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Avaliação da qualidade e segurança microbiológica de trutas de aquacultura Joana Isabel Oliveira Pereira Porto, 2013
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Avaliação da qualidade e segurança microbiológica de trutas de aquacultura
Joana Isabel Oliveira Pereira
Porto, 2013
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Avaliação da qualidade e segurança microbiológica de trutas de aquacultura
Assessment of the microbiological quality and safety of aquaculture trouts
Joana Isabel Oliveira Pereira
Dissertação de candidatura ao grau de Mestre em Alimentação Coletiva
apresentada à Faculdade de Ciências da Nutrição e Alimentação da Universidade
do Porto
Orientadora: Profª Doutora Patrícia Antunes (FCNAUP)
Investigação efetuada no Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Farmácia
da Universidade do Porto / REQUIMTE
abril, 2013
iv
v
Este trabalho foi parcialmente financiado por:
Universidade do Porto e Santander Totta, através dos “Projetos Pluridisciplinares
2011” (PP_IJUP2011_81) - The threat of multidrug resistance bacteria to public
health: when aquacultures raise more than fish.
Os resultados deste estudo foram apresentados e/ou publicados em:
Pereira J, Campos J, Mourão J, Barros M, Peixe L, Novais C, Antunes P.
2012. “Trutas arco-íris de aquacultura, veículos de bactérias e de genes de
resistência a antibióticos clinicamente relevantes”. 5ª Reunião Anual PortFIR
(Portal de Informação Alimentar) com o tema “A mais-valia da partilha da
informação”, organizada pelo Departamento de Alimentação e Nutrição (DAN)
do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA). 25 outubro,
Lisboa.
Pereira J, Campos J, Mourão J, Barros M, Novais C, Peixe L, Antunes P.
2013. “Antibiotic resistant bactéria in aquaculture rainbow trouts: a new threat
vi
in the food chain?”. 6º Encontro de Jovens Investigadores da Universidade do
Porto (IJUP). 13-15 fevereiro, Porto.
Pereira J, Campos J, Mourão J, Barros M, Novais C, Peixe L, Antunes P.
2013. “Aquaculture rainbow trouts are contaminated with multidrug-resistant
Enterobacteriaceae species carrying clinically relevant antibiotic genes”. 23rd
European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases
(ECCMID), organized by European Society of Clinical Microbiology and
Infectious Diseases (ESCMID). 27-30 abril, Berlim, Alemanha.
Antunes P, Campos J, Mourão J, Pereira J, Novais C, Peixe L. 2013.
“Contribution of trout farms to the spread of Enterobacteriaceae carrying
plasmid-mediated quinolone resistance genes”. 23rd European Congress of
Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), organized by
European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID).
27-30 abril, Berlim, Alemanha.
Prémios:
Pereira J, Campos J, Mourão J, Barros M, Peixe L, Novais C, Antunes P.
Melhor Poster atribuído a “Trutas arco-íris de aquacultura, veículos de
bactérias e de genes de resistência a antibióticos clinicamente relevantes”
na 5ª Reunião Anual PortFIR, com o tema “A mais-valia da partilha da
informação”, organizada pelo Departamento de Alimentação e Nutrição
(DAN) do INSA. 25 de outubro de 2012, Lisboa.
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Agradecimentos
Ao finalizar este trabalho, não esqueço todos aqueles que, de alguma forma,
me ajudaram a construí-lo e torná-lo realidade. Assim, gostaria de prestar um
sincero agradecimento:
À minha orientadora, a Profª Doutora Patrícia Sofia Carneiro Antunes por toda
a ajuda, apoio e disponibilidade que sempre demonstrou no decurso deste
trabalho. Um sincero agradecimento por todos os ensinamentos que me
transmitiu e por toda a compreensão que teve desde o primeiro momento.
À minha diretora de curso e a todos os outros professores que contribuíram
para a minha formação, agradeço.
À Joana Campos, pois sem ela muito do meu trabalho não estaria aqui hoje,
(Muito Obrigada!), à Joana Mourão, Mariana e outras tantas colegas que
encontrei pelo caminho da Faculdade de Farmácia. Obrigada pelo apoio e bons
momentos.
À minha amiga Sofia Duarte, pelas conversas, desabafos, companheirismo e
ajuda na entrega da tese, um grande beijinho!
À minha avó que faz tudo o que pode e o que não pode para me ver bem. A
ela, a todos os outros avós que guardo na memória e no coração e à restante
família, muito obrigado por me ajudarem a crescer e perceber que a família é
eterna e a melhor coisa que temos na vida.
Aos meus pais que sempre lutaram para que eu pudesse ter um futuro
melhor, dando-me apoio e carinho sempre que precisei, apesar de todos os
momentos complicados que foram surgindo pelo caminho. Com eles, foi possível
viii
ultrapassá-los, mesmo longe de casa. São exemplo para mim e espero um dia
poder retribuir todos os esforços.
À minha irmã, por saber que posso contar sempre com ela. Apesar da
distância, está sempre bem perto no coração. Obrigada por toda a paciência para
os meus desabafos e pelas tardes e noites de conversa via Skype com os meus
sobrinhos lindos, o Tomé e a Gabriela.
Por fim, ao meu Miguel, que é o meu melhor amigo e a melhor pessoa que
podia imaginar para ter ao meu lado. Obrigada pela paciência, pelo respeito, por
todos os bons momentos, por me apoiares quando fraquejo e pelo amor que dás
à minha vida.
Obrigada.
ix
Resumo
A aquacultura é das indústrias do setor alimentar que mais tem crescido nos
últimos anos, representando cerca de 50% do peixe consumido mundialmente. Os
produtos aquícolas são vantajosos para uso em unidades de alimentação coletiva por
apresentarem características constantes, qualidade controlada e preço mais estável e
inferior ao dos produtos da pesca. No entanto, os perigos microbiológicos para a
segurança alimentar são preocupantes e encontram-se incompletamente avaliados.
Assim, foi objetivo deste estudo avaliar a presença das bactérias patogénicas Salmonella
e Listeria monocytogenes e de Enterobacteriaceae portadoras de genes de resistência a
antibióticos clinicamente relevantes em trutas de aquacultura (Oncorhynchus mykiss)
comercializadas em Portugal. Foram recolhidas 25 amostras de truta arco-íris de
supermercados do distrito do Porto e 9 amostras (6 de águas, 2 de trutas e 1 de ração)
de uma aquacultura do Centro do país. Os parâmetros avaliados incluíram a pesquisa de
Salmonella, Listeria monocytogenes e Escherichia coli, segundo normas internacionais. A
deteção de bacilos Gram negativo resistentes a antibióticos foi efetuada após
enriquecimento e sementeira em meios suplementados e não suplementados com
antibióticos (ceftazidima, cefotaxima e ciprofloxacina). Os genes que codificam para
resistência a β-lactâmicos, fluoroquinolonas e outros antibióticos foram pesquisados por
PCR/sequenciação. As espécies foram identificadas por API ID32GN/16SrDNA PCR e
determinaram-se os grupos filogenéticos de E. coli. A resistência a antibióticos foi
analisada pelo método de difusão em agar/E-test. Não foram detetados os
microrganismos patogénicos Salmonella e L. monocytogenes. E. coli (37 isolados; grupos
filogenéticos: A0-6; A1-6; B1-16; B2-1; D-8) foi detetada em 48% das amostras (7 de
truticultura e 11 de supermercado), sendo 56% dos isolados resistentes a antibióticos de
diferentes famílias. Não foram detetadas β-lactamases de espetro alargado, mas
detetaram-se diversos tipos de genes de resistência a quinolonas habitualmente
associados a plasmídeos (PMQRs) em 9% dos isolados, com CMIs à ciprofloxacina
superiores ao ECOFF para a espécie/género. O gene qnrS1 foi detetado em E. coli (n=2;
truticultura), o gene qnrS2 em Hafnia alvei (n=2; supermercado), o gene qnrB10/nova
variante de qnrB em Citrobacter freundii (n=3; supermercado e truticultura) e o gene
recentemente descrito qnrD em Proteus vulgaris (n=1; supermercado), todos os isolados
apresentando resistência a outras famílias de antibióticos. As trutas disponíveis para
consumo humano estão satisfatórias relativamente à presença de Salmonella e L.
monocytogenes, mas constituem um veículo/reservatório importante de bactérias/genes
de resistência a antibióticos com impacto clínico. A deteção de bactérias multirresistentes
e de PMQR em produtos aquícolas é preocupante e salienta a necessidade de
estabelecer estratégias de controlo e prevenção em toda a cadeia alimentar.
Palavras-Chave
Aquacultura; Truta arco-íris; Enterobacteriaceae; resistência a antibióticos; genes PMQR.
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xi
Abstract
Aquaculture is currently one of the fastest growing food production sectors and is
associated with approximately 50% of the fish produced worldwide for human
consumption. It is a solution for food services with constant products, controlled quality
and more stable and cheaper prices than fish capture products. However, food safety
threats are currently recognized concerns but incompletely evaluated. Our goal was to
assess the presence of pathogenic bacteria Salmonella and Listeria monocytogenes and
Enterobacteriaceae carrying clinically relevant antibiotic resistance genes in aquaculture
rainbow trouts marketed in Portugal. We analyzed 25 rainbow trout samples from
supermarket and 9 samples (6 of water, 2 of trouts and 1 of feed) from an aquaculture in
the center of country. We screened for Salmonella, Listeria monocytogenes and
Escherichia coli by standard methods. Antibiotic-resistant Gram negative bacilli were
detected using selective media with/without antibiotics (ceftazidime, cefotaxime and
ciprofloxacin) after enrichment. Genes conferring resistance to β-lactams,
fluoroquinolones and other antibiotics were searched by PCR/sequencing. Species were
identified by API ID32GN/16SrDNA PCR and phylogenetic group was determined in E.
coli. Antibiotic resistance was analyzed by agar diffusion/Etest. The pathogenic bacteria
Salmonella and L. monocytogenes were not detected. E. coli (37 isolates; phylogenetic
groups: A0-6; A1-6; B1-16; B2-1; D-8) was found in 48% of samples (7 from aquaculture
and 11 from supermarket), with 56% resistant to different antibiotics. Extended spectrum
-lactamases were not detected but plasmid-mediated quinolone resistance genes were
observed in 9% of the isolates, all of them with MICs to ciprofloxacin above ECOFF for
species/genus. The qnrS1 gene was detected in E. coli (n=2; aquaculture), the qnrS2
gene in Hafnia alvei (n=2; aquaculture), the qnrB10/new qnrB variant in Citrobacter
freundii (n=3; aquaculture and supermarket) and the recently described qnrD in Proteus
vulgaris (n=1; supermarket), all presenting resistance to other antibiotic families. Trouts for
human consumption analyzed in this study are not a source of Salmonella and L.
monocytogenes but they seem to be a vehicle of antibiotic-resistant bacteria/genes of
relevance for human and animal health. Detection of multidrug resistant bacteria and
PMQR in fish products is of concern and highlights the need to establish strategies for
control and prevention in all the food chain.
