Aula

Neves, L.C.M Reviso Bibliogrfica

5

3. REVISO BIBLIOGRFICA

3.1.Processos Fermentativos Em termos gerais, a fermentao implica na utilizao de microrganismos

na transformao da matria orgnica catalisada por enzimas. A humanidade convive com processos fermentativos desde 5.000 a.C na

sua utilizao para a obteno de vinho, queijos e outros derivados do leite. Os egpcios j utilizavam a fermentao da cevada para a obteno de uma espcie de cerveja e, em 4000 a .C, a levedura da cerveja j estava sendo utilizada para a panificao. No Mxico, os astecas costumavam cultivar algas do gnero Spirulina para consumo prprio (WARD,1991).

Hoje em dia, diversos produtos utilizados nas indstrias qumicas, farmacuticas e de alimentos so obtidos por processos fermentativos. Estes produtos podem ser gerados pelo metabolismo primrio (ex: Etanol) ou secundrio (Ex: Antibiticos) do microrganismo cultivado e ao lado da produo de biomassa, enzimas e protenas em geral, eles so os responsveis pela evoluo tecnolgica e desenvolvimento das pesquisas na rea (WARD,1991).

As fermentaes podem ser conduzidas por processos descontnuos, descontnuo-alimentados ou contnuos, bem como, por variaes destes processos. (WARD, 1991; BORZANI, 2001).

Independente do modo de operao utilizado, o desenvolvimento de processos fermentativos para a produo de enzimas por microrganismos tornou vivel a obteno de novos sistemas enzimticos (PARK, 1975).

Novos processos que fossem economicamente viveis, com reprodutibilidade e confiabilidade, aumentariam a necessidade de controle e melhor acompanhamento do processo. Porm, maiores progressos resultariam de uma melhor compreenso da fisiologia microbiana, interaes do microrganismo com o meio e sua habilidade em manipular fluxos metablicos (BUCKLAND, LILLY, 1993).

Diversos so os estudos com a finalidade de aprimorar e otimizar os processos fermentativos, objetivando a produo de enzimas (PESSOA-


6

JNIOR et al., 1996; ABRAHO-NETO et al., 1996). No entanto, segundo TONGUE, INLOES (1990), a real aplicao industrial de qualquer enzima s vivel se as condies utilizadas no processo fermentativo forem favorveis e se a enzima produzida em larga escala apresentar os mesmos nveis, de atividade e produtividade obtidas em escala de bancada.

Segundo TACIRO (1992), a ampliao de escala de um processo fermentativo, para que este se torne vivel industrialmente, dever manter as condies do processo uniformes para qualquer volume de operao.

No entanto, de acordo com TONG & INLOES (1990), para tornar vivel essa ampliao de escala indispensvel primeiro definir o microrganismo a ser empregado, o meio de cultivo e as condies de agitao e aerao mais adequadas ao processo.

3.1.1.Processo Descontnuo Os cultivos descontnuos podem ser considerados como sendo um sistema

fechado, exceto pela aerao e controle de pH atravs da adio de cidos e bases, que contm uma quantidade limitada de meio, e no qual o inculo passa por um nmero de fases, o que pode ser observado pela curva de crescimento celular. Em processos descontnuos e semi-contnuos, todo o substrato fornecido no incio da fermentao, enquanto que nos demais processos, o substrato adicionado ao longo do cultivo.

A principal desvantagem da fermentao descontnua, quando utilizada para a produo de bioprodutos associados ao crescimento celular, que a formao eficiente do produto ocorre somente durante uma parte do ciclo de fermentao, o que promove uma produtividade menor do que a obtida por processos que consigam prolongar este perodo.

Em cultivos descontnuos, as elevadas concentraes de acares podem resultar numa represso chamada Efeito Crabtree, na qual as enzimas da respirao microbiana so inibidas e a produo de etanol aumenta. Este problema pode ser resolvido atravs do cultivo descontnuo-alimentado, onde os nutrientes essenciais podem ser alimentados conforme a necessidade do microrganismo durante o cultivo (WIN et al., 1995).


7

A quantidade de biomassa alcanada por um processo descontnuo depende da concentrao inicial de substrato limitante do crescimento e da eficcia do microrganismo para converter o substrato em material celular.

Segundo WARD (1991), a funo principal de um fermentador a de proporcionar um meio ambiente controlado que permita o crescimento eficiente das clulas e, a conseqente, obteno do produto de interesse. Sendo assim, na hora de decidir-se por um fermentador em escala laboratorial ou piloto, deve-se levar em conta a futura ampliao de escala, que por sua vez, resulta em fermentadores onde o custo e objetivos especficos so levados em conta. Os fermentadores trabalham, na maior parte dos processos, em condies asspticas, o que sugere a utilizao de inculo livre de contaminantes e de um sistema de fermentao passvel de esterilizao.

A maior parte dos processos fermentativos utiliza o reator do tipo tanque com agitao convencional mecnica, que nada mais que um eixo vertical contendo diversos agitadores em forma de p. O ar estril introduzido, geralmente, pela base da dorna e atravs de dispersores distribudo por todo o meio atravs do sistema de agitao. Portanto, a geometria dos fermentadores deve facilitar a eficcia da troca gasosa e as caractersticas finais deste fermentador devero levar em conta os fenmenos de transporte existentes nos processos biolgicos.

3.1.2. Processo Descontnuo-Alimentado O processo descontnuo alimentado vem sendo utilizado desde 1900 para

regular o crescimento de Saccharomyces cerevisiae, porm, os primeiros a utilizarem esse termo foram YOSHIDA et al. (1973). Basicamente, o processo descontnuo-alimentado definido como uma tcnica em processos microbianos, onde um ou mais nutrientes so adicionados no fermentador durante o cultivo e em que os produtos a permanecem at o final da fermentao. Em alguns casos, todos os nutrientes so adicionados gradualmente dorna (YAMANE et al., 1984) ou, ento, apenas os chamados aditivos (precursores de produtos ou nutrientes de menor


8

concentrao no meio) que so alimentados. A vazo de alimentao pode ser constante ou variar com o tempo, sendo que, no caso de a vazo de alimentao variar com o tempo, esta pode ser regulada em funo da concentrao de substrato desejada no meio, podendo-se, inclusive, manter a concentrao de substrato constante durante a alimentao (SENE et al., 2000).

Existem dois sistemas bsicos de aplicao para uma fermentao descontnuo-alimentada (Fed-Batch), que so o de volume fixo e volume varivel. No caso de volume fixo, o substrato alimentado sem que ocorra diluio da cultura. O volume de meio de cultura pode ser mantido constante atravs da alimentao de substrato na forma de lquido concentrado ou atravs de dilise. Em sistemas de volume varivel, o volume se altera de acordo com o tempo de fermentao oportuno para o substrato alimentado. A forma como esse volume se altera depende de fatores como as exigncias, limitaes e dos objetivos da operao. A alimentao pode ser efetuada atravs da adio com vazo constante, vazo crescente e vazo decrescente, entre outros. Este processo pode ser classificado, tambm, como fermentao decontnuo-alimentada simples ou repetida, sendo o processo de fermentao repetida aquele onde parte do meio de cultura removido do sistema em um certo momento da operao e mais meio nutriente ento adicionado. A existncia de um volume reduzido no incio do cultivo ou uma menor concentrao de nutrientes durante o enchimento, promove o aumento na velocidade especfica de crescimento, seguido por um decrscimo gradual onde se estabelece um estado praticamente constante. No processo simples, um meio de crescimento complementar adicionado durante a fermentao sem retirar-se a cultura at o fim do cultivo. Neste processo, a durao da fermentao limitada pelo volume do fermentador.

A fermentao descontnuo-alimentada uma tcnica de produo situada entre a fermentao descontnua e a contnua, onde necessria uma vazo de alimentao apropriada, com a constituio certa dos componentes. Este tipo de fermentao oferece diversas vantagens em


9

relao aos outros processos. Entre as vantagens oferecidas tem-se a produo de elevadas concentraes de clulas devido ao extenso tempo de trabalho (o que particularmente importante no caso de produtos associados ao crescimento celular), o melhor controle das condies de adio de substratos durante a fermentao (particularmente importante no caso das concentraes de substratos especficos como, por exemplo, a fonte de carbono), o melhor controle dos produtos obtidos ou dos efeitos da represso catablica devido adio de substrato ser limitado apenas quantidade necessria para a formao do produto, o modo de operao permite dominar e controlar os desvios no crescimento do microrganismo encontrados na fermentao descontnua, permite a reposio da gua perdida no meio por evaporao, um modo alternativo de operao para fermentaes que utilizem substratos txicos ou de baixa solubilidade e a no necessidade de peas adicionais especiais como necessrio em uma fermentao contnua.

