ApostilaBiotecnologia2

8/3/2019 ApostilaBiotecnologia2

1/20

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINACENTRO DE CINCIAS AGRRIASDEPARTAMENTO DE FITOTECNIA

FIT 5806 - BIOTECNOLOGIA

APOSTILA (v.5)

Rubens Onofre Nodari

Doutor em Gentica (UCDavis-CA), Prof. Titular do Dep. de Fitotecnia, Centro deCincias Agrrias, Universidade Federal de Santa Catarina, C. Postal 476, Florianpolis,

SC, 88040-900, e-mail: [email protected]

e

Miguel Pedro Guerra

Doutor em Cincias (USP), Prof. Titular do Dep. de Fitotecnia, Centro de CinciasAgrrias, Universidade Federal de Santa Catarina, C. Postal 476, Florianpolis, SC,

88040-900, e-mail:[email protected]

Florianpolis, maio de 2000


2/20

Tpicos PginaPARTE 1Apresentao 3I-Introduo s macromolculas: protenas e cidos nucleicos 41.1-Protenas 41.2-cidos nucleicos 5II-Replicao 11III-Transcrio 12IV-Traduo 14V-Mutao e reparo 15VI-Metilao 16VII-Regulao gnica 16PARTE 2-Marcadores genticos 21

1-Marcadores morfolgicos 212-Marcadores protenas de sementes 213-Isoenzimas 214-RFLPs 255-RAPDs 276-Minissatlites 287-Microssatlites 298-AFLPs 299-SCAR 3110-Anlise comparativa 3211-Aplicaes dos marcadores moleculares 3212-Bibliografia 36

PARTE 31-Introduo 412-Transformao de plantas 413-Diferenas entre os mtodos de melhoramento convencionais ebiotecnolgicos

42

4-Oportunidades 445-Evoluo do cultivo de plantas transgnicas 456-Limitaes 467-Biossegurana- Regulamentao 478-Determinao de risco 499-O caso da soja transgnica resistente ao herbicida glifosate 5010-Implicaes econmicas 52

11-Percepo pblica 53PARTE 41-Direitos de proteo e patentes2-Lei de proteo das cultivares3-Lei dos acessos4- Biodiversidade, Biotecnologia e AgriculturaPARTE 5BioticaBibliografia


3/20

APRESENTAO

Esta apostila rene contedos bsicos de biologia celular e molecular e suas decorrentesaplicaes biotecnolgicas e outras tcnicas de uso frequente como marcadores moleculares eplantas transgnicas visando conhecer, conservar e melhorar a diversidade gentica existente. Oobjetivo desta apostila proporcionar ao estudante um conjunto de informaes bsicas e asaplicaes de algumas biotecnologias. Este conjunto de informaes se constitui no ponto departida para estudos mais aprofundados.

A biotecnologia em seu sentido mais amplo compreende a manipulao demicroorganismos, plantas e animais, objetivando a obteno de processos e produtos deinteresse. Desta maneira, toda atividade que envolva a aplicao dos conhecimentos defisiologia, bioqumica e gentica, considerada como tcnica biotecnolgica. Em seu senso maisrestrito a biotecnologia compreende a associao de tcnicas mais sofisticadas de biologiamolecular e celular, engenharia gentica e manipulaes celulares in vitro. Para o CNPq,biotecnologia pode ser conceituada como a utilizao de sistemas celulares para a obteno deprodutos e desenvolvimento de processos. A FAO (1989) conceitua biotecnologia como aaplicao dos princpios cientficos e de engenharia para o processamento de materiais poragentes biolgicos proporcionando produtos ou servios. Fernandes (1987) conceitua como ouso das tcnicas de regenerao in vitroe do DNA recombinante.

As primeiras atitudes do governo brasileiro em relao s biotecnologias tiveram inicio emmeados da dcada de 1980, quando tanto o CNPq quanto o MCT iniciaram o apoio formaode recursos humanos. Atualmente, o volume de recursos, o nmero de bolsas e o nmero depesquisadores que trabalham com as biotecnologias na rea agrcola e florestal atingem valoresinferiores a 10% em relao s demais reas de C&T no pais. Contudo, cada vez maior onmero de pessoas envolvidas com as biotecnologias, as quais passam a ser utilizadas nasdiversas disciplinas da rea biolgica. No estado de So Paulo, a FAPESP, a agncia defomento a pesquisa do estado de So Paulo, financiou um projeto para o sequenciamento dabactria Xyllela fastidiosa, o agente causador da doena denominada de amarelinho em citrus.Outros programas de pesquisa em biotecnologia de plantas esto em progresso em caf, cacau,soja, milho, trigo e outras espcies de importncia econmica.

A clonagem de mamferos, obtidas em 1997, desencadeou uma discusso no s no seioda comunidade cientfica, mas tambm em toda a sociedade sobre as implicaes do poder dasbiotecnologias. Em 1998, um grupo de4 pesquisadores da Coria do Sul advoga o feito de ter

clonado um embrio humano. Toma corpo ento a Biotica, que discute o modo de ser (tica) davida. A biotica pergunta-se sobre a legitimidade dos projetos de efeitos biotecnolgicos.Vrios agrnomos j esto desenvolvendo atividades na gerao de processos e

produtos, utilizando estas tcnicas biotecnolgias. O mercado tende a uma expanso nosprximos anos. Alm dos conhecimentos tcnicos necessrios ao desempenho profissional, oEngenheiro Agrnomo tem um importante papel na discusso das questes relacionadas com asbiotecnologias com a sociedade. A liberao da soja transgnica em setembro de 1998,resistente ao herbicida glifosate, constitui-se num marco da agricultura e exige que osprofissionais formados tenham o conhecimento tcnico e cientfico no s para o corretomanuseio destes organismos como tambm para participar das decises a respeito das

mesmas.

Miguel Pedro Guerra e Rubens Onofre Nodari


4/20

PARTE 1

I-INTRODUO S MACROMOLCULAS: PROTENAS E CIDOS NUCLEICOS

1.1-PROTENASLigaes peptdicas entre as pequenas molculas formam molculas grandes, asprotenas. Protenas so cadeias de aminocidos (aa). A estrutura bsica composta de umesqueleto e de grupos laterais. Uma srie repetida de ligaes peptdicas entre o carbono de umaa e o nitrognio de outro aa formam o esqueleto, enquanto as ramificaes deste esqueleto soos aa. Devido a natureza da ligao peptdica, uma das extremidades da protena H 2N,denominada de N-terminal, e na outra extremidade encontra-se COOH, que chamada decarboxi-terminal. Existem cerca de 20 aa, cada um com sua forma e constituio qumicacaracterstica. Dependendo da composio, as protenas podem ter carga positiva, neutra ounegativa. Os aa lisina, arginina e histidina contribuem com carga positiva (denominados de

bsicos) enquanto que o cido asprtico e o cido glutmico so carregados negativamente(denominados de cidos). Os demais 15 aa so neutros com relao a carga eltrica. Destes, ospolares so: serina, treonina, tirosina, triptofano, asparigina, glutamina e cistena. Os demaisapresentam propriedades hidrofbicas (no polar): alanina, fenilalanina, glicina, isoleucina,leucina, metionina, prolina e valina. Tais propriedades (polaridade e a hidrofobia) tambm soincorporadas s protenas.

Os tipos de aa includos e principalmente a sua sequncia determinam a conformaotridimensional e portanto, as propriedades de todas as protenas. O tamanho de uma protenapode variar de alguns poucos at 30.000 aa. Trinta ou 40 aa so suficientes para proporcionaruma conformao terciria.

A estabilidade das protenas representa um equilbrio entre a sua sntese e a suadegradao. Existe um processo contnuo de reposio (turnover) que pode ser caracterizadoquando se conhece a meia-vida das protenas, ou seja o tempo necessrio para a renovao dametade da sua concentrao. A meia-vida das protenas pode variar de minutos a mais de 20horas e sua degradao catalisada por enzimas proteolticas. Exemplos: protenas com N-terminal arginina - 2 min; lisina, leucina e fenilalanina - 3 min; prolina - 7 min; tirosina e glutamina- 10 min.

