Aula 01 introdução
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Núcleo deBioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais
MÉTODOS ANALÍTICOS EM QUÍMICA ORGÂNICA – II
- CROMATOGRAFIA -
Prof. Dr. Alberto J. Cavalheiro
Instituto de Química de Araraquara – UNESPDepartamento de Química Orgânica
Introdução às principais técnicas cromatográficas
utilizadas na análise qualitativa e/ou quantitativa de
substâncias orgânicas em mistura, com ênfase em
cromatografia líquida (CL).
Objetivo
Metodologia
AULAS
ExpositivasPráticas
AVALIAÇÕES
(P) 2 Provas escritas (individuais) 45%(S) 2 Seminários (dupla) 30%(R) Relatórios das práticas (dupla) 20%(A) Avaliação de aproveitamento das aulas (“individual”) 5%
Média = 0,45P + 0,3S + 0,2R + 0,05AMédia = 0,45P + 0,3S + 0,2R + 0,05A
INTRODUÇÃO À CROMATOGRAFIA
1. Braithwaite, A. Chromatographic Methods, 4ª ed. 1985.
2. Scott, R. P. W. Techiques and practice of chromatography. v. 70, 1995.
3. Miller, J. M. Chromatography, 1988.
4. Poole, C. F. and Poole, S. K. Chromatography today. 1991.
5. Sewell, P. A. Chromatographic separactions, 1987.
6. Collins, H. C. Introdução a métodos cromatográficos. Ed. Unicamp. 7ª ed. 1995.
CLAE
Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Glajch, J. L. Practical HPLC Method Development. 2a. Ed. John Wiley. 1997.
Bibliografia
Fase Extratora
a + B
A + b
A + B MisturaHeterogêneaF1
F2
MisturaHomogênea(Amostra)
a + b
A + b
a + B
a + b
A + b
a + B
n etapas
[A]F2
[A]F1
KA=
[B]F2
[B]F1
KB=
Princípio Geral
Técnica de análise de substâncias em mistura, que envolve a distribuição
diferencial dessas substâncias em um sistema heterogêneo bifásico.
SISTEMA CROMATOGRÁFICO:
Heterogêneo e bifásico
Fase Móvel (FM) Fase Estacionária (FE) Configuração
gás (CG) sólido ou líquido coluna
líquido (CL) sólido ou líquido coluna/planar
Cromatografia
CC = cromatografia em colunaCCD = cromatografia em camada delgada (planar)
Técnica de análise de substâncias em mistura, que envolve a distribuição
diferencial dessas substâncias em um sistema heterogêneo bifásico.
Cromatografia Analítica:Análise qualitativa e/ou quantitativa de substâncias em mistura.Cromatografia Preparativa: Purificação de substâncias em mistura.
Cromatografia
Fase Extratora
a + B
A + b
A + B MisturaHeterogêneaF1
F2
MisturaHomogênea(Amostra)
a + b
A + b
a + B
a + b
A + b
a + B
n etapas
[A]F2
[A]F1
KA=
[B]F2
[B]F1
KB=
Princípio Geral
Cromatografia
Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel.
CC
Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel.
Cromatografia
Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel.
Cromatografia
Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel.
Cromatografia
Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel.
Cromatografia
Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel.
Cromatografia
Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel.
Cromatografia
CC
Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel.
