UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSEPÓLO UNIVERSITÁRIO DE VOLTA REDONDA

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATASDEPARTAMENTO DE QUÍMICA

APOSTILA DE BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL

Prof. Ricardo de Freitas Branco

Volta Redonda – RJ - 2013

APRESENTAÇÃO

Essa apostila foi montada visando o ensino de bioquímica experimental para

acadêmicos do curso de Química. Por este motivo alguns experimentos são mais

direcionados em análises do que nos fenômenos bioquímicos, sendo que o enfoque é

entender a “química” das análises e dos fenômenos.

Deve-se ressaltar que além das normas de segurança de laboratórios de química, as quais

os alunos já estão acostumados, os mesmos devem considerar que em alguns experimentos na

bioquímica experimental serão realizados com material biológico – neste caso, de baixo risco. Por

esta razão é necessário que os alunos sejam introduzidos a algumas normas de segurança de

laboratórios biológicos. O professor será responsável por ministrar na aula de segurança de

laboratório sobre esse tópico. Demais materiais sobre segurança em laboratórios podem ser

encontrados em outras apostilas vistas anteriormente e para segurança biológica há inúmeras

fontes na rede, recomenda-se os manuais da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).

1

SumárioPrática 1 – AMINOÁCIDOS E SOLUÇÕES TAMPÕES...........................................................................3

Prática 2 – PROTEÍNAS.....................................................................................................................11

Prática 3 – ENZIMAS........................................................................................................................15

Prática 4 – CARBOIDRATOS.............................................................................................................23

Prática 5 – LIPÍDEOS........................................................................................................................25

Prática 6 – METABOLISMO - VIA GLICOLÍTICA................................................................................27

Prática 7 – METABOLISMO - FERMENTAÇÃO..................................................................................30

Prática 8 – ISOLAMENTO DE DNA...................................................................................................31

2

Prática 1 – AMINOÁCIDOS E SOLUÇÕES TAMPÕES

3

4

5

6

7

8

9

10

Prática 2 – PROTEÍNAS

11

12

13

14

Prática 3 – ENZIMAS

15

16

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AÇÃO DA INVERTASE (B-FRUTOFURANOSIDADE) DE LEVEDO

A invertase ou sacarose é uma hidrolase que atua sobre a sacarose produzindo glicose e frutose. Como ambas as hexoses estão combinadas pelos seus grupos redutores respectivos, a sacarose não possui propriedades redutoras. Por este motivo, é possível medir a ação da invertase, determinando-se a formação de açúcar redutor.

1.1 Obtenção da preparação enzimática

Colocar um tablete de levedura prensada em um almofariz. Adicionar 5g de sílica e 10 ml de éter etílico.

Triturar bem e adicionar porções de 5 ml de água destilada, ainda triturando, até completar 30 ml. Então, deixar em repouso por 30 minutos e a seguir centrifugar por 10 minutos, a alta velocidade. A solução sobrenadante resultante deverá conter a invertase. Dividir em 2 porções e armazenar uma delas em congelador.

1.2 Curva padrão de glicose-frutose,

Será usada uma solução padrão contendo glicose 0,01 M e frutose 0,01 M. Pipetar alíquotas desta solução e colocar em tubos de ensaio, conforme a tabela abaixo. Completar o volume a 1,5 ml com água destilada.

Adicionar 1 ml do reagente do ácido 3,5 dinitrossalicílico (3,5 DNS) e colocar em banho de água fervente por 5 minutos. Resfriar em água fria e completar o volume a 10 ml com água destilada. Homogeneizar e ler a absorvância a 540 nm.

TUBO Nº SOLUÇÃO PADRÃO (ml)

ÁGUA ABS. 540 NM

1

2

3

4

5

6

7

Traçar curva padrão:

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Umol de glicídios redutores contra Abs. 540 nm.Calcular o coeficiente de inclinação da reta.

1.3 Diluição da enzimaPreparar uma série de tubos conforme indicado abaixo:

TUBOS 0,02 M

SACAROSE ACETATO TAMPÃO DILUÍDA INVERTASE ABS. 540 nm

1 0,5 ml 0,8 ml -

2 0,5 ml 0,8 ml 0

3 0,5 ml 0,8 ml 2

4 0,5 ml 0,8 ml 5

Pipetar 0,2 ml de solução de invertase previamente diluída. ATENÇÃO: Marcar o tempo zero a partir da adição da enzima no tubo 2. Agitar bem e incubar a temperatura ambiente por 5 minutos. Interromper a reação pela adição de 1 ml do reagente 3,5 DNS. Ao tubo 1 adicione a enzima após a adição do reagente. Agitar bem os tubos e colocar em banho de água fervente durante 5 minutos. Resfriar e completar o volume a 10 ml com água destilada. Homogeneizar e ler a absorvância a 540 nm.