Na maioria das vezes as protenas para exercerem suas funes devem sofrermodificaes, como fosforilao, glicosilao ou metilao. No processo de fosforilao adicionado protena um grupo fosfato pelas kinases, tonando-se fosfoprotenas. A metilao ou

acetilao consiste na incorporao de um metil ou acetil protena pelas metilases ouacetilases, respectivamente. A incorporao de carboidratos numa cadeia protica denomina-seglicosilao, origina as molculas denominadas de glicoprotenas.

Enzima a denominao de uma protena quanto esta apresenta a habilidade deacelerar uma reao fazendo ou quebrando uma ligao (covalente) especfica. Para o exercciodesta funo, as protenas devem apresentar a conformao terciria ou quaternria. Aconformao quaternria na realidade a agregao de duas ou mais sub-unidades, que nestacondio proporcionam a funo catalisadora uma protena enzima. Exemplo: Rubisco ouribulose-1,5-bifosfato carboxilase/oxigenase se torna uma enzima quando oito sub-unidades seagrupam, quatro delas codificadas por genes nucleares e as outras quatro por genes do

cloroplasto. A Rubisco responsvel pela incluso de CO2 numa cadeia de carbono (1 etapano ciclo de Calvin). Tratando-se de enzimas, nem todos os aa participam da reao cataltica.Existe um stio ativo responsvel pela catlise. Este stio ativo ento um conjunto de aa


5/20

denominado de motivo ou domain. A domainpode ser entendida como a unidade funcional deuma protena, um regio relativamente independente da protena. Nas interaes com outrasprotenas ou cidos nucleicos apenas uma parte da protena, o motivo (ou domain), responsvel pela funo.

Quando diferentes protenas desempenham funes semelhantes, constituem uma

famlia de protenas. A mesma seqncia formadora de uma determinada domain pode seencontrada em vrias protenas de espcies diferentes. Aparentemente, durante a evoluo adomain se moveu dentro da sequncia linear de aminocidos sem perder sua funo eespecificidade de ligao. Estas domainsvariam quanto ao nmero de aa: 18 no Colgeno, maisde 250 aa Fibrinognio. Freqentemente, as domainspodem se repetir (at mais de 30) numamesma protena, neste caso denominadas de motivo (motif) sendo que nem todas as repetiesso exatamente idnticas. Estas duplicaes provavelmente so devido a existncia deelementos mveis ou transformao. As duplicaes tm provocado a elongao de muitasprotenas. Estimativas admitem a existncia de mais de 50 mil tipos de protenas numa espcieeucariota.

As primeiras tcnicas de separao de macromolculas, foram desenvolvidas na dcadade 40. Nesta poca foi desenvolvido os sistemas de cromatografia que permitem a separaodas fraes polares das no polares com base na solubilidade das diferentes molculas. Deacordo com este princpio, um solvente no polar move-se carregando solutos com ele. Assubstncias migram a diferentes distncias de acordo com a sua solubilidade no solvente.Atualmente existem uma dezena de diferentes tcnicas de cromatografia, que possibilitaminclusive a identificao de molculas presentes numa mistura.

Nos anos 80 foi descoberto que algumas doenas (desordens degenerativas) poderiamser causadas por agentes infecciosos formados apenas por protenas. Estas protenas foramdenominados de prons ('proteinaceous infections particles'). O pron uma forma alterada da

protena PrP que normalmente est presente no crebro de vertebrados. Estas desordensdegenerativas ocorrem com freqncia em animais e muito raro na espcie humana.O sequenciamento de protenas uma tcnica, desenvolvida por (Sanger, 1950), com a

finalidade de conhecer a seqncia dos aa numa protena. As implicaes desta descoberta soinmeras. A mais importante se relaciona com a sade humana, pois a tcnica permitiu aidentificao de inmeras doenas. Mutaes a nvel de DNA podem provocar a substituio deum aa por outro numa determinada posio da seqncia de uma protena e dependendo daposio a protena perde sua funo, causando ento uma doena. Outra conseqncia foi apossibilidade de inferncia da seqncia de bases a nvel de DNA que codifica para as protenassequenciadas. Isto permitiu o isolamento e a clonagem dos primeiros genes. Mais tarde, o

prprio Sanger desenvolveu um mtodo de sequenciamento de DNA. Por esta contribuio cincia, Sanger foi agraciado com um segundo prmio Nobel.

1.2-CIDOS NUCLEICOS1.2.1-cido desoxirribonucleico - DNA

As molculas de DNA tm estrutura em forma de dupla hlice, semelhante a de umaescada retorcida. Cada fita formada por uma seqncia de nucleotdeos (dNTP). Cada dNTP composto de uma base nitrogenada ligadas a uma molcula de acar (desoxirribose) e umgrupo fosfato. As bases nitrogenadas ligadas a desoxirribose so quatro: adenina (A), citosina

(C), guanina (G) e timina (T). Uma ligao fosfodister unindo o grupo fosfato de um dNTP e oacar desoxirribose de outro dNTP forma o esqueleto da fita (strand), como se fosse uma daslaterais da escada. A outra fita (ou a outra lateral da escada) formada da mesma maneira, mas


6/20

com orientao da ligao fosfodister contrria, o que impe a caracterstica deantiparalelismo as duas fitas. Cada fita tem uma orientao (5'-3') em funo da natureza daligao fosfodister entre o carbono 3' e o 5' da desoxirribose, sendo que um nucleotdeo spode ser includo na cadeia atravs da ligao do fosfato com o carbono 3'OH da desorribose.Por isto, a orientao da cadeia 5'-3', pois haver sempre o carbono 3' numa das extremidade

da fita. Mais do que isto, estas duas fitas so complementares j que quando existir adenina deum lado, somente timina encontrada na mesma posio na outra fita. O mesmo acontece comcitosina e guanina. So estes os dois nicos tipos complementao de bases nitrogenadaspossveis no DNA. Como conseqncia o nmero de adeninas ser igual ao nmero de timinasnum organismo. O mesmo vale para C e G. Entretanto a quantidade de purinas (A e G) caracterstica de cada espcie. Assim a proporo entre A e G de 0,7 em Bacillus, 1,56 nohomem e 1,7 em Saccharomyces cereviseae. Isto conhecido como regra de Chargaff.

Entre as bases nitrogenadas existem pontes de hidrognio, duas entre A e T e trsentre C e G. Tais pontes juntamente com outras foras, mantm as duas fitas unidas. Cada par

de base anlogo a um degrau desta escada. O DNA funciona como um modelo para a sntesede novas fitas de DNA. O DNA a molcula responsvel pelo armazenamento e perpetuao docdigo gentico. Apesar da ocorrncia de 3 tipos de DNAs ('A', 'Z', 'B'), aparentementedesempenham a mesma funo.

A prova definitiva de que o DNA a molcula repositrio do cdigo gentico foi obtida em1952 por Hershey e Chase. Experimentalmente adicionou-se 32P numa colnia de bactriasinfectadas por vrus, neste caso o fsforo radioativo foi incorporado no DNA, j que pouco ouquase nenhum fsforo encontrado nas protenas. Num experimento paralelo, foi feita a adiodo istopo 35S, que pode marcar radioativamente as protenas, j que estas tm enxofre, masno marca o DNA, pois este no contm enxofre. Como s o 32P foi detectado nas prognies dos

vrus, conclui-se que o DNA passava de gerao a gerao. Na realidade, oito anos antes,outros trs cientistas (Avery, MacLead e McCarty) haviam postulado que o agente transformador(possivelmente o DNA) era destrudo pela desorribonuclease pancretica que por sua vez noafetava as protenas.

A quantidade de DNA pode variar de 103 a 1013 nucleotdeos. Esta quantidade de DNApor clula haplide denominada de valor C. So aproximadamente 3 bilhes de pares debases no ncleo de cada clula humana. Entretanto podem ser apenas 5387 no vrus x174. Amaioria das plantas tem uma quantidade de DNA que varia entre 109 a 1011. Nos mamferosexistem de 109 a 1010 pares de bases; j alguns peixes ou anfbios podem ter at 1013 pares debases. muito DNA para pouca funo (paradoxo do valor C). Enquanto nos procariotos

praticamente quase todo o DNA carrega informaes necessrias para a sntese de protenas eRNAs, a maior parte da seqncia de bases dos eucariotos no codifica para produto algum.Assim apenas 3% (aproximadamente) do genoma humano formado por genes (estimados emmais de 50 mil) sendo que a funo do restante ainda no est suficientemente compreendida. Amaior parte deste DNA sem funo conhecida composto por seqncias repetidas, de onde seoriginou o nome de DNA repetitivo (selfish, nos anos 80).

