Apresentação TCC Emanuel Meneses Barros

Universidade Federal do Ceará Centro de Tecnologia

Departamento de Engenharia Química Trabalho de Conclusão de Curso

“Isolamento, identificação e produção de etanol, utilizando uma levedura obtida do suco de caju”

Aluno: Emanuel Meneses Barros Orientadora: Profa Dra Luciana Rocha Barros Gonçalves Co-Orientadora: Profa Dra Maria Valderez Ponte Rocha

INTRODUÇÃO

ETANOL: JUSTIFICATIVAS

Problemas ambientais da

atualidade

Redução da emissão de carbono na atmosfera

Diminuição da dependência de

combustíveis fósseis

Investimento em fontes renováveis de energia

Brasil: Segundo maior produtor

mundial

Investimento da Petrobrás

INTRODUÇÃO

ETANOL: PROPRIEDADES E APLICAÇÕES

Combustível

Indústria Química

Elevado número de octanagem

Verde

Produzido a partir de matérias-primas

acessíveis

Utilizado puro ou misturado

a gasolina

Produção de eletricidade

INTRODUÇÃO

AGROINDÚSTRIA DO CAJU

Desempenha importante papel na economia do estado Do Ceará.

Somente 12% do pedúnculo total é processado

Abundância e baixo

custo(R$ 0,25/kg).

Rica composição

de nutrientes do pedúnculo

Benefício econômico -ambiental

Meio de cultura

ideal para produzir

etanol

INTRODUÇÃO

FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

2C6H12O6 + H2O C2H5OH + CH3COOH + 2CO2 + 2C3H8O3

MONOSSACARÍDEO ÁLCOOL ÁC. ACÉTICO GLICERINA

FERMENTAÇÃO

http://www.magma.ca/~scimat/Yeast-2m.jpg

OBJETIVOS

• Isolar uma levedura do suco de caju integral.

• Realizar a identificação molecular da levedura isolada do suco de caju, de forma a descobrir a qual gênero essa levedura está relacionada.

• Avaliar o efeito da temperatura na produção do etanol utilizando a levedura isolada do suco de caju

• Avaliar o efeito do pH na produção do etanol utilizando a levedura isolada do suco de caju

• Ajustar um modelo cinético aos processos fermentativos

MATERIAIS E MÉTODOS

ISOLAMENTO DA LEVEDURA PRESENTE NO SUCO DE CAJU

30 mL de suco

fermentado

120 mL de meio caldo

YEPD

30 °C, 150 rpm, durante 24 horas

Centrifugação a 6000 rpm por 10 minutos.

Precipitado

Placa petri com meio Ágar Sabouraud

Estufa bacteriológica à 30°C durante 48 horas.


IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR

O procedimento de Identificação molecular foi realizado no Laboratório de Ecologia Microbiana e Biotecnologia pertencente ao Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará



A cepa de levedura cresceu em meio complexo YEPD à 25 °C, durante 24 horas com agitação. 4 mL foram, então, centrifugados à 10000 rpm por 5 minutos e o pellet de células foi lavado com água. O DNA genômico foi obtido com extração usando reagente CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio)



O opéron de rRNA, abrangendo o gene de rRNA 5.8S e o acompanhamento interno dos espaçadores transcritos ITS1 e ITS2, foram amplificados por PCR usando o conjunto de primers ITS1 (5’-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3’) e ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TATGC-3’) As reações de amplificação foram realizadas num volume final de 25 uL contendo 50 ng de DNA genômico, 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, 50 mM KCl, 3,0 mM MgCl2, 200 uM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP, 20,0 pmoles de cada iniciador e 1,0 unidades de Taq DNA polimerase


ESTUDO DA PRODUÇÃO DE ETANOL POR UMA LEVEDURA ISOLADA DO SUCO DE CAJU


PREPARO DO INÓCULO


Solução turva


Precipitado de massa celular

300 mL de meio YEPD esterilizado

6 alçadas

Obtenção de 5 g.L-1 de

massa celular

Células ativadas em meio YEPD com ágar


ESTUDO DO EFEITO DA TEMPERATURA NA PRODUÇÃO DE ETANOL POR UMA LEVEDURA OBTIDA DO SUCO DE CAJU

Foi utilizado o meio de cultura sintético com os seguintes componentes:

Componente Concentração

Glicose (C6H12O6) 45g/L

Frutose (C6H12O6) 45g/L

Sulfato de amônio ((NH4)2SO4) 2,5g/L

Fosfato monobásico de potássio (KH2PO4)

0,5g/L

Sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4.7H2O)

0,65g/L

Sulfato de zinco (ZnSO4) 0,65g/L

O meio teve o pH ajustado para 4,5 ± 0,1 e foi autoclavado à 110°C durante 10 minutos.

FERMENTAÇÃO BATELADA


Ensaio de Produção de etanol utilizando 250 mL de meio de

cultura a 150 rpm e utilizando 5 g.L-1 de células

Estudo da Temperatura (28, 30,

32, 34, 36 e 38 °C

Determinação da

concentração celular

Separação das células

Análise do sobrenadante

CLAE: Análise da concentração de glicose, frutose e etanol.


Densidade óptica a 660 nm.


ESTUDO DO EFEITO DA TEMPERATURA POR UMA LEVEDURA OBTIDA DO SUCO DE CAJU

Após, foi escolhida a temperatura média do intervalo mais adequado ao processo e realizado um ensaio com o suco de caju na mesma temperatura e mesmo pH inicial. Com isso, foi realizada a comparação entre os parâmetros cinéticos da fermentação com o suco de caju e com o meio sintético.





Comparação entre MS e o CAJ

Determinação da








ESTUDO DO EFEITO DO pH POR UMA LEVEDURA OBTIDA DO SUCO DE CAJU.

Foi utilizado o suco de caju integral como fonte de carbono

A temperatura utilizada em todos os ensaios foi a mais adequada resultante dos estudos anteriores do efeito da variação da temperatura utilizando a levedura isolada do suco de caju


ESTUDO DO EFEITO DO pH POR UMA LEVEDURA OBTIDA DO SUCO DE CAJU.

• O suco de caju integral foi cedido pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Embrapa CE. • O suco foi centrifugado a 10.000 rpm durante 15 minutos e a concentração inicial de açúcares redutores (glicose e frutose) foi ajustado para 90 g.L-1. • O meio teve seu pH ajustado para 4,5 ± 0,1 com HCl 1N, sendo posteriormente esterilizados em autoclave a 110°C por 10 min

• Foi utilizado o suco de caju integral como meio de cultura





Estudo do pH (3,0, 4,5, 5,5 e 6,3)

Determinação da







VELOCIDADES ESPECÍFICAS DE TRANSFORMAÇÃO


X = Concentração de células (g/L) P = Concentração de etanol produzido (g/L) S = Concentração de substrato (A.R.T) (g/L)

Classificar o processo fermentativo

MODELAGEM E SIMULAÇÃO DOS PROCESSOS FERMENTATIVOS


Para descrever a cinética dos processos fermentativos, utilizou-se o modelo proposto por Monod:

Velocidade específica de crescimento celular é relacionada com a concentração de substrato limitante com ausência de inibição pela mesma.



Assumindo o modelo de Monod, o balanço de massa do biorreator pode ser representado pelo seguinte sistema de equações diferenciais:

Balanço para células

Balanço para substrato

Balanço para produto



Primeiramente, os parâmetros cinéticos do modelo de Monod foram estimados pelo método não-linear de mínimos quadrados de Levenberg-Marquardt a partir de uma rotina de ajuste desenvolvida em FORTRAN versão 6.1.

Para resolver o sistema de equações diferenciais utilizou-se o método de Runge-Kutta-Gill de 4ª ordem.