Keywords
Aquaculture; rainbow trout; Enterobacteriaceae;antibiotic resistance; PMQR genes.
xii
xiii
Índice
1. Introdução ........................................................................................................ 1
1.1. Evolução da produção de pescado e aquacultura ..................................... 1
1.2. Produção em Aquacultura .......................................................................... 4
1.2.1. Truticulturas e truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) .......................... 6
1.3. Impacto socioeconómico da produção aquícola ........................................ 7
1.4. Aumento do consumo de pescado ........................................................... 10
1.4.1. Produtos de aquacultura .................................................................... 11
1.5. O mercado da aquacultura e a alimentação coletiva ............................... 12
1.6. Aquacultura e segurança alimentar .......................................................... 14
1.6.1. Doenças de origem alimentar associadas ao pescado ...................... 15
1.6.2. Resistência aos antibióticos e aquacultura ........................................ 22
2. Objetivos ........................................................................................................ 31
3. Material e Métodos ......................................................................................... 33
3.1. Amostragem ............................................................................................. 33
3.1.1. Colheita das amostras ....................................................................... 33
3.1.2. Preparação das amostras .................................................................. 34
3.2. Análise da qualidade e segurança microbiológica ................................... 35
3.2.1. Contagem de microrganismos aeróbios mesófilos ............................ 35
3.2.2. Pesquisa de Escherichia coli ............................................................. 35
xiv
3.2.3. Pesquisa de Salmonella e Listeria monocytogenes .......................... 36
3.3. Seleção de bactérias resistentes a antibióticos ....................................... 37
3.4. Deteção e caraterização de genes de resistência a antibióticos ............. 37
3.4.1. Obtenção do DNA e condições dos métodos de PCR ...................... 38
3.4.2. Eletroforese em gel de agarose ........................................................ 39
3.4.3. Purificação e sequenciação dos produtos de PCR ........................... 39
3.4.4. Identificação ao nível da espécie/infra espécie ................................. 40
3.5. Avaliação da suscetibilidade a antibióticos .............................................. 40
3.5.1. Método de difusão em agar com discos ........................................... 41
3.5.2. Avaliação da suscetibilidade a antibióticos β-lactâmicos de largo
espetro e pesquisa de β-lactamases ............................................................. 42
3.5.3. Determinação da concentração mínima inibitória (CMI) à
Ciprofloxacina por E-test ............................................................................... 42
4. Resultados e Discussão ................................................................................ 43
4.1. Avaliação da qualidade e segurança microbiológica ............................... 43
4.2. Deteção e caraterização de bactérias resistentes aos antibióticos ......... 47
4.2.1. Escherichia coli ................................................................................. 47
4.2.2. Outras Enterobacteriaceae ............................................................... 54
5. Conclusões .................................................................................................... 59
6. Referências Bibliográficas ............................................................................. 61
Anexos ................................................................................................................. 73
xv
Lista de Abreviaturas
ATP: Adenosina Trifosfato
CDC: Center for Disease Control and Prevention
CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute
CMI: Concentração Mínima Inibitória
DNA: Ácido Desoxirribonucleico
ECOFF: Epidemiological cut-off value
EFSA: European Food Safety Authority
ESBL: Extended-spectrum beta-lactamase
EUA: Estados Unidos da América
EUCAST: European Commitee on Antimicrobial Susceptibility Testing
FAO: Food and Agriculture Organization
FDA: Food and Drug Administration
ISO: International Organization for Standardization
OIE: World Organisation for Animal Health
OMS: Organização Mundial da Saúde
PCR: Polymerase chain reaction
PMQR: Plasmid-mediated quinolone resistance
UE: União Europeia
UFC: Unidades Formadoras de Colónias
xvi
xvii
Lista de Figuras
Figura 1. Produção de pescado por captura e por produção aquícola a nível
mundial (2012) ....................................................................................................... 2
Figura 2. Disponibilidade de produtos de pesca per capita (2003). Quantidade em
kg/habitante/ano ..................................................................................................... 2
Figura 3. Utilização e disponibilidade de pescado a nível mundial (2007) ............ 3
Figura 4. As 10 espécies aquícolas mais produzidas na União Europeia (2005).
Volume em toneladas ............................................................................................. 7
Figura 5. Emprego no setor da pesca, por sexo (2003) ........................................ 8
Figura 6. Balança comercial (exportações e importações) dos produtos da pesca
ou relacionados com esta atividade, em Portugal (2011) ....................................... 9
Figura 7. Composição nutricional da truta arco-íris de captura e de aquacultura 12
Figura 8. Distribuição de surtos por veículos de alimentos na UE em 2010 ........ 16
Figura 9. Distribuição de surtos por veículos de alimentos na UE em 2011 ........ 16
Figura 10. Distribuição dos agentes causadores de surtos associados a pescado
na UE em 2011 .................................................................................................... 18
Figura 11. Distribuição dos agentes causadores de surtos associados a pescado
nos EUA, em 2009-2010 ...................................................................................... 19
Figura 12. O fluxo de bactérias/genes de resistência a antibióticos em diferentes
nichos ecológicos, incluindo aquaculturas ........................................................... 25
Figura 13. Transferência horizontal de genes de resistência a antibióticos.
Mecanismos de conjugação, transdução e transformação .................................. 27
Figura 14. Formas de transmissão de bactérias resistentes aos antibióticos
através da cadeia alimentar ................................................................................. 29
xviii
Figura 15. Distribuição dos isolados de E. coli (n=37) por grupos filogenéticos e
tipo de amostra ..................................................................................................... 47
Figura 16. Ocorrência da resistência aos antibióticos nos isolados de E. coli
(n=23) por tipo de amostra ................................................................................... 50
Lista de Tabelas
Tabela 1. Exemplos de microrganismos patogénicos transmitidos pelo pescado.
............................................................................................................................. 18
Tabela 2. Perfis de resistência aos antibióticos dos isolados de E.coli (n=23) .... 49
Tabela 3. Caracterização dos isolados de Enterobacteriaceae com genes PMQR
............................................................................................................................. 57
Tabela 4. Descrição e sequências nucleotídicas dos primers, reagentes,
condições de amplificação e tamanho do produto esperado para as diferentes
reações de PCR. .................................................................................................. 73
1
1. Introdução
1.1. Evolução da produção de pescado e aquacultura
A população mundial tem apresentado um aumento contínuo ao longo das
últimas décadas, assim como a produção de bens alimentares e o
desenvolvimento tecnológico associado (1). No entanto, este aumento na
produção de algumas categorias de alimentos encontra-se ainda distante do
desejado e necessário, incluindo no que se refere ao pescado1, quer do setor
pesqueiro em geral, quer da produção aquícola (produtos de aquacultura) (1).
A produção mundial da pesca, incluindo de aquacultura, tem aumentado ao
longo dos anos contribuindo, em 2008, com cerca de 142 milhões de toneladas de
pescado (Figura 1), prevendo-se que atinja os 170 milhões de toneladas até 2030
(2). Cerca de 81% (115 milhões de toneladas) da produção piscícola atual destina-
se ao consumo humano, sendo o peixe fresco o produto mais consumido (1, 3).
Relativamente à disponibilidade destes produtos para consumo humano registou-
se um novo máximo no valor per capita de 18,4 Kg/ano, em 2009 (1-3).
Atualmente, a União Europeia (UE) é o terceiro produtor de pescado a nível
mundial, correspondendo 8 mil toneladas de produção a Portugal (referentes ao
ano 2010) (4). No nosso país, os produtos da pesca por captura e de aquacultura
têm uma enorme importância dado que somos o maior consumidor de pescado da
União Europeia (Figura 2) e que ocupamos o 3º lugar a nível mundial, com uma
1 Segundo Vaz-Pires et al. (2005), define-se como “pescado” todos os seres vivos aquáticos
(incluindo suas partes ou produtos) que possam ser utilizados para a alimentação humana.
2
disponibilidade/consumo per capita (quantidade disponível por pessoa) de
aproximadamente 57 Kg/ano (5, 6).
Figura 1. Produção de pescado por captura e por produção aquícola a nível mundial (2012) (3)
.
Figura 2. Disponibilidade de produtos de pesca per capita (2003). Quantidade em
kg/habitante/ano (5)
.
3
A crescente demanda destes produtos da pesca tem sido acompanhada
por um aumento na estabilização de recursos de pesca, e em alguns casos,
levando mesmo à rotura de stocks de algumas espécies (2, 3, 6, 7). A diminuição dos
recursos naturais da pesca e o crescimento demográfico da população mundial
conduziram ao incremento da produção de pescado em aquacultura, cujo
aumento tem sido notável a nível mundial (Figura 3), assim como em tempos a
pecuária surgiu como alternativa para à caça (8).
Figura 3. Utilização e disponibilidade de pescado a nível mundial (2007) (9)
.
Com um crescimento médio anual de 8%, a aquacultura é provavelmente o
setor da indústria alimentar com maior e mais rápido crescimento nas últimas
décadas, representando atualmente cerca de 50% do pescado produzido
globalmente para alimentação humana (1, 2).