Quando esticado uma molcula de DNA de qualquer clula humana mediria 1,80 m eteria a espessura de um trilionsimo de um centmetro (1 micrmetro = 1 milsimo de milmetro).Uma clula humana no comportaria tal estrutura. Dentro de uma clula as molculas de DNAesto ligadas a protenas e so retorcidas ou enroladas (supercoil). Quando completamente

compactadas so possveis de serem visualizadas no microscpio tico e recebem adenominao de cromossomos. A compactao pode alcanar um fator de 7000 vezes. Vrus e


7/20

bactrias contm apenas um cromossomo. J os eucariotos (fungos, plantas, animais) tm doisou mais cromossomos que em geral, variam de tamanho.

Genoma e gene

A seqncia de pares de bases que formam o DNA pode ser chamado de genoma. A

forma do genoma pode ser circular como nos vrus, bactrias, mitocndria, cloroplasto eplasmdeos ou linear como nos cromossomos dos organismos eucariotos e alguns procariotos. Ogenoma da maioria absoluta dos organismos de DNA. Poucos vrus so de RNA, comoInfluenza, HIV, TMV, poliomielite. A grande maioria tambm apresenta fita dupla. Exceo aalguns vrus como (x174, M13 e f1, cujos genomas so constitudos de apenas uma fita deDNA. As caractersticas de um indivduo como a cor dos olhos ou da pele so determinadas porum conjunto limitado de pares de bases contidas no DNA (ou no RNA, como j mencionado,trecho este, denominado de gene.

O conceito de gene evoluiu tanto quanto a biologia. Uma das primeiras observaessobre o tema foi feita por Leonardo da Vinci. Observando a cor dos filhos de mulheres brancas

com homens pretos, ele sugeriu que a semente da me tinha o mesmo vigor que a do pai(Wallace, 1992). Mas foi Mendel em 1865 quem utilizou pela primeira vez a expresso fator paraos componentes hereditrios parentais responsveis pelas caractersticas nas prognies. Smais tarde (1908), Johannsen sugeriu o termo gene para designar os fatores hereditrios.

Por gene entende-se a unidade de herana. Contudo, os diferentes textos de genticaapresentam diferentes conceitos para gene. Segundo a maioria dos autores, o principal atributodo gene sua relao com a protena que codifica. Neste caso, define-se gene como sendo umsegmento de DNA, que atravs da intermediao de uma molcula mensageira de RNA, responsvel pela especificao de uma cadeia peptdica (Wallace, 1992). Entretanto, outrosgeneticistas incluem, alm das protenas, os RNAs como produtos gnicos. Neste caso, a

definio de gene um segmento de DNA responsvel pela produo de um produto difusvel(Lewin, 1994). Como um significativo grupo de RNAs exerce funes outras que a demensageiro, como por exemplo a regulao gnica, o segundo conceito de gene mais realista.

Por se tratar de uma sequncia de DNA, um gene pode ocorrer sob mais que umaalternativa ou alelo. Desta forma, basta uma alterao na sequncia de bases que cause umamudana no produto, para que se configure uma alternativa (alelo) diferente. Para simplicidade,normalmente utiliza-se um modelo bsico de um gene com dois possveis alelos, j que amaioria dos seres vivos so diplides, portanto, carregam dois alelos (um em cada cromossomohomlogo) para o mesmo gene. Mas na realidade, um gene pode ter muitas alternativas.Evidentemente que num indivduo diplide s ocorrem uma ou duas formas no mximo. Mas

diferentes indivduos podem apresentar formas allicas diferentes uns dos outros. Um dosexemplo mais conhecido trata-se do tipo sanguneo, sendo que numa populao de indivduospodem ser encontrados quatro diferentes alelos.

Sequenciamento de cidos nucleicos

O sequenciamento consiste na identificao ordenada dos nucleotdeos que compemum fragmento de DNA ou RNA. Existem duas tcnicas que so utilizadas normalmente emlaboratrios. Por outro lado, nos ltimos anos foram desenvolvidos equipamentossequenciadores de alta velocidade e que esto sendo utilizados no sequenciamento de espciesprocariotas (bactrias) e eucariotas (fungos, vegetais e animais, incluindo Homo sapiens.

Conhecer a sequncia de bases dos genomas das espcies tem sido um dos objetivosdos bilogos. A sequncia completa de vrios vrus j conhecida h bastante tempo, devido aofato do pequeno nmero de nucleotdeos participantes de seus genomas. Em 1995 foi finalizado


8/20

o sequenciamento do genoma das duas primeiras bactrias pelo 'The Institute for GenomicResearch'(TIGR http://www.tigr.org/tdb/): Haemophilus influenzaee Mycoplasma genitalium. Aprimeira delas, que causa a inflamao no ouvido, tem aproximadamente 1,8 milho de pares debases e aproximadamente 1700 genes. A segunda que apenas 570 genes, est associada sinfees reprodutivas. O sequenciamento do organismo deve contribuir para o desenvolvimento

de vacinas ou outras estratgias de combate a doena causada por aquela bactria. Alm disso,o sequenciamento do Saccharomyces cerevisae, iniciado em 1989, foi concludo em junho de1996, resultante de um projeto feito em parceria por um grupo de pesquisadores de vrios paseseuropeus. Esta levedura, alm de ser utilizada como modelo gentico para estudos em espcieseucariotas, utilizada na produo de bebidas fermentadas. O sequenciamento desta levedura um marco histrico, pois foi o primeiro organismo eucarioto a ter seus genes totalmenteinventariados. Brevemente, sero conhecidas a maioria das sequncias de nucleotdeos devrias espcies vegetais e animais de importncia econmica e cientfica.

Tabela 1. Nmero de genes e tamanho do genoma de espcies parcial ou totalmentesequenciadas.Espcie Em milhes de pares de

basesNmero de genes

EubacteriaMycoplasma genitalium 0,580 482*Borrelia burgdorferi 0,910 853*Chlamydia trachomatis 1,042 894*Treponema pallidum 1,138 1.041*Rickettsia prowazekii 1,111 834*

Aquifex aeolicus1,551 1.512*

Helicobacter pylori 1,677 1.590*Campylobacter jejuni 1,641 1654*Haemophilus influenzae 1,830 1.740*Xylella fastidiosa 2,679 2.656*Neisseria meningitidis Z2491 2,184 2.121Neisseria meningitidis A MC58 2,272 2.158Deinococcus radiodurans 3,284 3.187*Bacillus subtilis 4,214 4.100*Escherichia coli 4,639 4.307*

ArchaeaArchaeoglobus fulgidus 2,178 2.436*

EukaryaSaccharomyces cerevisae 12,5 6.034*Caenorhabditis elegans 97 19.099*Arabidopsis thaliana 120 21.000**Drosofhila melonogaster 180 13.600**Oryza sativa 430 30.000**Sorghum bicolor 760 30.000Zea mays 2.000 30.000**

Homo sapiens 3.000 100.000**Triticum aestivum 16.000 30.000Plamodium falciparum 30.000 ? **


9/20

*J sequenciados (Science270, 276, 277, 281, 282, 286, 287; Nature387, 390,391, 392, 396,397, 400,

403, 404); ** Sequenciados parcialmente.

O principal projeto no Brasil nesta rea o sequenciamento da bactria Xyllela fastidiosa

que causa uma doena no citrus chamada de amarelinho. O referido projeto foi iniciado em 1997e tem um oramento de 14 milhes de dlares, financiado pela FAPESP, que a Fundao deAmparo a Pesquisa do Estado de So Paulo.

O nmero de espcies j totalmente sequenciadas cresce ano a ano e vrias espciesvegetais e animais esto sendo sequenciadas, entre elas, arroz, milho, soja, boi e porco.

