Estratgias para purificao de uma protena Os assuntos abordados nessa aula so:

Mtodos de centrifugao e precipitao diferencial Dosagem de protenas Mtodos cromatogrficos Anlise de eficincia da purificaoBIO10-329 Biofsica de ProtenasRegente: Clia R. CarliniAteno ! Use o modo apresentao de slides para ativar as animaes

Principais componentes moleculares da bactria E. coli A tabela acima mostra a percentagem em peso dos principais tipos de molculas presentes em uma clula simples, a bactria Escherichia coli. Observe que as protenas compem o grupo mais diverso de molculas. Como so as protenas que executam a maior parte das funes vitais de um organismo, uma grande parte das questes na Biologia envolve conhecer em detalhes a estrutura 3D e o funcionamento de uma protena.

Para se obter uma protena em particular, necessrio separ-la de todas as outras que esto presentes na mesma fonte biolgica.

Mtodos de Isolamento de BiomolculasO isolamento ou purificao de uma protena uma etapa que precede os estudos de suas caractersticas fsico-qumicas, de sua estrutura 3D e a compreenso de suas propriedades biolgicas. Inicialmente, a estratgia de purificao de uma protena emprica, ou seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada protena individualmente. No h como prever quais mtodos sero os mais eficientes para se purificar uma protena pela primeira vez.

Mtodos baseados em caractersticas fsico-qumicas das biomolculas:

1. Tamanho Massa Densidade (ex: centrifugao, dilise, gel-filtrao) 2. Carga eltrica (ex: cromatografia de troca inica, eletroforese) 3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa)

Mtodos baseados em afinidade biolgica, que exploram a interao entre duas molculas: 4. Cromatografia de afinidade (pressupe que uma das molculas do par que interage um reagente de fcil obteno, disponvel comercialmente) Mtodos de Isolamento de BiomolculasExiste uma grande variedade de mtodos visando a separao de biomolculas. Como na maioria das vezes o que se pretende purificar uma protena, o grupo de molculas com maior diversidade, as metodologias de separao de protenas tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opes disponveis.Os mtodos de separao de biomolculas so agrupados em duas categorias:

O fluxograma ao lado representa a marcha de purificao de uma protena, mostrando as etapas sucessivas, cada uma consistindo de mtodo, que levam ao isolamento de uma protena presente numa mistura complexa.Observe a quantidade de protenas (100g) presente no material inicial e quanto da protena purificada se obtm no final (0,001g). Esses nmeros so tpicos para a purificao da maioria das protenas, em especial enzimas.

Em cada etapa, a protena de interesse separada das demais com base em uma propriedade diferente. Consequente-mente, as protenas ainda misturadas com aquela que est sendo isolada so cada vez mais semelhantes em suas caractersticas fsico-qumicas, exigindo mtodos cada mais sensveis, capazes de explorar pequenas diferenas, para se chegar protena pura.

Medida da atividade biolgica - particular para cada protena - deve ser quantitativa, para estimar quanto da protena de interesse h em cada frao.

Medidas do contedo proteico (diversos) - absorbncia de luz UV de 280 nm - mtodos colorimtricos (ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)

Alm dos mtodos de purificao, anlises complementares devem ser feitas ao longo da purificao, para verificar se o processo de separao est sendo eficiente.

A medida da atividade biolgica da protena de interesse e do contedo de protenas de cada frao resultante do processo de separao devem ser feitas a cada passo. Assim, apenas a frao que contm a protena de interesse, marcada com um crculo vermelho no fluxograma, submetida prxima etapa de purificao.

Mtodos para medida do contedo de protena: O grfico mostra o espectro de absoro de luz UV dos aminocidos aromticos Trp, Tyr ou Phe.

A absorbncia de uma soluo de protenas a 280 nm diretamente proporcional ao seu contedo proteico, desde que essas contenham esses aminocidos na sua composio, especialmente triptofano.

A vantagem desse mtodo que ele no destrutivo para a protena. Em geral, considera-se que uma leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentrao de 1 mg/mL.