4
Apesar de atualmente grande parte do pescado ser ainda obtido por captura,
a sua disponibilidade tem estabilizado. Observando a Figura 3 verifica-se que a
disponibilidade de pescado com origem na aquacultura tem vindo a aumentar ao
longo das últimas décadas, podendo no futuro desempenhar um papel ainda mais
determinante na produção global de peixe e, consequentemente, na saúde das
populações.
1.2. Produção em Aquacultura
A aquacultura ou aquicultura é definida como o cultivo de animais (nos quais
se incluem os moluscos e crustáceos) e/ou plantas aquáticas com recurso a
algum tipo de intervenção no processo de criação, na totalidade ou em parte do
seu ciclo de vida, com o objetivo de melhorar/incrementar a sua produção (Ex.:
manutenção de stocks, alimentação e proteção em relação a predadores) (9-12).
Atualmente, existem várias formas de classificar as técnicas e os tipos de
aquacultura, sendo frequentemente divididas em: i) água doce ou marinha; ii)
extensiva ou intensiva; iii) em meio natural ou em tanques (8, 13).
A aquacultura realizada em águas marinhas, também designada de
maricultura, recorre à utilização de jaulas (em alto-mar) ou tanques (estruturas
construídas em terra), onde os animais ficam limitados a uma zona controlada.
Esta produção pode ser realizada de forma extensiva (a alimentação dos animais
é exclusivamente baseada nos recursos naturais), semi-intensiva (com
contribuição parcial do Homem na alimentação dos animais) ou intensiva (os
animais estão dependentes exclusivamente da alimentação artificial) (13).
A produção aquícola em água doce, designada de piscicultura, pode ser
realizada em lagos/lagoas naturais ou artificiais tratados de forma a favorecer a
5
fauna aquática (13). Nestes sistemas de produção a densidade de animais é baixa
e a sua alimentação é, preferencialmente, natural, sendo do tipo de produção
extensivo. No entanto, os produtores podem fornecer, em alguns casos, um
complemento alimentar, sendo então um modo de produção semi-intensivo (2).
Mais recentemente, o modo de produção intensivo tem vindo a ser o mais
utilizado, consistindo na construção de estruturas artificiais (tanques) onde o peixe
é criado e recorrendo-se a alimentação artificial até o pescado atingir o tamanho
comercial e/ou o tamanho desejado (2, 13).
As técnicas de cultivo mais utilizadas envolvem a recirculação da água, ou
seja, a água mantém-se em circuito fechado, sendo tratada, reciclada e depois
reutilizada, ou o escoamento contínuo, em que os tanques são alimentados por
um desvio de água do rio a montante, que em fluxo contínuo passa uma única vez
no sistema de produção, sendo depois restituída a jusante, após “utilização” e,
idealmente, após tratamento (2, 13). A recirculação apresenta vantagens
relativamente ao escoamento contínuo, quer ao nível da poupança de água, quer
num melhor controlo da sua qualidade, incluindo um reduzido impacto ambiental
(2, 13). No entanto, apresenta desvantagens por ter custos elevados de
investimento e manutenção e poder não conseguir eliminar possíveis agentes de
doenças. A piscicultura por escoamento contínuo continua a ser a mais comum,
tendo como vantagens menores custos de investimento e manutenção, e, como
principais desvantagens uma maior dependência da qualidade da água do rio a
montante e possíveis impactos no ambiente envolvente com repercussões na
saúde pública (ex.: transmissão de doenças), em casos de falhas no tratamento
da água à saída do sistema (2, 13).
6
1.2.1. Truticulturas e truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss)
Na União Europeia, o terceiro produtor de pescado a nível mundial, as
espécies mais produzidas têm sido o mexilhão, a truta arco-íris e o salmão do
Atlântico (5). No nosso país, as espécies aquícolas mais produzidas são a truta em
água doce e a dourada, pregado e amêijoa em águas salgadas e salobras (4).
A truta arco-íris foi uma das primeiras espécies a ser produzida em
aquacultura, representando uma elevada fração do total de pescado produzido
em água doce, quer a nível mundial e europeu, quer a nível nacional (2, 5, 14, 15).
Uma das razões apontadas para esta elevada produção é a sua grande
adaptabilidade ao meio ambiente (14, 16). Na Europa, a produção deste peixe
começou na Dinamarca, por volta de 1890, e hoje representa a segunda espécie
aquícola mais produzida na União Europeia, sendo a primeira de água doce
(Figura 4) (5, 14). Em Portugal, a produção aquícola apresenta um rápido
crescimento (desde 1985), sendo de destacar as truticulturas, principalmente no
Norte do país, onde a temperatura da água é mais baixa e por isso mais
adequada à sua produção (16, 17). A truta arco-íris é uma das 5 espécies mais
produzidas em Portugal, ocupando o 1º lugar na piscicultura, do tipo intensiva, e a
sua produção atingiu, em 2011, as 949 toneladas (4, 5).
A truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) é um peixe originário da Califórnia
e a sua espécie nativa pode hoje encontrar-se na costa do Pacífico dos Estados
Unidos da América (EUA), devendo o seu nome às numerosas manchas coloridas
da sua pele (14, 18, 19). Este peixe é caracterizado por ser muito resistente à
manipulação humana e às condições ambientais, podendo ocupar diferentes
habitats, deslocar-se da água salgada para a doce e vice-versa ou permanecer
em lagos (14, 18). A temperatura ideal para a sua reprodução é de 21ºC, no entanto,
7
consegue tolerar temperaturas desde os 0 aos 25ºC. O seu crescimento está,
essencialmente, dependente da temperatura da água e da alimentação e a
maturação é atingida, em condições normais, aos 3-4 anos de idade (18).
Figura 4. As 10 espécies aquícolas mais produzidas na União Europeia (2005). Volume em
toneladas (5)
.
No mercado nacional e internacional, a truta arco-íris está disponível para
consumo durante todo o ano, apresentando uma carne de cor branca ou rosada,
podendo ser vendida inteira ou em filetes, no estado fresco ou preservada por
fumagem (18).
1.3. Impacto socioeconómico da produção aquícola
Com o crescimento da população mundial e a estabilização, ou mesmo rotura,
dos recursos naturais da pesca, tem sido colocado aos vários setores agrícolas o
desafio de melhorar e aumentar a produção animal sem comprometer a qualidade
e, principalmente, a segurança dos produtos (20). No setor das pescas, prevê-se
que a aquacultura possa vir a desempenhar um papel cada vez mais importante
8
face ao incremento na procura destes produtos e ao aumento populacional, tendo
em conta a sua já forte contribuição para a economia (destacando-se a
exportação) de vários países (1, 8, 20).
Os setores das pescas e da aquacultura são fonte de inúmeros postos de
trabalho relacionados com a área (mais de 415 mil postos na Europa; Figura 5),
incluindo processamento, embalamento, marketing e distribuição,
desenvolvimento de tecnologia e equipamento para o setor (redes, engrenagens,
embarcações), trabalho de pesquisa e administrativo, entre outros (3, 5).
Figura 5. Emprego no setor da pesca, por sexo (2003). * Dados relativos a 2005; ** Dados
relativos a 2004,; *** Dados relativos a 2002 (5)
.
Estima-se que o emprego associado ao setor das pescas tenha aumentado
significativamente nas últimas três décadas e que represente o meio de
subsistência para 660-820 milhões de pessoas em todo o mundo (cerca de 10-
12% da população mundial) (1, 3, 7).
9
Os produtos da pesca continuam entre os produtos alimentares mais
comercializados mundialmente (contribuindo com cerca de 10% para as
exportações do setor agrícola) (3). Em Portugal, têm um impacto a destacar, dado
o elevado consumo de pescado pela população e o constante défice na balança
comercial destes produtos (superior a 660 mil euros em 2011; Figura 6) (4, 5, 21-23).
Figura 6. Balança comercial (exportações e importações) dos produtos da pesca ou relacionados
com esta atividade, em Portugal (2011) (4)
.
Em Portugal, a aquacultura tem-se revelado uma área com um enorme
potencial de crescimento e uma importante alternativa no combate à diminuição
dos produtos provenientes de captura, dado a privilegiada localização geográfica
sob influência do Atlântico e do Mar Mediterrâneo (5, 6). Contudo, é urgente o
desenvolvimento e/ou atualização das atuais políticas relacionadas com a
produção aquícola, incluindo a criação de estratégias para que se possam atingir
melhores resultados na produção (3). Alguns incentivos monetários e fiscais têm
sido implementados em vários países, incluindo Portugal, com o objetivo de
promover a competitividade e sustentabilidade do setor aquícola com aposta na
inovação e qualidade dos produtos, tirando proveito de todas as possibilidades da
pesca e potencialidade da aquacultura (3, 4, 16, 24). A produção aquícola pode,
assim, contribuir para um ambiente mais sustentável, desenvolvimento do
comércio, emprego e redução da pobreza, para além de outros benefícios (1, 2).
10
1.4. Aumento do consumo de pescado
As alterações na qualidade de vida e nos padrões de consumo alimentar da
população têm sido associadas à rápida urbanização, ao aumento das transações
comerciais, à melhoria da industrialização, produção e distribuição de alimentos e
à inserção da mulher na vida ativa (1, 3). A partir dos anos 50, os consumidores
começaram a associar a ingestão de uma alimentação equilibrada com a
promoção da saúde, sendo comum considerarem que uma alimentação
correta/saudável deve incluir uma elevada ingestão de fibras e uma diminuição da
ingestão de gorduras (25). Na opinião dos consumidores em geral, o pescado
(peixe e marisco) é um dos grupos de alimentos considerados mais saudáveis,
tendo aumentado a sua procura nas últimas décadas (1). Os apoios
governamentais e os avanços tecnológicos na indústria do pescado contribuíram
para a melhoria na produção, conservação, distribuição e globalização do seu
consumo e, consequentemente, para a redução de custos, aumento da variedade
de espécies para consumo humano e da segurança destes produtos
considerados de alta perecibilidade (1, 15).
