AVALIAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DA VIA DE SINALIZAÇÃO WNT

CANÔNICA E NÃO CANÔNICA NO ADENOCARCINOMA GÁSTRICO

PROGRAMA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA PIBIC DO IAMSPE

ACADÊMICO: PEDRO AUGUSTO SOFFNER CARDOSOORIENTADOR: PROF. DR. JAQUES WAISBERG

INTRODUÇÃO – EPIDEMIOLOGIA

• 3° CA sexo masculino • 5° CA sexo feminino• Idade entre 50-70 anos

• 14° CA mais comum • 5° CA em incidência• 3° CA em mortalidade

• INCA 2016 Estimativas 2016. Incidências do câncer no Brasil [data base on the internet]. 2016• GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide

INTRODUÇÃO – FATORES DE RISCO

INTRODUÇÃO – ALTERAÇÕES GENÉTICAS

1. Alterações no genoma

2. Alterações pós-transcricionais

3. Alterações nas vias de sinalização

INTRODUÇÃO –VIA DE SINALIZAÇÃO WNT

• White B et al., 2012•Lyas M et al., 2005

• Funções da via canônica

• Regulação e produção de proteínas

• Migração e diferenciação celular

• Embriogênese

• Alteração na via de sinalização

• Câncer

• Canônica: participação da betacatenina

• Não canônica: FZD e Wnt-5a

INTRODUÇÃO

• Proteína WNT

• Sinalizadores transmembrana

• Mutações e metilações relacionadas ao câncer gástrico

• Wnt 1, 2, 3 e 5

•Habas R et al., 2006• Nojima M et al., 2007

INTRODUÇÃO

• FZD

Proteínas transmembrana

Receptor sinalização Wnt

Ativado estimula a agregação com axina evitando a degradação da betacatenina

• Ciclina D1

Gene CND1

Reguladora ciclo celular

Mutações e hiperexpressões relacionadas ao câncer

• Kinoshita T et al., 2011• Qu Y et al., 2013

INTRODUÇÃO

• Axina

Gene Axin 1

Complexo destruição da betacatenina

• CK1

Reguladora da transdução celular

Fosforilação da betacatenina

• Lyas M et al., 2005

INTRODUÇÃO

• Myc

Regulador da cascata da via Wnt

Mutações relacionadas ao câncer

• Ubiquitina

Marca proteínas para serem degradadas no proteossoma

• Ko A et al., 2012

INTRODUÇÃO

• Desregulação da via Wnt

• Mutações no gene APC no câncer

gástrico: diminui sua função

• Mutações do gene da betacatenina

• Impede que ela seja fosforilada

• Outros mecanismos carcinogênese

gástrica

• Hiperexpressão do FZD

• Hipoexpressão de fatores inibitórios

• Todos esses mecanismos aumentam a betacatenina no citoplasma e no núcleo celular

•White B et al., 2012 •Ayed et al., 2014

OBJETIVOS

• Avaliar a expressão de proteínas da via de sinalização celular Wntcanônica e não canônica no tecido neoplásico de doentes operados deadenocarcinoma gástrico

• Relacionar o nível de expressão das proteínas e sua localização na célulacom as características biodemográficas dos doentes e com as característicasmorfológicas e histopatológicas do tumor

MÉTODOS

• Estudo retrospectivo e comparativo

• Amostra• 72 doentes operados por adenocarcinoma gástrico no Serviço de

Cirurgia do Aparelho Digestivo da FMABC no período de janeiro 2007 a dezembro 2010

MÉTODOS

• Critérios de inclusão • Maiores de 18 anos

• Ambos os sexos

• Diagnóstico de adenocarcinoma gástrico

• Não submetidos à neoadjuvância

• Critério de exclusão• Tecidos no bloco de parafina inadequados para confecção do tissue

microarray (TMA)

MÉTODO - CONSTRUÇÃO DO TISSUE MICROARRAY (TMA)

• Realizada no Laboratório de Patologia da FMUSP

• Blocos de parafina com tecido de adenocarcinoma gástrico

• Pequenos fragmentos cilíndricos de tecido tumoral a partir do bloco original

• Bloco de parafina único contendo fragmentos de tecido tumoral de todos os doentes

MÉTODO – CLASSIFICAÇÃO

Intensidade da reação Extensão da Área Positiva de Imunocoloração

0 pontos NEGATIVA < 10%

1 ponto FRACA 11-25%

2 pontos MODERADA 26-50%

3 pontos FORTE >50%

MÉTODO

• Imunoexpressão

• Intensidade da reação X extensão da coloração

• Resultados em escore de 0 a 9 pontos

Positivo – escore ≥ 4 pontos

Negativo – escore < 4 pontos

MÉTODO – VARIÁVEIS ESTUDADAS

• Características biodemográficas da amostra (idade e sexo)

• Características macroscópicas da lesão neoplásica ( localização e diâmetro)

• Características histopatológicas (TNM, classificação de Lauren, presença de invasão vascular

venosa, linfática e/ou perineural)

• Expressão tecidual das proteínas Wnt-5a, FZD5, GSK3B, axina, CK1, ubiquitina, ciclina D1 e

myc no tecido de adenocarcinoma gástrico

RESULTADOS - AXINA

• Expressão citoplasmática positiva se relacionou com tumores moderadamente e bem diferenciados e com os tumores do tipo intestinal da classificação de Lauren (p=0,05)