BCA = cido 2,2'-Bicinchonnico ou 4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinolineReagente Bradford = Coomassie Brilliant Blue G-250 Mtodo baseado em uma mudana espectral do reagente, em que d absoro mxinma a 595 nm (cor azul), quando interage com protenas. Interao com protenas se d atravs de foras de Van der Waals e ligaes inicas, especialmente com arginina, mas tambm com resduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e fenlialanina.ons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presena de protenas reagem fortemente com o BCA formando um composto azul, Reagente de Biureto: sulfato de Cu2+ em tartarato

Cu2+ reage com as ligaes peptdicas e produz um complexo prpura com absoro mxima em 540 nm 1. Cu2+ quelado pela protena [Cu2+-proteina]2. Reao redox Cu2+ + (ligaes peptdicas) > [Cu+ -protena] ons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presena de protenas e cadeias laterais de aminocidos aromticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o reagente de Folin-Ciocalteu (cido fosfo- mobidnio-tungstnio), dando um composto de cor azul.Mtodo de LowryMtodos para medida do contedo de protena:

Para iniciar a purificao, inicialmente necessrio extrair a protena de interesse para um meio lquido, exceto se ela j estiver naturalmente presente em um meio lquido (sangue, suor, gua do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc). Vrios mtodos so possveis para transformar clulas, rgos, tecidos em um homogenado, ou extrato bruto, como mostra a figura.

Sendo a protena de interesse uma protena de membrana, necessrio solubiliz-la. Para esse fim so utilizados detergentes, que dissolvem a membrana plasmtica e formam complexos solveis com as protenas.Detergentes podem ser inicos e no inicos

sangue centrifugado: separao de plasma e clulas A centrifugao frequentemente uma das primeiras etapas de purificao aplicado a um extrato bruto. Atravs do movimento de rotao do rotor da centrfuga, uma fora centrfuga aplicada amostra, separando seus compo-nentes atravs de suas massas e/ou densidade, conforme a tcnica.

Atravs de sucessivas etapas de centrifugao com velocidades (rotaes por minuto, rpm) crescentes, pode-se obter diferentes fraes de um homogenado de clulas ou tecidos.

R$ 3.000US$ 70,000CentrfugaClnica

UltracentrfugaFora centrfuga1,200g por 15 minutos separa plasma de clulas sanguneas200,000 g por 24 horas para separar organelas menores ou complexos proteicos(necessitam vcuo para evitar atrito do ar, alm de refrigerao)Relao entre o raio do rotor, velocidade angular (rpm) e a fora centrfuga (g)Preo aproximadoExistem centrfugas para diferentes tipos de aplicaes, dependendo da fora centrfuga que so capazes de gerar.

Centrifugao em gradiente de densidadeA centrifugao em um meio com gradiente de densidade melhora a eficincia da separao. As partculas se deslocaro atravs do gradiente at encontrarem uma regio com densidade equivalente a sua, quando param de se mover, formando bandas.

Gradientes podem ser utilizados para separar diferentes tipos de clulas, organelas, cidos nuclicos, complexos proteicos, etc.

As mais potentes ultracentrfugas atuais ainda no so capazes de sedimentar protenas.Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitao fracionada de protenas so utilizados como etapas preliminares de purificao. Uma das vantagens desses mtodos o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes/massas.

A precipitao de protenas pode ser induzida por:- adio de sais (Precipitao salina)- adio de solventes- variao de pH (Precipitao isoeltrica)

Sais se dissociam em soluo aquosa e competem com as protenas pela gua de solvatao.Considere uma soluo com fibrinognio, albumina, hemoglobina, pseudoglobulina e mioglobina e observe o grfico.

Usando o sal sulfato de amnio (NH4)2SO4, pode-se purificar completamente o fibrinognio a partir de uma mistura das 5 protenas, pois este precipita totalmente em uma saturao de 2,8 M do sal.

Neste ponto, centrifuga-se a soluo e o fibrinognio coletado como um precipitado.

Numa prxima etapa, adicionando-se mais sal soluo at uma saturao de 7 M, pode-se obter um novo precipitado contendo albumina, hemoglobina e pseudoglobulina.

E teremos tambm purificada a mioglobina, ainda em solvel na presena de 7M do sal, e que ficou sozinha no sobrenadante.

Solventes miscveis com a gua diminuem a constante dieltrica do meio e desorganizam a camada de solvatao das protenas.