Os produtos da pesca e aquacultura contribuem significativamente para o
cumprimento das necessidades nutricionais nos países europeus, particularmente
em Portugal, onde a sua disponibilidade/consumo per capita é elevada (3, 5, 25). De
facto, cada porção de pescado (aproximadamente 150g) contribui com 50-60% do
valor proteico diário recomendado para um adulto (1, 25). A sua importância para
uma alimentação saudável está comprovada, pois o pescado é uma excelente
fonte de proteína de alta qualidade (contendo os 9 aminoácidos essenciais) e
elevada digestibilidade, de baixo teor calórico e reduzidos níveis de gorduras
saturadas e colesterol (1, 3, 20, 25, 26). O pescado é composto maioritariamente por
11
gordura polinsaturada, altos níveis de ácidos gordos ómega-3 e representa uma
boa fonte de vitaminas e minerais, destacando-se o iodo (1, 20, 25, 26). Assim, este
grupo de alimentos pode e deve ser consumido por todos os grupos etários, dado
que o consumo destes produtos contribui para a prevenção de doenças
cardiovasculares, para o desenvolvimento cerebral, melhoria do sistema nervoso
e prevenção de distúrbios mentais (ex.: depressão ou demência) (1, 25, 26).
1.4.1. Produtos de aquacultura
Com a crescente procura de pescado observada nas últimas décadas e a
estabilização/rotura dos recursos pesqueiros, incluindo em Portugal, a
aquacultura parece ser a única alternativa para que a oferta de pescado
corresponda à procura (1). No entanto, alguns consumidores ainda demonstram
algumas reservas em relação aos produtos aquícolas, nomeadamente
relativamente à sua composição e segurança (1).
A composição química do pescado varia de acordo com as suas
características intrínsecas (espécie, sexo, idade) e características extrínsecas
(fatores ambientais, geográficos e composição da dieta) (27). A qualidade do peixe
inclui as suas propriedades nutricionais, microbiológicas e físico-químicas, sendo
no momento da compra a avaliação sensorial (aparência, cheiro e textura) e o
conceito de “frescura” que mais influenciam o consumidor (2, 15, 20, 28, 29). De facto,
verificam-se algumas diferenças no grau de frescura e na qualidade entre o peixe
capturado e o de aquacultura, mas ao contrário da opinião de alguns
consumidores, em benefício do pescado de aquacultura (6). Por exemplo, o
esforço físico e a fadiga causados na captura podem causar alterações ao nível
molecular devido à extinção dos recursos energéticos (ex.: ATP, glicogénio), com
12
repercussões negativas na qualidade do músculo e na frescura (29, 30).
Adicionalmente, o aquicultor pode manipular diversos fatores (ex.: alimentação
dos animais, fatores ambientais, idade biológica, crescimento) de forma a
assegurar a disponibilidade do pescado durante todo o ano e a melhorar a sua
qualidade (15, 31, 32). Relativamente à comparação da composição nutricional entre
peixes de captura e de aquacultura não há grande diferença (25, 33, 34),
apresentando-se na Figura 7 a composição nutricional média da truta arco-íris de
captura versus de aquacultura.
Figura 7. Composição nutricional da truta arco-íris de captura e de aquacultura (33, 34)
.
1.5. O mercado da aquacultura e a alimentação coletiva
Nos últimos anos, em virtude de diversas alterações no estilo de vida das
populações, tem-se verificado um aumento do número de refeições efetuadas
13
“fora-de-casa” (1, 3, 35). Por exemplo, em França e na região central norte dos EUA
o consumo de pescado fora-de-casa é muito elevado, quando comparado com
refeições de outros grupos de alimentos ou com as refeições feitas em casa, ou
seja, a maior parte das vezes que a população consome estes alimentos é fora-
de-casa (35, 36).
Os consumidores procuram rapidez e conveniência, mas não deixam de exigir
qualidade nos produtos alimentares e nas refeições que lhes são servidas (1, 3). Os
vendedores (retalhistas, comerciantes, responsáveis de vendas da restauração),
por sua vez, exigem aos seus fornecedores alimentos de qualidade, aumentando
globalmente o padrão de qualidade dos produtos (2, 15). Assim, o setor da
aquacultura terá ainda uma grande margem de crescimento, podendo fornecer
alimentos de qualidade não só diretamente ao consumidor, mas também às
unidades de alimentação coletiva. No entanto, os aquicultores enfrentam ainda
algumas dificuldades associadas aos conflitos com o setor da pesca, falta de
feedback em relação às preferências dos seus clientes/consumidores e,
sobretudo, problemas burocráticos do foro governamental (1).
O setor da alimentação coletiva tem aumentado significativamente nos últimos
anos, em parte como consequência do estilo de vida da população. O consumo
“fora-de-casa” representa cada vez maior relevância no orçamento familiar, em
particular o consumo de produtos da pesca (6, 35, 36). As unidades de alimentação
coletiva em França e nos EUA têm representado um dos principais mercados
para estes produtos, nomeadamente para os de aquacultura (35, 36).
Adicionalmente, em várias regiões dos EUA (New England, Mid Atlantic, South
East, East Central e Central), os produtos aquícolas são mesmo considerados de
14
qualidade superior comparativamente com os de captura, principalmente pelas
unidades de alimentação coletiva, supermercados e distribuidores (37).
Para que o setor da alimentação coletiva e o da produção aquícola
apresentem uma relação de “simbiose” real e promissora, algumas entidades
oficiais têm contribuído para elucidar os responsáveis das instituições de
alimentação coletiva em relação às vantagens da aquacultura e dos seus
produtos, no sentido de clarificar algumas preocupações e dúvidas que possam
ainda existir (36). Assim, os produtos de aquacultura são produtos saudáveis, com
características nutricionais adaptáveis a todos os consumidores, permitem uma
grande diversidade/variedade de escolha das espécies, são fáceis de manipular e
muito versáteis para a elaboração de ementas (35). Adicionalmente, estes produtos
estão disponíveis todo o ano, o que permite menores preços e mais estáveis do
que os obtidos por captura e facilita a elaboração dos orçamentos e do cálculo
das capitações nas instituições com uma redução de custos (15, 35). Para além
disso, devido ao modo de criação e alimentação dos animais, a sua qualidade
mantém-se constante, assim como o tamanho das porções, o que facilita a
elaboração das ementas nas unidades de alimentação coletiva (35).
1.6. Aquacultura e segurança alimentar
Paralelamente ao rápido crescimento da aquacultura a nível mundial têm
surgido preocupações na área da qualidade e segurança alimentar dos produtos
aquícolas (8). De facto, o desenvolvimento, a intensificação e a diversificação na
área da aquacultura associados ao aumento da globalização do comércio
alimentar levantam preocupações relacionadas com a segurança desses géneros
alimentícios e possíveis consequências para a saúde pública (1).
15
1.6.1. Doenças de origem alimentar associadas ao pescado
A introdução e distribuição do pescado no mercado global conduziram a um
aumento da exposição humana aos contaminantes, incluindo microrganismos,
associados a este nicho ecológico (38). Deste modo, os perigos microbiológicos
deixaram de estar confinados aos locais de produção, podendo ocorrer uma
disseminação transcontinental (38, 39).
As doenças de origem alimentar são definidas como qualquer doença de
natureza infeciosa ou tóxica causada pelo consumo de alimentos ou água
contaminados (40). Quando a ingestão do mesmo alimento contaminado tem como
consequência a ocorrência de doença semelhante em dois ou mais casos
humanos ou quando se observa um número de casos superior ao número
expectável para determinada doença estamos perante um surto de origem
alimentar (40).
A maioria dos surtos reportados pelos sistemas de vigilância dos países
industrializados está associada a alimentos de origem animal (41, 42).
Relativamente ao pescado (inclui peixe e produtos de peixe) os dados da EFSA
(European Food Safety Authority) mostram que entre 2010 e 2011 ocorreu um
aumento do número de surtos associados a este tipo de alimentos, passando de
44 (6,3%) em 2010 (43) para 71 (10,1%) em 2011 (41) (Figura 8 e Figura 9). O
aumento do número de casos reportados ao pescado resulta da melhoria dos
métodos de identificação e deteção dos patogénicos, mas também da melhoria
dos sistemas de vigilância, sendo que tem aumentado o número de países que
têm reportado casos e surtos (43, 44).
16
Figura 8. Distribuição de surtos por veículos de alimentos na UE em 2010 (43)
.
Figura 9. Distribuição de surtos por veículos de alimentos na UE em 2011 (41)
.
17
Por outro lado, o número de surtos com origem no pescado também varia
dependendo da localização geográfica, sendo habitualmente superior nos países
do sudeste asiático (45). Esta variação está relacionada com fatores
antropológicos, como os hábitos alimentares das populações (Ex.: consumo de
pescado; consumo de pratos típicos crus) e do seu nível de saúde, a possibilidade
de efetuarem viagens e a globalização do comércio de produtos alimentares (45).
Atualmente, os fatores ambientais, como a temperatura atmosférica e do
ambiente aquático que influenciam a prevalência de patogénicos em
determinadas zonas do globo são também considerados fatores determinantes na
emergência das doenças de origem alimentar associadas ao consumo de
pescado (45).
As doenças de origem microbiana transmitidas pelos alimentos, incluindo o
pescado, podem ser divididas em intoxicações alimentares, quando o agente
etiológico é uma toxina produzida por um microrganismo no alimento, e infeções
alimentares, em que o agente causador é ingerido vivo e tem capacidade para
produzir enterotoxinas (toxi-infeção alimentar) e/ou invadir a mucosa intestinal
(e/ou disseminar-se para outros órgãos) (46). Na Tabela 1 apresentam-se os
principais agentes microbianos associados a intoxicações e infeções alimentares
por ingestão de pescado. Em 2011, segundo o último relatório publicado pela
EFSA relativo aos surtos de origem alimentar na Europa, o agente etiológico
microbiano mais frequentemente associado a surtos associados com pescado foi
a histamina (78,9% dos surtos), Salmonella e biotoxinas marinhas (4,2% dos
surtos cada)(41) (Figura 10). Nos EUA, segundo os dados de 2009-2010 do CDC
(Center for Disease Control), os principais agentes envolvidos em surtos
associados ao consumo de pescado foram Histamina e Ciguatoxina, seguido por
18
Salmonella e Clostridium botulinum, sendo o principal veículo o peixe (42) (Figura
11).
