AULA 18 – PARTE III: Organização e Funcionamento Celular

Transdução de Sinal

- Sinalização através de receptores de morte - Sinalização através da mitocôndria- Regulação e manipulação farmacológica

Vias apoptóticas

Existem duas vias bem caracterizadas de apoptose:- Receptor de morte celular ou via extrínseca( ligação receptor-ligando, apoptose dependente da caspase)- Mitocondrial ou via intrínseca( Induzida por stress, sendo a apoptose também dependente da activação de caspases)

1)Via do receptor de morte celular

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Receptores de morte celular

FasL (Fas Ligand) …………………. TNF- α ………………………………….. TRAIL (TNF- Related Apoptosis……..

Inducing Ligand)

Características: A via do receptor de morte celular transmite sinais externos de

apoptose A activação das caspases é induzida pela ligação a ligandos

especializados da família TNF (Tumor Necrosis Factor) aos seus receptores de morte TNFR.

Ligandos de morte celular

- Os ligandos encontram-se tipicamente ligados à membrana ( ≥18);- Os receptores são constituídos por uma subunidade ( ligação a ≥ 28 ligandos, promiscuidade)- Receptores Decoy (DcR), competem por ligandos mas não traduzem o sinal.

Componentes da via de receptor de morte celular: Receptor e sinal de morte celular Proteínas adaptadoras Caspases iniciadoras (caspase-8 e 10) Caspases efectoras (caspase-3)

Sinal de morte celular Receptor de morte celular

Adaptador

TNF- TNFR1 TRADDFaz ligand(Faz-L, CD95L) Faz (Apo-1,CD95) FADD

TRAIL DR4 (TRAIL-1)DR5 (TRAIL-2)

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Fas TNFR1 DR4, DR5 (death receptor 4/5)

Sinalização DISC

DISC (Death – Inducing Signaling Complex)

Activação do Sistema FasL/Fas

A FasL é principalmente produzida pelas células T, sendo a sua expressão aumentada na auto imunidade

Formação do DISC:

Ligação de uma FasL trimérica à Faz; Trimerização e enclausura da Faz; Recrutamento da FADD para a Faz; Recrutamento da caspase-8 para a

FADD

Activação induzida por proximidade da caspase-8 (auto activação)

Activação de caspases efectoras

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Ligando de morte celular

Receptor de morte celular

Adaptador

Caspase iniciadora

AdaptadorFADD – Fas- associated death domain

A FADD interage com a Faz via DD (death domain)

A FADD interage com a procaspase-8 via DED (death effector domain)

Activação do Sistema TNF- α /TNFR1

Sinalização pelo TNFR1

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O TNF-α é principalmente produzido por macrófagos activados e células T em resposta a infecções;

TRADD liga-se a FADD, que por sua vez recruta caspase-8;

O TNF-α raramente desencadeia a apoptose sem que a síntese proteica esteja bloqueada, o que sugere que outros factores celulares podem suprimir a apoptose;

O TRADD funciona como uma plataforma adaptadora para o RIP e para o TRAF2;

O TNF-α/NFR1 activa o NF- kB e assim a sobrevivência celular

TRADD, TNFR-associates dead domain;TRAF2, TNFR-associated factor2RIP, receptor interacting protein

sobrevivência

Consiste na junção de TNR1, TRADD, TRAF2 e RIP1;

Leva à rápida activação de NF-kB e MAPKs, como o p38, JNK e ERK

É um complexo de sobrevivência

Na membrana plasmática, é formado o complexo I de ligação à membrana:

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Depois da endocitose do receptor, o complexo II (citoplasmático) é formado:

endocitos

Modificação/dissociação

Recrutamento de FADD e caspase-8

apoptose

A proteína adaptadora TRADD recruta FADD e procasase-8 ou 10, mediando a apoptose

Complexo pró-apoptótico

ApoptoseSobrevivência

Activação do sistema TRAIL/DR

TRAIL desencadeia uma rápida apoptose em muitas vias com células tumorais;

É um processo caspase-dependente, a via independente da FADD liga a TRAIL a caspases;

DcR1/2 compete com DR4/5 para o TRAIL, pára a sinalização;

A expressão diferencial de receptores Decoy e de morte celular pode fazer com que o TRAIL induza a apoptose em tumores poupando as células normais.

2) Via mitocondrial

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Libertação de proteínas mitocondriais

Apoptose

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Doenças agudas e crónicas humanas, agrupadas segundo o tecido mais afectado, associadas à apoptose mitocondrial:

SNC-Isquémia cerebral- Ataxia de Friedreich- Desordens neurodegenerativas- Síndrome de Reyes

Sistema Cardiovascular- Enfarte miocárdio- Aterosclerose- Cardiomiopatias- Complicações diabéticas- Ataxia de Friedreich

Fígado- Colestasia- Aumento de ferro- Lesão isquémica- Hepatite não alcoólica- Toxicidade de CCl4, etanol

Rim- Glomerulonefrite- Lesão isquémica- Pedras- Toxicidade com acetaminofenos, cádmio

Apoptose

Apoptossoma

1) Citocromo c (Cyt c) Promove a formação do

apoptossoma O citocromo c activa o Apaf-

1 citosólico O Apaf-1 citosólico liga-se à

caspase-9 activando-a.

