

$3 2rova da Coag"lase

2rinc+pio

/ coa%ulase ( uma enzima" produzida por certas bact(rias" que coa%ula o plasma san%u<neo.

écnica

4isturar F"+ ml da cultura / com F"2+ ml de plasma citratado de san%ue de coelho a 1J.ncubar a $o' e observar durante & horas. 7azer o mesmo com a cultura 8 e anotar osresultados.

:esultado positivo 0 forma)ão de coá%ulo. ne%ativo 0 suspensão inalterada

'ultura 5rova da 'oa%ulase /8

!3 2rova da $N5se

2rinc+pio

/ N/se ( uma enzima" produzida por certas bact(rias" que hidroliza o N/. 5ara pesquisá0la" basta colocar ácido clor<drico !B'l# sobre as colXnias a serem testadas. ; B'l precipita oN/ contido na cultura" turvando o meio. @e a bact(ria produzir N/se" haverá hidrólise deN/ e consequentemente não turva)ão do meio de cultura" pois o B'l não precipita N/hidrolizado.

écnica

Merter ácido clor<drico 1N sobre a placa semeada com a cultura / e sobre a placa com a cultura8 M ifi i t d h l l d d lX i

1+



:esultado?positivo? aparecimento de halo claro ao redor das colXnias.ne%ativo? turva)ão do meio.

'ultura 5rova da N/se

/8

*3 <denti,icação das c"lt"ras

'ultura /'ultura 8

E@O>E4/ E EN=7'/^_; ;@ A`NE:;@

'taph;lococc"s e Micrococc"s !fam<lia Micrococaceae#

'ocos Aram positivossolados ou a%rupados

'atalase V

O O!

Micrococc"s sp 'taph;lococc"s sp

'oa%ulase

!V# N/se !0#

'. a"re"s '. coa%ulase ne%ativa

1,



STREPTOCOCCUS

ECE:'D';@

53=bservar placas de ágar sang"e semeadas com as c"lt"ras C6 $ e !. $escrever ascaracter+sticas das col>nias e veri,icar hem0lise.

'ultura 'aracter<sticas das 'olXnias Bemólise'E

B3 Corar6 pelo método de Gram6 es,regaços das c"lt"ras C6 $ e !6 observar ao microsc0pio edesenhar.

'ultura ' 'ultura 'ultura E

C3 2rova da catalase.

'olocar sobre a cultura ' !em caldo# al%umas %otas de á%ua oxi%enada. Merificar a rea)ãoe anotar o resultado. 7azer o mesmo com as culturas e E.

'ultura 'atalase'E

$3 2rova da sensibilidade a opto"ina2rinc+pio) Esta prova verifica a sensibilidade das bact(rias / e E à optquina !etil0hidrocupre<na hidroclor<drica#écnica) /dicionar um disco contendo a substancia em uma placa de /%ar san%ue semeadocom as bact(rias aserem testados. ncubar a $o ' e examinar após 2& horas. /notar oresultado. 7azer o mesmo com a cultura E.

Aeit"ra. :esultado positivo !suspensão solvel#0a cultura fica transparente. ne%ativo !suspensão insolvel#0 a cultura permanece turva.

'ultura ;ptoquinaE

1



E) <denti,icação das c"lt"ras

'ultura ''ultura 'ultura E

*3 2rova de sensibilidade & bacitracina.

2rinc+pio) ; princ<pio desta prova baseia0se na inibi)ão de crescimento do 'taph;lococc"s p;ogenes !β0hemol<tico" %rupo /# frente a uma pequena quantidade de bacitracina.écnica) Merificar se ocorre uma zona de inibi)ão de crescimento ao redor do disco de papelde filtro contendo bacitracina" colocado sobre a cultura '.Aeit"ra) sens<vel? exist3ncia de uma zona de inibi)ão do crescimento.resistente? aus3ncia de zona de inibi)ão de crescimento.

G3 C5M2 este

2rinc+pio) / atividade da hemolisina β do '. a"re"s ( aumentada pela atividade hemol<tica do'. agalactiae !β0hemol<tico do %rupo 8#.écnica) Merificar zona de hemólise" em placa de á%ar san%ue !feito c[ san%ue de carneiro#"semeada com '. agalactiae e '. a"re"s.Aeit"ra) resultado 0 positivo? forma)ão de uma zona de hemólise semelhante à ponta de

flecha na união das duas hemolisinas.ne%ativo? não forma)ão de ponta de flecha.