Cromatografia
CromatogramaRegistro gráfico do processo cromatográfico
Resolução (Rs)
21
12 ).(2
ww
trtrRs
+−=
CC
Cromatograma
t0 = momento da aplicação da amostra na colunatm = tempo mortotr = tempo de retençãow = largura do picoh = altura do pico
AMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRA
Rf = d/D1,00
0,00 (ORIGEM)
0,73
0,36
0,08
D d10,0 cm
7,3 cm
3,6 cm
0,8 cm
Rf = fator de retençãoD = distância percorrida pela FMD = distância percorrida pela manchaOrigem = ponto de aplicação da amostra
Cromatografia
Cromatografia em Camada DelgadaCCD ou TLC
Adsorção Absorção Permeação (dissolução)
Líquido/gás sólido
Líquido sólido
+
+
+-
-
Líquido/gás líquido Líquido/gás gel/sólido
INTERAÇÕES INTERMOLECULARESIônicasPonte de Hidrogêniovan der Waals Keeson (dipolo/dipolo)
Debye (dipolo/dipolo induzido) London (dipolo induzido/dipolo induzido)
Mecanismos
Antes 1965 - Colunas de vidro Partículas > 100 µm Fase Normal (silica, alumina, etc.) Amostras pouco polares Fluxo induzido por gravidade Tempo: horas - dias Detecção: off-line (UV, pH, gravimetria, etc)
1965 a 1970 - Partículas 30-50 µm Bombas para impulsionar FM Primeiros detetores on-line: IR, UV.
Depois 1975 - Fase Reversa (C18, C8, C2, etc.) Compatibilidade com amostra biológicas polares Tempo: minutos
Depois 1980- Automação completa
CC - Instrumentação
Micheal S. Tswett (ou Tsvett)Botânico Russo
Pai da cromatografia
1906 - χρωµα γραφια croma grafia
Separação de pigmentos vegetais
Micheal S. Tswett (ou Tsvett)Botânico Russo
Pai da cromatografia
1906 - χρωµα γραφια croma grafia
Separação de pigmentos vegetais
Kuhn, Wintertein e Lederer1931 Reinvenção da técnica
Separação de carotenóides e xantofilas
A. J. P. Martin1944 Cromatografia em papel
Separação substâncias polares, como amino ácidos, carboidratos e pigmentos
PRIMEIRAS APLICAÇÕES:ESTUDO DE METABÓLITOS VEGETAIS
J. Chem. Ed. 1967, 44, 238.
Cromatografia em Coluna Aberta
Algodão
Disco de papel filtro
Empacotamento:- Suspensão- Seco
Análise das frações:- CCD
15 – 30 cm
60–200 µm
Cromatografia
SOLVENTES
BOMBA
INJETOR COLUNA
DETETOR COLETOR
DESCARTE
Cromatografo Líquido
CCD - Instrumentação
SimplicidadeBaixo custo
Suporte sólidoAdsorvente (FE)EspalhadorCubaRevelador
CCD - Instrumentação
Até 31 canais diferentes (190-800 nm)
Cromatograma
t0 = momento da aplicação da amostra na colunatm = tempo mortotr = tempo de retençãow = largura do picoh = altura do pico
� Fluxo (F): vazão da FM, geralmente em mL/min.
� Tempo morto (tm): tempo necessário para eluir uma substância que não interage com a FE.
� Volume morto (Vm): volume de FM necessário para preencher todos os interstícios e poros da FE, ou volume de FM necessário para eluir uma substância que não interage com a FE.
tm = Vm/F
� Tempo de retenção (tR): tempo necessário para eluir uma substância de um determinado sistema cromatográfico.
� Volume de retenção (VR): volume de FM necessário para eluir uma substância de um determinado sistema cromatográfico.
tR = VR/F
DEFINIÇÕES
Nomenclature for Chromatography. Pure & Appl. Chem. 65:819-872 (1993)
)(
)(.2
21
12
ww
trtrRs
+−=
Resolução (Rs)
Indica a qualidade da separação entre duas bandas cromatográficas.
Para resolução completa, Rs > 1,25
Mapa de Resolução
Resolução (Rs)
Fatores envolvidos na resolução cromatográfica:
2
21
2
.54,5ou .16
=
=
w
trN
w
trN
N: Fator de eficiência
Relação entre tempo de permanência do analito no sistema e alargamento da banda cromatográfica.
Quanto mais difícil a separação (a pequeno), maior N necessário.
k’: Fator de capacidade ou de retenção
É a razão da distribuição do analito entre FE/FM
Quanto maior, maior a afinidade do analito pela FE, em relação à FM.
tm
tmtrk
n
nk
FM
FE −== 'ou '
1
2
'
'
k
k=α
α : Fator de seletividade
É a razão entre os fatores de retenção de dois analitos.