Segundo WIN et al. (1996), a produtividade celular (PrX) alcanada no cultivo de S.cerevisiae utilizando melao de cana-de-acar em processo descontnuo foi de 0,31 g/L enquanto que a obtida para processo descontnuo-alimentado foi de 2,33 g/L, implicando num aumento considervel da concentrao de biomassa resultante graas reduo de provveis efeitos inibitrios que estariam presentes durante o cultivo descontnuo. necessrio observar-se que este tipo de fermentao necessita de uma anlise prvia do microrganismo, do que necessrio para o seu crescimento e conhecer-se sua fisiologia com a produtividade. Tambm necessrio conhecer-se a tcnica de operao para o incio, definio e desenvolvimento do processo.

O substrato , particularmente, um importante parmetro para se controlar este tipo de fermentao devido ao fato de estar, eventualmente, associado inibio do crescimento e ao aumento da eficincia do fluxo de carbono, pela reduo da quantidade de produtos derivados formados e a quantidade de dixido de carbono envolvido. Um exemplo de controle de concentrao


10

de glicose encontrado na produo descontnuo-alimentada de levedura de panificao (AIBA & NAGAI, 1976).

Segundo KAPAT et al (1998), a alimentao com galactose aps o meio fermentado se mostrar exaurido de glicose mostrou-se a mais eficiente estratgia de produo de Glicose-Oxidase atravs do cultivo de Saccharomyces cerevisiae recombinante em processo descontnuo alimentado.

Nutrientes como metanol, etanol, cido actico e compostos aromticos inibem o crescimento celular, mesmo em concentraes baixas, porm, sabe-se que qualquer nutriente pode se tornar inibitrio, mesmo que somente em concentraes muito elevadas e esse efeito inibitrio efetivamente reduzido pelo uso do processo descontnuo alimentado, atravs do controle das concentraes destes nutrientes (BORZANI et al., 2001). Outro grande problema minimizado seria o da formao de produtos metablicos txicos, que crtica em processos onde exista a necessidade de se trabalhar com altas densidades celulares, como no caso de fermentaes de microrganismos modificados geneticamente, onde a concentrao celular elevada implica num aumento significativo na produo, j que o crescimento celular em microrganismos modificados geneticamente sempre bem menor do que o microrganismo selvagem. Problemas de transferncia de oxignio so acentuados em fermentaes em alta concentrao celular, de forma que a velocidade de crescimento celular passa a ser fator determinante para a eficincia do processo, de forma que se mantenha a mesma em nveis desejveis e tenhamos, com isso, a diminuio na produo de produtos txicos, possibilitando que se consiga altas concentraes celulares e, tambm, aumento na quantidade de produto formado. No processo descontnuo alimentado no existem problemas comuns ao processo contnuo, como os problemas de mutao, contaminao e instabilidade do plasmdeo, de forma que o processo descontnuo alimentado se torna muitas vezes o mais vivel para a produo de produtos recombinantes (YOON & KANG, 1994).


11

O processo descontnuo alimentado pode ser controlado no somente pela concentrao de nutrientes no meio, mas tambm, pela variao do pH durante a alimentao como na produo de Glicose-Oxidase (GOD) atravs do cultivo de Saccharomyces cerevisiae recombinante (KAPAT et al., 1998). Neste procedimento, a alimentao com galactose foi automaticamente controlada pela variao do pH durante o cultivo de forma que seu valor no ultrapassasse a faixa entre 5,45 e 5,55. O sistema de controle do pH possibilitou um aumento na secreo extracelular da enzima e uma reduo na produo de etanol, aumentando a produo de GOD.

Outra maneira de se controlar um processo fermentativo atravs da medida on-line da concentrao de etanol, uma vez que sua produo durante o cultivo uma das maiores razes para uma queda na produtividade celular e do produto de interesse (WIN et al., 1995).

Para que um microrganismo tenha sua sobrevivncia garantida no meio ambiente, ele tem que, necessariamente, ser eficiente, no desperdiando energia. Para isso, o microrganismo possui mecanismos regulatrios no seu metabolismo para evitar a formao de algum metablito em excesso. Uma forma de se evitar ou contornar essa regulao atravs da utilizao de cultivos descontnuo-alimentados. Como exemplo temos a utilizao desse processo para contornar o efeito da represso catablica, comum quando utilizamos Glicose como fonte de carbono. A Glicose rapidamente metabolizvel e acaba inibindo a expresso de genes que codificam enzimas relacionadas ao metabolismo de outras fontes de carbono. Uma maneira de se evitar esse efeito atravs do cultivo em batelada alimentada onde se consegue manter a concentrao de glicose no meio baixa, restringindo, com isso, o crescimento celular e desreprimindo a biossntese de enzimas.

Segundo BORZANI (1996), todos os acares fermentveis disponveis na dorna so completamente metabolizados uma hora aps o trmino da fase de alimentao de um processo descontnuo-alimentado de produo de etanol eficiente.

Outro efeito da regulao catablica que pode ser controlado pelo uso de cultivo em batelada alimentada o que se chama de induo. A induo , ou


12

desrepresso, ocorre quando na presena de algum substrato, os genes que induzem formao de algum bioproduto (ex: enzimas) so desreprimidos, liberando a sntese dessa enzima. Por exemplo, em processos onde o produto obtido seja uma protena recombinante, a induo de proteases se d quando ocorre a diminuio da concentrao de nitrognio no meio. Esta teoria foi comprovada por YOON et al. (1994), que adicionaram extrato de levedura como fonte de nitrognio orgnica, e evitaram a induo (desrepresso) dos genes que induzem formao de proteases. A formao de proteases degradaria a protena recombinante obtida no cultivo.

O processo descontnuo alimentado tambm utilizado para o estudo da cintica de processos fermentativos, pois, possibilita a manuteno de baixos nveis de substrato por um longo perodo de tempo, concentrao celular constante e controlar a velocidade de crescimento em condies transientes. Com isso, possvel estimar de forma mais favorvel os parmetros cinticos e se obter a mxima velocidade.

A fermentao alcolica pode ser realizada em processo descontnuo, descontnuo alimentado ou contnuo, mas, no Brasil o processo descontnuo-alimentado com reciclo de clulas um dos mais empregados. A grande vantagem e principal justificativa para seu emprego esto na possibilidade de controlar-se a velocidade de alimentao de meio, diminuindo com isso a inibio, causada pelas elevadas concentraes de substrato e/ou de produto, no metabolismo celular. Vrios trabalhos mostraram um aumento na produtividade em etanol entre 10 e 14% ao alimentarem o substrato atravs de sistemas de adio linear decrescente (KRAUTER et al., 1987) ou exponencial decrescente (ECHEGARAY et al., 2000) quando comparados com cultivos em processo descontnuo.

3.2.Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae destaca-se como a espcie mais explorada comercialmente entre as leveduras e apresenta grande emprego em nosso pas, notadamente, na indstria de produo de etanol.


13

As leveduras e, em particular, a Saccharomyces cerevisiae, so microrganismos aos quais ns temos algumas das mais antigas referncias bibliogrficas. J em EXODUS 12 e 13 existem citaes sobre leveduras (FLORES et al., 2000).

Desde a Antiguidade, Saccharomyces cerevisiae vem sendo utilizada em processos fermentativos diversos, como na panificao, cervejaria e fabricao de vinho e, seu uso foi possvel desde ento, devido sua capacidade de converter rapidamente acares em etanol, cidos orgnicos e gs carbnico (WARD, 1991).

A produo de etanol pela fermentao do caldo de cana e melao tem dado uma grande contribuio para o programa energtico brasileiro.

O uso de Saccharomyces cerevisiae como uma fonte na obteno de enzimas mostra-se uma alternativa vivel e bem prtica devido grande manipulao desta cepa em plantas industriais (SILVA et al., 2001).

A primeira pesquisa voltada ao estudo das leveduras foi realizada por Antonie van Leewhoek, que as observou primeiramente em cervejas e vinhos. Foi somente em 1876, atravs de Pasteur, que se conseguiu comprovar que as fermentaes do vinho e da cerveja eram causadas pelas leveduras. A partir de ento, as leveduras e ,em particular, Saccharomyces cerevisiae passaram a ser os microrganismos favoritos para os estudos de biologia celular bsica, o que a tornou um ponto central na evoluo da microbiologia, bioqumica e gentica. Existem diversas razes para isso, como a facilidade de seu isolamento e manuteno, pouca exigncia nutricional, bom crescimento em meios constitudos por resduos industriais, amplo uso em processos industriais e sua reconhecida capacidade de produzir enzimas extracitoplasmticas.

Segundo ENTIAN (1997), a Saccharomyces cerevisiae tornou-se um microrganismo modelo em gentica e biologia molecular, culminando com o seu completo sequenciamento.