1



E@O>E4/ E EN=7'/^_;7am<lia? 'treptococcaceae

A3nero? 'treptococc"s!cocos Aram positivos aos pares ou em cadeia#

'atalase !0#

=ipo de hemólise

α β γ

;ptoquina 8ilisolubilidade -etalidade em camundon%os 8acitracina

@ : !V# !0# !V# ! 0# @ :

'. pne"moniae '. α0hemol<tico '. pne"moniae '. α0hemol<tico '. pne"moniae '. α0hemol<tico '. p;ogenes !%r./# 'treptococc"s !quaisquer dos %rupos de -ancefield"

exceto o /#@ ] sens<velY : ] resistente

provas soroló%icas!%rupos de -ancefield#

1G



NEISSERIA

ECE:'D';@

53 =bservar6 ao microsc0pio6 es,regaço de secreção "retral6 corado pelo método de Gram edesenhar.

B3 Crescimento em ágar-simplesMerificar a diferen)a de crescimento" em meio de á%ar simples" entre Neisseria sp e N.meningitidis. /notar o resultado.

'ultura 'rescimento em á%ar simples

Neisseria sp

N: 9%../*+

C3este de Citocromo-o#idase

7azer o teste da citocromo0oxidase com uma das culturas de Neisseria e com a cultura de!scherichia coli. !ver princ<pio e t(cnica do teste na pá%ina 11#. /notar os resultados.

'ultura 5rova da citocromo0oxidaseNeisseria sp

!scherichia coli

2F



E@O>E4/ E EN=7'/^_;7am<lia? Neisseriaceae

A3nero? Neisseria!diplococos Aram ne%ativos#citocromo0oxidase positivos

'rescimento em á%ar simples

!V# !0# N. sicca e outras esp(cies

não pato%3nicas de Neisseria fermenta)ão da maltose

!V# !0#

N. meningitidis N. gonorrhoeae

:ea)*es soroló%icas

dentifica)ão do sorotipo

21



PSEUDOMONAS

ECE:'D';@

53 =bservar placa de ágar sang"e semeada com 5seudomonas aeru%inosa.$escrever as caracter+sticas das col>nias e veri,icar hem0lise. =bservar6 também6 a pigmentação verde do crescimento em ágar simples "ma caracter+stica pec"liar da espécie.

'ultura 'aracter<stica das colXnias

2. aer"ginosa

B3 Corar6 pelo método de Gram6 es,regaço da c"lt"ra de 2se"domonas aer"ginosa. =bservar ao microsc0pio e desenhar.

2se"domonas aer"ginosa

C3 2rova da Citrocromo-o#idase

7azer prova da citocromo0oxidase com a cultura de 2. aer"ginosa e com uma cultura de!scherichia coli " para fins de compara)ão. /notar o resultado.

'ultura 5rova de citocromo0oxidase

2. aer"ginosa

!scherichia coli

22



iferencia)ão entre as fam<lias !nterobacteriaceae e 2se"domonadaceae

8acilos Aram ne%ativos

;7 ;

citocromo0oxidase ne%ativos citocromo0oxidase positivos

!nterobacteriaceae 2se"domonadaceae

%3nero 2se"domonas

!produ)ão de pi%mento#

provas bioqu<micas paraidentifica)ão de esp(cies

2$



ENTEROBACTÉRIAS

/s enterobact(rias são bacilos Aram ne%ativos morfolo%icamente indistin%u<veis entre sie pertencentes à fam<lia !nterobacteriaceae. 'ompreendem vários %3neros e esp(cies"al%umas das quais divididas em tipos soroló%icos ou sorotipos.

/s enterobact(rias são citocromo0oxidase ne%ativas" fermentam a %licose" reduzemnitrato a nitrito" crescem bem nos meios de cultura comuns e" quando móveis" possuemfla%elos peritr<quios. / identifica)ão de %3neros dentro da fam<lia ( feita atrav(s de uma s(riede provas bioqu<micas e atrav(s do teste de motilidade !ver pá%inas 1F a 1#. /l%umas provassão especialmente teis para a diferencia)ão de al%uns %3neros" como por exemplo" a provade urease e da fenilalanina para os %3neros 2rote"s6 Morganella e 2rovidencia.