Quanto maior, mais fácil a separação.
N: Fator de eficiência (Pratos Teóricos)
Relação entre tempo de permanência do analito no sistema e alargamento da banda cromatográfica.
Quanto mais difícil a separação (a pequeno), maior N necessário.
Ajustar através de:
comprimento da coluna ou placa
tamanho e forma da partícula
fluxo da FM
volume da amostra
quantidade de amostra
2
21
2
.54,5
ou .16
=
=
w
trN
w
trN
Resolução (Rs)
k’: Fator de capacidade ou de retenção
É a razão da distribuição do analito entre FE/FM
Quanto maior k’, maior a afinidade do analito
pela FE, em relação à FM.
Ajustar através de:
força de eluição da FM
polaridade da FE tm
tmtrk
n
nk
FM
FE−== 'ou '
Resolução (Rs)
α : Fator de seletividade
É a razão entre os fatores de retenção de dois analitos.
Quanto maior, mais fácil a separação.
Ajustar através de :
tipo de componente da FM
tipo de FE1
2
'
'
k
k=α
Resolução (Rs)
)1'(
'.
)1(.
42
2
+−=
k
kNRs
αα
EFICIÊNCIA
Depende da configuração do sistema
SELETIVIDADE RETENÇÃO
Dependem das características da FM e FE do sistema
FATORES QUÍMICOS
FATORES FÍSICOS
Resolução (Rs)
0 2 4 6 8 10
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Influ
ênci
a na
Res
oluç
ão
n N
NRs ∝
0 2 4 6 8 10
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
(α -
1/α
)
α
αα 1−∝Rs
0 2 4 6 8 10 12 140,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
K'/(
1+K
')
K'
1'
'
+∝k
kRs
)1'(
'.
)1(.
42
2
+−=
k
kNRs
αα
κ
(RETENÇÃO)
TEMPO
(SELETIVIDADE)
α
N
(EFICIÊNCIA)
Resolução (Rs)
Dificultar o espalhamento da bandaAumentar a área da FEDiminuir volume da FM
↑ N
Diminuir tamanho das partículas (mm)Partículas esféricasAumentar comprimento da coluna (L)Otimizar fluxo da FM Otimizar temperatura
Otimizando a Resolução
1. Eficiência (N) .162
=w
trN
Coluna, tubulação, injetor, detetor ∑ 2= Lh /σ
µµ
CB
Ah ++=A = Difusão de Eddy
B = Difusão molecular na FM
C = Efeitos da transferência de massas
Otimizando a Resolução
1. Eficiência (N)Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica.
h = N/L
h: altura de um prato teórico
ou
d
LN .4,0
max=
Comprimento grande causa espalhamento e análise longaPartícula muito pequena necessita pressão muito alta
40 − 60 µm
5 µm
DIÂMETRO PARTÍCULA L=15cm L=25 cm
60 − 200 µm (130 µm) ⇒ 460 770
40 - 60 µm (50 µm ) ⇒ 1.200 2.000
20 µm ⇒ 3.000 5.000
10 µm ⇒ 6.000 10.000
5 µm ⇒ 12.000 20.000
3 µm ⇒ 20.000 33.300
1. Eficiência (N)Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica.
Otimizando a Resolução
Coluna, tubulação, injetor, detetor ∑ 2= Lh /σ
µµ
CB
Ah ++=A = Difusão de Eddy
B = Difusão molecular na FM
C = Efeitos da transferência de massas
1. Eficiência (N)Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica.
h = N/Lou
Otimizando a Resolução
Coluna, tubulação, injetor, detetor ∑ 2= Lh /σ
µµ
CB
Ah ++=A = Difusão de Eddy
B = Difusão molecular na FM
C = Efeitos da transferência de massas
1. Eficiência (N)Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica.
h = N/Lou
Otimizando a Resolução
µµ
CB
Ah ++=
Equação de van Demmter
A = Difusão de Eddy
B = Difusão molecular na FM
C = Efeitos da transferência de massas
mt
L=µF
Vt mm =
L
VF m.µ=
1. Eficiência (N)Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica.
Otimizando a Resolução
Otimizando a Resolução
2. Retenção (k’) e Seletividade (α)Fatores que afetam a interação relativa entre analitos e fase estacionária (FE) e fase móvel (FM).