Tabela 1. Exemplos de microrganismos patogénicos transmitidos pelo pescado (Adaptado de (46)
).
Agente etiológico
Infeções Bactérias Listeria monocytogenes, Salmonella, Escherichia coli, Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus
Vírus Vírus da hepatite A, Norovírus, Vírus da hepatite E
Parasitas Nemátodos (Anisakis simplex, Psudoterranova dicipens, Gnathostoma spp., Capillaria spp., Angiostrongylus spp.), Céstodos (Diphyllobothrium latum, Diphyllobothrium pacificum), Tremátodos (Clonorchis sinensis, Opisthorchis sinensis, Metagonimus yokagawai, Heterophyes spp., Paragonimus spp., Echinostoma spp.)
Toxi-infeções Vibrio cholerae
Intoxicações Bactérias Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum
Figura 10. Distribuição dos agentes causadores de surtos associados a pescado na UE em 2011
(41).
19
Figura 11.Distribuição dos agentes causadores de surtos associados a pescado nos EUA, em
2009-2010 (Adaptado de (42)
).
O peixe e o marisco apresentam naturalmente uma flora microbiana
associada que pode incluir microrganismos patogénicos para o Homem. Esta flora
pode ser de origem endógena/natural do próprio animal ou pode ser de origem
externa/exógena, resultante de uma contaminação exterior associada ao
ambiente aquático que o envolve (ex.: contaminação por fezes de animais) e/ou
contaminação cruzada provenientes de erro humano em etapas como a
preparação, armazenamento e manutenção (8, 47, 48).
As estirpes de Vibrio, Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides,
Listeria monocytogenes e Clostridium botulinum fazem parte da flora microbiana
considerada indígena do peixe e encontram-se amplamente distribuídas nos
ambientes aquáticos de várias partes do mundo (46, 49). No entanto, a temperatura
da água tem um efeito seletivo, fazendo com que os microrganismos
psicrotróficos (ex. Clostridium botulinum e Listeria) sejam mais frequentes no
20
Ártico e climas frios enquanto os mesófilos (ex.: Vibrio cholerae e Vibrio
parahaemolyticus) representem parte da flora natural do peixe de zonas
temperadas ou tropicais quentes (49). Os casos de botulismo são reduzidos e
normalmente estão associados a produtos embalados/armazenados em
condições de baixa concentração ou ausência de oxigénio (45, 50, 51). Relativamente
a Listeria monocytogenes, o registo de casos esporádicos associados a pescado
está habitualmente associado a produtos fumados, como aconteceu
recentemente nos USA em produtos de salmão fumado (52) e na Europa com
produtos de peixe fumado, incluindo de truta arco-íris (53-55). O género Vibrio está
associado ao ambiente aquático de regiões geográficas com climas amenos,
como os países asiáticos (principais produtores de pescado), onde a espécie
Vibrio parahaemolyticus é o principal agente etiológico de surtos de origem
alimentar, em contraste com o que acontece em países europeus (56). Também
nos EUA tem ocorrido nos últimos anos um aumento do número de surtos
associados a espécies de Vibrio e pescado, principalmente marisco, relacionado
com as alterações climáticas, nomeadamente aumento da temperatura da água
(57).
Adicionalmente, outras bactérias patogénicas (ex.: Salmonella, Shigella, E.
coli patogénicas e Staphylococcus aureus) podem estar presentes nestes
alimentos, sendo provenientes do ambiente de produção (ex.: água e sedimentos
contaminados por matéria fecal), e/ou dos trabalhadores (ex.: más praticas de
higiene) do setor ao longo da cadeia alimentar (46, 49). A presença de Salmonella
está normalmente associada a contaminação fecal, quer do ambiente aquático,
quer por más práticas de higiene dos trabalhadores (41, 45). Em 2011, na Europa,
este patogénico foi o principal agente bacteriano associado com pescado, tendo
21
representado 4,2% dos surtos alimentares causados por peixe (EFSA; Figura 10)
e 8% dos surtos em 2009-2010 nos EUA (CDC; Figura 11) (41, 42). De destacar um
surto de salmonelose com origem em salmão fumado que provocou 866 casos na
Holanda em 2012 (58). Adicionalmente, esta bactéria tem sido detetada em
aquaculturas ao longo dos anos e em diferentes regiões geográficas. Por
exemplo, em 1986, foi detetada a presença de isolados de Salmonella em
amostras de água e de peixe de aquaculturas na África do Sul (Durban) (59). Em
Portugal, foi detetada a presença de diferentes serotipos de Salmonella em
amostras ambientais recolhidas de duas aquaculturas do Norte e Centro do país
em 2011 (60). Esta bactéria constitui um risco para a saúde quando se encontra
em número suficiente no pescado para atingir a dose infeciosa (ou se for
armazenada em condições que permitam a sua proliferação) ou se as medidas
aplicadas no processamento alimentar não forem suficientes para reduzir ou
manter reduzidos os valores de concentração bacteriana (45). Estirpes de
Escherichia coli podem também ser isoladas de ambientes contaminados por
matéria fecal e conseguir sobreviver durante um longo período de tempo (61).
Apesar de não serem comuns surtos por estirpes patogénicas de E. coli (ex. E.
coli O157:H7) associados a pescado, as aquaculturas abastecidas por águas não
tratadas (ex. águas de rios contaminadas com fezes de animais) ou as más
práticas de higiene por parte dos manipuladores podem tornar os produtos
aquícolas como veículo potencial para estas bactérias (8, 46).
Os vírus, apesar de não se multiplicarem na água e nos alimentos (ao
contrário das bactérias), podem sobreviver (ex. resistindo à temperatura) no
ambiente aquático e pescado. A sua presença no pescado resulta da
contaminação fecal da água ou da contaminação pelos manipuladores, sendo que
22
a contaminação inicial tem de ser elevada para que o pescado possa veicular
uma dose infeciosa suficiente para causar doença (46). O Homem e os animais são
a fonte dos vírus entéricos (ex.: Norovírus), podendo através de contaminação
fecal contaminar direta ou indiretamente os alimentos (46). Os Norovírus, um dos
principais agentes de doença de origem alimentar (46), causaram na Europa, em
2011, 87 surtos de origem alimentar, incluindo pescado (41). Em alguns países,
alguns casos têm sido associados a produtos aquícolas, como por exemplo os
surtos de 2011 na Nova Zelândia relacionados com ostras de aquacultura
contendo Norovírus (62).
Para o controlo das doenças microbianas transmitidas pelo pescado, incluindo
produtos de aquacultura, é essencial a existência de medidas de proteção
ambiental (ex.: qualidade da água à entrada e tratamento à saída em caso de
sistemas de fluxo contínuo; avaliação das áreas de pesca), de boas práticas de
higiene pessoal e de formação em segurança alimentar aos funcionários nos
postos de trabalho, principalmente em relação a pontos críticos como temperatura
de armazenamento e confeção (cruciais para a evitar a proliferação dos
microrganismos e para os inativar), higiene dos utensílios e materiais em contacto
com o pescado (13, 45, 46, 48, 63).
1.6.2. Resistência aos antibióticos e aquacultura
Os antibióticos são agentes antimicrobianos extensamente utilizados para fins
terapêuticos e profiláticos, quer em medicina humana, quer veterinária (12, 64-66). No
setor aquícola recorre-se, por vezes, à utilização de agentes antimicrobianos para
o controlo de doenças infeciosas bacterianas e/ou eliminação de bactérias
patogénicas para o peixe e para prevenir o aparecimento dessas doenças
23
associadas ao local de produção (1, 12, 67). Adicionalmente, em aquacultura a
utilização de antibióticos é importante para a produção de novas espécies de
animais em cativeiro, mas muitas vezes também como alternativa à
implementação de medidas preventivas de controlo da infeção e de bem-estar
animal (1, 68) e para a promoção do crescimento dos animais, uma vez que
aumentam a eficácia da alimentação e diminuem os desperdícios na produção, tal
como na pecuária (64-66, 69). Apesar da utilização para este fim estar limitada ou
mesmo proibida em vários países (incluindo na União Europeia, desde 2006) (1, 68,
70), a possibilidade de usar estes compostos varia com as regiões geográficas
onde estão localizadas as produções aquícolas, uma vez que não existe
legislação nem práticas de produção homogéneas a nível mundial (71, 72). Na
União Europeia, são habitualmente aplicadas medidas de controlo e segurança,
sendo o uso de antibióticos integrado no programa de saúde animal e apenas
permitido para tratar as doenças infeciosas no peixe (controlar e/ou eliminar
microrganismos patogénicos) (73). Adicionalmente, o seu uso tem tido uma
redução crescente em alguns países (ex. Noruega) devido a políticas de
vacinação eficazes que previnem o desenvolvimento de infeções nos animais (71,
72, 74). Estas medidas preventivas podem ser bem-sucedidas, isto porque, a
prevenção de doenças no pescado vai diminuir a quantidade de antibióticos
utilizados (71). Em contraste, noutras regiões menos desenvolvidas como os
países asiáticos (onde se situam os maiores produtores mundiais de pescado), o
uso de antibióticos é menos regulamentado e mais intensificado, incluindo em
profilaxia e em terapia empírica, podendo os antibióticos manter-se no ambiente
aquático e em doses subinibitórias (71, 75).