/ssim como para a maioria dos micror%anismos pato%3nicos" a identifica)ão a n<vel deesp(cie de uma enterobact(ria nem sempre satisfaz ao cl<nico e ao epidemiolo%ista. 5or exemplo" quando isolamos um colibacilo das fezes de um rec(m0nascido com diarr(ia" não (suficiente dizer que se trata de uma !scherichia coli mas" devemos proceder a identifica)ão an<vel intraespec<fico porque nem todos os colibacilos são diarrea%3nicos. o mesmo modo" aidentifica)ão de um sorotipo de 'almonella pode ser indispensável ao trabalho de um

epidemiolo%ista que estuda infec)*es ent(ricas. este modo" a identifica)ão da esp(cie deveser complementada com m(todos soroló%icos para caracteriza)ão da cepa" a fim de se ter umaid(ia de seu potencial de pato%enicidade.

/ identifica)ão soroló%ica pode ser aplicada a qualquer esp(cie de enterobact(ria mas"na prática" ( feita para !scherichia coli6 'higella6 'almonella e ersinia enterocolitica. /sorolo%ia baseia0se na detec)ão de varia)*es anti%3nicas de al%uns constituintes bacterianoscomo o ant<%eno capsular W" o ant<%eno ; do -5@ e a fla%elina" prote<na que constitui o fla%elo!B#. Maria)*es dos ant<%enos ; definem soro%rupos. 8act(rias de um mesmo soro%rupofrequentemente apresentam varia)*es anti%3nicas no ant<%eno fla%elar B e capsular W. Em !.coli6 a combina)ão de variantes ;?W?B" ou apenas ;?B" define um sorotipo. Embora isto nãosea sempre poss<vel na prática" a identifica)ão precisa de uma !scherichia coli enteropato%3nica requer a caracteriza)ão a n<vel de sorotipo.

/ tipa%em dos ant<%enos ;" W e B ( feita atrav(s de rea)*es de a%lutina)ão utilizando0se soros preparados por inocula)ão de amostras padr*es em coelhos. Estes soros podem ser diri%idos contra ant<%enos individuais !soros monovalentes# ou contra uma mistura deant<%enos !soros polivalentes#. / sorotipa%em de uma amostra bacteriana ( feita inicialmentecom soros polivalentes. Ouando a rea)ão ( positiva" submete0se a amostra a rea)*esindividuais com cada um dos soros monovalentes do pool contido no soro polivalente.

M%)+ *% C8;/8, 8/;<,*)+ =,, ) %.78%39%./) % +);,9%./) *% %./%)4,3/6,+:

Meio de enri"ecimento? 4eio de tetrationato. 7avorece o crescimento das enterobact(rias do%3nero 'almonella e inibe o crescimento de outras enterobact(rias.

Meios de isolamento. Esses meios foram idealizados para o isolamento de enterobact(riaspato%3nicas das fezes. 5ossuem componentes que eliminam bact(rias da microbiota normal efacilitam a diferencia)ão entre bact(rias pato%3nicas e não pato%3nicas. @ão" portanto" meiosseletivos e diferenciais !ver pá%ina #. ;s meios mais utilizados são 4ac'onKeL" 'almonella-'higella !@@#" verde brilhante e heKtoen.

MacConDe;. mpediente para bact(rias Aram positivas" permitindo o crescimento dasenterobact(rias. 8act(rias fermentadoras da lactose apresentam colXnias vermelhas e nãofermentadoras" colXnias incolores.

Egar ''. mpediente para bact(rias Aram positivas e enterobact(rias da microbiota intestinal

normal" possibilitando o isolamento de 'higella6 'almonella6 !scherichia coli enteroinvasora!EE'# e ersinia enterocolitica. / colora)ão das colXnias -ac V e -ac 0 no á%ar @@ (semelhante à observada no 4ac'onKeL.