Tabela 14 - Razão de chances para a associação entre o nível de imunoexpressão positiva da axina no citoplasma e as variáveis biodemográficas dos

doentes e morfológicas e anatomopatológicas do tumor

Positivo (N) Negativo (N)OR p

Grau de diferenciaçãoModerado / Bem diferenciado 35 0

0,05*Pouco / Indiferenciado 26 31

T

0+1+2 17 11,89

0,86

3 37 22,06

0,57

4 9 1 1

Metástase linfonodalAusente 22 0

0,15Presente (1/2/3) 41 4 1

Classificação de LaurenIntestinal 45 1 7,5

0,05*Difuso 18 3 1

RESULTADOS – CK1

• A expressão positiva no citoplasma das células foi significante nos tumores com margens cirúrgicas livres de comprometimento (p=0,031)

Tabela 16 - Nível de expressão citoplasmática da proteína CK1 nos tecidos de adenocarcinoma gástrico associada aos dados

biodemográficos dos doentes e morfológicos e anatomopatológicos do tumor

Negativo Positivo p

N (%) N (%)

Margem comprometida

Ausente 6 (10,2) 53 (89,8)

0,031*

Presente 3 (50,0) 3 (50,0)

Classificação de Lauren

Intestinal 4 (8,9) 41 (91,1)

0,142Difuso 5 (22,7) 17 (77,3)

RESULTADOS - UBIQUITINA

• A proteína ubiquitina apresentou expressão forte em tumores moderadamente e bem diferenciados (p=0,037) e nos tumores do tipo intestinal (p=0,031)

•

Tabela 18 - Expressão citoplasmática da proteína ubiquitina nos tecidos de adenocarcinoma gástrico e os dados biodemográficos

dos doentes e morfológicos e anatomopatológicos do tumor

Negativo N (%) Positivo N (%) p

SexoMasculino 2 (4,7) 41 (95,3)

0,341Feminino 3 (12,5) 21 (87,5)

Idade≤ 50 anos 3 (42,9) 4 (57,1)

0,07> 50 anos 2 (3,3) 58 (96,7)

Grau de diferenciaçãoModerado / Bem diferenciado 0 (0) 35 (100)

0,037*

Pouco / Indiferenciado 4 (13,8) 25 (86,02)

T

0+1+2 1 (5,6) 17 (94,4)

13 3 (7,7) 36 (92,3)

4 1 (10) 9 (90)

Metástase linfonodalAusente 1 (4,5) 21 (95,5)

1Presente(1/2 /3) 4 (8,9) 41(91,1)

Classificação de LaurenIntestinal 1 (2,2) 45 (97,8)

0,031*Difuso 4 (19) 14 (81)

RESULTADOS – CICLINA D1

• A proteína ciclina D1 foi expressa apenas no núcleo e significantemente mais intensa nos tumores dos doentes masculinos (p=0,039)

Tabela 22 - Expressão nuclear da proteína ciclina D1 nos tecidos de adenocarcinoma gástrico associada aos dados biodemográficos dos

doentes e morfológicos e anatomopatológicos do tumor

Negativo N(%) Positivo N(%)p

SexoMasculino 15 (35,7) 27 (64,3)

0,03*Feminino 14 (63,6) 8 (36,4)

Idade≤ 50 anos 3 (50,0) 3 (50,0)

1> 50 anos 26(44,8) 32 (55,2)

LocalizaçãoDistal 9 (39,1) 14 (60,9)

0,602Proximal 20 (48,8) 21 (51,2)

Diâmetro (cm)≤ 5 13 (46,4) 15 (53,6)

0,8045 15 (42,9) 20 (57,1)

Margem comprometidaAusente 26 (45,6) 31 (54,4)

1Presente 2 (40,0) 3 (60,0)

RESULTADOS - MYC

• Expressão significantemente maior nos tumores do tipo intestinal (p=0,028) e com razão de chances com significância (p=0,021).

Tabela 24 - Expressão citoplasmática da proteína c-myc nos tecidos de adenocarcinoma gástrico e os dados biodemográficos dos doentes e morfológicos e anatomopatológicos

do tumor

Negativo N(%) Positivo N(%) p

SexoMasculino 2 (74,4) 1 (25,6)

1Feminino 18 (78,3) 5 (21,7)

Idade≤ 50 anos 5 (83,3) 1 (16,7)

1> 50 anos 45 (75) 15 (25)

Metástase linfonodalAusente 14 (6,9) 9 (39,1)

0,068Presente (1,2,3) 36 (86,7) 7 (16,3)

Classificação de LaurenIntestinal 31 (67,4) 15 (32,6)

0,03*Difuso 19 (95) 1 (5)

RESULTADOS – WNT-5a E FZD-5

• As imunoexpressões das proteínas Wnt-5a e Frizzled-5 não apresentaram diferenças significantes (p≤ 0,05) em relação às características epidemiológicas dos doentes e anatomopatológicas do tumor

CONCLUSÕES

1. A forte expressão das proteínas da via de sinalização celular canônica Wntsugere a sua importância e o seu envolvimento na carcinogênese doadenocarcinoma gástrico

2. Houve relação da expressão positiva das proteínas da via de sinalizaçãocelular canônica Wnt com as variáveis biodemográficas dos doentes eanatomopatológicas do tumor.

3. A fraca expressão das proteínas da via de sinalização celular nãocanônica Wnt e a ausência de relação da expressão positiva com as variáveisbiodemográficas dos doentes e anatomopatológicas do tumor sugerem queessa via pode ter uma baixa participação na carcinigênese gástrica.