Para otimizar esses fatores, é preciso conhecer as características dessas duas fases e a maneira como os analitos interagem com elas:
FASE ESTACIONÁRIA FASE NORMAL FASE REVERSA
FASE MÓVEL SOLVENTES, características e compatibilidade FORÇA DE ELUIÇÃO
Otimizando a Resolução
2.1 Cromatografia de Fase Normal (FN) FE mais polar que FM.
Interações ANALITO X FE e FM X FM(em ordem decrescente de intensidade):
- Iônica (indesejáveis)- Ponte de Hidrogênio- Van der Waals
Dipolo – dipoloDipolo – dipolo induzido
ADSORVENTES p/ FN (exemplos):-Sílica-Alumina-Poliamida-Fases ligadas polares (CN, NH2, Diol)
Superfície da FE é polar.
Otimizando a Resolução
2.1 Cromatografia de Fase Normal (FN) FE mais polar que FM.
ORDEM DE ELUIÇÃO (crescente)
APOLAR → POLAR
SOLVENTES MAIS COMUNS:- Hexanos (éter de petróleo pe 60-80o C)- AcoEt ou acetona- Et2O ou MTBE- i-PrOH ou MeOH- CHCl3 ou CH2Cl2 (DCM)
Superfície da FE é polar.
Sílica gel
Si O
OH
O
O H
Si O
CH 3 Si O
CH 3 C H 3
SiO
OH
C H 3
SiO H
CH 3
CH 3
O H
SiH 3
O
H
H
O
H
H
Otimizando a Resolução
Mecanismo de adsorção:-Si-OH: Interações polares por ponte de
hidrogênio, como doador ou aceptor de H.-Si-OH e –Si-O-Si-: dipolo/dipolo ou
dipolo/dipolo induzido
Esféricas IrregularesDiâmetro: 3 a 200 µm
Poro: 60 a 120Å
Partículas
Sílica gel
Si O
OH
O
O H
Si O
CH 3 Si O
CH 3 C H 3
SiO
OH
C H 3
SiO H
CH 3
CH 3
O H
SiH 3
O
H
H
O
H
H
Otimizando a Resolução
Vantagens:• Elevada resistência mecânica• Grande porosidade e área superficial
• Gel duro (intumescimento não varia em função do solvente).
Esféricas IrregularesDiâmetro: 3 a 200 µm
Poro: 60 a 120Å
Partículas
PAREI AQUI
Sílica gel
Si O
OH
O
O H
Si O
CH 3 Si O
CH 3 C H 3
SiO
OH
C H 3
SiO H
CH 3
CH 3
O H
SiH 3
O
H
H
O
H
H
Otimizando a Resolução
Influência do teor de água da FM sobre a eficiência (H) e retenção (k’).FE: Sílica FM: DCM Amostra: Fenilpropanol
Desvantagens:• Difícil controle da atividade de água• Forte adsorção de substâncias polares• Forte adsorção de substâncias básicas• Limite operacional de pH (2 a 8)• Sítios com energia de adsorção diferentes.
Otimizando a Resolução
AluminaAtividade: capacidade de adsorção em função do teor de água adsorvida
Atividade, segundo escala de Brockmann & Schadder
Ativ.% de água
Alumina Sílica
I - -
II 3 10
III 6 12
IV 10 15
V 15 20
O Al
AlO
ClAlCH3
Cl
CH3
Cl
ÁCIDApH 4,0
O Al
AlO
ONaAlCH3
ONa
CH3
ONa
BÁSICApH 9,0
O Al2+
AlO
AlCH3 O NEUTRApH 7,0
CLAE
CCD
Alumina 1100 C4000 CII ou IIII
Otimizando a Resolução
Alumina
O Al
AlO
ClAlCH3
Cl
CH3
Cl
ÁCIDApH 4,0
O Al
AlO
ONaAlCH3
ONa
CH3
ONa
BÁSICApH 9,0
O Al2+
AlO
AlCH3 O NEUTRApH 7,0
Mecanismo de adsorção:Al3+: campo positivo favorece interação
com moléculas polarizáveis (p. ex. sistemas conjugados)O2-: sítios básicos favorecem a interação
com doadores de H+
Vantagens:• Elevada resistência mecânica• Faixa operacional de pH maior (2 a 12)
• Gel duro (intumescimento não varia em função do solvente).