Enquanto nos procariotos, a densidade mdia de genes de 1 gene a cada 1000 pbaproximadamente, nos eucariotos de 1 gene a cada 2000 pb nas leveduras, 1 gene em 5000pb nos nematides e 1 gene a cada 4800 pb em Arabidopsis. A maior quantidade de DNA podeser parcialmente explicada pelo fato de que, nos eucariotos a parte regulatria dos genes muitomaior que nos procariotos. Alm disso, nos eucariotos existem sequncias repetidas, que so

ausentes nos procariotos. Embora se saiba o nmero de genes dos organismos sequenciados,ainda no se conhece as funes de 40 a 60% dos genes, dependendo da espcie. Oconhecimento da sequncia de bases de um genoma permite aos bilogos o entendimento dofuncionamento dos organismos, as funes dos genes, que tipo, tamanho, quantidade ecaractersticas das protenas formadas.

A maior parte das espcies de bactrias j sequenciadas causam doenas espciehumana. A razo principal para se conhecer sua sequncia relaciona-se com a possibilidade doseu controle, via desenvolvimento de vacinas ou outros medicamentos.

As plantas so a base da vida na terra. Contudo, pouco se conhece de seu genoma. Ogenoma das angiospermas altamente varivel, mas ainda praticamente desconhecido.

Desconhecemos tambm o nmero de espcies e o nmero de genes em cada espcie. Naverdade, ainda no conhecido o nmero de cromossomos de mais de 70% das espciesvegetais. O valor C de DNA s conhecido em 1% das espcies. Desta forma, o projeto genoma de fundamental importncia para o aprofundamento do conhecimento das plantas,domesticadas ou no.

O sequenciamento completo do genoma humano (estimado em 3 bilhes de pares debases) dever revolucionar a medicina e poder auxiliar na cura para as mais de 3000 doenashereditrias que atingem a raa humana. Iniciado em 1985, o sequenciamento do genomahumano que rene cientistas e laboratrios dos Estados Unidos, Canad, Japo, Inglaterra,Frana, Rssia, Itlia, Austrlia e Brasil entre outros, dever ser completado bem antes da data

prevista (2005). Em fins de 1999, j havia sido sequenciado, aproximadamente 10% do genoma.Quando ficar pronto, o arquivo necessrio ao armazenamento das informaes dever serequivalente a 200 listas telefnicas com mil pginas cada uma. O GenBank (USA) e o DNADatabase (Japo) j dispem de informaes de mapeamento e sequenciamento de mais de2500 diferentes organismos. Mapas fsico e de ligao tm sido divulgados a cada ano commaior resoluo. Tais mapas facilitaro a clonagem de genes humanos, como aquelesenvolvidos com as doenas, a obesidade, etc.

Introns e exons

Foi descoberto nos anos 70 a presena de seqncias presentes no DNA mas no no

RNA mensageiro, produto da transcrio do DNA. Tais seqncias foram denominadas deintrons (intervening sequences) e esto intercaladas com os exons(expressed sequences), queso as regies codificadoras dos genes. A remoo dos introns feita por enzimas e faz parte do


10/20

processamento que sofre o pr-mRNA antes de sair do ncleo. A presena de introns ousequncias intervenientes sugere uma maior oportunidade para recombinaes e maior acmulode mutaes. Introns so comuns nos eucariotos e raramente encontrado nos procariotos.Quando o intronque faz o processamento, ele se regenera no final do processo. Neste caso, ointronseria uma enzima, proporcionando ao RNA a funo de catlise. Nas bactrias ainda no

foram detectados introns. Uma das hiptese de que as bactrias perderam os intronsdurante aevoluo. Neste caso os intronsteriam se originado no incio da vida. Outra hiptese admite queos intronssurgiram com os eucariotos. Na realidade, ainda no se sabe exatamente como osintrons surgiram, nem tampouco se apareceram logo no incio da vida ou surgiram maisrecentemente.

Embora tenham caractersticas similares, os introns so muito diversos quanto aotamanho, processamento e funes. Certos introns, em especial os do chamado grupo I, comunsem genomas de organelas celulares (como a mitocndria) e em alguns genes do ncleo (como orRNA), apresentam caractersticas especiais. Eles prprios realizam sua remoo do pr-mRNA(autocatlise) e ligam os exons, fenmeno denominado self-splicing.

Alguns introns desse grupo so elementos mveis (transposons), capazes de se transferirem cruzamentos genticos para alelos que no os continham, pelo processo denominadohoming, iniciado com o corte do DNA por uma endonuclease, enzima codificada pelo prpriointron. Outros introns do grupo I codificam cofatores proticos, como as maturases. So poucosos casos conhecidos em que um mesmo produto desse tipo de intron realiza ambas as funes -- de endonuclease e de maturase.

J so conhecidos casos de transferncia de introns do grupo I entre indivduos da mesmaespcie (transferncia vertical). Nesse caso, um intron passa de um alelo para outro que no ocontinha. Tambm j foi constatado que introns desse grupo presentes no genoma dasmitocndrias podem passar de uma espcie para outra (transferncia horizontal, ou lateral),

mas dentro do mesmo filo.A transferncia lateral, entre organismos que no se acasalam sexualmente, foi objeto deprofundo estudo de YangraeCho e colaboradores, publicado em novembro de 1998. O estudoenvolveu um intron do grupo I do genoma mitocondrial de plantas vasculares, bastanteconhecido e localizado no gene cox1 da erva Peperomia polybotrya, que teria sido adquirido deum fungo, por transferncia lateral. Analisando o DNA de 335 plantas de diferentes gneros, osautores verificaram que esse intron est amplamente disseminado nos genes cox1 dasangiospermas.

O intron estudado est presente em 48 gneros diferentes, a partir de 32 eventosindependentes de transferncia lateral. A concluso sobre as transferncias baseia-se em trs

pontos principais: a presena constante do gene cox1 e espordica do intron, a incongrunciaentre as filogenias (histrias evolucionrias) das espcies e dos introns e a co-converso(Co-converso quando parte das extremidades de um segmento de DNA 3 a 18 pb -, aps o

processo de recombinao/reparo, convertida sequncia do DNA doador ou invasor. Assim,

o DNA da espcie recipiente parcialmente degradado e uma nova sequncia sintetizada com

base no molde do DNA da espcie doadora. Desta forma, a converso deixa um rastro, pois a

sequncia original alterada.) das seqncias prximas do local de insero do intron. Oprimeiro ponto indica que o gene cox1 se disseminou com alta freqncia e manteve-se nasespcies que o receberam, enquanto o intron foi perdido na maioria dos casos. O segundodemonstra que a transferncia independe do grau de parentesco entre as diferentes plantas. E o

ltimo -- a divergncia gentica das regies que flanqueiam a insero do intron -- revela que atransferncia se d via recombinao/reparo e catalisada por uma endonuclease. Esseprocesso, conhecido como homing, exatamente o que esse tipo de intron promove.


11/20

Os resultados geram vrias preocupaes. Entre as dvidas principais esto a causa daextraordinria invaso desse intron, os passos do processo de transferncia em nvel celular e ocaminho evolutivo da disperso do intron do grupo I do gene cox1 entre as angiospermas. Entreas implicaes, a mais importante est ligada freqncia com que o DNA transferido de umaespcie a outra. A transmisso planta a planta requer acasalamento sexual ou a ajuda de

vetores (vrus, bactrias, insetos e outros). A questo bastante atual, j que muitas plantastransgnicas esto sendo liberadas para cultivo.O trabalho de Cho e colegas demonstra claramente que a transferncia horizontal ocorre e

mais freqente do que se imagina. Isso torna imperativo estudar o fluxo gnico entre plantastransgnicas e espcies afins, antes de sua liberao para cultivo, para testar a possibilidade deuma irradiao de genes, que podem ser desejveis em uma espcie mas completamenteindesejveis em outras. A probabilidade desta irradiao aumenta com o aumento do cultivodestas plantas, principalmente no sistema de monocultura. Num dado momento, um mesmogene poder estar presente em milhes de plantas, aumentando o risco da transfernciahorizontal.