Os mais utilizados so etanol e acetona. Protenas tambm podem ser precipitadas com adio de solventes ao meio ou quando colocadas em meio com pH prximo ao seu ponto isoeltrico. Ponto Isoeltrico de algumas Protenas

Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a dilise.

amostra colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros tratados, que permite a passagem de molculas at 10,000 d.- o saco contendo a amostra imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja- excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente- aps vrias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente ter sido retirado.Para obter as protenas precipitadas em soluo novamente, necessrio reverter as condies que levaram precipitao.inciofinalDt

At o momento, exploramos as etapas iniciais de purificao de protenas, como a centrifugao diferencial e precipitao fracionada.

Esses mtodos, apesar de terem baixo poder de resoluo (exploram diferenas grosseiras entre as protenas), permitem processar grandes volumes ou massas, tpicos das etapas iniciais de isolamento.

Quando j houve reduo significa-tiva dos montantes de protenas a serem processados, iniciam-se as cromatografias, que iro explorar as diferenas mais sutis entre as molculas.

No esquecer que todas as fraes obtidas devem ter o contedo de protenas e de atividade biolgica medidos, para se decidir qual/quais devero passar para o passo seguinte da purificao.

Funcionamento Bsico de uma Coluna Cromatogrfica Uma coluna um tubo cilindrco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou matriz ou gel cromatogrfico. A coluna constantemente alimentada com lquido (tampo), banhando a resina e forando o contacto desta e as molculas que esto sendo analisadas. Abaixo est representado o esquema geral de uma cromatografia:

Os componentes da mistura so separados por interao diferenciada com a resina, com base em propriedades moleculares como:

massa molecular carga eltrica solubilidade afinidade Um cromatograma, como o grfico ao lado, a maneira usual de se representar o resultado de uma cromatografia.

Que caractersticas devem ter as resina cromatogrficas para possibilitar separaes de molculas baseadas em diferentes propriedades ?

Cromatografia de gel filtrao ou peneira molecular gros (beads) da resina com poros Na gel-filtrao, as protenas que penetram nos poros da resina precisam diferentes volumes de tampo para sarem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os canais internos dos gros. Quanto maior o nmero de gros que cada molcula entrar durante o percurso atravs da coluna, maior o volume necessrio para sua sada. Protenas maiores que o dimetro dos poros no so separadas e saem da coluna com pouco tampo, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos gros, tambm chamado de volume morto (Vo). Protenas menores que o dimetro dos poros no so separadas e saem da coluna com um volume de tampo correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do prprio gel).Molculas com massas diferentesFluxo do tampo

Absorbncia a 280 nmvolumeMedida da ativ. biolgicaMolculas maioresMolculas menoresKavMassa molecular (kD) 20 40 60 80 100 120 mL A cromatografia de gel-filtrao possibilita estimar a massa molecular de uma protena em seu estado nativoAlm de purificar, por ser realizada em condies de pH, fora inica e temperatura que preservam a atividade biolgica da protena, a gel-filtrao fornece a Mr do seu estado nativo.

Para isso, necessrio calibrar a coluna com protenas de massa molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibrao.

O volume de sada (eluio) de uma protena numa coluna de gel-filtrao proporcional ao logaritmo de sua massa molecular.Curva de calibraoMedir o volume de eluio da frao mais ativa. Transportar para a curva de calibraao.Ler a massa correspondenteObservar a escala log

Molculas pequenasMolculas pequenasProtenasProtenasClulas, partculas sub-celularesExistem diferentes tipos de resinas para gel-filtrao, conforme o tipo de molculas ou partculas a serem separadas

Para comparar calibraes com a mesma resina cromatogrfica em colunas de dimenses diferentes utiliza-se o Kav, que proporcional ao log de Mr. Ve volume de eluio de uma certa protenaVt volume total da colunaVo volume morto da coluna, em que saem molculas com massa acima da resoluo da resina onde:O gel nessa coluna o Sephadex G-200, cuja faixa de resoluo de protenas de 5.000 a 600.000 d.Observe como protenas nos extremos da faixa de resoluo tendem a sair da parte linear da curva.Esta uma outra forma de representar a calibrao de uma coluna de gel-filtrao.