• Retenção menos pronunciada de substâncias básicas.
Otimizando a Resolução
Alumina
O Al
AlO
ClAlCH3
Cl
CH3
Cl
ÁCIDApH 4,0
O Al
AlO
ONaAlCH3
ONa
CH3
ONa
BÁSICApH 9,0
O Al2+
AlO
AlCH3 O NEUTRApH 7,0
Desvantagens (em relação à Sílica):• Catalisa reações (p. ex. aldólicas)• Partículas irregulares e maiores (↓ N)
• Menor reprodutibilidade
• Retenção pronunciada de substâncias ácidas (p. ex. ác. carboxilicos).
Otimizando a Resolução
Alumina
O Al
AlO
ClAlCH3
Cl
CH3
Cl
ÁCIDApH 4,0
O Al
AlO
ONaAlCH3
ONa
CH3
ONa
BÁSICApH 9,0
O Al2+
AlO
AlCH3 O NEUTRApH 7,0
Aplicações:
• Análises em condições mais básicas que as suportadas por sílica (> 9);
• Poliaromáticos, alcalóides, aminas e vitaminas lipossolúveis.
Otimizando a Resolução
Esféricas IrregularesDiâmetro: 3 a 200 µm
Poro: 60 a 120Å
Partículas
Fases Ligadas (BPC)
Si O
OH
O
O H
Si O
CH 3 Si O
CH 3 C H 3
SiO
OH
C H 3
SiO H
CH 3
CH 3
O H
SiH 3
O
H
H
O
H
H
Si R
CH3
Cl CH3
+
Sílica
Otimizando a Resolução
Esféricas IrregularesDiâmetro: 3 a 200 µm
Poro: 60 a 120Å
Partículas
Fases Ligadas (BPC)
Si O
OH
O
O
Si O
CH 3 Si O
CH 3 C H 3
SiO
O
C H 3
SiO H
CH 3
CH 3
O H
SiH 3
Si
R
CH3H3C
Si
R
CH3H3C
SILANOLRESIDUAL
Si O Si
Si O Si
Si O Si
Si O Si
Si O Si N
Si O Si NH2
Si O Si OHOH
ODS, RP-18, C-18
RP-8, C-8
Fenil
CN, Cianopropil
NH2,Propilamino
TMS, C-1
Diol
APOLARES
POLARES
Si CH3
CH3
Cl CH3
+Cloreto de
trimetilsilano
Fase ligada
Otimizando a Resolução
Esféricas IrregularesDiâmetro: 3 a 200 µm
Poro: 60 a 120Å
Partículas
Fases Ligadas (BPC)
Si O Si
Si O Si
Si O Si
Si O Si
Si O Si N
Si O Si NH2
Si O Si OHOH
ODS, RP-18, C-18
RP-8, C-8
Fenil
CN, Cianopropil
NH2,Propilamino
TMS, C-1
Diol
APOLARES
POLARES
Si O
OH
O
O
Si O
CH 3 Si O
CH 3 C H 3
SiO
O
C H 3
SiO
CH 3
CH 3
O H
SiH 3
Si
R
CH3H3C
Si
R
CH3H3C
Si CH3
CH3
CH3
Fase ligada capeada
Otimizando a Resolução
Fases Ligadas (BPC)
Si O
OH
O
O
Si O
CH 3 Si O
CH 3 C H 3
SiO
O
C H 3
SiO
CH 3
CH 3
O H
SiH 3
Si
R
CH3H3C
Si
R
CH3H3C
Si CH3
CH3
CH3
Fase ligada capeada
Vantagens:Vantagens:
- Equilíbrio mais rápido
- Menor adsorção irreversível
- Água não influi na reprodutibilidade
- Sítios de adsorção mais homogêneos
- Eluição em gradiente facilitada
Esféricas IrregularesDiâmetro: 3 a 200 µm