1.2.2-cido ribonucleico - RNAApesar de ser tambm um cido nucleco, o RNA tm muitas diferenas em relao ao

DNA. Em primeiro lugar, todos os RNAs so formados por apenas uma fita. Entretanto, podeapresentar uma configurao denominada de secundria, quando ocorre o pareamento entrebases complementares. Ao invs de desoxirribose como no DNA, o acar do RNA uma ribose(uma oxidrila a mais em relao a desoxirribose do DNA). A terceira principal diferena apresena de uracil (U) ao invs de timina (T). Podem ocorrer pelo menos quatro tipos de RNA:mRNA (1-3%), rRNA (>90%), tRNA (1-2%) e sRNA (?%), denominados de mensageiro,

ribossomal, transportador e smallRNAs, respectivamente. Cada um deles desempenha funesespecficas. Dentro do ltimo grupo, so includos um grande grupo de RNAs, muitos dos quaisainda sem funo conhecida. Outros esto envolvidos na regulao gnica.

Alm das funes de mensageiro entre o DNA e os ribossomos, formador dosribossomos, e transportador de aminocidos, os RNAs podem ainda desempenhar a funo decatlise e de regulao gnica. A funo de catlise (at ento exclusividade das protenas) foidescoberta na dcada passada e os RNAs que tm esta habilidade, as ribozimas, realizam aseparao do RNA transcrito em vrias partes, fenmeno que se chama de splicing. Oautoprocessamento do RNA no idntico catlise enzimtica executada pelas protenas.Numa reao enzimtica, a protena se envolve mas liberada intacta ao final do processo. No

caso do autoprocessamento, o pr-RNA se processa a si prprio, sem a presena de enzimas,mas no se regenera no fim do processo. Portanto, o pr-RNA no uma enzima, mas tem apropriedade de catlise. Alm disso, foi verificado experimentalmente que o RNA tem acapacidade de retirar bases de um segmento de RNA e adicion-las em outro, demonstrando acapacidade de sintetizar algo semelhante a si prprio.

mRNA

Resultam da transcrio de um gene. So os RNA mensageiros (mRNA), aqueles quesero decodificados pelos ribossomos e contm informaes para a produo de uma protena.O tamanho dos mRNAs varivel, dependendo do nmero de bases contidas no gene transcrito.

Como contm uma mensagem, diz-se que existe uma colinearidade entre as bases do mRNA ea sequncia de aminocidos da protena resultante de sua decodificao. O tempo de vida de


12/20

um mRNA muito pequeno. Na maioria dos procariotos a meia vida de um mRNA noultrapassa 2 minutos. J nos eucariotos, alguns mRNAs duram algumas horas.

rRNA O RNA ribossomal (rRNA) tambm resultante da transcrio de genes de uma regiodo DNA, neste caso denominada de rDNA. O produto da transcrio no decodificada, pois osprprios RNAs produzidos juntamente com protenas vo formar os ribossomos e executar afuno especfica, que a produo de protenas. Participam da formao do ribossomo de umprocarioto trs rRNAs: o 5S rRNA com 120 nucleotdeos, o 16S rRNA com 1542 nucleotdeos e o23S rRNA com 2904 nucleotdeos. Nos eucariotos, estes rRNAs so um pouco maiores edesignados de o 5S rRNA, o 18S rRNA e o 28S rRNA. Entretanto, nem todos os eucariotos tmos rRNAs do mesmo tamanho.

tRNADenominada de adaptadores por Francis Crick, o tRNA (RNA transportador) um RNA

que tem a funo especfica de transportar os aminocidos at o ribossomo durante a sntese deuma protena. So molculas relativamente pequenas, contendo de 73 a 93 nucleotdeos. Doscidos nucleicos conhecidos, o tRNA o nico que apresenta algumas bases que no A, C, G eT. Numa clula existem pelo menos tantos tRNAs quanto so os aminocidos, e estes estoligados ao tRNA na extremidade 3'OH. A estrutura tridimensional de um tRNA assemelha-se auma folha de trevo, contendo numa das alas (loop ou hairpin) o anticodon, que umaseqncia de trs bases.

Outros RNAsExistem outros RNAs, muitos deles transcritos e que permanecem no ncleo da clula

sem funo aparente (hnRNA). Outros RNAs, de cadeia curta, chamados de snRNA, estoenvolvidos na regulao gnica. Mais recentemente, descobriu-se que alguns RNAs podem sedeslocar de suas clulas e desempenhar uma atividade em outra clula, provavelmenteregulatria.

1.2.3-cido peptdeo nucleico (PNA)Esta nova molcula, criada em 1991 em laboratrio, tm as quatro bases nitrogenadas do

DNA ou RNA ligadas ao esqueleto de uma protena. Este novo composto sinttico alm de sermais estvel nas clulas que o DNA e o RNA, se liga naturalmente a estes com uma intensidade50 a 100 vezes mais forte que os prprios cidos nucleicos naturais o fazem entre si. Quando seliga ao DNA, forma uma estrutura de trs fitas. Isto permite o uso destas molculas na terapiagnica, pois pode provocar a indisponibilidade daquela regio genmica ser acessada porenzimas e protenas. Neste caso, poderia ser utilizado um PNA para se ligar a um genedefeituoso que, ento, deixaria de expressar uma protena defeituosa. Os PNAs podem procurare se ligar a outra fita com seqncia complementar de bases, estratgia similar ao antisenso.

O PNA construdo ligando-se cada base nitrogenada a um peptdeo ao invs de umacar e um grupo fosfato. Como a cadeia de peptdeos tm carga eltrica neutra, os PNAs

apresentam uma grande capacidade de ligao, eliminando a repulso criada pela carga eltricanegativa devido a presena dos grupos fosfatos presentes no DNA e RNA. Alm disso, os PNAs


13/20

podem atacar genes invadindo a dupla hlice, algo que DNA e RNA no conseguem. Mais ainda,a qumica de peptdeos simples e mais barata que sintetizar cidos nucleicos.

Este produto da biotecnologia poder ser aplicado na sade humana. O principalargumento da utilizao dos PNAs em diagnstico, decorre do fato da grande afinidade com oalvo; quanto maior a afinidade, maior a possibilidade de ligao com seqncias especficas e

consequentemente, a sua marcao. Mas como a molcula artificial, ainda no se conheceainda a sua toxicidade.

1.2.4-cidos nucleicos e a origem da vidaComo capaz de armazenar o cdigo gentico em alguns vrus, tem a funo cataltica e

de regulao gnica, o RNA passou a ser admitido (hiptese) como a provvel molcula quepoderia ter originado a vida a partir do 'caldo primitivo'. Esta teoria tem recebido contribuiescientficas por uma grande quantidade de cientistas do mundo inteiro. Duplicando RNAssemelhantes como os RNAs ribossomais e participando da produo das protenas, o RNA um

forte candidato a ser a estrutura do primeiro ser vivo na face da Terra. A funo cataltica,entendida aqui como sendo a capacidade de quebrar e ligar outros RNAs, j foi comprovada. Htambm resultados de pesquisa que atribuem ao RNA a capacidade de editorao, um sistemasimplificado do sistema de reparo do DNA. Os vrus que possuem RNA como material genticonecessitam da enzima transcriptase reversa para produzir DNA e ento se replicarem. Quandose provar que o RNA tem ou teve capacidade de autoduplicao, ser dado um passo importantefavorvel a hiptese do 'Mundo do RNA'. Nenhuma outra molcula teria a capacidade e aversatilidade de desempenhar tantas funes como o RNA no 'caldo primitivo'. Outra hipteseconsidera uma molcula mais simples, precursora do RNA, composta de um cido nucleicoligado a peptdeos (denominada de PNA).

Alguns cientistas no concordam com estas hipteses por considerarem que asmolculas de RNA so muito complexas para ter tido origem no ambiente primitivo terrestre,onde s havia gua, gs carbnico, nitrognio e radiao ultravioleta. Alm disso, no 'caldoprimitivo' deveriam existir substncias muitos txicas. Em contrapartida, admitem que sob ascondies primitivas, a estrutura cristalogrfica dos minerais seria capaz de reduzir dixido decarbono para formar aldedos e a partir destes se formariam acares e molculas orgnicasessenciais. A transferncia de eltrons de uma molcula outra poderia ter contribudo para astransformaes metablicas. Recentemente, cientistas obtiveram molculas de RNA maiscomplexas quando utilizaram uma mistura de pequenas molculas de RNA sob condies dealtas temperaturas, situao que deve ter ocorrido na poca do surgimento da vida.