Cromatografia de troca inica A resina para cromatografia de troca inica apresenta carga eltrica, positiva ou negativa, em uma ampla faixa de pH.Existem dois tipos bsicos: resinas trocadoras de nions (possuem carga positiva), como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de ctions (possuem carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose

O grfico mostra que essas resinas mantm suas cargas em uma ampla faixa de pH. Assim, o DEAE-celulose pode ser utilizado em pH abaixo de 10, enquanto que o CM-celulose utilizado em pH acima de 4, condies em que pelo menos 50% dos grupos dessas resinas esto carregados.Cromatografia de troca inica

Como funciona a Cromatografia de Troca Inica AdsoroEluioMolculas com a mesma carga, ou sem carga, no interagem com a resina, sendo as primeiras a sair da colunaAdio de sal ao tampo resulta em competio entre os ons em soluo e as molculas adsorvidas na resina.Na+Cl- +A cromatografia de troca inica compreende duas etapas:

adsoro das protenas com carga contrria resina, e sada da coluna das protenas com a mesma carga; eluio das protenas adsorvidas.No exemplo ao lado, como funciona uma resina catinica ou trocadora de nions, como o DEAE-celulose):Para a eluio, as condies de adsoro da coluna (pH ou fora inica) so alteradas para neutralizar a interao entre as protenas e a resina.

Mais frequentemente utiliza-se um aumento da concentrao do sal no tampo, pois alteraes de pH podem desnaturar protenas, levando-as a precipitar dentro da coluna.

Como funciona a Cromatografia de Troca Inica O processo da cromatografia de troca inica depende da diferena de ponto isoeltrico das protenas na amostra e das condies escolhidas de pH e de fora inica.Ponto Isoeltrico de algumas ProtenasProtenas apresentam carga positiva quando em meio cido em relao ao seu PI, e carga negativa, quando em meio alcalino em relao ao seu pI.Nesse caso, a referncia para se dizer que o meio cido ou bsico o PI da protena, e no o pH do meio.A carga das protenas varia em funo do pH do meio, pois o pH influencia o estado de dissociao das cadeias laterais dos aminocidos cidos e bsicos.Responda: em pH 7,0, qual ser a carga eltrica da albumina, da mioglobina e do citocromo C ?

Carboximetil~celulose(trocadora de ctions)Dietilaminoetil~celulose(trocadora de nions)Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Inica Gradientes de sal podem fracionar as protenas adsorvidas na resina de acordo com a intensidade de suas cargas, que dada pela diferena entre seus PIs e o pH do tampo de eluio. As protenas no retidas (com a mesma carga da resina) no so separadas, sendo simplesmente arrastadas pelo tampo (ou seja, no so repelidas pela resina).

Tipos de Resina de troca Inica Tipos de Resina de troca Inica Existem vrios tipos de resinas de troca inica disponveis no mercado.

Cromatografia de afinidade:Eluio: condies que interferem na ligao da protena ao ligante, como mudanas no pH e/ou fora inica, ou por competio com o ligante livreUm dos mtodos mais eficientes para a purificao de protenas, possibilitando um alto rendimento com nmero reduzido de etapas.

A separao de molculas tem como base a interao especfica do analito (molcula-alvo) com um ligante imobilizado na matriz. Foras envolvidas nessa interao podem ser no covalentes (eletrostticas, hidrofbica, pontes de H) ou covalentes (p.e., ponte dissulfeto). Ex: cromatografia de imunoafinidade

1. Mono-especficos - ligao especfica da molcula-alvo- anlogos de substratos ou inibidores de enzimas- agonistas ou antagonistas de receptores- haptenos ou determinantes antignicos de anticorpos- ligantes com tag ou marcao- glutationa-S-transferase- poli-Histidina

2. Grupo-especfico: ligantes para separao de grupos:Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade8-AEA-cAMP

8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic monophosphate(ligante para protenas com afinidade por cAMP ou cGMP) Stios de ligao das protenas A, G e L imunoglobulina, que permitem a purificao de anticorpos por cromatografia de afinidade

Ligante grupo-especficoEspecificidadeProtena ARegio Fc de IgGProtena GRegio Fc de IgGConcanavalina AGrupos glicosil- ou manosil-Cibacron BlueVrias enzimas, albuminalisinaPlasminognio, RNA ribossomalargininaproteinases tipo tripsinabenzamidinaproteinases tipo tripsinacalmodulinaProtenas reguladas por calmodulinaheparinaFatores de coagulao, lipases, hormnios, receptores estorides, etcMetais de transio Protenas e peptdeos com resduos de His expostos

Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) h o risco de impedimento estrico entre a matriz e a molcula-alvo, que causa dificuldade ou impede sua ligao resina.