2&



Egar heDtoen. mpediente para bact(rias Aram positivas" enterobact(rias da microbiotaintestinal normal" possibilitando o crescimento de 'higella e 'almonella !exceto 'almonellat;phi6 que cresce com menor intensidade#. /s bact(rias fermentadoras de lactose formamcolXnias de cor amarela ou alaranada enquanto que as não fermentadoras apresentamcolXnias incolores.

M%)+ *% 38;/8, 8/;<,*)+ =,, *%./3,'() *% %./%)4,3/6,+:

Meio '<

; meio =@ !triplice s"gar iron ou triplice accar ferro# cont(m %licose !F.1J#" lactose!1.FJ#" sacarose !1.FJ#" uma base sulforada" um sal f(rrico e" como indicador de pB" overmelho fenol" que lhe confere cor vermelha. ; =@ ( um meio sólido que deve ser mantidoem posi)ão inclinada" quando do seu preparo. / inocula)ão ( feita a partir de uma colXnia bemisolada" por picada em toda a base e es%otamento na superf<cie.

'ulturas em =@ de bact(rias que fermentam somente a %licose produzem mudan)a decolora)ão para amarelo na base" mantendo a cor ori%inal do meio na superf<cie. Embora

outras explica)*es possam ser dadas" parece mais provável que isto decorra da diferen)a novolume de crescimento nas duas partes do meio !base e superf<cie#. Na superf<cie" onde ocrescimento bacteriano ( abundante" a acidez resultante da fermenta)ão da %licose (neutralizada pelos produtos do metabolismo proteico" o mesmo não ocorrendo na base" onde ocrescimento se restrin%e ao ponto de inocula)ão !picada#" não havendo" portanto" quantidadesuficiente de metabólitos para neutralizar os ácidos produzidos. @e a bact(ria fermenta alactose e[ou sacarose" accares que se encontram em concentra)*es 1F vezes superior a da%licose" a quantidade de ácido formada será bem maior e" desta forma" não haveráneutraliza)ão por outros produtos do metabolismo bacteriano. 'onsequentemente" tanto abase como a superf<cie acidifica0se" apresentando colora)ão amarela. /ssim sendo" conformeas rea)*es que ocorrem na base" na superf<cie e em toda a extensão do meio" pode0se saber se apenas a %licose ou se tamb(m a sacarose e[ou a lactose foram metabolizadas. /l(m disto"

o meio =@ permite verificar se houve produ)ão de B2@ e %ás. ; resultado positivo para B2@ (indicado pelo sur%imento de cor escura no meio e" de %ás" pela reten)ão de bolhas de ar.

Meio !2M

; meio E54 tamb(m ( um meio sólido" que deve ser mantido em posi)ão inclinadaapós o preparo" como o =@. Este meio resultou da modifica)ão de um meio tradicional" de usomuito comum em 8acteriolo%ia" o meio de :u%ai. / modifica)ão foi feita na Escola 5aulista de4edicina" cuas iniciais desi%nam o meio" e teve como obetivo ampliar o nmero de provas domeio de :u%ai. No E54" são realizadas + provas? urease" fenilalanina0desaminase" B2@"%licose e produ)ão de %ás. ; meio est(ril apresenta colora)ão verde clara. Ouando semeadocom uma cultura0teste" apresenta0se multicolorido. / colora)ão azul na base indica resultado

positivo para urease e" verde escuro na superf<cie" positivo para fenilalanina0desaminase. /ssim como no meio de =@" o resultado positivo para %licose e B2@ ( indicado"respectivamente" por colora)ão amarela e por pontos escuros na base. 8act(rias produtorasde %ás ret3m o mesmo no interior do meio !forma)ão de bolhas#" do mesmo modo que no meio=@.

Embora o meio E54 facilite o trabalho" ao permitir a realiza)ão de + provas de uma sóvez" a leitura dos resultados nem sempre ( fácil. 7requentemente o resultado positivo de umaprova impede a leitura de outra. o caso" por exemplo" da urease. 8act(rias que apresentamrea)ão muito forte nesta prova !quando o meio fica todo azulado# t3m o resultado da %licosemascarado. Neste caso" a prova de %licose deve ser repetida em um meio de culturaespec<fico para %licose.