Para avaliar a qualidade da predição do modelo de Monod aos dados experimentais foi utilizado o teste do desvio padrão residual (Residual Standard Desviation-RSD):



Os valores de RSD são mais comumente encontrados na literatura como uma porcentagem da média dos valores experimentais (ӯ):

Para engenharia de bioprocessos, valores de RSD (%) abaixo de 10% podem ser considerados aceitáveis. Logo, o modelo pode ser utilizado para predizer a cinética fermentativa do processo.

PARÂMETROS DE TRANSFORMAÇÃO E RENDIMENTO


Conversões ou rendimentos da fermentação alcoólica

PARÂMETROS DE TRANSFORMAÇÃO E RENDIMENTO


• Porcentagem Volume de etanol por volume de solução:

• A produtividade volumétrica de etanol (QP, g.L-1.h-1):

• A eficiência da conversão de açúcar em etanol (η, %):

• O consumo de substrato (Ѳs, %):

(YP/S)teórico é igual a 0,511 g.g-1

RESULTADOS E DISCUSSÕES


30 mL de suco

fermentado

120 mL de meio caldo

YEPD



Precipitado

Placa petri com meio Ágar Sabouraud

Estufa bacteriológica à 30°C durante 48 horas.

Solução se tornou

turva


IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DA LEVEDURA ISOLADA DO SUCO DE CAJU

A sequência de 665 pb obtidos apresentaram 100% de identidade com Hanseniaspora opuntiae e estirpes Hanseniaspora uvarum sendo classificados como Hanseniaspora sp e depositados na base de dados NCBI com o número de acesso XXXXX.


ESTUDO DA INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA NA PRODUÇÃO DE ETANOL POR UMA LEVEDURA OBTIDA DO SUCO DE CAJU

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

T = 28 °C

Tempo (h)

Co

nc d

e C

élu

las (

g.L

-1)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Co

nc d

e S

ub

stra

to e

Eta

no

l (g.L

-1)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

T = 30°C

Tempo (h)

Co

nc d

e c

élu

las (

g.L

-1)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Co

nc d

e S

ub

stra

to e

Eta

no

l (g.L

-1)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

T = 32 °C

Tempo (h)

Co

nc d

e c

élu

las (

g.L

-1)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Co

nc d

e S

ub

stra

to e

Eta

no

l (g.L

-1)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

T = 34 °C

Tempo (h)

Co

nc d

e c

élu

las (

g.L

-1)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Co

nc d

e S

ub

stra

to e

Eta

no

l (g.L

-1)



0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

T = 36 °C

Tempo (h)

Co

nc d

e c

élu

las (

g.L

-1)

0

20

40

60

80

100

Co

nc d

e S

ub

stra

to e

Eta

no

l (g.L

-1)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

T = 38 °C

Tempo (h)

Co

nc d

e c

élu

las (

g.L

-1)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Co

nc d

e S

ub

stra

to e

Eta

no

l (g.L

-1)



Visto que o modelo de Monod se adequou bem aos dados experimentais, como etapa seguinte calculou-se o desvio padrão residual (RSD) para que o modelo seja validado estatisticamente

Variável de

saída

RSD (%)

T = 28 °C T = 30 °C T = 32 °C T = 34°C T = 36°C T = 38 °C

X 4,9 5,3 2,2 4,1 4,0 3,4

P 2,8 3,0 6,0 4,0 6,3 4,3

S 7,7 3,2 4,6 5,7 7,4 3,6

Valores de RSD entre 2,2 e 7,7%. Segundo Cleran et al. (1991), na engenharia de bioprocessos os valores de RSD devem se encontrar abaixo de 10% para serem considerados aceitáveis.