Saccharomyces cerevisiae uma levedura ascomictica e anaerbia facultativa. Uma levedura tpica, consta de clulas pequenas, ovais e apresenta uma reproduo vegetativa por brotamento. O ciclo de vida de


14

leveduras do tipo Saccharomyces cerevisiae inclui duas fases: haplide e diplide. Quando clulas diplides so colocadas em um meio de esporulao, o crescimento vegetativo se encerra e as clulas comeam a formar esporos de forma que cada clula diplide forme um asco, geralmente, com quatro esporos (BYERS,1981).

A levedura uma fonte biolgica para a obteno de produtos de interesse na indstria farmacutica e de alimentos, como as enzimas invertase, hexoquinase, glicose-6-fosfato desidrogenase, glicose-oxidase, proteases e outras, alm da possvel utilizao de sua prpria biomassa como fonte de protenas na alimentao animal e humana (PESSOA -JNIOR et al., 1996; SILVA, 1998).

A Saccharomyces cerevisiae adquirida comercialmente apresenta atividade da enzima G6PDH muito similar quando comparado Saccharomyces cerevisiae produzido por fermentao sob condies controladas. Entretanto, a Saccharomyces cerevisiae modificada geneticamente produziu atividade enzimtica de ,aproximadamente, 100 vezes mais que a cepa selvagem e mostrou ser o mais efetivo procedimento para a obteno de G6PDH, alm de justificar o uso de tcnicas de biologia molecular para a produo dessa enzima pela Saccharomyces cerevisiae (LOJUDICE et al., 2001).

Vrios so os fatores que influenciam o cultivo de Saccharomyces cerevisiae. O crescimento celular depende de fatores como temperatura, pH, componentes do meio de cultura e disponibilidade de oxignio para a clula (SILVA et al., 2001).

3.2.1.Influncia da Temperatura Sendo as leveduras microrganismos mesfilos, em geral, as temperaturas

timas para sua utilizao em processos industriais iro se situar na faixa entre 25 e 35o C. Para a produo de etanol, a temperatura tima obtida foi de 30o C (WIN et al., 1995), porm, encontram-se trabalhos em que a temperatura utilizada foi de 32o C (ECHEGARAY et al., 2000; BORZANI, 1996) ou at mesmo de 28o C (PAALME et al., 1997) o que refora a idia


15

da existncia de uma faixa tima de temperatura em que se possa trabalhar sem que a modificao no valor de temperatura dentro dessa faixa implique em grandes perdas de produtividade. Porm, estudos feitos por FIESCHKO & HUMPHREY (1983) mostraram que entre 23o C e 33o C o coeficiente de manuteno de bactrias se manteve constante, porm, com o aumento da temperatura de 33o C para 35o C, houve uma sensvel alterao no coeficiente de manuteno celular, mesmo no tendo ocorrido grande variao no fator de converso de substrato em clula. Isto implica que, possivelmente, o aumento da temperatura de forma que esta saia da faixa tima resulta em alteraes no metabolismo basal da clula.

Para a produo de cerveja podemos ter uma temperatura tima em torno de 26o C (LIMA, 1975), enquanto que para a obteno de Glicose-Oxidase, este valor ficou em torno de 30o (KAPAT et al., 1998) e para a obteno de Hexoquinase a temperatura tima variou entre 35 e 40O C (ABRAHO-NETO et al., 1996).

Uma explicao para essa faixa de temperatura est no fato de que em temperaturas elevadas ocorre inibio da sntese de cidos graxos e esteris (STARR, 1962).

3.2.2.Influncia do pH O pH , sem dvida, uma importante varivel a ser considerada em um

cultivo de microrganismos pois cada cepa utilizada ter um valor timo de pH na qual dever ser cultivada. Uma mudana no valor intracelular do pH seria indesejvel e por isto que os microrganismos tem uma eficiente capacidade tamponante intracelular, capaz de manter o valor de pH sempre timo. Portanto, o pH utilizado afeta apenas as enzimas extracitoplasmticas, como a invertase, alm de promover alteraes na estrutura da membrana celular. (ABRAHO-NETO et al., 1996; DE MORAIS, 1984).

O pH considerado timo para a produo da enzima hexoquinase foi de 4,0 e a justificativa para este valor estaria no acoplamento entre a produo


16

de hexoquinase e a atividade da enzima extracelular invertase, diretamente afetada pela variao no pH extracelular (ABRAHO-NETO et al., 1996).

Segundo SOUZA et al. (2000) e ASENJO (2000), o pH pode alterar as cargas dos grupos qumicos localizados ao lado das cadeias de protenas provocando uma modificao na rede de cargas de toda a estrutura da macromolcula de forma que a enzima tenha sua capacidade cataltica reduzida ou mesmo perdida.

Sabe-se que em ausncia de meio tamponado, o valor do pH cai rapidamente durante as primeiras fases de fermentao e este fenmeno pode ser tido como um reflexo da atividade da levedura, que est absorvendo aminocidos, acumulando ons, excretando gs carbnico no meio ou mesmo excretando ons H+ durante a gerao de ATP pela respirao (extruso de prtons durante o transporte de eltrons pela Cadeia de Transporte de Eltrons CTE), (DE MORAIS, 1984).

DE MORAIS (1984) comprovou que a acidificao ocorre pela extruso de prtons para o meio extracelular, assim como, o controle dessa extruso feito pelo valor do pH no meio externo. Como uma forma de buscar equilbrio na relao entre a concentrao de prtons extra e intracelularmente, a clula busca o controle do pH no ambiente extracelular atravs dessa acidificao, o que prova a importncia do pH extracelular na gerao de ATP que, por sua vez, est intimamente ligado ao gradiente de prtons gerados pela diferena de concentrao extra e intracelular dos mesmos.

O pH do meio de cultivo exerce papel significante na atividade da G6PDH. ABRAHO-NETO et al. (1997), trabalhando a 35o C e 4,0 mg O2 / L, obtiveram maior atividade para G6PDH com um pH 4,5, sendo que um acrscimo de 0,5 neste valor promoveu uma queda de 50% da atividade enzimtica. Por outro lado, a modificao gentica pode alterar o valor timo deste pH, como comprova ROSSI (2002), onde o pH 5,7 mostrou-se mais adequado para a produo de G6PDH atravs do cultivo de Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada.


17

3.2.3.Influncia do Meio de Cultura Devem ser considerados os nutrientes responsveis pelo crescimento

celular. Fontes de carbono e nitrognio so muito importantes no cultivo de microrganismos. O modo de aplicao e seleo de fontes de carbono um dos fatores crticos dos processos fermentativos, pois muitos compostos, especialmente acares, podem causar intensa represso catablica da sntese de vrias enzimas, alm da reduo na velocidade de crescimento de determinados microrganismos (LILLY, 1979).

As grandes parcelas de microrganismos crescem bem em meios contendo amido ou acar, uma fonte usual de nitrognio e sais para suprir a necessidade de elementos minerais.

Os meios podem ser classificados como naturais ou sintticos. Os meios naturais so tecidos ou sumo de plantas ou animais em seu estado nativo, enquanto que os meios sintticos so preparados com acar puro e compostos orgnicos e inorgnicos quimicamente puros. Nos meios sintticos, a composio qumica qualitativa e quantitativamente bem definida.

Os meios naturais so altamente desejados pois permitem se cultivar microrganismos em meios obtidos a partir de fontes naturais de qualquer parte do mundo. Tem-se, tambm, que pelo fato do meio ser, basicamente, composto de extratos naturais, o seu custo largamente inferior ao que se tem com o cultivo em meio sinttico. Para aumentar a produtividade, se utilizam meios concentrados, porm, isto pode acarretar um aumento da presso osmtica e dificuldades de aerao. As matrias-primas perfazem 60 a 80% do preo de custo em uma produo de enzimas por fermentao e, portanto, a composio do meio deve ser definida com cuidado e trabalhos de pesquisas so necessrios para que se viabilize a substituio de compostos caros por outros disponveis em maior quantidade e de preo mais baixo (GODFREY & WEST, 1986).

STEINBERG (1939) estudando o tema concluiu que o meio sinttico exerce um excelente papel na nutrio de microrganismos. Segundo RICCI-SILVA (1998), a composio do meio de cultivo exerceu grande influncia


18

para a produo de hexoquinase (HK) e glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PDH) em clulas de S. cerevisiae. De acordo com LIMA (1975) qualquer composto orgnico natural ou mesmo sinttico pode ser utilizado como fonte de carbono por microrganismos, o que permite versatilidade no estudo e posterior emprego de diferentes meios de cultura em uma extensa srie de transformaes teis ao homem. Para obteno do produto desejado, h necessidade de uma seleo entre essas diversas fontes de carbono. Assim, podem-se obter melhores condies de processo, e suprir suficientemente as clulas para biossntese e gerao de energia (WANG et al., 1979). Portanto, a definio da fonte de carbono e de sua concentrao um dos fatores crticos do processo fermentativo (LILLY, 1979).