Outra possibilidade da origem da vida seria via metablitos secundrios. Tais metablitos,no atual estgio evolutivo considerados secundrios, teriam sido relevantes no perodo pr-bitico como integrantes do metabolismo primrio responsvel pela sntese dos cidos ncleicose traduo e replicao.

De qualquer forma, a hiptese de maior consenso a de que o RNA teria sido o primeiromaterial gentico sobre o qual a evoluo agiu, resultando numa quantidade enorme de formasde vida que se conhecem atualmente.

II-REPLICAO (Replication)

O DNA funciona como um modelo para a sntese de novas fitas de DNA de maneirasemiconservativa, ou seja, cada uma das duas molculas filhas tem uma fita da molcula mee outra recm sintetizada. A replicao ocorre bidirecionalmente a partir de uma (procariotos) ou


14/20

vrias (eucariotos) origens. A replicao precisa (alta fidelidade), ou seja, a maioria dos errosso corrigidos. Cabe a replicao o desafio maior de perpetuar, com alta fidelidade, um genomae ao mesmo tempo permitir erros que originam a variabilidade necessria para a evoluo.

A origem de replicao uma regio do DNA que contm uma seqncia de basesespecfica. Nas bactrias s existe uma destas seqncias. A rigor, a replicao completa do

cromossomo de uma bactria depende da iniciao nesta seqncia. Neste caso, dito que asbactrias tem apenas um replicon. Replicon a unidade de DNA no qual a replicao ocorre apartir de uma origem. J os eucariotos, por terem genomas bem maiores que as bactrias e maisde um cromossomo, tm vrias origens de replicao. Nas leveduras (ex: Saccharomycescerevisiae) existem pelo menos umas 500 origens de replicao, denominadas de ARS(Autonomously Replicating Sequences); ou seja, 500 replicons. Na Drosophila melanogasterexistem cerca de 3.500 replicons. J na Vicia fabaestima-se a presena de pelo menos 35.000replicons. As origens de replicao dos eucariotos so ativados em diferentes tempos durante operodo de replicao do ciclo celular (fase S da mitose). Estas origens de replicao estoespaadas em mdia de 50 a 100 kb. A velocidade de replicao em Escherichia coli, a bactria

residente no intestino de todas as pessoas, chega alcanar 50.000 bases por minuto. Noseucariotos, o movimento do garfo de replicao pelo menos 10 vezes mais lento.Os vrus apresentam um modo de replicao especfico denominado de crculo rolando

(rolling circle). Um vez iniciada a replicao, o genoma circular vai sendo replicadoindefinidamente. Posteriormente uma enzima produzida pelo prprio genoma viral, corta a longacadeia produzida em partes iguais, cada uma contendo uma cpia do genoma do vrus, a sersubseqentemente encapsulada.

Mais de 20 enzimas atuam diretamente no processo de replicao das bactrias. Asprincipais protenas envolvidas e sua funo na replicao so apresentadas abaixo:

toposisomerases - desenovelam o DNA

helicases - separam as duas fitasSingle strand binding proteins (SSB) - protegem o DNA na forma de fita simplesPrimase - adiciona os primersou iniciadoresDNA polimerase III - polimeriza, i.., adiciona os dNTP no sentido 5'-3'DNA polimerase I - substitui os iniciadores de RNA por bases do DNA; tambm tem a

funo de reparoligase - une os dNTP de dois fragmentos.

Nos procariotos, alm destas duas polimerases, existe uma terceira, a DNA polimerase II,cuja funo ainda desconhecida. Das trs, somente a DNA Pol I apresenta a funo de edio

ou seja, de correo dos possveis erros de replicao. A DNA Pol I formada por vrias sub-unidades. O agrupamento de algumas delas forma o que se conhece por fragmento Klenow,utilizado para replicao do DNA in vitro. Este fragmento no tem a habilidade de edio como aenzima completa, pode ser comprado de vrios fornecedores e usado em laboratrios. A DNAPol III formada por sete sub-unidades ou polipetdeos.

Nos eucariotos tambm existem trs polimerases. Duas delas atuam no ncleo, sendoque a DNA Pol teria a mesma funo que a DNA pol III dos procariotos. A DNA Pol teria afuno de reparo. A terceira polimerase (DNA Pol ) especfica para a replicao do genomadas mitocndrias.

A replicao dos genomas dos retrovrus, que so codificados por RNA, feita pela

transcritpase reversa (RT), o que pode produzir inmeros variantes. O conhecimento da naturezamolecular destes vrus permite a criao de estratgias para combat-los. Molculas ribozimas


15/20

de RNA, foram engenheiradas e podem ser introduzidas nos hospedeiros para procurar edestruir o genoma do HIV, cortando-os em dois.

O avano no conhecimento cientfico sobre a replicao foi de fundamental importnciano desenvolvimento da reao da polimerizao em cadeia (PCR), uma das tcnicasmoleculares mais utilizadas no momento.

III-TRANSCRIO (Transcription)Transcrio o processo pelo qual uma regio do DNA transcrita resultando num RNA.

Existem dois grandes grupos de RNAs: (i) os RNA mensageiros (mRNA), aqueles que serodecodificados pelos ribossomos e contm informaes para a produo de uma protena e (ii) ooutro grupo de RNAs, formado pela transcrio de determinadas regies genmicas e quepermanecem como RNA para executar uma funo especfica. Entre eles esto o transportador(tRNA), o ribossomal (rRNA) que juntamente com protenas forma os ribossomos e outros RNAs(snRNA, hnRNA, etc.) com funo na regulao gnica ou desconhecida. A regio (segmento)do DNA transcrita a parte estrutural do gene.

A transcrio nos procariotos feita pela RNA polimerase. Numa E. colipodem existir at3.000 cpias dela. Esta enzima usa o DNA como molde e sintetiza uma cadeia de nucleotdeosde RNA complementar ao molde. Aparentemente no h conferncia do produto transcrito. Seno DNA esto A, C, G e T, vai aparecer no mRNA U, G, C e A, respectivamente. A exemplo dareplicao, a transcrio ocorre na direo 5'-3'.

Seis peptdeos ou sub-unidades fazem parte da RNA pol ('2). A rigor o fator tema habilidade de reconhecer o promotor, que a regio 5', situada imediatamente anterior aoincio da parte codificadora (ou estrutural) do gene. Posteriormente, juntam-se ao fator s osdemais peptdeos quando ento a RNA Pol inicia o processo de transcrio. Vrios fatores detranscrio (pequenos polipeptdeos), os TFs, atuam no incio, durante a elongao e no trmino

da transcrio.O fator de fundamental importncia. Quando um vrus entra numa clula hospedeira,um fator do vrus transcrito e agora os outros cinco peptdeos da RNA Pol ficam a disposiodo fator do vrus, que reconhece to somente os genes do vrus. Desta forma, em pouco tempoos vrus conseguem expressar seus genes no hospedeiro e se replicando a uma velocidadeimpressionante, atingem milhes de cpias. Afetam drasticamente o organismo hospedeiroporque tambm reprimem a produo de protenas deste.

O promotor das bactrias formado por duas seqncias localizadas nas posies -10 e-35 (regio 5') da base codificante +1 do gene. Nestas regies, normalmente so encontradas asseqncias (consenso) TATAAT (denominada de TATA box ou Pribnow box) e TTGACA

(CAAT box), respectivamente. Nos eucariotos, a regio regulatria dos genes bem maiscomplexa. Em alguns casos, podem ser encontrados vrios elementos que controlam ou afetama transcrio. Entre eles esto o promotor, o enhancere elementos como o GLE, o MRE, etc.Os enhancersso seqncias de DNA que esto muito distantes dos genes e so compostas deseqncias muitas vezes repetidas. Os elementos, so sequncias de DNA, que so alvos deligao para protenas especificas, que constituem o que se chama de fatores de transcrio(TF). Os fatores de transcrio podem aumentar dramaticamente a taxa de transcrio de umgene nos organismos eucariotos. Alm do promotor outras regies podem acelerar a taxa detranscrio como os enhancerse os terminadores. Os terminadores so seqncias que a RNAPol identifica como o fim da regio de DNA codificadora ou de um gene.