Poro: 60 a 120Å
Partículas
Fases Ligadas (BPC)
CH3
CH3
CH3
TOLUENO
NAFTALENO
BIFENILA
ACENAFTENO
2,3-DIMETILNAFTALENO
COLUNA 100 x 8 mmFluxo: 2,0 mL/minDetetor UV 254 nm
C18 – 10% carbonoEsférica – 5 µmNão capeada
C18 – 7% carbonoEsférica – 5 µmCapeada
C18 – 10% carbonoIrregular – 10 µmNão capeada
C8 5% carbono
CN2% carbono
Fenil5% carbono
Para amostra APOLAR↓ Polaridade da FE, ↓ retenção dos analitos
FM: ACN/Água 70:30
Otimizando a Resolução
Fases Ligadas Polares - FN
Interações ANALITO X FE e FM X FM(em ordem decrescente de intensidade):
- Iônica (indesejáveis)- Ponte de Hidrogênio- Van der Waals
Dipolo – dipoloDipolo – dipolo induzido
ORDEM DE ELUIÇÃO (crescente)
APOLAR → POLAR
SOLVENTES MAIS COMUNS:-Hexanos (éter de petróleo pe 60-80o C)- AcoEt ou acetona- Et2O ou MTBE- i-PrOH ou MeOH- CHCl3 ou CH2Cl2 (DCM)
S i O S i N
S i O S iN H 2
S i O S iOH
OH
CN, Cianopropil
NH2, Propilamino
Diol
Fase Ligada Amino (NH2)
AMOSTRA: ESTERÓIDES
O
O
CH3
CH3
OH
1. Desoxicorticosterona
O
O
OH
CH3
CH3
OH
2. Desoxicortisona
O
O
CH3
OH
CH3
OH
3. Corticosterona
O
O
O
OH
CH3
CH3
OH
4. Cortisona
O
O
OH
CH3OH
CH3
OH
5. Hidrocortisona
O
O
O
OHCH3
CH3
OH
6. Prednisona
FM quaternáriaMTBE 40%DCM 15%CHCL3 42%MeOH 3%
COLUNA: Zorbax-NH2 10 µm250 x 4,6 mmFluxo 3,0 mL/minDetetor UV 254 nm
1
2 3
6
4
5
Fase Ligada Amino (NH2)
Aplicação: análise de monossacarídeos – FASE NORMAL
Coluna: Hypersil 5 APS
100 x 3,0 mm
FM: ACN/Água 80:20
Fluxo: 0,5 mL/min
Detector: RI
O
OHOH
OH OH
CH3
O
OHOH
OHOH
O
OH
OH
OHOH
O
OH
OH OH
OH O OH
OH
OHOH
OH
O
OH
OH
OH OH
OH
O
O
O
OHOH
OH OH
OH
OH
OH
OH
O
O
O
OH OH
OHOH
OH
OH
OHOH
O
O
O
OH OH
OHOH
OH OH
OHOH
H
H
1. Raminose 2. Ribose 3. Xilose
4. Arabinose 5. Frutose
6. Glicose 7. Sacarose
8. Maltose 9. Lactose
Aplicação: análise de monossacarídeos – FASE NORMAL
Amostra: suco de frutas (tomate, uva, framboesa, etc)
O
OH
OH
OHOH
1. Xilose
O OH
OH
OHOH
OH
2. Frutose
O
OH
OH
OH OH
OH
3. Glicose
O
O
O
OHOH
OH OH
OH
OH
OH
OH
4. Sacarose
O
O
O
OH OH
OHOH
OH
OH
OHOH
5. Maltose
Coluna: Hypersil 5 APS
100 x 3,0 mm
FM: ACN/Água 80:20
Fluxo: 0,5 mL/min
Detector: RI
Otimizando a Resolução
2.2 Cromatografia de Fase Reversa (FR) FE menos polar que FM.
Superfície da FE é apolar.
