UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DO SOLO

SEMINÁRIO II

Atividade biológica associada à Atriplex nummularia em solo salino-sódico no Agreste de Pernambucosalino-sódico no Agreste de Pernambuco

Discente: Karen Cristina Fialho dos Santos

Novembro, 2009

Orientadora: Maria Betânia Galvão dos Santos Freire

Co-orientadores: Júlia Kuklinsky SobralMario de Andrade Lira Junior

Introdução

A salinidade em solos

• Acúmulo de sais

• Lençol freático

CE ≥ 4 dS/m• CE ≥ 4 dS/m

(Oliveira et al., 1992; Ribeiro et al., 2009)

Introdução

A salinidade em solos

• Fator limitante para agricultura

• Aumento considerado nas últimas décadas

• Fatores:

• Material de origem (gênese do solo)

• Uso indiscriminado de água

• Qualidade da água

(Liang et al., 2005)

Introdução

A salinidade em solos

• No Brasil, acontece principalmente em regiões de clima árido esemi-árido

• Teor de sais que permite apenas o desenvolvimento de plantashalófitashalófitas

• Utilização para fitoextração

(Oliveira et al., 1992; Leal et al., 2008; Ribeiro et al., 2009)

Introdução

A cultura da Atriplex e sua utilização na recuperação de solos salinos

• Família Chenopodiacea (Austrália)

• Abundante fitomassa

• Precipitação de 100 a 250 mm/ano

• Planta arbustiva, perene

• Altura 1,5 – 3,0 m e raízes de até 3,5 m

• Toleram solos pouco profundos, secos e pobres em nutrientes

• Precisam de sais para completar seu ciclo de vida (Halófilasautênticas)

(Flower et al., 1977; Kelley et al., 1982; O’Leary, 1990; Porto et al, 2000; )

Introdução

A cultura da Atriplex e sua utilização na recuperação de solos salinos

• Folhas verde acinzentadas

• Vesículas esbranquiçadas acumuladoras de sais – mecanismo detolerância

• Por isso, usadas na fitoextração• Por isso, usadas na fitoextração

(Kelley et al., 1982; Porto et al., 2000, Santana & Silva, 2000; Zhu, 2001).

Introdução

Microorganismos em ambientes salinos

• Maioria presentes no Domínio Archea - halófilas

• Cocos e bacilos

• Requerem no mínimo 9% de NaCl no solo chegando a até 23%(4mol/L)(4mol/L)

• Halotolerantes 2 a 5% de salinidade

•Para adaptação – principalmente acúmulo de íons orgânicos paraequilibrar a tensão osmótica

(Santos et al., 2001, Kyaw, 2009; Oetterer, 2009). http://www.scielo.br/img/revistas/qn/v30n1/24f1.gif

Introdução

Microorganismos em associação à Atriplex

• Adubação nitrogenada para desenvolvimento da cultura

• Conhecimento e isolamento de bactérias nativas que fixem N2

• Aumento da capacidade do desenvolvimento em solos pobres –promoção da fitorremediaçãopromoção da fitorremediação

• Produção do AIA

• Estudos escassos sobre o tema

(Silva et al., 2008).

Objetivos

Geral

• Avaliar o desenvolvimento de mudas de Atriplex nummularia sobassociação com microorganismos em condições de salinidade.

Específicos

• Avaliar a comunidade bacteriana associada a plantas de Atriplex pormeio de isolamento em meio de cultura com alta concentração de sal

• Identificar e analisar filogeneticamente os isolados bacterianos peloestudo do gene 16S rRNA;

• Identificar e analisar a variabilidade genética de populações bacterianasnão-cultiváveis por meio da técnica de DGGE (Denaturing Gradient Gel

Objetivos

não-cultiváveis por meio da técnica de DGGE (Denaturing Gradient Gel

Electrophoresis).

• Selecionar bactérias fixadoras de N2 e produtoras de ácido indol acético(auxina), um regulador de crescimento vegetal;

• Avaliar isolados bacterianos quanto a tolerância a diferentesconcentrações de salinidade in vitro;

• Avaliar, em casa de vegetação, os efeitos da reinoculação de bactériasselecionadas sobre o desenvolvimento inicial de plantas de Atriplex.

Material de estudo e amostragem

• Bactérias associadas à ambientes com e sem plantas de Atriplex

nummularia

• Experimento de campo, 2008, Neossolo Flúvico salino-sódico noMunicípio de Pesqueira (PE).

• Período seco (dezembro) e chuvoso (agosto)

O solo - textura média, pH 9,1, CE de 21,49 dS/m e Na+ solúvel 29,8

Material e Métodos

• O solo - textura média, pH 9,1, CE de 21,49 dS/m e Na+ solúvel 29,8cmolc/dm3

• O experimento foi montado em delineamento experimental em blocoscasualizados

• Três tratamentos: planta sem poda, planta com poda e a testemunha

Material de estudo e amostragem

• Serão coletadas amostras de solo na profundidade de 0-20 cm• Três locais distintos por bloco: 1) na rizosfera, 2) no pontointermediário entre plantas e na área sem interferência das plantas(tratamento testemunha).