3.2.3.1.Fonte de Carbono Segundo LUCERO et al. (2001) , Saccharomyces cerevisiae utiliza

preferencialmente acares em relao a qualquer outra fonte de carbono e esta preferncia facilitada por diversos mecanismos que so controlados com eficincias diferentes por todos os acares fermentescveis: induo das protenas que favorecem a fermentao, represso das enzimas da cadeia respiratria e do ciclo do glioxilato e inativao das enzimas chaves da gluconeognesis.

A glicose um dos mais importantes primeiros mensageiros em clulas de leveduras. A adio de glicose ou de um acar rapidamente fermentescvel s clulas que cresceram em fontes no fermentescveis (condies de desrepresso) gera sinais metablicos e dispara uma ampla variedade de fenmenos regulatrios. O sinal produzido interage com o produto de um gene, regulando sua transcrio por ativao de protenas repressoras ou pela inibio de protenas ativadoras (GANCEDO,1992).

Segundo descrito por LUCERO et al. (2001), a glicose utilizada preferencialmente pelas leveduras em relao a qualquer outro acar presente e isto mostra o seu efeito sobre os mecanismos, que so controlados especificamente pela glicose, atravs de uma imposio nos mecanismos de catabolismo dos outros acares, seja pela induo de


19

alguns transportadores de acares ou pela represso de transportadores e enzimas necessrias. Trs transportadores de acares distintos foram identificados em leveduras sendo que dois deles so especficos para o transporte de galactose e maltose e um terceiro seria para o transporte de -glicosdeos, sendo todos os trs transportadores inativados em presena de glicose atravs de um sistema que inclui protelises e denominado de inativao catablica.

A concentrao de glicose no meio exerce uma funo reguladora importante no metabolismo. Por exemplo, para S. cerevisiae, a glicose no somente uma fonte de carbono, mas tambm age como um regulador global do mecanismo de crescimento celular (REIFENBERGER et al.,1997). O transporte de acar pode ser uma fase limitante do catabolismo durante o processo fermentativo (REIFENBERGER et al.,1997; DOES & BISSON,1998). Um estudo de comparao da capacidade de absoro de glicose entre diferentes leveduras sugere que o seu transporte esteja relacionado com a habilidade fermentativa especfica de cada microrganismo (SILVA,1998). Em presena de glicose no meio, a sntese de muitas enzimas reprimida, particularmente, a envolvida na glicognese, ciclo do cido tricarboxlico, cido glioxilato e catabolismo de acar fornecido ao meio, tais como: maltose, sacarose e galactose (ENTIAN et al.,1985).

A fase germinativa da levedura Saccharomyces cerevisiae acumula dois tipos de depsitos de glicose: o glicognio e a trealose.

O glicognio polissacardeo ramificado de elevado peso molecular. formado pela juno da cadeia linear (1,4) glicosil com carbonos ligados na posio (1,6).

A trealose um dissacardeo no reduzido e composto de duas molculas de glicose ligadas na posio (1,1).

Diversos trabalhos tm ilustrado importantes variaes nos nveis desses dois estoques de fonte de carbono durante as diversas fases do cultivo do microrganismo.


20

Segundo FRANOIS & PARROU (2000), possvel s clulas de Saccharomyces cerevisiae crescer em meio contendo trealose como fonte de carbono ocorrendo, neste caso, uma extensa fase lag devido induo do consumo de trealose. Sabe-se, tambm, que o consumo de trealose favorecido em meios que contenham maltose ou -metilglucosdeo e seu consumo fortemente inibido em meios contendo glicose, galactose ou etanol. O consumo de glicognio possvel quando temos amilase, catalisada por - glicosidases, que produz glicose, ou por uma seqncia de reaes envolvendo a fosforilao e produo de glicose-1-fosfato ou glicose.

A glicose atua como um importante mecanismo regulatrio na levedura Saccharomyces cerevisiae, a qual tem seus nveis de transcrio muito afetados pela represso pela glicose. O sinal que inicia a represso pela glicose ainda desconhecido, mas dados indicam que ele est localizado sobre ou atravs dos nveis de glicose-6-fosfato, o que sugere o envolvimento da concentrao extra ou intracelular de glicose ou o fluxo de glicose no incio da represso.

A habilidade da glicose em reprimir a expresso de genes, atravs da inibio da transcrio, chamada de represso catablica do carbono ou represso por glicose. Os genes que esto sob o controle da represso por glicose codificam enzimas que esto envolvidas na gliconeognese, ciclo de Krebs, respirao, desenvolvimento mitocondrial e na utilizao de outras fontes de carbono alm de glicose, frutose ou manose.

Apesar de diversas protenas e interaes entre protenas estarem ligadas represso catablica, os sinais que iniciam a transduo que promove a represso por glicose no tm sido bem identificados.

Segundo observado por MEIJER et al. (1998), os parmetros que esto ligados ao caminho que promove a gerao do sinal inicial para a represso so o aumento na concentrao (intra ou extracelular) de glicose ou o aumento no fluxo de glicose pela membrana.


21

Existem dois sistemas de captao de glicose pela Saccharomyces cerevisiae, sendo um com baixa e outro com alta afinidade.

O sistema de captao de baixa-afinidade, independe de Hexoquinase (primeira enzima da Via Glicoltica, responsvel pela formao de 2 molculas de ATP e Piruvato), seria aquele onde ocorre apenas uma difuso facilitada.

O sistema de captao de alta-afinidade dependente de Hexoquinase, das condies de cultivo e pode ser reprimido pela glicose. Este sistema de captao reduzido na presena de elevadas concentraes de glicose e, portanto, mostra-se mais presente quando as clulas crescem ou so transferidas para um meio com baixa concentrao de glicose (DOES & BISSON,1989).

Segundo RONNE (1995), os microrganismos usualmente desativam uma srie de genes em presena de glicose e a represso por glicose durante a Gliconeognesis envolve mais de um mecanismo, sendo o principal, a represso promovida pelo gene MIG1.

O controle da respirao tambm pode ser promovido pelo efeito de represso catablica sobre a expresso dos genes promotores da Via Respiratria. A represso catablica indiretamente mediada atravs do controle do gene HAP4, o qual reprimido pela Glicose.

A regulao da Glicose ainda pode envolver o controle da degradao do RNAm, o qual contribui de forma significativa para a regulao da Glicose de alguns RNAs mensageiros manifestados durante a respirao.

POSTMA et al. (1988) afirmaram que Saccharomyces cerevisiae pode fermentar glicose ou etanol sobre condies anaerbias, onde estas so as nicas fontes possveis de energia. J sobre condies aerbias, ocorre preferencialmente a respirao podendo, no entanto, ocorrer fermentao alcolica mesmo diante da presena de oxignio (aerobiose). Originalmente, este desvio no metabolismo para a via fermentativa em condies aerbias promovido pela represso por glicose, pois, diante da presena de elevadas concentraes residuais de Glicose ocorreu uma diminuio progressiva na velocidade especfica de consumo de O2 (QO2), acompanhado pela


22

degradao dos componentes da Via Respiratria e represso das diversas enzimas que atuam no Ciclo dos cidos Tricarboxlicos.

PRONK et al. (1996) define Efeito Crabtree como a fermentao alcolica sob condies aerbias e descrito como sendo um dos fenmenos metablicos mais importantes presentes em processos industriais de Saccharomyces cerevisiae, especialmente os ligados produo de biomassa.

Segundo HULL (1991), uma levedura pode ser considerada Crabtree positiva se esta sofrer uma represso de seu metabolismo oxidativo em altas concentraes de glicose presente no meio de cultivo.

Nesta situao temos um acmulo de biomolculas em sua forma reduzida, especialmente o NADH gerado pela Via Glicoltica, uma vez que a produo de NADH ser maior que a capacidade que a clula tem de reoxid-la atravs da doao de eltrons para o O2 presente no meio, e que constitui o aceptor final de eltrons neste caso. Com isso, a clula passa a reoxidar o NADH atravs da reao de converso do Piruvato em Etanol.

O Efeito Pasteur tambm pode ser identificado em clulas de Saccharomyces cerevisiae, porm, ir ocorrer somente em condies onde o fluxo metablico da Via Glicoltica estiver bem reduzido (baixssimo crescimento celular). caracterizado por uma supresso da capacidade fermentativa da levedura na presena de oxignio e promove um aumento da afinidade pelo sistema respiratrio por Piruvato, Acetaldedo e NADH em relao Via Fermentativa (PRONK et al., 1996).