OBS.: Para realizar os outros testes, escolher a melhor diluição da preparação enzimática.

1.4. Cinética da ação da invertase

Preparar 7 tubos de ensaio contendo 0,8 ml de tampão acetato 0,05M a pH 4,7. Acrescentar 0,2 ml de solução de enzima.

Acrescentar 0,5 ml de solução de sacarose 0,02 M em cada tubo e interromper a reação pela a adição de 1 ml do reagente 3,5 DNS em intervalos de tempo conforme a tabela abaixo. Agitar bem os tubos e colocar em banho água fervente por 5 minutos. Resfriar e adicionar 7,5 ml de água, homogeneizar e ler a absorbância a 540 nm.

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TUBOS TEMPO A540nm Umoles glic.formados

1 0

2 1

3 2

4 3

5 5

6 8

7 10

OBS.: No tubo 1, acrescentar primeiro o reagente de 3,5 DNS e depois a solução de sacarose 0,02 MTraçar o gráfico que relaciona umoles de açúcares redutores formado e o tempo. Calcular a velocidade inicial, ou seja umoles de produto formado/min.

1.5. Influência da concentração da enzimaPipetar alíquotas de solução diluída de invertase em 5 tubos de ensaio (vide tabela).

Completar o volume a 1 ml com tampão acetato 0,05 M a ph 4,7. Escolher uma diluição de invertase que dê Absorbância próxima de 0,2 à 540 nm.

Acrescentar 0,5 ml de solução de sacarose 0,2 M a cada tubo e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.

Interromper a reação pela adição de 1 ml do reagente 3,5 DNS e proceder como descrito anteriormente.

TUBOS SOL. ENZIMA (ml)

TAMPÃO ACETATO (ml)

A540 uMOLES GLICÍDIOS FORMADOS

1 0,0 1,0

2 0,1 0,9

3 0,2 0,8

4 0,4 0,6

20

5 0,6 0,4

Construir um gráfico de volume de enzima contra umoles de glicídios redutores formados.

1.6 Influência da concentração do substrato

Serão usadas soluções de sacarose nas concentrações da 0,01M, 0,02M, 0,03M, 0,04M, 0,05M a pH 4,7 a cada tubo.Acrescentar 0,2 ml de solução de invertase diluída.

ATENÇÃO: marcar o tempo a partir da adição da enzima no primeiro tubo. Agitar bem e incubar por 5 minutos a temperatura ambiente. Parar a reação pela adição de 1 ml do reagente 3,5 DNS. Agitar bem os tubos e colocar em banho de água fervente por 5 minutos. Resfriar e completar o volume a 10 ml em água destilada. Homogeneizar e ler a absorbância a 540 nm.

TUBO CONCENTRAÇÃO DE SACAROSE (M)

ABS 540 nm uMOLES DE GLICÍDIOS REDUTORES/ MIN

1 0,00

2 0,01

3 0,02

4 0,03

5 0,05

6 0,10

7 0,20

8 0,30

OBS.: No tubo 1, acrescentar 0,5 ml de água ao invés de substrato.

Calcular a quantidade de glicídios redutores/ min (v) para cada concentração do substrato. Traçar um gráfico de concentração do substrato (S) contra a velocidade (V). A reação segue a equação de Michaelis-Menten?Colocar os dados de 1/S x 1/V em gráfico e determinar Km e Vmax pelo método de Lineweaver-Burk.

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1.7 Preparo de soluções

-Reagentes do ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS): 1,0 g de DNS, 40ml de NaOH 1N e 30 ml de água. Dissolver a quente e completar o volume a 100ml.-Solução de sacarose com diferentes concentrações: preparar 50 ml da solução mais concentrada (0,3M) e diluir para obter as demais (0,01M, 0,02M, 0,03M, 0,05M, 0,10M, 0,20M). Conservar em geladeira.

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Prática 4 – CARBOIDRATOS

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Prática 5 – LIPÍDEOS

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Prática 6 – METABOLISMO - VIA GLICOLÍTICA

1. VIA GLICOLÍTICA

1.1. Inibidores da via glicolítica

MATERIAIS:

100 ml de solução tampão fosfato de potássio 0,1M pH 5,7

30g de leveduras prensadas

25 ml de glicose 0,25M

5 ml de bissulfito de sódio 0,25M

5 ml de fluoreto de potássio 0,5M

5 ml de iodetoacetato 0,1M

1 almofariz com pistilo

1 cilindro graduado de 100 ml

5 pipetas de 5 ml

4 tubos de ensaio grandes acompanhados de 4 tubos pequenos de diâmetro menor para o teste de Durham

1 banho a 30°C

PROCEDIMENTO:

Preparar os seguintes tubos

TUBOS GLICOSE (ml)

H2O NaHSO3 KF (ml)

IODOACETATO

1 4 42 4 43 4 44 4 4

Suspender 15g de levedura em 50 ml de tampão fosfato no almofariz. Adicionar em cada tubo 4 ml de suspensão de levedura. Introduzir em cada tubo de ensaio grande, um tubo de ensaio pequeno e de diâmetro menor invertido (teste de Durham). Completar o pequeno tubo de ensaio com a solução e observar com o tempo (até uma hora) o que acontece.