•Ramos terminais contendo folhas

Material e Métodos

• As amostras de solo serão coletadas em duplicata para a identificaçãobiológica e atividade biológica.

Isolamento de bactérias

• Laboratório de Genética e Biotecnologia Microbiana, UAG-UFRPE, paraprocedimento das análises.

• Para separação das bactérias do solo e rizosfera serão feitos osprocedimentos iniciais de desagregação do solo, em Erlenmeryers compérolas de vidro.

Material e Métodos

• Diluições seriadas para inoculação em meio de cultura TSA 10% + 5%de NaCl, juntamente com o fungicida Cercobyn

• Serão avaliadas após 3, 8 e 14 dias através da contagem das UFCs

• Posteriormente serão isoladas e purificadas

http://www.uspinc.com/MCtubes.htmhttp://www.cerveceroscaseros.com.ar/levaansa.jpg

Isolamento de bactérias

• Para o rizoplano, as raízes serão lavadas para retirada do solo

• Depois será seguido o mesmo procedimento para rizosfera e solo

•Para isolamento das bactérias endofíticas de folhas e raízes será feita adesinfecção, que seguirá as etapas:

Material e Métodos

•Depois será seguido o mesmo procedimento para rizosfera, solo e rizoplano

Etanol 70%

Etanol 70%

NaOCl 2%

Água 2

Água 1

1 min 3 min 30 seg

Seleção de bactérias

• Fixação de N2 – meio de cultura sem fonte de N (NFb) – confirmação(presença de halo), após 7 dias a 28ºC

• Produção de AIA – meio de TSA + L-triptofano + membrana denitrocelulose, por 1 dia a 28ºC

• Após este tempo, membrana removida e tratada com reagente deSalkowski- confirmação por um halo rosa em torno da colônia

Material e Métodos

Salkowski- confirmação por um halo rosa em torno da colônia

• Tolerância a salinidade- inoculação em placas de petri comconcentrações de NaCl de 0g/l; 15 g/l; 30 g/l; 45 g/l; 60 g/l e 75 g/l, por 7dias a 28ºC

•Avaliações de acordo com nível do crescimento

Identificação de bactérias

• Análise parcial do 16S rDNA

•Posteriormente analisadas pelo BLAST

• Posteriormente o DNA será analisado através de kits (EMBRAPA MeioAmbiente)

Material e Métodos

• Só então serão realizadas análises de PCR e DGGE

Atividade Biológica

• Laboratório de Química do Solo – UFRPE

• Respiração basal (incubação – reação do CO2 da respiração com NaOH)

•C e N (fumigação-extração)

Material e Métodos

Ensaio em casa de vegetação

• Após avaliação e identificação dos isolados bacterianos

• Montagem de experimento em casa de vegetação

• Envolvendo: mudas de Atriplex (c/ e s/ inoculação), Fertilizantes orgânicoe mineral, além de irrigação com águas de diferentes salinidades

Material e Métodos

• Mudas – micropropagação – CETENE – sacos de polietileno

• Escolha dos inóculos – N2, AIA e tolerância a salinidade

Tratamento Identificação

1 Fertilizante químico

2 Fertilizante orgânico

3 Inóculo 1

4 Inóculo 2

5 Inóculo 3

Material e Métodos

6 Inóculo 4

7 Inóculo 5

8 Combinação de bactérias 1

9 Combinação de bactérias 2

10 Combinação de bactérias 3

11 Testemunha

Esquema fatorial: 11 x 2 (tratamentos x águas de irrigação 1 e 5 dS/m), com 5 repetições – 110 unidades experimentais

Material e Métodos

Ensaio em casa de vegetação

• A cada 15 dias, medições de planta

• Após 90 dias, coleta das plantas e solo

• Da planta, raízes separadas da parte aérea para determinação do N total ematéria seca

• Serão realizadas também análises da atividade microbiana do solo

Material e Métodos

Análise estatística

• Para a densidade populacional bacteriana - programa SAS

• Os valores de UFC/g serão transformados em log10 antes da análise devariância.

• A ANOVA será utilizada para testes a 1% de significância, nodelineamento experimental inteiramente casualizado.delineamento experimental inteiramente casualizado.

•Teste de Tukey - comparação entre as médias.

• Experimento casa de vegetação - Contrastes ortogonais (comparaçãoentre grupos)

Ano 2009 2010 2011

Atividades/mês A S O N D J F M A M J J A S O N D J F

Elaboração e defesa

do projeto

x x

Coleta das amostras x x

Análises

microbiológicas

x x x x x x x x

Análises de DGGE x x

Implementação do

experimento da

x

Cronograma

experimento da

casa-de-

vegetação

Coleta das amostras x

Análise do material

coletado

x x

Análise estatística x x

Avaliação dos

resultados

x x x

Redação de artigos e

da dissertação

x x x x

Defesa da

dissertação

x

Obrigada.