CH3Si
OSi
OSi
OSi
O
CH3
CH3
OH
CH3
OH
O
CH3
CH3
CH3
CH3
ADSORVENTES p/ FR (exemplos):
Si O Si
Si O Si
Si O Si
Si O Si
ODS, RP-18, C-18
RP-8, C-8
Fenil
TMS, C-1
SOLVENTES MAIS COMUNS:- Água- Acetonitrila (ACN)- MeOH- Tetraidrofurano (THF)
Otimizando a Resolução
2.2 Cromatografia de Fase Reversa (FR) FE menos polar que FM.
ORDEM DE ELUIÇÃO (crescente)
POLAR → APOLAR
Superfície da FE é apolar.
CH3Si
OSi
OSi
OSi
O
CH3
CH3
OH
CH3
OH
O
CH3
CH3
CH3
CH3Interações ANALITO X FE e FM X FM(em ordem decrescente de intensidade):
Van der WaalsDipolo – dipoloDipolo – dipolo induzidoDipolo induzido – dipolo induzido
Interações residuais: pte. H
Vantagens:Vantagens:
- Equilíbrio mais rápido
- Menor adsorção irreversível
- Água não influi na reprodutibilidade
- Sítios de adsorção mais homogêneos
- Eluição em gradiente facilitada
Otimizando a Resolução
2.2 Cromatografia de Fase Reversa (FR) FE menos polar que FM.
Coluna Fase Reversa C18:Aplicação quase universal (~ 70% das aplicações na literatura)Permite análise desde substâncias hidrossolúveis e/ou iônicas até substâncias lipofílicas (NARP).
Supressão da Ionização
Coluna: µBONDAPAK C18 30 cm X 3,9 mmFM: Água, com 5% HOAcDetecção: UV 254nmTempo: 30 min.
R-COOH R-COO- + H+ pKa 4-5
Φ-OH Φ-O- + H+ pKa 10-12
OHO
HO
OH
OH
OHO
OH
OH
OHO
OH
OHO
OH OH
O OHO OH
OH
O OH
OH
OH
O OH
O
OH
HO
OH
OH
OH
1. Ácido gálico
2. Ác. protocatecuico
3. Ác. p-OH-benzóico
6. Ác. salicílico
5. Ác. cafeico 7. Ác. p-coumárico
8. Ác. o-coumárico
9. Ác. ferúlico
10. Ác. cinâmico
O OH
OH
OMe
4. d-CatequinaAmostra: Ácidos Carboxílicos Fenólicos
O
N
CH3
CH3
N
NH
CH3
N
CH3
CH3
CH4
N
N
CH3
CH3
CH3
1 2
3 4
Coluna: Zorbax ODS 5µm, 150 x 0,46 mm FM: ACN/Tampão 30:70 + 0,2% TEA e 0,2% TFATampão Fosfato 25 mM pH 2,5Fluxo: 1,0 mL/min Detector: UV
C18
Aplicação: antidepressivos tricíclicos – FASE REVERSA
C18
Coluna: Inertisil ODS 250 x 4,6 mmFM: MeOH a 1,0 mL/minDetector: UV (λe: 295 nm)
Coluna: Inertisil ODS 250 x 4,6 mmFM: MeOH a 1,0 mL/minDetector: UV (λe: 295 nm)
OCH3
CH3
CH3
OHCH3 CH3
CH3
CH3
CH3
3. α-tocoferol (vitamina E)
OCH3
CH3
CH3
OHCH3 CH3
CH3
CH3
2. β-tocoferol
OCH3
CH3
CH3
OHCH3 CH3
CH31. δ-tocoferol
OCH3
CH3
CH3
OCH3 CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
O
4. Vitamina E - acetato
Aplicação: análise de tocoferóis – FASE REVERSA
Coluna: Inertisil 5 Si 150 x 4,6 mmFM: EtOH 0,3% em n-HexanoFluxo: 1,0 mL/minDetector: FLU (λex: 300 nm; λem:330 nm)
Aplicação: análise de tocoferóis em margarina – FASE NORMAL
Sílica gel