A introduo de um brao espaador (alguns C) diminue o risco.Preparo da resina de afinidade:

Passo 1. Ativao da resina Passo 2. Acoplar o ligante

Cromatografia de PartioPrincpio: Explora diferenas de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade diferentes, um polar e outro apolar.Aplicvel especialmente molculas pequenas, como compostos orgnicos, aminocidos, peptdeos, acares, lipdeos, etc.

Apresenta limitaes para uso com protenas acima de 20-30kda, que so desnaturadas em presena de solvente orgnico.

Consiste de 2 sistemas:Dois tipos de montagem:

Para um dado sistema de solvente e tipo de suporte, cada substncia apresenta um valor de Rf caracterstico.

Assim, alm de um mtodo de purificao, as cromatografias de partio permitem identificar e quantificar (pela intensidade das manchas obtidas aps a separao) diferentes compostos.

Pode-se ainda recortar a mancha de interesse do papel ou da slica e recuperar o composto isolado.Cromatografia de PartioPapelou placa de slicaAmostra na origemtempo 0 t 1 t2 tn direo do fluxo do solventeCompostos separadosCuba com solvente (fluxo por capilaridade)

HPLC: high performance (pressure) liquid chromatographyInicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna, hoje em dia abrange aplicaes para todos os tipos de cromatografias.

Caracterstica diferencial da cromatografia convencional: partculas de resina com dimetro muito pequeno (poucos microns) aumento da eficincia da separao em funo do nmero maior de gros de resina em um mesmo volume da coluna fase mvel - necessita bomba de alta presso para ter fluxo atravs da coluna

Desenho bsico de um HPLCDuas bombas permitem eluio em gradiente

Detector: ndice de refrao, absorbncia UV ou Vis, fluorescncia, etc.

Coluna pode ser aquecida para melhorar a eluio diferencial na fase reversa

Condio de equilbrio: em meio cido (0.1% de cido trifluoroactico) para aumentar hidrofobicidade (protonar as carboxilas)

Eluio com gradiente crescente de solvente orgnico miscvel com gua- acetonitrila, metanol, propanolFase reversa: resinas de slica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 CCromatograma de uma coluna de fase reversa, com eluio por um gradiente de acetonitrila

Cromatografia de interao hidrofbica um processo de partio que explora a interao entre aminocidos apolares de uma protena e uma matriz de carcter hidrofbico.Protenas em soluo salina concentrada perdem parte da camada de solvatao para os sais, expondo na superfcie regies ricas em aminocidos apolares, que interagem com uma matriz hidrofbicaEficincia dos sais em provocar salting-out varia com a srie de Hofmeister:

nions: PO4-2> SO4-3>CH3COO->Cl->Br->NO3->ClO4->I->SCN-Ctions:NH4+>Rb+>K+>Na+>Cs+>Li+>Mg+>Ca+>Ba+Trs estratgias para eluio: 1. diminuir a concentrao de sal2. diminuir a polaridade da fase mvel3. adicionar detergenteFora da interao hidrofbica aumenta com o tamanho da cadeia de C na resina: Fenil (C6-OH) > Butil (C4) > Octil (C8)

Como se avalia se o processo de purificao de uma protena foi eficiente ?Trs parmetros permitem avaliar a eficincia do processo de purificao de uma protena:

Atividade especfica (AE): a razo entre a quantidade da protena de interesse, medida atravs de sua atividade biolgica, e a quantidade total de protenas presentes em cada etapa de purificao. Esse ndice aumenta ao longo da purificao.

ndice de purificao: indica quantas vezes em relao ao material de partida a protena de interesse foi concentrada. Calcula-se como a razo entre as atividades especficas inicial (material de partida) e final (protena pura).

Rendimento: indica quanto (em %) da protena de interesse ativa presente no material de partida foi recuperado ao final da purificao. Um certo grau de perda inerente do processo de purificao (em cada etapa s devem ser proces- sadas as fraes mais ricas em atividade biolgica, desprezando-se aquelas que apresentam pouca atividade). Tambm podem ocorrer perdas por desnaturao das protenas devido s diferentes condies (pH, sais, etc) a que so submetidas nas diferentes etapas de purificao. Espera-se recuperar o mximo possvel da protena de interesse.