Existem algumas diferenas entre eucariotos e procariotos com relao a transcrio. Emprimeiro lugar existem trs RNA polimerases ao invs de uma. A RNA Pol I s transcreve orDNA (sequncia de DNA que codifica o rRNA). A RNA pol II transcreve os genes que codificam


16/20

para protenas, produzindo ento mRNAs. Os demais RNAs (tRNA, snRNA e a 5 S rRNA) sotranscritos pelo RNA pol III. Nos procariotos, os ribossomos identificam os mRNAs porque estesapresentam uma seqncia denominada de Shine-Dalgarno que includa antes das basescodificadoras, complementar a uma regio do componente 16 S rRNA. Por sua vez os mRNAsdos eucariotos apresentam uma estrutura denominada de quepe (Cap) resultante de uma

ligao 5'-5' entre duas guaninas ou entre G e A. Aps a transcrio, ao mRNA adicionadouma longa cauda de adeninas, o que se convencionou denominar de poli-A. Esta caractersticados eucariotos permite a separao dos mRNAs dos demais RNAs, o que normalmente pode serfeito em laboratrio. Nos procariotos, a cauda de adenina bem reduzida. Uma quarta diferenaentre procariotos e eucariotos relaciona-se com o processamento do pr-mRNA nas clulaseucariotas. Nestas, aps a transcrio, so removidos os intronsdo pr-mRNA. S ento, esteRNA se desloca para o citoplasma e recebe a denominao de mRNA.

IV-TRADUO (Translation)

Traduo o processo de decodificao do mRNA nos ribossomos resultando naformao de um peptdeo. Na maioria dos casos as protenas so formadas por apenas umpeptdeo. Para a produo de um peptdeo in vitroso necessrios o mRNA, os ribossomos, ostRNAs, os amino cidos, fatores da traduo e energia.

Os ribossomos dos procariotos so formados por duas sub-unidades: a grande, chamadade 50 S, constituda por dois rRNAs, o 23 S rRNA e o 5 S rRNA, e por 34 protenas; apequena, chamada de 30 S, constituda pela unidade 16 S rRNA e por 21 protenas.Dependendo da fase, uma bactria pode ter aproximadamente 5.000 ribossomos, o querepresenta 25% da massa celular.

Os tRNAs so os RNAs transportadores, tambm chamados de adaptadores, que

transportam os amino cidos do meio at os ribossomos para serem incorporados cadeiapeptdica. Uma enzima, encarregada de carregar o amino cido especfico na extremidade3'OH do tRNA, com base no seu anticodon. Existem mais de 20 tRNAs, pois na maioria doscasos, mais de um codon codifica para um mesmo amino cido.

O processo de traduo (5'-3') inicia quando a sub-unidade pequena do ribossomoreconhece a seqncia lder do mRNA. Em seguida o primeiro codon (um conjunto de 3 bases) lido e geralmente codifica para metionina. Um tRNA traz o amino cido correspondente ao codonlido. Sucessivamente os codons vo sendo lidos e os amino cidos correspondentesincorporados ao peptdeo nascente pela enzima peptidil transferase. A velocidade da traduochega a 40 amino cidos por segundo. Qualquer um dos codons de terminao UAG, UAA ou

UGA, significa o fim do peptdeo, cuja interpretao feita pelos ribossomos. Nos procariotos,algumas mensagens so policistrnicas.

Nos procariotos a traduo simultnea transcrio. Mais ainda, um mesmo mRNApode ser traduzido por dezenas de ribossomos enfileirados, o que resulta num nmero elevadode cpias repetidas de uma protena a partir de uma nica molcula mensageira.

O cdigo gentico est estruturado em codons (trincas), cada um com trs bases. Aprobabilidade de associar trs bases independentemente da ordem e natureza de 64. Trscodons so de terminao. Os outros 61 codificam os 20 amino cidos. Consequentemente, ummesmo amino cido pode ser codificado por mais de um codon.

As principais caractersticas do cdigo gentico so:

- estruturado em trinca de bases- no h sobreposio (uma base pertence a um e somente um codon)


17/20

- universal (refora a teoria da origem nica da vida); somente poucas diferenas com o cdigogentico das mitocndrias- degenerativo (mais de um codon codificam para um mesmo amino cido)- o primeiro codon (das protenas) AUG ou GUG- h diferena ou preferncia de uso de diferentes codons de um mesmo amino cido

- a hiptese de Wobble permite a no ocorrncia dos 61 tRNAs.

Tabela 2. Cdigo gentico do RNA mensageiro.Primeira

baseSegunda

baseTerceira

baseU C A G

U UUU - Phe UCU - Ser UAU - Tyr UGU Cys UUUC - Phe UCC - Ser UAC - Tyr UGC Cys CUUA - Leu UCA - Ser UAA Stop UGA Stop A

UUG - Leu UCG - Ser UAG - Stop UGG Trp GC CUU - Leu CCU - Pro CAU - His CGU - Arg U

CUC - Leu CCC - Pro CAC - His CGC - Arg CCUA - Leu CCA - Pro CAA Gln CGA - Arg ACUG - Leu CCG - Pro CAG Gln CGG - Arg G

A AUU - Ile ACU - Thr AAU Asn AGU - Ser UAUC - Ile ACC - Thr AAC Asn AGC - Ser CAUA - Ile ACA - Thr AAA Lys AGA - Arg AAUG - Met ACG - Thr AAG Lys AGG - Arg G

G GUU - Val GCU - Ala GAU Asp GGU - Gly U

GUC - Val GCC - Ala GAC - Asp GGC - Gly CGUA - Val GCA - Ala GAA Glu GGA - Gly AGUG - Val GCG - Ala GAG Glu GGG - Gly G

O conhecimento do funcionamento desta fbrica permitiu a compreenso da ao dosantibiticos e o desenvolvimento de remdios para vrias doenas. Geralmente os antibiticos seligam ao rRNA ou s protenas dos ribossomos, impedindo ou a leitura do mRNA, ou oemparelhamento do tRNA com o ribossomo ou impedindo outra atividade nos ribossomos. Como

os ribossomos dos procariotos so diferentes dos eucariotos, um antibitico pode afetar ofuncionamento da sub-unidade pequena (30 S) de uma bactria, sem contudo interferir noribossomo da clula eucariota hospedeira, cujas sub-unidades tem rRNAs de diferentestamanhos e seqncia.

V-MUTAO E REPAROMutao uma modificao no DNA. Mutante o fentipo resultante da mutao. As

mutaes so causadas por erros de replicao do DNA e alteraes do DNA por deleo,duplicao ou rearranjamentos causados por vrus, transposons, ao enzimtica ou processos

fsicos e qumicos. A taxa mdia de mutao que ocorre naturalmente atinge 1x10-7. Agentesqumicos e fsicos (radiaes) so utilizados em laboratrio para aumentar esta taxa.


18/20

Uma mutao dita silenciosa quando o codon alterado, mas no muda o amino cidocodificado e consequentemente, a cadeia peptdica. Ela neutra quando, mesmo alterando oamino cido, a protena permanece com a mesma funo. Aqui surge o conceito de polimorfismoa nvel molecular: diferentes gentipos com o mesmo ou diferentes fentipos. A mutao com oefeito mais crtico aquela que provoca a insero ou remoo de uma base (frameship). Como

conseqncia, todos os codons localizados aps a mutao ficam alterados, ou seja, a cadeia setorna diferente do padro anterior. Mutaes ocorrem naturalmente. As mutaes mais comunsso aquelas de ponto, onde apenas uma base alterada. Outras mutaes com profundasimplicaes no fentipo so aquelas decorrentes de delees, adies, inverses etransposies.

preciso salientar que o prprio DNA tem mecanismos de produzir mutaes em simesmo, independentemente do ambiente. Um deles atravs dos elementos mveis existentesno genoma: os transposons. Transposons so seqncias de DNA que se movem (pulam) deum lugar para outro no genoma. A transposio deixa duplicadas as bases imediatamenteprximas desta seqncia (entre 5 e 9), alm de causar interrupes de outros genes quando

neles se inserirem. Outras vezes, o transposon se duplica e a nova cpia se insere num outroponto do genoma. Apesar de no serem ainda bem conhecidos, sabe-se que em alguns casosos transposons carregam genes de resistncia a antibiticos. Como eles afetam a evoluo,devem ter outras funes celulares ainda no descobertas. Uma deles poderia ser o controle doestresse celular. No entanto, eles tem sido tratados como 'genes egostas' porque eles sconseguem se replicar quando dentro do cromossomo, garantindo a sua prpria permanncia nogenoma. Nos procariotos, os vrus podem se integrar ao genoma do hospedeiro, podendo causarduplicaes ou delees. Ou seja, existem causas naturais de produo de mutaes,responsveis pela propulso da evoluo.