2) AIF e Endo G Translocação entre o citosol

e o compartimento nuclear onde favorecem a fragmentação do DNA e a condensação da cromatina.

Membros das HSP (Heat Shock Protein), como a HSP70, antagonizam a AIF e a sua actividade pró-apoptotica prevenindo a sua importação nuclear

Mecanismos de permeabilização mitocondrial

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3) Smac/DIABLO and Omi/HtrA2

Promove indirectamente a apoptose por ligação a esta e antagoniza os membros da família IAP

Sob circunstâncias normais, iriam exercer efeitos anti-apoptóticos por prevenção da actividade das caspases

Apoptose

Condições fisiológicas:- A mitocôndria exibe um elevado potencial transmembranar- Proteínas do espaço intermembranar são retidas na mitocôndria;- Membros pró-apoptoticos da família Bcl-2 estão no seu estado inactivo (solúveis no citoplasma, como a Bax e a Bid, ou ancoradas à membrana mitocondrial, como as Bak)- O complexo poroso de transição por permeabilidade (PTPC) assegura a troca de metabolitos entre o citosol e a matriz.

Indução apoptótica:1) Sinais pró-apoptóticos podem destabilizar directamente os lípidos

mitocondriais, favorecendo a formação de poros;2) A abertura prolongada do PTPC pode levar à dissipação

transmembranar do potencial, seguido pela destabilização osmótica e induz plasmólise, podendo culminar na ruptura física da membrana externa.

3) Membros pró-apoptóticos da família Bcl-2 podem translocar-se a partir do citosol para a membrana externa

4) Proteínas pró-apóptoticas activadas da família Bcl-2 podem agrupar-se em grande multímeros permitindo a libertação de proteínas.

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A mitocôndria apresenta pontos cruciais de controlo da apoptose, onde sinais leais e vitais provenientes de compartimentos intra e extra celulares, convergem e integram-se para induzir a permeabilização.

1) Membros pró e anti-apoptose da família Bcl-2 exercem a sua actividade na mitocôndria mas também no retículo endoplasmático (ER) onde regulam a concentração de cálcio. A quantidade de Ca2+ libertada determina a resposta mitocondrial a este ião.

2) O p53 controla a resposta à destruição do DNA por mecanismos dependentes da transcrição (o p53 regula positivamente os membros pró-apoptóticos da família Bcl-2) e independentes (o p53 favorece a permeabilização por interacção directa com Bak, Bax, Bcl-2 e Bcl-XL na membrana mitocondrial externa).

3) Os receptores de morte celular traduzem sinais pró-apoptóticos extra celulares. A via extrínseca é ligada à mitocôndria pela caspase-8 através da tBid. A tBid favorece a permeabilização por promover a formação de poros com a actividade da Bak e da Bax, a desconstrucção de oligomeros Opa1 (optic atrophy 1) (processo que resulta na remodelação cristalina) e a disfunção mitocondrial através da interacção com a cardiolipina.

4) Quando as membranas lisossomais são desfeitas, catepsinas e outras hidrolases são libertadas para o citoplasma onde promovem apoptose e/ou necrose. Algumas catepsinas são capazes de activar as Bid, assim como de induzir a disfunção mitocondrial por clivar subunidades específicas de complexos de fosforilação oxidativa (OXPHOS), aumentando a pool de radicais livres de oxigénio (ROS)

5) Os sinais vindos do citosol levam à permeabilização. Incluem ROS, metabolitos e a activação de cinases específicas.

6) Moduladores endógenos inibem o PTPC e protegem a mitocôndria da permeabilização. Estes incluem metabolitos, membros anti-apoptóticos

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Bcl-2, enzimas antioxidantes (glutationa-S-transferase) e cinases pró-sobrevivência.

Ligação com a via de receptor de morte celular

A via de receptor de morte celular pode ser relacionada com a permeabilização mitocondrial através da clivagem da BH3 (only protein Bid)

- A caspase-8, activada pela ligação de receptores de morte celular, cliva a BH3-only protein Bid , que se torna activa- A Bid liga a Bax e a Bak para permeabilizar a mitocondrial ligando a via mitocondrial de apoptose- A Bid actua como uma ligação entre as duas vias apoptóticas

Manipulação farmacológica

Manipulação farmacológica da permeabilização mitocondrial

- Os antagonistas Bcl-2 (mimetizam BH3) para induzir a morte celular Aumentam a biodisponibilidade de BH3-only proteins Interrompem as interacções proteína-proteína entre Bcl-2/Bcl-XL com

Bax e Bak Promove a activação de caspases (feedback positivo) Promove a acumulação mitocondrial de Ca2+

- Compostos mitocondriais tóxicos para a terapia cancerígena Inclui derivados peptídicos, pequenas moléculas e agentes

catiónicos lipofílicos

- Inibidores do PTPC para prevenir a morte celular- Modulador dos canais mitocondriais de K+ sensíveis a ATP

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