3.2.3.2. Fonte de Nitrognio A ausncia ou limitao de fontes de nitrognio o principal fator de

influncia na inativao dos transportadores de acares devido a diversos fatores que terminam por estimular a degradao de protenas. Ou seja, a inativao catablica no deve ser promovida especificamente pelos mecanismos de controle de glicose, mas pela estimulao ao mecanismo regulador das protenas principais ligados deficincia em nitrognio. Sendo


23

assim, pode-se afirmar que a presena de uma fonte de nitrognio deve diminuir a inativao.

LUCERO et al. (2001) verificaram que em diversos casos estudados a velocidade de inativao dos transportadores foram menores na presena do que na ausncia de uma fonte de nitrognio. Ainda foi verificado que o tempo de meia-vida aumenta quando existe fonte de nitrognio presente mas o mesmo no acontece quando da presena de aminocidos no meio.

Os ons NH4+ ,presentes quando da utilizao de sulfato de amnio como fonte de nitrognio, so considerados txicos para as clulas diante de elevadas concentraes. Ele pode ser assimilado primeiro nos aminocidos e depois em outras biomolculas que contm nitrognio. O ponto crtico de entrada destes ons est ligado a dois aminocidos (Glutamato e Glutamina), pois o grupo amino presente nos outros aminocidos geralmente derivado do grupo amino do glutamato atravs de reaes de transaminao. Portanto, o NH4+ assimilado pela clula atravs de uma reao de biossntese envolvendo o glutamato e catalisada pela enzima glutamina sintetase, que apresenta alta afinidade por NH4+. O Glutamato, por sua vez, gerado pela reao entre -cetoglutarato e glutamina na presena de NADPH e H+, sendo esta reao catalisada pela enzima glutamato sintase (LEHNINGER et al., 1995).

O efeito de represso ocasionado por excesso de molculas de amnia no meio conhecido como Efeito Amnia e foi observado com a variao da atividade da NAD-Glutamato Desidrogenase. A maior atividade foi observada em meios limitados em molculas de amnia.

LANG et al. (1997) verificaram que a quantidade da fonte de nitrognio alimentada durante o cultivo interfere na produo da protena de interesse, bem como a relao carbono-nitrognio imposta no meio de cultivo, devido ao aumento no nmero de ons amnio e seu efeito indesejvel sobre o metabolismo celular.

RICCI-SILVA (1998) verificou que alm das tradicionais fontes de nitrognio, h tambm alguns aminocidos que quando adicionados ao meio


24

de cultivo podem aumentar a produo de enzimas como a Hexoquinase e a Glicose-6-Fosfato Desidrogenase.

LANG et al. (1997) utilizaram diversas fontes de aminocidos (casena, peptona e extrato de levedura) para enriquecer o meio e observaram que em todos os casos testados houve um aumento na produo da protena heterloga de interesse.

As leveduras podem ter uma alterao no comportamento gerada por desvios metablicos, que por sua vez, so promovidos por efeitos como o Crabtree e o Pasteur. Estes mecanismos esto diretamente ligados ao balano entre a capacidade fermentativa e respiratria da levedura.

3.2.4. Influncia da Agitao e Aerao O estudo da agitao e aerao em processos fermentativos tambm

essencial para o desenvolvimento das melhores condies de crescimento do microrganismo considerado. Diversos autores afirmam que os objetivos principais das condies de agitao e aerao so a disperso das bolhas de ar, com conseqente suprimento de oxignio aos microrganismos, a manuteno das clulas em suspenso e o aumento da transferncia de calor e massa no meio (AIBA et al., 1973; WANG et al., 1979; LEE, 1992).

Para microrganismos facultativos, como S. cerevisiae, o oxignio tem crucial importncia em todo metabolismo porque ele participa da gerao de energia atravs da cadeia de respirao dentro da mitocndria, que fundamental para obteno de uma velocidade de crescimento especfico significante (SILVA et al., 2001).

Mostra-se de fundamental importncia abordar o problema da transferncia de oxignio em processos fermentativos aerbios, que nada mais que a dissoluo de oxignio no meio de cultura para que o microrganismo possa exercer atividades.

Do ponto de vista bioqumico, o oxignio o ltimo elemento a aceitar eltrons, ao final da cadeia respiratria, sendo ento reduzido gua, permitindo que ocorra a reoxidao das coenzimas que participam das reaes de desidrogenao (ao longo da Gliclise e Ciclo de Krebs) e, ainda,


25

permitindo a estocagem de energia atravs da passagem das molculas de ADP para ATP. Estas ltimas, por sua vez, iro participar necessariamente nas reaes de snteses de molculas, para a sobrevivncia das clulas e para o surgimento de novas clulas, no processo de proliferao da biomassa microbiana, para as quais fundamental a introduo de energia. Assim sendo, um cultivo que seja altamente eficiente, ocorrendo com elevadas velocidades de crescimento celular, implica em elevadas velocidades de consumo de substrato, a fim de que haja abundncia de eltrons transportados na cadeia respiratria (CTE Cadeia de Transporte de Eltrons) e, com isso, gerar mais ATP; mas significa tambm, a necessidade de existncia de oxignio dissolvido, a fim de que estes eltrons sejam drenados para fora da clula ao final da cadeia.

Para que ocorra a oxidao de um mol de Glicose so necessrios seis moles de oxignio a serem consumidos, o que torna bvio a necessidade de se agitar e aerar um meio de cultura no caso de processos fermentativos aerbios. Por ser muito pouco solvel em meio lquido, podendo atingir apenas alguns miligramas por litro, em termos de concentrao de saturao, existe a necessidade de estarmos suprindo a demanda de oxignio durante o processo fermentativo para que as clulas encontrem a possibilidade de converterem, de forma adequada, o substrato no produto desejado. Sendo assim, de nada adianta dissolver centenas de gramas por litro de glicose, alm das quantidades necessrias dos demais nutrientes, sem se imaginar que se dever introduzir, ao longo do processo fermentativo, o oxignio necessrio para suportar a condio de aerobiose, tendo em vista a limitada capacidade de estocar O2 na soluo. Diante desta situao, pode-se afirmar que a extenso de um processo descontnuo aerbio e, sua conseqente, obteno de elevadas concentraes de bioprodutos de interesse, depende totalmente da capacidade de se transferir oxignio para a fase lquida, especialmente, nos instantes mais avanados do processo, onde a concentrao celular deve ser elevada, existindo situaes onde as condies de operao a serem empregadas sero definidas em funo da capacidade de transferncia de oxignio. O transporte de oxignio desde a


26

bolha de ar at o interior da clula afetado e controlado por uma grande resistncia a essa transferncia de oxignio e que pode ser subdividida em diversas resistncias especficas mostradas na Figura 3.1.

FIGURA 3.1.: Diagrama esquemtico dos passos envolvidos no transporte do oxignio de uma bolha de ar para o interior de uma clula microbiana (BAILEY, OLLIS,1986).

As resistncias apresentadas na Figura 3.1. podem ser conceituadas da seguinte forma:

R1 : Difuso do gs do interior da bolha at a interface gs-lquido R2 : Passagem pela interface gs-lquido R3 : Difuso atravs da pelcula estagnada de lquido, externa bolha R4 : Transporte atravs do meio lquido R5 : Difuso atravs da pelcula estagnada externa ao agregado celular R6 : Passagem pela interface pelcula estagnada-agregado celular R7 : Difuso no agregado celular R8 : Passagem pela membrana celular R9 : Difuso interna na clula


27

Estas resistncias, por sua vez, podem ser agrupadas em trs grandes grupos de resistncias:

1) Transferncia do oxignio da bolha para a soluo. 2) Transferncia do oxignio dissolvido atravs do meio de cultivo. 3) Utilizao do oxignio pela clula.

Considerando que ocorra simples difuso na transferncia de oxignio dissolvido pelo meio de cultivo (devido a uma agitao adequada), o segundo grupo de resistncia pode ser considerado desprezvel, restando somente duas grandes resistncias interferindo no transporte da molcula de oxignio: A transferncia da Fase Gasosa para a Fase Lquida e a prpria reao bioqumica no interior da clula.

A demanda de oxignio no incio do processo fermentativo descontnuo padro bastante baixa devido baixa concentrao celular. Porm, com o crescimento celular, esta demanda aumenta com o tempo, tornando obrigatrio o fornecimento contnuo de oxignio.

Uma clula consome mais oxignio, por unidade de tempo, quanto maior for a velocidade de crescimento existindo um limite, ou seja, uma velocidade dita mxima, a qual nada mais do que a capacidade mxima de sntese das enzimas que participam do processo. Esta velocidade depende das condies de cultivo (pH, temperatura, etc) e do meio de cultura.