Uma tabela como a vista acima a maneira usual de se descrever o resultado de uma purificao. No exemplo acima, a mesma protena foi isolada por duas marchas diferentes de purificao (A e B). Observe os parmetros de purificao. Se voc fosse repetir essa purificao, qual esquema de purificao escolheria ?

EU TERIA ESCOLHIDO A MARCHA B.

Como se avalia se o processo de purificao de uma protena foi eficiente ? A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) permite visualizar a composio de protenas de uma amostra. um mtodo complementar para a purificao de protenas.

Fornece informaes sobre a massa molecular e composio de subunidades da protena em meio desnaturante e redutor.A poliacrilamida um polmero que um gel de malha porosa.

A poliacrilamida funciona como uma peneira, deixando passar atravs de seus poros as molculas pequenas e retendo as grandes formado a partir da reao de acrilamida e bisacrilamida. concentrao de acrilamida variando de 5 a 20% determina o dimetro dos poros uso de gradiente de acrilamida aumenta o poder de resoluo o gel polimerizado com tampo pH 8.9, na presena do detergente Na+ dodecil sulfato (SDS)

Sdio dodecil sulfatoDesnaturao de protenas por SDSEfeito do SDS

desnaturao uniformiza a forma das protenas, que poderia influenciar na migrao atravs dos poros da poliacrilamida;

mascara a carga natural das protenas no pH da corrida, fazendo com que todas molculas migrem para o ando;

facilita o efeito de redutores, rompendo pontes dissulfeto intra- e inter-cadeiasA poro hidrocarboneto do detergente interage com as regies hidrofbicas da protena, dispondo o grupo sulfato carregado na superfcie, em contacto com o meio aquoso. A repulso entre os grupos fosfato desestabiliza os laos no covalentes que mantm a estrutura 3D da protena, desnaturando-a.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)O desenho ao lado mostra o tipo mais comum de cuba para PAGE. Na cuba, o gel polimerizado entre duas placas de vidro ou plstico, afastadas 1 mm uma da outra.

Antes da polimerizao, um pente colocado na parte superior do gel para formar os poos onde sero colocados de 5 a 20 microlitros de cada amostra, misturadas com azul de bromofenol, um indicador da corrida.

As partes superior e inferior do gel fazem contacto com recipientes de tampo, onde esto os eletrodos que estabelecero o campo eltrico (~100V) durante a corrida (1 a 2h).

Terminada a corrida, as placas so retiradas da cuba, e o gel entre elas cuidadosamente retirado e corado para revelar as bandas de protena. Como corantes utiliza-se Coomassie Blue ou nitrato de prata.catodoanodotampoPoos para as amostrasamostraPlacas de vidro1 mmtampogel

Eletroforese em Meio RedutorAdio do redutor 2-mercaptoetanol rompe pontes dissulfeto nas protenas, possibilitando a determinao do nmero de cadeias e tipo de ligao entre cadeias de protenas oligomricasSDS-PAGE das protenas da bactria Salmonella tiphymuriumDireo da migraoCada linha (banda) corada no gel representa uma protena

SDS-PAGE permite determinar a massa molecular de protenasMobilidade relativa =

distncia percorrida pela banda Xdistncia percorrida pelo marcador da corridaCurva de calibrao de SDS-PAGE A migrao eletrofortica, expressa como mobilidade relativa, proporcional ao logaritmo da massa molecular. Utiliza-se protenas padres com Mr conhecida para se fazer uma curva de calibrao do gel em cada corrida. Interpolando-se a mobilidade relativa de uma protena desconhecida na curva, pode-se estimar a sua massa molecular.Protenas padres em um SDS-PAGEMr

Terminamos aqui a 4.aula online do curso de Biofsica de Protenas.Os assuntos abordados nessa aula so:

Mtodos de centrifugao e precipitao diferencial Dosagem de protenas Mtodos cromatogrficos Anlise de eficincia da purificaoNa aula prtica, vocs tero oportunidade de ver alguns tipos de cromatografia funcionando.