OCH3
CH3
CH3
OHCH3 CH3
CH3
CH3
OCH3
CH3
CH3
OHCH3 CH3
CH3
OCH3
CH3
CH3
OHCH3 CH3
CH3
CH3
OCH3
CH3
CH3
OHCH3 CH3
CH3
CH3
CH3
1. α-tocoferol (vitamina E)
2. β-tocoferol
3. γ-tocoferol
4. δ-tocoferol
AMOSTRA
Sol. em Água
Insol. em Água
Iônica ou Ionizável
Não-iônica
PM ≠
Sol. em solv. orgânico
PM ≠
APOLAR*
POLAR**
FASE NORMAL
FASEREVERSA
GPC
Iônica ouIonizável
Não-iônica
GPC
FASEREVERSA
ÍON-PAR ouTROCA IÔNICA
ÍON-PAR ouTROCA IÔNICA
FASEREVERSA
SUPRESSÃO
SUPRESSÃO
FASE NORMAL
Sephadex
C18C8
C18C8CN
SiCNNH2
C18C8
C18C8CN
SiCNNH2
C18C8
Sephadex - LH20
CHAVE PARA ESCOLHA CHAVE PARA ESCOLHA DO ADSORVENTE (FE)DO ADSORVENTE (FE)
* Hexano, CHCl* Hexano, CHCl33
** AcOEt, MeOH** AcOEt, MeOH
♦ Substâncias com grupos funcionais diferentes
Valor de α maior em Sílica do que em C18
Valor de α menos distinto entre fases ligadas FN e FR
♦ Homólogos ou substâncias que diferem no no. de carbonos
Valor de α maior em FR
♦ Isômeros
Valor de α maior em FN
Otimizando a Resolução
2.2 Fase Normal (FN) X Fase Reversa (FR)
Cromatografia em Fase NormalCromatografia em Fase NormalVANTAGENS DESVANTAGENS
1. Permite grandes variações na seletividade atravésda variação da composição da FM.
1. Amostras iônicas são mais facilmente separadaspor RPC.
2. Colunas são muito estáveis em FM não aquosa 2. Controle da força de eluição da FM é mais difícildo que em RPC.
3. Muitas substâncias orgânicas são mais solúveisnos solventes de NPC (vantagem em Crom. Prep.)
3. Menor p. e. dos solventes usados na FM causamformação de bolhas.
4. Pressão necessária é menor devido menorviscosidade dos solventes.
4. Retenção pode variar em função de águaadsorvida pela FE.
5. Útil para análise de amostras que podemdecompor em soluções aquosas.
5. Eluição em gradiente limitada pelo “demixing”da FM e pela adsorção de água.
6. Adsorventes mais baratos. 6. Solventes mais caros. Descarte mais caro.
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MÉTODOS ANALÍTICOS EM QUÍMICA ORGÂNICA – II
- CROMATOGRAFIA -
Prof. Dr. Alberto J. CavalheiroMs. Tamara R. Calvo
Instituto de Química de Araraquara – UNESPDepartamento de Química Orgânica
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O
NO
O
O
O
O
O
CH3
CH3
CH3
CH3
HH
2
NO
O
O
O
CH3
CH3
CH3
CH3
3
N
N
N
N
O
O
CH3
CH3
CH3
4
O
N
O O
CH3
CH3
H
CH3
O 5
O
N
OO
OO
CH3
CH3CH3
6
O
N
OHOH
CH3
H
7
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EXPLICAR MELHOR FR E FNAMPLIAR OS TIPOS DE COLUNASEXPLICAR MELHOR MECANISMO DE RETENÇAO NOS VARIOS TIPOS DE FE