Meio de M<Ai

/ desi%na)ão deste meio ( formada pelas iniciais das tr3s provas que nele são

2+



trabalho de pesquisadores da Escola 5aulista de 4edicina. ; meio 4-i ( um meio semi0sólidoe" quando est(ril apresenta colora)ão vinho. /pós o crescimento de uma cultura" pode ficar turvo em toda sua extensão ou somente na linha do inóculo !picada#. No primeiro caso" trata0se de uma bact(ria móvel e" no se%undo" de uma bact(ria imóvel. 8act(rias -'V mant3m acolora)ão ori%inal do meio e -'0 mudam a colora)ão de vinho para amarelo. / revela)ão daprova de indol se%ue o mesmo procedimento da prova realizada com cultura crescida em meioespec<fico !ver pá%ina 1+#? após o crescimento da cultura" coloca0se entre + a 1F %otas dereativo de Wovacs" espera0se al%uns se%undos" e observa0se a superf<cie do meio. 8act(riasindol positivas mudam a cor do reativo de Wovacs para vermelho.

ECE:'D';@

53 =bservar a coloração das col>nias das bactérias 56 B e C c"ltivadas em placas deMacConDe;6 ágar '' e heDtoen. 5notar os res"ltados da prova de lactose.

'ultura colora)ão da colXnia em lactose4ac'onKeL @@ heKtoen /8'

B) =bservar e interpretar crescimento das c"lt"ras 56 B e C em meio de '<.

'ultura em =@ / 8 '

colora)ão da basecolora)ão da superf<cieB2@%ás

C3 <denti,icação bio"+mica

/ partir do =@" inocular as culturas /" 8 e ' em s(ries bioqu<micas !meios de E54" 4-ie citrato de @immons# e incubar a $o'. /notar os resultados e identificar as culturas" combase no perfil bioqu<mico" utilizando a tabela da pá%ina &1.

5rovas / 8 'citrato%licose

%ásurease

B2@7enilalaninamotilidade

lisinandol

lactose\

Esp(cie[%3nero

2,



$3 Feação sorol0gica para con,irmação dos res"ltados de identi,icação bio"+mica.

7azer rea)ão de a%lutina)ão em l6mina com as culturas /" 8 e '" utilizando os soros anti 0'. ,le#neri " anti 0 !. coli ;++ e anti 0 'almonella sp. /notar os resultados !positivo oune%ativo#.

@oro 'ultura / 8 '

/nti 0 !scherichia coli = /nti 0 'higella ,le#neri

/nti 'almonella

'omportamento de Enterobact(rias fermentadoras !lac V# e não fermentadoras !lac 0# delactose em 4ac'onKeL" á%ar @@ e á%ar heKtoen. iferencia)ão baseada na colora)ão dascolXnias

8act(rias A3nero 'or da colXnia em4ac'onKeL e @@ á%ar heKtoen

!%9%./,*),+ !scherichia vermelha alaranada:lebsiella vermelha alaranada

!nterobacter vermelha alaranada'erratia vermelha alaranada

N() 'higella incolor incolor %9%./,*),+ 'almonella incolor incolor

2rote"s incolor incolor Morganella incolor incolor

ersinia incolor incolor

2



5erfil 8ioqu<mico e 4otilidade de /l%umas Esp(cies de Enterobact(rias

P)>, !. coli 'higellasonnei

!dHardsiellatarda

'almonella sp Citrobacter ,re"ndii

:lebsiella pne"moniae

!nterobacter cloacae

'erratiamarcescens

2rote"smirabilis

2rote"sv"lgaris

Morganellamorganii

2rovidenciarettigeri

'itrato 0 0 0 V ou 0 V V V V V ou 0 V ou 0 0 VAlicose V V V V V V V V V V V VAás V 0 V V V V V V ou 0 V V ou 0 V ou 0 V ou 0>rease 0 0 0 0 V ou 0 V V ou 0 V ou 0 V ou 0 V V VB2@ 0 0 V V V 0 0 0 V V 0 07enilalanina 0 0 0 0 0 0 0 0 V V V V4otilidade V ou 0 0 V V V 0 V V V V V ou 0 V

-isina V ou 0 0 V V 0 V 0 V 0 0 0 0ndol V 0 V 0 0 0 0 0 0 V V V-actose V 0 0 0 V ou 0 V V ou 0 0 0 0 0 0

2

Apostila Biomedicina2015

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