ABRAHO-NETO et al., (1997) estudaram a influncia de vrios fatores na produo de G6PDH por S. cerevisiae e verificaram que a maior atividade da enzima ocorria com uma taxa de oxignio dissolvido de 4,0 mg ar.L-1 , sendo que a diminuio da atividade enzimtica observada com valores superiores e inferiores de oxignio dissolvido tiveram como causa a reduzida taxa de crescimento sob estas concentraes de oxignio. Essa observao deve-se ao fato da G6PDH participar da via das pentoses, caminho pelo qual as clulas sintetizam ribose-6-fosfato, um dos constituintes chave dos cidos nuclicos e nucleotdeos. Dado que a demanda por cidos nuclicos durante a fase de crescimento mximo acentuada, a atividade especfica da G6PDH tambm aumenta. Porm, segundo OURA (1976), a contribuio do ciclo das


28

pentoses no crescimento aerbio da levedura pequeno destacando-se apenas sua funo de fornecimento de NADPH reduzido para reaes biossintticas. Deste modo, poucas mudanas foram observadas por esse autor na atividade da G6PDH sob diferentes regimes de aerao.

Segundo PINHEIRO et al. (1997), Saccharomyces cerevisiae cresce melhor quando o oxignio fornecido atravs da alimentao com ar do que quando a alimentao efetuada com oxignio puro. Oxignio puro promoveu um aumento na produo de etanol e o crescimento celular foi inibido tanto pelo aumento da vazo de ar como de oxignio puro.

O O2 passa a ter efeitos txicos nos microrganismos aerbios sob presses parciais no muito maiores que no ar sobre 1 bar. Esta toxicidade iniciada pela reduo univalente do O2, qual, conduz a danos s enzimas, cidos nuclicos ou lipdeos. Sendo assim, temos que um fornecimento acima do necessrio pela demanda de oxignio pode causar efeitos adversos nas clulas de leveduras.

OURA et al. (1976) concluram que a atividade de enzimas da Via Glicoltica, bem como a lcool desidrogenase e a piruvato descarboxilase so afetadas pela condio de aerao imposta. A atividade da enzima lcool desidrogenase, por exemplo, cai com o aumento da quantidade de oxignio contido no gs fornecido, mas ocorre um aumento em sua atividade quando temos elevadas intensidades de aerao. Para a relao entre a atividade da enzima G6PDH e a vazo de aerao empregada, temos que poucas mudanas so observadas na atividade da enzima sobre diferentes condies de aerao, exceto quando se utilizam vazes que forneam concentraes txicas de oxignio, onde a atividade enzimtica dobra.

SILVA et al. (2001) verificaram a influncia da agitao e aerao na produo de Hexoquinase e concluram que as melhores condies de aerao so as de vazo moderada de ar resultando em coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (KLa) da ordem de 60 h-1. A enzima teve sua formao afetada pela utilizao de vazes maiores de oxignio, o que seria devido saturao da via respiratria pelo oxignio.


29

OURA et al. (1974) concluram que a capacidade da levedura seguir um metabolismo aerbio varia quando o cultivo efetuado sob diferentes intensidades de aerao e a mxima atividade seguindo a via respiratria foi observada para os crescimentos com 10% de oxignio no gs de mistura da aerao.

Segundo SILVA et al. (2002), as melhores condies de aerao para a produo da enzima G6PDH so obtidas diante de aeraes moderadas (1,7 vvm e 400 rpm), gerando um KL.a igual a 60 h-1. Os resultados indicaram, tambm, que a produo desta enzima pelo microrganismo est ligada formao de biomassa, ou seja, ao crescimento celular, que por sua vez, definido pelas condies operacionais e do meio de cultivo.

3.2.5. Metabolismo da levedura S. cerevisiae Segundo FLORES et al. (2000), acares so utilizados por quase todas

as leveduras conhecidas e todas tm em comum no seu metabolismo a converso da Glicose-6-Fosfato (ou Frutose-6-Fosfato) em Piruvato atravs de uma Via Glicoltica comum. O destino metablico do Piruvato que ser diferenciado de acordo com a espcie de levedura e as condies de cultivo.

No caso especfico de Saccharomyces cerevisiae, a glicose e outros acares podem causar um forte prejuzo capacidade respiratria (Efeito Crabtree) de forma que, mesmo em presena de ar, Saccharomyces cerevisiae fermenta em cultivos descontnuos. Desta forma temos uma levedura Crabtree positiva. Entretanto, na maioria dos casos em condies aerbias, o Piruvato oxidado para CO2 atravs do Ciclo dos cidos Tricarboxlicos (TCA).

Sendo assim, temos que a Gliclise e o Ciclo dos cidos Tricarboxlicos so as principais vias metablicas para a Saccharomyces cerevisiae e so responsveis diretos pela produo de energia e reduo dos equivalentes na forma de ATP, NADH e NADPH, alm da gerao de grande parte dos compostos precursores necessrios biossntese de biomolculas.

As membranas celulares no so livremente permeveis a todos os componentes que possam estar presentes no meio. O primeiro passo no


30

metabolismo das hexoses o transporte de carboidratos, exceto nos casos onde um di ou trissacardeo hidrolisado fora da clula. Este transporte atravs da membrana conduzido por transportadores especficos chamados permeases e para a Saccharomyces cerevisiae este transporte consiste de uma difuso facilitada no caso de meios contendo glicose, frutose ou manose.

O metabolismo de dissacardeos precedido pela hidrlise para outros monmeros e dependendo da espcie de levedura e da natureza do acar a ser metabolizado, esta hidrlise acontece fora da membrana celular, no espao periplasmtico, ou dentro da clula atravs do transporte deste dissacardeo. No caso de Saccharomyces cerevisiae esta hidrlise feita em sua maior parte pela invertase extracelular repressvel pela glicose.

A hexose intracelular entra na Via Glicoltica aps uma etapa inicial de fosforilao, onde duas hexoquinases so responsveis pela fosforilao da glicose, frutose e manose enquanto que uma glicoquinase responsvel pela fosforilao de glicose e manose, que so obtidos a partir da transcrio dos genes HXK1 e HXK2 (Hexoquinases) e GLK1 (Glucoquinase), cuja expresso controlada pela concentrao de glicose. As hexoquinases tambm so reprimidas pela presena de Trealose-6-Fosfato, o que a transforma em uma importante ferramenta de controle da gliclise em Saccharomyces cerevisiae. A Fosfofrutoquinase considerada o gargalo da Via Glicoltica, pois, a superproduo de genes que codificam a fosfofrutoquinase no aumenta a fermentao em Saccharomyces cerevisiae.

A oxidao do Piruvato, aps a etapa final da Via Glicoltica, para CO2 ocorre atravs do Ciclo de Krebs, onde para entrar no ciclo, o Piruvato sofre uma descarboxilao oxidativa catalisada pela Piruvato Desidrogenase, um complexo multienzimtico formado por trs componentes (Piruvato Desidrogenase, Di-hidrolipoamidoacetil transferase e di-hidrolipoamido Desidrogenase).

As reaes catablicas geradoras de NADH ocorrem tanto no citosol como na mitocndria e, durante a fermentao, o NADH produzido pela Via


31

Glicoltica regenerado a NAD+ atravs da formao de Etanol enquanto que o NADH formado por outras reaes diferentes das da Via Glicoltica so regenerados atravs da produo de Glicerol.

Durante o crescimento em aerobiose, as enzimas NADH Desidrogenases mitocondriais tambm participam da reoxidao em NAD+. A reoxidao do NADH pela via respiratria a principal fonte de energia para as clulas com um metabolismo respiratrio. Esta reoxidao est acoplada pela produo de ATP no processo conhecido como Fosforilao Oxidativa.

A Via das Pentoses constitui uma importante rota implicada na produo de NADPH necessrio s reaes de biossntese e de Ribose-5-Fosfato para a sntese de cidos nuclicos e cofatores nucleotdeos. Esta Via tambm gera Eritrose-4-Fosfato, presente como precursor na sntese de aminocidos aromticos. A Via tem incio com duas reaes oxidativas irreversveis e uma outra reversvel e no-oxidativa. A diviso entre a Via Glicoltica e a Via das Pentoses ocorre no nvel da Glicose-6-Fosfato e a concentrao da fonte de nitrognio no meio influencia na quantidade de acar a ser direcionado a cada uma dessas Vias, sendo que, a presena de aminocidos promove a queda na atividade da Via das Pentoses, direcionando maior parcela dos acares para a Via Glicoltica.

Em Saccharomyces cerevisiae existem quatro genes que codificam isoenzimas de lcool-desidrogenases, sendo que o gene ADH1 codifica a isoenzima durante a fermentao e induzida pela glicose enquanto que o gene ADH2 codifica a isoenzima que est ligada utilizao do etanol como fonte de carbono, sendo esta, repressvel pela presena de glicose.