Explicar o resultado em cada caso.

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2.1. INTERMEDIÁRIOS DA VIA GLICOLÍTICA

MATERIAIS:

52 ml de hidrogênio fosfato de potássio 0,5M

52 ml de dihidrogênio fosfato de potássio 0,5M

25 ml de glicose 10%

2 ml de nitroprussiato de sódio 5% recém preparado

5 ml de amônia concentrada

5 g de sulfato de amônia sólido

2 ml de NaOH 10% (p/v)

2 ml de solução saturada de 2,4 –dinitrofenilhidrazina

HCl (ver item preparo de soluções)

Banho a 37°C

Suspensão de leveduras (5g/50 ml de K2HPO4 – recém preparada)

Suspensão de leveduras (5g/50 ml de KH2PO4 – recém preparada)

10 ml de solução de ácido tricloroacético (100 g/L)

2.1.1. Ensaio para a formação de piruvato a partir da glicose

PROCEDIMENTO:

Pipetar 5 ml de solução de glicose 10 % em 2 tubos A e B, e adicionar 5 ml da suspensão de leveduras em solução de K2HPO4 ao tubo A e 5 ml da suspensão KH2PO4 no tubo B. Colocar os tubos num banho a 37°C por 1 hora. Após este tempo adicionar 2 ml de ácido tricloroacético em cada tubo, homogeneizar bem, e centrifugar por 10 minutos numa centrífuga clínica. (Passar os sobrenadantes para 2 tubos novos A e B).

Ensaio com nitroprussiato: adicionar 2 ml de cada sobrenadante fervido em 2 tubos de ensaio que já contenham aproximadamente 1 cm de sulfato de amônio sólido. Adicionar 2 gotas de solução recém preparada de nitroprussiato de sódio (50 g/L), agitar vigorosamente, e adicionar cuidadosamente pelas paredes do tubo amônia (1ml) concentrada para formar 2 camadas. Observar a coloração formada na superfície de separação das camadas (deixar em repouso).

Ensaio com 2,4 –dinitrofenilhidrazina: adicionar 1 ml de solução saturada de 2,4 –dinitrofenilhidrazina em 2 ml de cada sobrenadanteem 2 tubos A e B e agitar vigorasamente. Colocar 2 ou 3 gotas de cada mistura em tubos de ensaio A e B e

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adicionar 1 ml de hidróxido de sódio 10%, e diluir com aproximadamente 5ml de água.

Explicar os resultados.

PREPARO DE SOLUÇÃO:

2,4 –dinitrofenilhidrazina HCl: dissolver pequenas porções de 2,4 –dinitrofenilhidrazina em 20 ml de HCl 2N até saturação.

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Prática 7 – METABOLISMO – FERMENTAÇÃO

Materiais/Equipamentos Quantidade Total Opções C.L.

pHmetro (calibrado) 3 -

Bastão de vidro 3 -

Agitador magnético com aquecimento 3 -

Barra magnética 3 pequena

Tubo de silicone 3 0,5-1,5 cm de diâmetro e 15-25 cm

comprimento

Rolha para frasco Erlenmeyer de 125 mL 3 com entrada para o tubo de silicone

Proveta 6 25 mL ou 50 mL

Proveta 6 10 mL

Frasco Erlenmeyer 3 125 ml

Bequer 3 100 ml

Reagente

(evitar fórmula)

Quantidade

(g ou mL)

Concentração C.L.

S. cerevisiae 0,05 g - -

Glicose 1,5 g - -

Extrato de levedura 0,5 g - -

Peptona 0,5 g - -

Água destilada 100 mL - -

PREPARO DO MEIO DE CULTIVO

A glicose, extrato de levedura e peptona deverão ser colocados em Erlenmeyer de 125mL então adiciona-se 50 mL de água destilada. O meio deve ser então autoclavado à 110 C (0,5 atm) por 15 min. Resfriado a temperatura ambiente, se necessário ajustar o pH para 5,0±0,2(faixa de 4,8 a 5,2) com amônia ou ácido sulfúrico.

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Prática 8 – ISOLAMENTO DE DNA

31

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FONTES BIBLIOGRÁFICAS

APOSTILA UFF

LIVRO DE BIOQ

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