MODELO DE MONOD PODE SER UTILIZADO PARA PREDIZER DADOS EXPERIMENTAIS



Parâmetros

Cinéticos

Temperatura

28ºC 30 °C 32 °C 34 °C 36 °C 38 °C

µmáx 0,050 ± 0,002 0,054 ± 0,003 0,064 ± 0,005 0,063 ± 0,001 0,069 ± 0,001 0,054 ± 0,000

YP/S (g.g-1) 0,44 ± 0,00 0,44 ± 0,02 0,44 ± 0,02 0,43 ± 0,00 0,45 ± 0,02 0,43 ± 0,01

YP/X (g.g-1) 11,88 ± 1,93 10,99 ± 0,19 11,19 ± 0,43 11,43 ± 0,12 10,87 ± 2,47 9,34 ± 0,75

YX/S (g.g-1) 0,033 ± 0,005 0,034 ± 0,005 0,038 ± 0,003 0,035 ± 0,003 0,038 ± 0,002 0,045 ± 0,005

Pmáx (g.L-1) 37,98 ± 0,89 37,14 ± 1,02 37,07 ± 0,37 36,92 ± 0,20 37,60 ± 0,52 32,40 ± 0,57

V/V (%) 4,81 ± 0,11 4,71 ± 0,13 4,69 ± 0,03 4,67 ± 0,12 4,80 ± 0,14 4,11 ± 0,08

QP (g.L-1.h-1) 2,37 ± 0,06 2,32 ± 0,06 2,31 ± 0,02 2,24 ± 0,12 2,35 ± 0,03 1,95 ± 0,13

ѲS (%) 99,53 ± 0,17 99,72 ± 0,00 97,77 ± 1,35 99,12 ± 0,43 98,57 ± 0,56 83,66 ± 1,76

η (%) 86,56 ± 0,79 86,59 ± 4,41 86,98 ± 3,69 84,15 ± 0,68 86,11 ± 1,20 84,92 ± 2,06

TESTE DE VARIÂNCIA ANOVA FOI REALIZADO NOS PARÂMETROS



• 38 °C Diminuição da viabilidade celular Não está no intervalo operacional adequado.

• Caráter mesófilo das leveduras

• 28 a 36 °C intervalo operacional adequado

• Em seguida foi realizada a comparação entre uma fermentação no meio sintético e uma fermentação realizada utilizando o suco de caju como fonte de carbono. Para esse ensaio comparativo foi escolhida a temperatura de 32 °C

• 32 °C menor temperatura no intervalo operacional adequado com maior velocidade específica de crescimento celular e porque segundo Atala et al (2001), as fermentações alcoólicas industriais são realizadas mais comumente acima de 30 °C.



Parâmetros

Cinéticos

Meio de Cultivo

Sintético Suco

µmáx (h-1) 0,054 ± 0,003 0,010 ± 0,000

YP/S (g.g-1) 0,44 ± 0,02 0,48 ± 0,02

YP/X (g.g-1) 11,19 ± 0,43 9,16 ± 0,44

YX/S (g.g-1) 0,038 ± 0,003 0,061 ± 0,000

V/V (%) 4,69 ± 0,03 5,07 ± 0,19

QP (g.L-1.h-1) 2,31 ± 0,02 4,40 ± 0,72

ѲS (%) 97,77 ± 1,35 95,22 ± 0,16

η (%) 86,98 ± 3,69 95,96 ± 1,64



Fermentação utilizando suco de caju como fonte de carbono foi mais eficiente e, de modo geral, apresentou parâmetros cinéticos mais adequados.

Rocha (2010): suco de caju apresenta uma composição mais rica que o meio sintético em nutrientes como, vitaminas, metais e aminoácidos.


ESTUDO DA INFLUÊNCIA DO pH NA PRODUÇÃO DE ETANOL POR UMA LEVEDURA OBTIDA DO SUCO DE CAJU

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

pH = 3,0

Tempo (h)

Co

nc d

e c

élu

las (

g.L

-1)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Co

nc d

e S

ub

stra

to e

Eta

no

l (g.L

-1)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

pH = 4,5

Tempo (h)

Co

nc d

e c

élu

las (

g.L

-1)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Co

nc d

e S

ub

stra

to e

Eta

no

l (g.L

-1)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

pH = 5,5

Tempo (h)

Co

nc d

e c

élu

las (

g.L

-1)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Co

nc d

e S

ub

stra

to e

Eta

no

l (g.L

-1)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

pH = 6,3

Tempo (h)

Co

nc d

e c

élu

las (

g.L

-1)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Co

nc d

e S

ub

stra

to e

Eta

no

l (g.L

-1)



Visto que o modelo de Monod se adequou bem aos dados experimentais, como etapa seguinte calculou-se o desvio padrão residual (RSD) para que o modelo seja validado estatisticamente

Valores de RSD entre 2,7 e 6,8%. Segundo Cleran et al. (1991), na engenharia de bioprocessos os valores de RSD devem se encontrar abaixo de 10% para serem considerados aceitáveis.