24
Assim, a utilização de antibióticos e os seus efeitos negativos continuam a ser
uma preocupação atual (1, 69, 71). Em algumas circunstâncias, os antibióticos são
administrados por injeção diretamente nos animais doentes, mas o mais comum é
serem administrados oralmente através da ração e neste caso parte do agente
antimicrobiano (ou seja, o alimento que não é consumido) permanece no
ambiente aquático por períodos de tempo prolongados, principalmente se não
forem agentes biodegradáveis (64, 65, 67). Na área da segurança alimentar surgem
questões relacionadas com o aumento da resistência bacteriana aos antibióticos,
presença de resíduos de fármacos veterinários nos produtos de aquacultura e
com o custo económico associado com os tratamentos, que têm vindo a ser mais
prolongados e complicados devido à redução da sua eficácia (1, 68, 73).
Como consequência da exposição bacteriana aos antibióticos pode ocorrer a
seleção e consequente disseminação de bactérias resistentes (patogénicas para
peixes/humanos e/ou comensais) nos animais de produção, na água/sedimento
dos tanques e no ambiente aquático recetor das águas das aquaculturas (Figura
12) (71, 72, 75). Estes microrganismos resistentes são capazes de sobreviver e
persistir na presença de concentrações de antibióticos mais elevadas do que os
isolados da mesma espécie selvagens (wild type) conseguem suportar (8, 71).
Adicionalmente, estas bactérias aquáticas podem constituir um reservatório de
genes de resistência que podem ser transferidos para patogénicos humanos, quer
na aquacultura, quer no ambiente aquático (71, 72). Alguns estudos mostram que é
frequente que as bactérias isoladas dos peixes de aquacultura sejam resistentes
a diversos grupos de antibióticos (76). Num estudo na Dinamarca, verificou-se que
o uso frequente de antibióticos na produção de trutas de aquacultura levou ao
aumento dos níveis de resistência das bactérias ambientais e patogénicos dos
25
peixes (77). O contacto do Homem com estas bactérias e genes pode dar-se
através do consumo e manipulação do pescado ou de atividades recreativas em
sistemas aquáticos contaminados, podendo limitar, posteriormente, o sucesso da
antibioterapia em situações de infeção (71, 72, 75).
Figura 12. O fluxo de bactérias/genes de resistência a antibióticos em diferentes nichos
ecológicos, incluindo aquaculturas (68)
.
26
De facto, com a globalização do comércio alimentar, a possibilidade de
disseminação de bactérias resistentes aos antibióticos e de resíduos de agentes
antimicrobianos em alimentos aquícolas é comum a todas as regiões (72). Além
disso, a disseminação dos genes de resistência a antibióticos não respeita
fronteiras filogenéticas, geográficas ou ecológicas, podendo tornar-se um
problema para a saúde pública relacionado com as aquaculturas, quer pela
transmissão direta de bactérias resistentes do ambiente aquático para os
humanos (por ingestão ou manipulação do pescado), quer indireta quando o
ambiente aquático funciona como um intermediário/reservatório de genes de
resistência (8, 71, 73).
A resistência bacteriana aos antibióticos ocorre por mutações genéticas ou
através da aquisição de genes de resistência, podendo ser transmitida por via
vertical ou horizontal (64, 78). A transferência vertical de genes consiste na
transmissão de material genético da célula mãe para a célula filha e a
transferência horizontal refere-se à transmissão de material genético entre
bactérias independentes, com uma distância filogenética por vezes significativa.
Atualmente, a transferência horizontal de genes é considerada muito importante
para a disseminação de genes de resistência a antibióticos, pois permite que
bactérias de espécies e origens diferentes que se encontram no mesmo
ambiente/nicho partilhem informação genética entre si, através da troca de
elementos genéticos móveis (ex.: plasmídeos) ou mobilizáveis (ex.: integrões) por
diferentes mecanismos – conjugação, transformação ou transdução (Figura 13)
(73, 76, 79). De facto, a presença de genes/elementos genéticos idênticos em
isolados diferentes do mesmo nicho ecológico e entre os isolados de animais e do
Homem demonstra a importância da transferência horizontal na disseminação da
27
resistência pela cadeia alimentar (66). Por exemplo, foram detetados, plasmídeos
idênticos, contendo genes de resistência, que foram transferidos in vitro de
bactérias patogénicas do peixe e aquáticas (ex.: Aeromonas salmonicida,
Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum e Vibrio salmonicida) não só para
bactérias do mesmo género mas também para E. coli (71). Estes dados mostram
que bactérias do ambiente aquático, incluindo patogénicos do pescado, podem
funcionar como reservatórios de genes de resistência a antibióticos que podem
ser transferidos para patogénicos humanos (71). Entre as bactérias Gram negativo,
os membros da família Enterobacteriaceae, são considerados importantes nesta
problemática porque sendo comuns à flora intestinal do Homem e outros animais
podem colonizar o Homem e/ou transferir os seus genes de resistência a
antibióticos para outras bactérias da sua flora intestinal (66, 69, 80).
Figura 13. Transferência horizontal de genes de resistência a antibióticos. Mecanismos de
conjugação, transdução e transformação (Fonte: http://www.scq.ubc.ca/attack-of-the-
superbugs-antibiotic-resistance/).
28
Atualmente, a preocupação crescente com o papel da cadeia alimentar na
disseminação da resistência aos antibióticos relaciona-se fundamentalmente com
os antibióticos de maior relevância clínica que foram classificados pela
Organização Mundial de Saúde (OMS) como “clinicamente relevantes” (Critically
Important) (81). Esta classificação tem por base alguns critérios (ex.: se existem
alternativas ao antibiótico em questão ou se é um antibiótico utilizado no
tratamento de zoonoses), sendo de destacar as fluoroquinolonas e as
cefalosporinas de 3ª e 4ª geração, quer por serem antibióticos de largo espetro
importantes em medicina humana, quer devido à sua ampla utilização na
produção animal e à sua ligação com a resistência detetada em algumas
bactérias patogénicas para o Homem de origem zoonótica (ex.: Salmonella) (81).
Na cadeia alimentar, desde a produção primária ao consumo (venda a retalho
e cozinha), incluindo nas unidades de alimentação coletiva, são diversas as
formas/vias de transmissão das bactérias resistentes aos antibióticos (Figura 14).
No local de preparação dos alimentos (cozinhas domésticas ou industriais), as
bactérias resistentes podem ser disseminadas por uma incorreta evisceração do
animal, que poderá conduzir a contaminação da parte edível do peixe, mas
também por práticas de contaminação cruzada entre o pescado cru e outros
alimentos cozinhados ou prontos a comer (63). Também a confeção do pescado a
temperaturas insuficientes para a eliminação dos microrganismos provenientes da
parte edível do peixe poderá conduzir à ingestão de bactérias potencialmente
resistentes aos antibióticos (63). Assim, com o aumento global do consumo de
produtos de aquacultura, a probabilidade de exposição/ingestão de bactérias
resistentes a antibióticos, de genes de resistência ou de resíduos de antibióticos
29
através do pescado está aumentada, particularmente em alimentos pouco ou
nada processados termicamente (64, 71).
Figura 14. Formas de transmissão de bactérias resistentes aos antibióticos através da cadeia
alimentar (73)
.
As consequências da ingestão de bactérias resistentes aos antimicrobianos
podem ser diretas, incluindo o aumento da frequência de falhas terapêuticas e o
aumento da severidade das infeções, o que implica maiores taxas de morbilidade
e mortalidade e custos económicos para toda a comunidade (64, 71). Vários estudos
demonstram que as infeções em humanos com origem em bactérias resistentes a
antibióticos têm associada uma maior mortalidade e um tratamento mais
prolongado e complicado (64). Por outro lado, a ingestão de resíduos de
antibióticos no pescado pode provocar alterações na microbiota normal do trato
30
intestinal, fazendo com os indivíduos possam ficar mais suscetíveis a infeções por
patogénicos enquanto a população microbiana não seja regularizada (71).
Apesar de algumas evidências, os estudos sobre a utilização de agentes
antimicrobianos na aquacultura e as suas repercussões para a saúde humana
são ainda escassos para elaborar conclusões definitivas, embora se considere
que as consequências sejam semelhantes àquelas decorrentes da sua utilização
noutros tipos de produção alimentar (71, 73).
Apesar da produção de peixe em aquacultura ser uma atividade em expansão
a nível mundial, incluindo em Portugal, poucos trabalhos de investigação na área
da microbiologia e segurança alimentar têm sido efetuados no ambiente de
produção das unidades de aquacultura, sendo ainda mais escassos os estudos
efetuados em pescado produzido em aquacultura no fim da cadeia alimentar, ou
seja nos pontos de venda. O estudo de bactérias patogénicas e de bactérias
resistentes a antibióticos ao longo da cadeia alimentar é considerado
extremamente relevante para a saúde pública, em particular para a área da
qualidade e segurança alimentar, áreas cruciais para a alimentação coletiva que
recorre frequentemente ao peixe produzido em aquacultura para responder aos
orçamentos e limitações económicas.
31
2. Objetivos
A aquacultura é das indústrias do setor alimentar que mais tem crescido nos
últimos anos, representando, atualmente, cerca de 50% do peixe produzido
globalmente para alimentação humana (1). Adicionalmente apresenta várias
vantagens para as unidades de alimentação coletiva, uma vez que disponibiliza
produtos de características constantes, qualidade controlada e preços mais
estáveis e inferiores aos dos produtos da pesca (35). No entanto, os perigos
microbiológicos para a segurança alimentar, incluindo a presença de bactérias
patogénicas e/ou bactérias resistentes a antibióticos, encontram-se ainda
incompletamente avaliados.
Assim, o objetivo global do presente estudo consistiu na avaliação da
qualidade e segurança microbiológica de trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss)
de aquacultura comercializadas em Portugal, no distrito do Porto.
Os objetivos específicos foram:
i. Avaliar a presença do bioindicador Escherichia coli e das bactérias
patogénicas Salmonella e Listeria monocytogenes;
ii. Avaliar a presença de bactérias da família Enterobacteriaceae portadoras
de genes de resistência a antibióticos clinicamente relevantes.