Segundo PRONK et al. (1996), nas leveduras o Piruvato um ponto fundamental entre a dissimilao respiratria e a fermentao alcolica. A etapa mais lenta da Via Glicoltica est ligada converso de trioses-fosfatos em Piruvato. Durante o crescimento fermentativo, o Piruvato pode ser convertido em diversos compostos, inclusive molculas de hidrognio, CO2 e alguns metablitos orgnicos, enquanto que durante a respirao celular, o Piruvato segue para o Ciclo dos cidos Tricarboxlicos, onde ocorre sua completa oxidao para CO2 e H2O. Quando a clula segue um


32

metabolismo fermentativo, os principais metablitos excretados por ela sero o Etanol e o CO2, sendo que o Glicerol tambm pode ser encontrado, porm, no como um produto obtido primariamente pela oxidao do acar e sim devido a reoxidao do NADH gerado pela Via Glicoltica. Como durante o metabolismo respiratrio, o NADH reoxidado por enzimas especficas na mitocndria, no caso de limitao ou ausncia de oxignio, esta reoxidao ser efetuada atravs da formao de Glicerol, funcionando, portanto, como uma vlvula redox.

JIN et al. (1997) avaliaram os fluxos metablicos obtidos durante a produo de uma protena heterloga em Saccharomyces cerevisiae e identificaram um aumento na atividade da Via das Pentoses quando de um aumento na produo da protena heterloga e resultando tambm em um aumento no fator de converso em ATP.

A fonte de carbono teve sua utilizao ampliada durante a fase exponencial de crescimento da ordem de 2 e 5 vezes quando comparada, respectivamente, com o final da fase exponencial e a fase estacionria em presena de meio mnimo de Galactose e em cultivos descontnuos.

3.3.Enzimas

As enzimas tornaram-se importantes ferramentas prticas no s na rea mdica, mas tambm, para a indstria qumica, no processamento de alimentos, na agricultura e na indstria farmacutica.

Devido a essa grande expanso no uso de enzimas, nos ltimos anos vem crescendo ainda mais o interesse na produo das mesmas. Existem muitas aplicaes comerciais para as enzimas, entre elas a Pectinase utilizada durante a fabricao de sucos de frutas (SANTHANAM, 1992); a Invertase utilizada para a obteno de acar invertido (DURANTI, 1991; KOO et al., 1998); a Xilose-redutase utilizada na produo de xilitol por processo enzimtico (SILVA et al., 1996); a Xilanase e seu potencial de aplicao na etapa de branqueamento na indstria de papel e celulose (VIKARI,1991); a Hexoquinase e a Glicose-6-Fosfato Desidrogenase e suas


33

aplicaes em mtodos analticos para se medir teores de glicose, frutose, manose, ATP e creatinoquinase (ABRAHO-NETO et al., 1996; RICCI-SILVA, 1998; SILVA, 2000); e a Glicose-Oxidase e seu potencial de aplicao para a obteno de cido glicnico (KAPAT et al., 1998).

A diversidade de reas de potencial de aplicao de enzimas torna necessria a realizao de estudos que desenvolvam processos de obteno e purificao eficientes e passveis de ampliao de escala, de forma a tornarem-se viveis comercialmente.

O emprego de microrganismos recombinantes vem de encontro expectativa de aumento na disponibilidade de enzimas, como a glicose-6-fosfato desidrogenase, j utilizadas ou que passariam a estar disponveis com a aplicao destas novas tcnicas de modificao gentica. A reduo de custos de produo, tambm uma perspectiva real (BUCKLAND and LILLY,1993).

A pesquisa sobre enzimas est ligada maior parte da histria da bioqumica, sendo, sua atividade cataltica, descrita desde o sculo XIX, quando tiveram incio os estudos sobre a digesto da carne por secrees do estmago e a converso do amido em acares simples pela saliva e por diversos extratos vegetais (LEHNINGER et al., 1998). O estudo das enzimas apresenta grande importncia prtica, uma vez que, diversas doenas so ocasionadas pela deficincia funcional ou mesmo pela ausncia de uma ou mais enzimas em um indivduo. Condies anormais podem ocorrer tambm pelo excesso da atividade de uma enzima at por serem, as enzimas, as principais ferramentas de regulao do metabolismo.

Os microrganismos so capazes de alterar seu metabolismo em resposta s mudanas no meio. Esta alterao obtida por mecanismos regulatrios capazes de conferir flexibilidade ao metabolismo. Os principais mecanismos regulatrios esto ligados sntese das enzimas, bem como, regulao dos seus nveis de atividade (WARD, 1991).

As enzimas so protenas, constitudas por uma ou mais cadeias polipeptdicas, e que so capazes de catalisar de forma especfica uma dada reao bioqumica. As enzimas apresentam quatro caractersticas principais:


34

Reduzem a Ea (Energia de Ativao), levando a altas velocidades de reao.

Apresentam elevada especificidade, ou seja, cada enzima tem uma estrutura que permite a ela se encaixar perfeitamente a apenas um determinado substrato de forma a promover a catlise.

So sintetizados pela prpria clula. Tem concentrao e atividades modulveis, ou seja, podem ser

reguladas, permitindo um ajuste em diferentes condies fisiolgicas.

As enzimas so catalisadores, ou seja, aceleram a velocidade de uma reao sem serem consumidos durante o processo. O uso crescente desses catalisadores em aplicaes industriais deve-se em muito a essas caractersticas especficas, bem como aos avanos das pesquisas em gentica e na otimizao de processos fermentativos para a produo de enzimas. Cada enzima apresenta um substrato especfico, ou seja, s ir se ligar a um determinado reagente, de forma que sua estrutura fique tensionada e amoldada para que se aproxime da estrutura caracterstica do estado de transio da reao. Esse amoldamento faz com que o substrato fique mais prximo dos grupos radicais R, no stio ativo da enzima, e que so os responsveis pela catlise.

Cada enzima possui em sua estrutura quaternria uma regio definida por stio ativo onde feita a ligao com o substrato. Trata-se de uma regio pequena e bem definida formada por resduos de aminocidos que foram trazidos mais prximos uns dos outros pelos desdobramentos da cadeia polipeptdica que compe a estrutura terciria da enzima. atravs do stio ativo que a enzima consegue reconhecer o seu substrato uma vez que, por se tratar de uma cavidade com forma definida, necessrio que o substrato tenha forma espacial adequada para alojar-se no centro ativo, alm de grupos qumicos capazes de estabelecer ligaes precisas com os radicais do centro ativo.


35

Segundo VITOLO & ROCHA-FILHO (1998), a utilizao de enzimas em escala industrial de fundamental importncia, devendo ser analisada, no entanto, a relao custo/benefcio. Com relao aplicao na indstria, as enzimas podem ser classificadas em trs grupos:

Enzimas utilizadas na produo de alimentos e ingredientes alimentcios.

Enzimas utilizadas na produo de bebidas. Enzimas utilizadas na produo de bens variados, como os

reagentes analticos.

A estabilidade de uma enzima afetada por duas condies do meio: temperatura e pH. O aumento da temperatura favorece a velocidade de uma reao, pois, proporciona uma maior energia cintica e ocasionando um aumento no nmero de choques entre as molculas (enzima e substrato) por unidade de tempo. Tem-se, porm, que o excesso dessa energia cintica pode romper as estruturas tercirias e quaternrias de forma que a enzima acaba perdendo sua atividade cataltica. (SEGEL,1979).

Segundo HALL (1996), a quantidade de calor necessrio para desnaturar uma enzima varia de acordo com a molcula e este fenmeno depende tambm do pH e da fora inica do meio.

O pH tambm afeta a estabilidade das enzimas de forma que estas apresentam um valor ou uma regio de pH timo onde sua atividade ser mxima. Isto ocorre porque as cadeias laterais de alguns aminocidos agem como cidos ou bases fracos e realizam funes crticas no stio ativo da enzima e esta variao no estado de ionizao uma das razes da variao na atividade. A mudana no pH pode eliminar uma interao inica essencial, atravs da remoo de prtons de grupos residuais de aminocidos, de forma a afetar a estabilidade da conformao ativa da enzima (LEHNINGER et al., 1995).

Segundo HALL (1996), as enzimas quando submetidas a valores extremos de pH, tanto cidos como bsicos, podem desnaturar, expondo com isso grupamentos hidrofbicos. Esta desnaturao devido queda nas


36

interaes eletrostticas e, em muitos casos, pode ocorrer inclusive uma precipitao dessa molcula.

3.3.1. Glicose-6-Fosfato Desidrogenase A glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) a primeira enzima do

processo oxidativo da via pentose-fosfato, convertendo a Glicose-6-Fosfato em 6-Fosfogliconato e classificada bioquimicamente como uma oxidorredutase.