O nmero de mutaes que ocorre num organismo relativamente muito grande.

Entretanto, os seres vivos dispem de vrios sistemas de reparo, que corrigem a maioria doserros ocorridos. Outros erros, quando no corrigidos, podem causar enormes problemas tanto nasobrevivncia como na reproduo do organismo. Neste caso atua a seleo natural, oueliminado este indivduo ou fazendo com que ele deixe um menor nmero de descendentes. Oacmulo de mutaes em diferentes populaes pode provocar, a longo prazo (prazo em termosde evoluo), a diminuio da freqncia de cruzamentos com o conseqente incio daespeciao, processo que pode culminar com a origem de uma nova espcie.

A nvel de laboratrio, os agentes qumicos mais utilizados para induzir mutaes so: etilmetil sulfanato (EMS), cido nitroso, etil metano e alguns agrotxicos ou defensivos. A ao dosagentes qumicos normalmente produz alterao de uma base qualquer. Exemplo: substituio

de A por T. Muitos vegetais contm substncias que causam mutaes na espcie humana. Ex:nas frutas e legumes so encontradas as psoralenas (o limo contm quantidades elevadas),que tambm dimerizam duas timinas, se ocorrem lado a lado. Entre os agentes fsicos, os maisusados so as radiaes (UV, gama, etc.). Os agentes fsicos geralmente causam quebras erearranjos de cromossomos. Especificamente a radiao UV causa a dimerizao de duastiminas se estiverem lado a lado. Durante a replicao, a DNA Pol no consegue ler este dmero,o que provoca a insero de duas bases quaisquer no lugar das timinas, se no houver reparo.Muitos problemas de pele so causados pela radiao UV. por isto que existe tantapreocupao com a diminuio da camada de oznio, pois este atua como uma barreira aosraios UV.

A mutagnese direcionada permite a alterao de uma ou mais bases de umaseqncia de DNA qualquer. Inicialmente a seqncia de interesse inserida num vetor, como ovrus M13 que de fita simples. Posteriormente feito um primer(iniciador) num sintetizador de


19/20

oligonucleotdeos. Este primer complementar a um certo segmento da seqncia de interesse,mas contendo uma base diferente. Posteriormente, o restante da molcula duplicado.Resultado: a nova seqncia difere da original por uma base apenas. Esta seqncia pode seravaliada in vitro ou in vivo. Pela tcnica da recombinao homloga, esta seqncia mutantepode substituir a seqncia normal de um organismo. Desta forma, avaliado o efeito de uma

mutao in vivo.Foi desenvolvido por Ames, um teste para avaliar a capacidade mutagnica dos produtosqumicos utilizados, com base no tipo de mutao que os produtos provocam. Tais produtosqumicos so classificados quanto ao potencial de causar danos nas pessoas, dependendo dotipo de mutao e a freqncia que so causadas. Este teste associa a capacidade de aomutagnica com a capacidade de causar cncer, pois estas duas esto estreitamenterelacionadas. Outros tipos de testes tambm so utilizados para confirmar a periculosidade doproduto. Com base nestes testes, a fabricao e a comercializao de muitos produtos qumicosj foram proibidas.

VI-METILAOUma frao das citosinas no DNA de muitos organismos torna-se metilada (5mC) aps a

replicao. Esta metilao no tem distribuio ao acaso. Algumas seqncias como asdenominadas ilhas de CpG em animais, so raramente ou no metiladas. Enquanto algumasseqncias so metiladas em certas condies, como aquelas herdadas da me e no do pai,outras so sempre metiladas em todos os tecidos.

Nas plantas e fungos as ilhas CpG so freqentemente metiladas pelas metilases,embora h evidncia de uma substancial quantidade delas no metiladas. Em fungos, ametilao atinge 1,5% das Citosinas e no ocorre somente de forma simtrica.

Tanto o controle da metilao quanto sua funo nos eucariotos, ainda no sosuficientemente compreendidos. A metilao tem sido correlacionada com reduo na atividadegnica, havendo evidncias de inibio da expresso de vrios genes. Em ratos, a reduo dametilao do DNA em 70%, resultante da mutao no gene metiltransferase do DNA, leva amorte os indivduos na embriognese. A hiptese levantada admite que as regies com basesmetiladas dificilmente so transcritas. Neste caso, a morte dos ratos poderia ter sido provocadapela falta de protenas e/ou RNAs. A metilao tambm requerida para o comportamentonormal dos cromossomos em Neurospora crassa. Sua necessidade foi comprovada, mas suafuno ainda no est totalmente esclarecida.

VII-REGULAO GNICANa definio de Jacob e Monod (1961), gene uma seqncia de DNA que codifica para

um produto difusvel. A regio regulatria do gene uma seqncia de DNA que no convertida em outra forma (como a regio codificadora) e que s funciona in situ. Alm disso,existem genes estruturais e genes reguladores de outros genes.

O princpio bsico da regulao gnica a interao entre protenas regulatrias e certasregies (seqncias) do DNA. Assim, nos procariotos a regulao gnica chamada denegativa se um gene no se expressa caso o repressor, que uma protena, liga-se ao DNA naregio do promotor do gene. Para que o gene possa ser transcrito, h a necessidade de remover

a protena repressora. Isto possvel, pela presena do indutor, para o qual a protenarepressora tem muito mais afinidade que pela regio do DNA responsvel pela regulao dogene. O indutor ento, tem um efeito inativador sobre o repressor. Este tipo de regulao gnica


20/20

o mais comum nos genes de organismos procariotos. No controle dito positivo, o maisfrequente nos eucariotos, o gene ativado pela presena de um ativador. Em outras palavras,no controle negativo, a interao protena-DNA desliga o gene, enquanto no controle positivo, ainterao liga o gene.

O controle negativo bastante comum nas bactrias, onde a maioria dos genes estariam

ligados (on) at que os repressores os desligariam (off). J o sistema positivo mais comum noseucariotos, onde os genes estariam desligados at que os ativadores os ligariam.A rigor, existem cinco pontos de controle na regulao de um gene eucarioto: 1) na

ativao de gene estrutural, 2) no incio da transcrio, 3) no processamento da transcrio, 4)no transporte para o citoplasma e 5) na traduo do mRNA. Na ativao de um gene estrutural,um gene regulado por uma seqncia no promotor e/ou no enhancer, as quais soreconhecidas por protenas especficas. Esta protena funciona como um fator de transcrionecessrio para o incio da transcrio atravs da RNA Pol. Protena ativa s disponvel sobcondies quando o gene para ser expresso. In vitro possvel modular a regulao nosdiversos pontos de controle. In vivo, a adio de determinados genes permitem o controle de um

ou mais pontos de controle.Nos eucariotos ainda no se conhece profundamente a regulao gnica. Entretanto,vrios mecanismos j foram amplamente estudados. Em primeiro lugar, um grande nmero degenes so ativados em determinados tecidos e rgos e no em outros. Os genes denominadosde Homeobox so os responsveis por este controle. J nas primeiras divises celulares dozigoto formado, os genes Homeobox se encarregam de marcar quais os genes que podero equais os genes que no podero ser expressos num determinado tecido ou rgo. Outros genesdependem de um complexo sistema de eventos: sinal ambiental (temperatura, umidade, etc.)faz com que uma substncia seja produzida e/ou movida para as clulas. Este sinal qumicoseria recebido por um receptor na clula, cujo complexo tem habilidade para penetrar no ncleo

da clula e ativar um conjunto de genes de forma coordenada.

ApostilaBiotecnologia2

Documents

Transcript of ApostilaBiotecnologia2