32
33
3. Material e Métodos
3.1. Amostragem
3.1.1. Colheita das amostras
3.1.1.1. Truticultura
De forma a conhecer e compreender o modo de produção e as condições a
que as trutas da espécie Oncorhynchus mykiss estão sujeitas, realizou-se uma
colheita numa truticultura do Centro de Portugal. Esta primeira colheita, em
ambiente de produção, teve também como objetivo testar e afinar as
metodologias que foram posteriormente aplicadas às amostras provenientes das
superfícies comerciais.
Foram colhidas 9 amostras de diferentes pontos da aquacultura: água de rio a
montante (n=1), água à entrada (n=1) e saída do sistema (n=1), água de rio a
jusante (n=1), água dos tanques de trutas adultas (n=2), ração (n=1) e trutas
adultas (n=2). Todas as amostras foram colhidas para recipientes/sacos estéreis,
utilizando a técnica assética. As amostras de água foram compostas por três
litros, as de trutas por 3 peixes de cada tanque e a da ração por 500g obtidos
duma embalagem intacta do produto.
3.1.1.2. Superfícies Comerciais
Entre maio e junho de 2012 foram colhidas 25 amostras provenientes de 8
estabelecimentos comerciais (arbitrariamente designados de I a VIII) do distrito do
Porto. Cada amostra foi constituída por 3 trutas do mesmo lote (com um peso
total médio de 700g), obtidos diretamente dos cestos do armazém ou da bancada
34
do supermercado onde o peixe se encontrava exposto para venda, consoante
disponibilidade. Cada unidade foi colocada num saco estéril, transportada e
armazenada a temperatura de refrigeração (entre 2 e 5ºC) até ao momento da
preparação e análise das amostras (máximo 24h). De cada amostra foram
registadas a origem, marca (se aplicável), designação, data de colheita e código
atribuído.
3.1.2. Preparação das amostras
A preparação das amostras de peixe consistiu na evisceração de cada truta
(procedimento semelhante ao efetuado na preparação do peixe), sendo retirado
todo o trato digestivo, coração, rins e músculo em contacto com estes órgãos,
respeitando as regras de assepsia. Cada amostra foi composta por vísceras e
músculo de 3 trutas, sendo a mistura posteriormente homogeneizada
manualmente e recorrendo a meios mecânicos (Stomacher – Lab-Blender 400).
De seguida, foram pesadas 2 tomas de 25g da mistura, recorrendo a uma balança
digital (Kern EW 1500-2M), para cada um dos meios de enriquecimento: 225mL
de Água Peptonada Tamponada (bioMérieux) para incubação a 37ºC e 225mL de
caldo Half-Fraser broth (bioMérieux) para incubação a 30ºC.
Para a amostra de ração foram igualmente preparadas 2 tomas de 25g, após
homogeneização mecânica (Stomacher), para os mesmos meios de
enriquecimento (Água Peptonada Tamponada e caldo Half-Fraser broth).
A preparação das amostras de água foi efetuada recorrendo à metodologia de
filtração por membrana, sendo filtradas tomas de 1 litro de cada amostra através
de filtros de 0,45m que posteriormente foram colocados em Água Peptonada
35
Tamponada para incubação a 37ºC e no caldo Half-Fraser broth para incubação a
30ºC.
3.2. Análise da qualidade e segurança microbiológica
3.2.1. Contagem de microrganismos aeróbios mesófilos
Neste estudo, a carga microbiana total de cada amostra foi avaliada através
da contagem de microrganismos a 30ºC (microrganismos aeróbios mesófilos),
recorrendo a sementeira por incorporação em Plate Count Agar (Biogerm),
incubada a 37ºC (temperatura favorável aos microrganismos patogénicos para o
Homem). As placas foram observadas nas 24, 48 e 72 horas seguintes para
análise da evolução do crescimento/desenvolvimento microbiano, em
conformidade com os métodos de referência (ISO 4833:2003) (82).
3.2.2. Pesquisa de Escherichia coli
O bioindicador de contaminação fecal selecionado para este estudo foi a
Escherichia coli. A pesquisa efetuou-se após uma etapa de pré-enriquecimento
em Água Peptonada Tamponada a 37ºC/18h seguida de sementeira à superfície
em meios seletivos: Tryptone Bile X-Glucuronide (Biogerm) e/ou chromID Coli
(bioMérieux). As colónias produtoras de -glucoronidase foram consideradas
suspeitas de E. coli, de acordo com a norma internacional (83). De cada placa
foram selecionadas colónias suspeitas de E. coli de diferentes morfotipos, de
modo a ser possível selecionar isolados diferentes de cada amostra para posterior
caraterização.
36
3.2.3. Pesquisa de Salmonella e Listeria monocytogenes
Para a pesquisa das bactérias patogénicas Salmonella e Listeria
monocytogenes foram utilizadas as normas de referência internacionais ISO
6579:2002 e ISO 11290-1 (84-86), respetivamente.
Para a pesquisa de Salmonella efetuaram-se as seguintes etapas:
i. Pré-enriquecimento de 25g de amostra em 225mL de Água Peptonada
Tamponada (bioMérieux) a 37ºC/18h; (87)
ii. Enriquecimento em dois meios seletivos Rappaport Vassiliadis Soya (RVS,
bioMérieux) a 41,5ºC/24h e Muller-Kauffmann tetrathionate-Novobiocin
(MKTTn, bioMérieux) a 37ºC/24h;
iii. Isolamento das colónias em placas de Xylose lisine deoxycholate agar
(XLD agar, Liofilchem) e de CHROMagar Salmonella (Biogerm), incubadas
a 37ºC/24h;
iv. Confirmação das colónias suspeitas de Salmonella (selecionadas até 5
colónias de cada placa) efetuada através de provas bioquímicas (sistema
API20E/API-ID32GN, bioMérieux) e serológicas (soro polivalente anti-
Salmonella O e soros específicos dos serogrupos B, C1, C2 e D, Difco).
Para a pesquisa de Listeria monocytogenes (87) efetuaram-se as seguintes
etapas:
i. Pré-enriquecimento de 25g de amostra em 225mL de Half-Fraser broth
(bioMérieux) a 30ºC/24h;
ii. Enriquecimento em Fraser broth (bioMérieux) a 37ºC/48h;
iii. Isolamento das colónias em placas de Agar Listeria according to Ottaviani
and Agosti (ALOA, Biogerm) e Oxford agar (Biogerm), incubadas a
37ºC/48h;
37
v. Confirmação das colónias suspeitas de Listeria monocytogenes
(selecionadas até 5 colónias de cada placa) efetuada através de provas
bioquímicas (sistema API Listeria, bioMérieux).
3.3. Seleção de bactérias resistentes a antibióticos
A deteção de bacilos Gram negativo resistentes a antibióticos clinicamente
relevantes (fluoroquinolonas e β-lactâmicos) foi efetuada após uma etapa de
enriquecimento em Água Peptonada Tamponada a 37ºC/18h seguida de
sementeira em meios seletivos. Para seleção de bacilos Gram negativo utilizou-se
o MacConkey Agar (Liofilchem) e para a seleção de E. coli o Tryptone Bile X-
Glucuronide e/ou chromID Coli suplementados com antibióticos do grupo das
cefalosporinas de 3ª geração, ceftazidima (1µg/mL, Sigma) e cefotaxima (1µg/mL,
Sigma) e das fluoroquinolonas, ciprofloxacina (0,125µg/mL, Sigma). De cada
placa foram selecionadas colónias de vários morfotipos para posterior
caraterização molecular.
Os isolados selecionados foram armazenados a -80ºC em Tryptone Soya
Broth (Oxoid) com 15% de glicerol.
3.4. Deteção e caraterização de genes de resistência a antibióticos
No presente trabalho foram pesquisados em todos os isolados de bacilos
Gram negativo (E. coli e outras Enterobacteriaceae) os genes que mais
frequentemente codificam para a resistência adquirida a vários grupos de
antibióticos através de ensaios de Polimerase chain reaction (PCR). Foi, assim,
realizada a pesquisa de genes de resistência às fluoroquinolonas (ciprofloxacina)
que têm sido associados a plasmídeos [qnrA (88, 89), qnrB (88, 89), qnrC (90), qnrD (91),
38
qnrS (88, 92), qepA (93), aac(6’)-Ib-cr (93) e oqxAB (94)] e de genes de resistência à
família dos antibióticos β-lactâmicos (blaTEM (95), blaCTX-M
(95), blaSHV (96)) em todos
os isolados selecionados. Adicionalmente, foram pesquisados genes de
resistência a outros grupos de antibióticos como cloranfenicol (floR, catA, cmlA)
(97), estreptomicina (strA-strB) (97), sulfametoxazole (sul1, sul2 e sul3) (98, 99),
tetraciclina [tet(A), tet(B) e tet(G)] (97) e trimetoprim (dfrA1, dfrA7, dfrA12 e dfrA17)
(100-102). A presença de genes de resistência a antibióticos associados a integrões
de classe 1 foi pesquisada por PCR em todos os isolados resistentes ao
sulfametoxazole, utilizando-se primers específicos para as regiões conservadas
5´CS e 3´CS e para o gene intI1 (Tabelas 4; Anexos) (98, 100). A caracterização da
zona variável dos integrões de classe 1 foi realizada por PCR recorrendo-se ao
primer para a zona conservada 5’CS e ao primer para o gene variável de
interesse (dfrA1, dfrA7, dfrA12, dfrA17 ou aadA)(100-102).
3.4.1. Obtenção do DNA e condições dos métodos de PCR
Para a realização dos PCRs foi previamente efetuada a extração do DNA total
de cada isolado selecionado, de acordo com o método descrito por Seifert et al
(1997)(103). Assim, todos os isolados foram semeados em Cystine Lactose
Eletrolyte Deficiente agar (CLED agar, Liofilchem) e incubados a 37ºC/18-24h
para obtenção de colónias para a extração do DNA, seguindo as seguintes
etapas:
i. Retiraram-se 2-3 colónias da placa de CLED e fez-se uma suspensão na
solução de lise (0,05M NaOH; 0,25% SDS), até se obter turvação.
ii. Recorrendo a um termociclador, os tubos foram colocados a 95ºC/15min
(lise).