A G6PDH vem sendo extensivamente purificada e obtida, principalmente, por leveduras, E. coli e tecidos animais. A coenzima especfica para a reao catalisada por essa enzima o NADP+, podendo, no caso de outros microrganismos (Leuconostoc mesenteroides, Acetobacter suboxydans e Pseudomonas aeruginosa) apresentar dois cofatores especficos (NAD+ e NADP+).

A G6PDH obtida a partir de Leuconostoc mesenteroides apresenta massa molar de 104kDa e composta por dois monmeros de 55kDa. O pH timo igual a 7,8, ponto isoeltrico em torno do pH 4,6 e coeficiente de extino igual a 11,5 (pH 7,2). Os principais ativadores desta enzima seriam o Mg2+ e HCO3- e os principais inibidores da sua atividade enzimtica seriam o Piridioxal 5 Fosfato, que promove uma inibio competitiva com o substrato (G6P) e no-competitiva com o NADP+. O on Al3+ tambm pode ser considerado um inibidor e, esta caracterstica, devida a seus efeitos sobre mudanas conformacionais induzidas por este on. No caso de leveduras, sabe-se que a massa molar de uma sub unidade da enzima equivale a 56kDa e que ela ser altamente especfica a NADP+.

O NADPH formado pela reao catalisada pela G6PDH utilizado em diversos processos da biossntese como, por exemplo, na formao dos cidos graxos (REILLY & ALLRED, 1995). Por formar NADPH durante a reao catalisada por ela, a G6PDH fundamental para a manuteno celular, j que ser responsvel diretamente pela regulao da concentrao deste importante cofator. Por participar da Via das Pentoses, a G6PDH tambm tem importncia reconhecida devido formao de Ribose-5-


37

Fosfato, precursor necessrio na biossntese de DNA e RNA pela clula (SEVERO,1979).

Segundo DUMITRU et al. (1995), a radiao ultravioleta e o acetato de cobre so sistemas geradores de radicais livres e, estes radicais, reduzem a atividade da enzima Glicose-6-Fosfato Desidrogenase em Saccharomyces cerevisiae. A queda na atividade enzimtica est ligada ao aumento na concentrao de produtos gerados pela peroxidao de lipdeos e a enzima parcialmente inativada pela ao dos radicais livres apresenta um aumento na sensibilidade ao calor de desnaturao quando comparada com a enzima livre destes radicais.

3.4. Obteno de produtos geneticamente modificados

O desenvolvimento sustentvel tem se tornado uma prioridade na poltica dos fabricantes mundiais. Entre as diversas tecnologias com potencial para alcanar a meta da sustentabilidade, a biotecnologia teria um importante lugar, especialmente nos campos de produo de alimentos, matrias-primas e energia renovveis, preveno da poluio e biorremediao (ZECHENDORF, 1999).

A E.coli foi o primeiro microrganismo de eleio como hospedeiro para a formao de bioprodutos a partir do desenvolvimento da tecnologia do DNA Recombinante e, isto se deu, porque a E.coli apresentava seu sistema gentico bem caracterizado, o que, por sua vez, facilitava a obteno de altos nveis de expresso (YIN et al., 2000 ; WARD, 1991).

O primeiro bioproduto recombinante a conseguir liberao para a produo foi a insulina humana obtida a partir do cultivo de cepas recombinantes de E.coli (WARD, 1991).

A grande limitao para a obteno destes bioprodutos recombinantes sempre esteve ligada produo em larga escala, onde manter os mesmos nveis de produtividade obtidos em escala laboratorial eram quase impossveis (YING-LIN et al., 2000).


38

Uma desvantagem na utilizao de E.coli como um hospedeiro vantajoso est ligado sua incapacidade de excretar protenas recombinantes e por estas clulas conterem uma srie de endotoxinas que devero encarecer o processo posterior de purificao.

Outro microrganismo que pode ser utilizado na obteno de bioprodutos recombinantes o Bacillus subtilis, por no ser patgeno, poder crescer em aerobiose, no produzir lipossacardeos e ser capaz de secretar protenas extracelulares no meio. Uma desvantagem est no fato de terem diminudos os nveis de expresso dos genes heterlogos neste microrganismo com relao aos nveis de expresso alcanados pela E.coli.

As leveduras tambm so bastante empregadas, porm, apresentam nveis de expresso menores que os da E.coli. Saccharomyces cerevisiae tem sido modificada geneticamente mediante o emprego de tcnicas de engenharia gentica para a obteno de produtos comerciais como o antgeno de superfcie do vrus da Hepatite B, entre outras protenas heterlogas (WARD, 1991; CHUNG et al, 1997).

A Glicose-Oxidase uma enzima que catalisa a oxidao de -D-Glicose para D-Glucono--Lactona e perxido de hidrognio e encontrada originalmente em Aspergillus niger. KAPAT et al. (1998) descrevem uma modificao gentica em S.cerevisiae onde foi construdo um vetor contendo um promotor GAL10, da prpria S.cerevisiae, uma seqncia de sinal de --amilase e a estrutura do gene da GOD do A .niger, alm do terminal GAL7 da levedura. A modificao gentica possibilitou a produo de GOD pelo cultivo de S.cerevisiae recombinante em Processo Descontnuo-Alimentado.

Segundo OKENNEDY et al. (1995), a instabilidade de vetores recombinantes em organismos comercialmente importantes representa um obstculo significativo para a produo em larga escala de protenas atravs de elevados nveis de expresso de seus genes heterlogos. Rearranjos estruturais e instabilidades segregacionais podem resultar na perda do gene de interesse. A instabilidade segregacional ir ocorrer quando o plasmdeo no hospedeiro perde a capacidade de se transferir para as clulas-filhas.


39

A perda do plasmdeo pode ocorrer pela competio entre as duas sub-populaes presentes (com e sem plasmdeo) e pode ser estimulada pela menor velocidade de crescimento obtida pelas clulas recombinantes. A menor velocidade de crescimento gerada pelo aumento da carga metablica, como um resultado direto da necessidade de replicao do plasmdeo e da expresso do gene recombinante.

O uso de S.cerevisiae como hospedeiro recombinante apresenta diversas vantagens sobre outros microrganismos por no ser patognica, no produzir endotoxinas, por ter sido muito estudada e ter grande aplicao em processos industriais (KINGSMAN et al, 1987 apud CHUNG et al., 1997).

Segundo LANG et al. (1997), S.cerevisiae um hospedeiro muito atrativo pois pode excretar protenas recombinantes para o meio sem excretar conjuntamente protenas homlogas de forma que quase a totalidade das protenas secretadas ser constituda pela protena de interesse, com isso, facilitando o processo de purificao e resultando numa significativa reduo nos custos do processo.

Uma grande variedade de trechos de genes de expresso contendo promotores constitutivos ou induzidos tem sido definidos e construdos para uma superproduo de protenas heterlogas em S.cerevisiae (CHUNG et al., 1997).

As indstrias nos EUA geram mais que 300 milhes de toneladas de lixo perigoso e 600 milhes de toneladas de lixo no perigoso por ano. A Biotecnologia tem dado uma pequena contribuio no tratamento desse lixo, porm apresenta um potencial ainda maior. O desenvolvimento de rvores geneticamente modificadas para auxiliar na separao da lignina de celulose tem economizado US$ 100 milhes/ano na produo do papel. As indstrias qumicas esto interessadas na aplicao de biocatlise e microrganismos modificados geneticamente para minimizar a formao de lixo txico sem aumentar o consumo de energia. Indstrias farmacuticas e de alimentos j aplicam em grande escala tcnicas de fermentao com tecnologia gentica. Alguns exemplos incluem enzimas utilizadas a frio e a quente visando otimizar o uso de energia e reduzir a quantidade de lixo. Os usos da


40

engenharia gentica nos processos de produo proporcionam uma reduo de 41% no consumo de matrias-primas, reduo de 48% no consumo de vapor e reduo de 49% no consumo de eletricidade (ZECHENDORF, 1999).

O gene da fosfogliceratoquinase 1 (PGK 1) de S. cerevisiae codifica um dos mais abundantes nveis de RNAm de determinadas protenas na clula, compreendendo entre 1% e 5% do total celular (OGDEN et al., 1986 apud LOJUDICE et al., 2001). Portanto, o promotor PGK 1 uma opo atraente para obteno de altos nveis de expresso de protenas. Seqncias codificadoras de protenas de interesse tambm tem sido clonadas sob o controle do promotor GAL 1, o qual um dos mais potentes promotores fortemente regulados na S. cerevisiae.

A Engenharia Gentica poder certamente melhorar a eficincia dos microrganismos quando sua capacidade puder ser explorada ao mximo (ZECHENDORF, 1999).

Aula

Documents

Transcript of Aula