MODELO DE MONOD PODE SER UTILIZADO PARA PREDIZER DADOS EXPERIMENTAIS

Variável de

saída

RSD (%)

pH = 3,0 pH = 4,5 pH = 5,5 pH = 6,3

X 2,7 4,9 5,9 4,2

P 3,1 4,0 6,8 3,3

S 4,7 4,9 5,1 5,2



0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0

1

2

3

4

5

6

pH

Tempo (h)

• Variação do pH ao longo dos processos fermentativos:

CAPACIDADE TAMPONANTE DO SUCO DE CAJU EM pHs MAIS BAIXOS



• Classificação do processo fermentativo:

ETANOL: METABÓLITO PRIMÁRIO

0 2 4 6 8 10 12

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Ve

locid

ad

es e

sp

ecific

as

Tempo (h)



Parâmetros

Cinéticos

pH

3,0 4,5 5,5 6,3

µmáx (h-1) 0,104 ± 0,000 0,100 ± 0,000 0,106 ± 0,002 0,140 ± 0,001

Yp/s (g.g-1) 0,48 ± 0,02 0,48 ± 0,01 0,49 ± 0,01 0,48 ± 0,00

YP/X (g.g-1) 12,43 ± 0,25 9,16 ± 0,12 8,45 ± 0,15 6,06 ± 0,20

YX/S (g.g-1) 0,038 ± 0,007 0,061 ± 0,000 0,052 ± 0,009 0,069 ± 0,006

Pmáx (g.L-1) 43,26 ± 0,89 41,05 ± 1,10 42,10 ± 1,11 40,03 ± 0,59

V/V (%) 5,48 ± 0,11 5,07 ± 0,19 5,34 ± 0,14 5,20 ± 0,07

QP (g.L-1.h-1) 4,33± 0,09 4,10 ± 0,05 4,17 ± 0,11 4,10 ± 0,06

ѲS (%) 93,74 ± 1,74 86,32 ± 1,48 94,00 ± 0,82 93,80 ± 0,47

η (%) 94,83 ± 3,05 93,23 ± 3,64 95,89 ± 2,77 93,71 ± 1,21

TESTE DE VARIÂNCIA ANOVA FOI REALIZADO NOS PARÂMETROS



• O intervalo adequado de pH é igual a 3,0 a 5,5

• As fermentações conduzidas em meios mais ácidos resultam em maiores rendimentos de etanol, devido à baixa produção de glicerol. Esta condição também auxilia no controle da infecção, pois reduz o crescimento de bactérias contaminantes (Martins, 2009).

• Se um pH inicial tiver de ser escolhido para o processo fermentativo, o pH igual a 3,0

CONCLUSÕES

• Uma levedura produtores de etanol foi isolada do suco de caju e identificada com pertencente ao gênero Hanseniaspora sp • O modelo de Monod se adequou aos dados experimentais demonstrando que não ocorreu inibição pelo substrato no processo fermentativo de produção de etanol. •O intervalo de temperatura adequado ao processo foi de 28 a 36 °C, sendo que para um processo isotérmico a temperatura de 32 °C é a mais adequada, e a partir de 38 °C foi verificada uma diminuição da viabilidade celular. •O intervalo de pH adequado ao processo foi de 3,0 a 4,5. Se um pH tiver de ser escolhido, esse é pH = 3,0.

AGRADECIMENTOS

Apresentação TCC Emanuel Meneses Barros

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