39
iii. De seguida, adicionaram-se a cada tubo 180µL de TE 1x (10mM Tris:1mM
EDTA; pH 8,0), perfazendo um volume final de 200µL.
iv. Após homogeneização, os tubos foram centrifugados durante 3min a
13000rpm.
v. Finalmente, retirou-se o sobrenadante (contendo o DNA pretendido de
cada isolado) e armazenou-se a -20ºC em tubos de 1,5mL para posterior
utilização.
As condições utilizadas para a amplificação dos genes pesquisados e as
sequências nucleotídicas dos primers para utilização nas reações de PCR
encontram-se na Tabela 4 (Anexos). Para a amplificação foi utilizado o
termociclador C1000TM Thermal Cycler (BIO-RAD®).
3.4.2. Eletroforese em gel de agarose
Os produtos obtidos nas reações de PCR foram separados por eletroforese
em gel de agarose a 2% (SeaKem® LE Agarose, Lonza) corado com SYBR® Safe
DNA gel stain (invitrogen™) em tampão TAE 1x (Tris-base 40mM, EDTA 1mM,
ácido acético glacial, pH 8), durante 35min a 90V. O tamanho dos fragmentos de
DNA obtidos foi calculado por comparação com dois controlos positivos e com
marcador de peso molecular (100bp DNA Ladder, Bioron ou GenLadder 1kbp,
Genaxxon). A obtenção da imagem dos géis fez-se utilizando o aparelho
Molecular Image® Gel Doc™ XR+ with ImageLab Software (BIO-RAD).
3.4.3. Purificação e sequenciação dos produtos de PCR
Os produtos de PCR referentes a amplificação dos genes de resistência a
antibióticos clinicamente relevantes e à região 16SrDNA (identificação da espécie)
40
foram preparados para posterior sequenciação. Previamente, os produtos de PCR
foram purificados, utilizando-se o kit de purificação Ezway™ PCR Clean-up Kit
(KOMABIOTECH), de acordo com as instruções do fabricante.
As sequências nucleotídicas obtidas por sequenciação foram comparadas com
outras presentes na base de dados GenBank, utilizando o BLASTN (NCBI,
National Center for Biothecnology Information) e recorrendo às ferramentas
Chromas (versão 2.4) e ClustalW2 (104).
3.4.4. Identificação ao nível da espécie/infra espécie
Os isolados de bacilos Gram negativo foram identificados ao nível da espécie
utilizando o sistema de identificação API ID32GN (bioMérieux) e/ou por
sequenciação do 16S rDNA após amplificação por PCR (105). Os isolados de E.
coli foram identificados por PCR, sendo posteriormente classificados em grupos
filogenéticos por PCR multiplex (106). As condições do PCR e as sequências
nucleotídicas dos primers encontram-se na Tabela 4 (Anexos).
3.5. Avaliação da suscetibilidade a antibióticos
Em todos os isolados de E. coli e nas bactérias Gram negativo portadoras de
genes de resistência a antibióticos clinicamente relevantes, tais como genes que
codificam para β-lactamases de espetro alargado (ESBL – extended-spectrum
beta-lactamases) e/ou genes de resistência a quinolonas associados a
plasmídeos (PMQR – plasmid-mediated quinolone resistance), foram efetuados
ensaios para avaliação da suscetibilidade a diversos antibióticos.
41
3.5.1. Método de difusão em agar com discos
Os isolados foram semeados em meio CLED agar, incubados a 37ºC/18-24h.
Após obtenção de colónias puras, fez-se uma suspensão em tubos com soro
fisiológico até turvação equivalente a 0,5McFarland. De seguida, uma zaragatoa
foi mergulhada na suspensão preparada, removendo-se o excesso (pressionando
a zaragatoa contra a parede do tubo) e espalhando sobre a superfície de placas
contendo o meio Mueller-Hinton agar 2 (bioMérieux), em várias direções e girando
a placa para garantir homogeneidade de crescimento bacteriano. Posteriormente
colocaram-se os discos de antibióticos sobre as placas previamente preparadas,
utilizando um dispensador automático. As placas foram incubadas a 37ºC/16-18h.
A estirpe E. coli ATCC 25922 foi utilizada como controlo (107).
Os agentes antimicrobianos e as respetivas concentrações testados foram os
seguintes: ácido nalidíxico (30 μg; Oxoid), amoxicilina (10 μg; Oxoid), canamicina
(30 μg; Oxoid), ciprofloxacina (5 μg; Oxoid), cloranfenicol (30 μg; Oxoid),
estreptomicina (10 μg; Oxoid), gentamicina (10 μg; Oxoid), sulfametoxazole (300
μg; Oxoid), tetraciclina (30 μg; Oxoid) e trimetoprim (5 μg; Oxoid).
Após o período de incubação foram medidos e registados os diâmetros dos
halos de inibição, que permitem obter uma classificação qualitativa nas categorias
sensível, intermédia ou resistente. Os resultados obtidos foram interpretados
utilizando as tabelas padronizadas do Clinical and Laboratory Standards Institute
(107) (107) e The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
(EUCAST) (108) para Enterobacteriaceae. Foram considerados como
multirresistentes os isolados que apresentaram fenótipo de resistência a pelo
menos 3 classes de antibióticos diferentes.
42
3.5.2. Avaliação da suscetibilidade a antibióticos β-lactâmicos de
largo espetro e pesquisa de β-lactamases
Os isolados que apresentaram resistência à amoxicilina foram testados para
avaliar a presença de ESBL, através do teste do duplo sinergismo (DDST, Double
Disc Sinergy Test). O sinergismo foi avaliado, segundo a técnica de difusão em
agar com discos, aplicando um disco de amoxicilina/ácido clavulânico (30 μg;
Oxoid) próximo de discos de ceftazidima (30 μg; Oxoid), cefotaxima (30 μg;
Oxoid), cefoxitina (30 μg; Oxoid) e cefepime (30 μg; Oxoid), na placa de Mueller-
Hinton agar 2 (bioMérieux).
3.5.3. Determinação da concentração mínima inibitória (CMI) à
Ciprofloxacina por E-test
Para a determinação da CMI à ciprofloxacina, foi utilizado o método de E-test
(AB Biodisk), colocando uma tira impregnada com o antibiótico em Mueller-Hinton
agar 2 previamente semeado com as suspensões de turvação 0,5McFarland. As
placas foram incubadas em aerobiose a 37ºC/16-18h, de acordo com o CLSI para
Enterobacteriaceae (107). De seguida, foram observadas e registadas as CMIs
representadas pelo valor observado na interseção do halo formado com a tira de
E-test. Este método quantitativo permite, assim, determinar qual o valor de
concentração mínima inibitória de um dado agente antimicrobiano necessário
para inibir o crescimento de um microrganismo. Os isolados foram classificados
como sensíveis, intermédios ou resistentes, de acordo com as tabelas de
breakpoints clínicos do CLSI (107) e a CMI foi comparada com os ECOFFs
(epidemiological cut-off value) propostos pelo EUCAST (108) para cada
espécie/género.
43
4. Resultados e Discussão
4.1. Avaliação da qualidade e segurança microbiológica
A avaliação da carga total de microrganismos mesófilos é um parâmetro que
tem sido utilizado para avaliação da qualidade microbiológica do pescado, quer
em países europeus, quer no Japão e EUA (109). Este parâmetro não está
diretamente relacionado com a segurança, mas é indicativo da qualidade dos
alimentos, uma vez que é influenciado por diversos fatores desde a produção à
comercialização, incluindo a temperatura de armazenamento (29).
No presente estudo, verificou-se na contagem de microrganismos aeróbios
mesófilos que todas as amostras de trutas apresentaram valores superiores a
3,0x103 UFC/g. Estes valores encontram-se dentro dos valores estimados para
peixe fresco inteiro (102-106 UFC/g) (29). Relativamente às amostras de águas da
truticultura, os resultados foram semelhantes aos das amostras do peixe, mas
sendo amostras ambientais não foram encontrados critérios referentes à carga
total de microrganismos aeróbios mesófilos. A legislação portuguesa apenas
contempla a análise de alguns parâmetros da água à entrada do sistema (ex.:
temperatura, oxigénio dissolvido, nitritos, pH, sólidos suspensos totais) que é feita
mensalmente (à exceção da medição da temperatura da água, que é feita
semanalmente) através da entrega das amostras de água a uma entidade externa
à de produção e fiscalizada pela Direção-Geral das Florestas ou pela Direção
Regional do Ambiente, segundo o Decreto-Lei N.º 236/98 (110).
Neste estudo, verificou-se que todas as amostras, quer as recolhidas na
truticultura (6 amostras de águas, 1 de ração e 2 de trutas), quer as provenientes
de supermercado (25 amostras de trutas) se apresentaram negativas
44
relativamente à presença dos microrganismos patogénicos pesquisados,
Salmonela e Listeria monocytogenes. De facto, o peixe raramente tem sido
implicado em casos/surtos de doenças bacterianas de origem alimentar na
Europa, comparativamente com outros alimentos, como os produtos cárneos e
ovos (41). No entanto, dados publicados por diferentes organismos internacionais
de vigilância (EFSA, FDA, OMS e FAO) revelam que diferentes estirpes de
Salmonella têm sido associadas ao pescado, incluindo de aquacultura, sendo
confirmada a sua origem exógena, e o seu consumo associado a infeções em
humanos (8, 46, 71, 111, 112). Por exemplo, um estudo realizado nos EUA, em 2005,
demonstra uma elevada prevalência de Salmonella spp. em amostras de ostras
de aquacultura. Também em diversos países (ex.: África do Sul, EUA, Turquia e
Índia) estudos com diferentes espécies de pescado de aquacultura, não incluindo
a truta, detetaram isolados de Salmonella (59, 113-116). Segundo um relatório da FAO
sobre aquacultura, de 2010, nos países em vias de desenvolvimento o ambiente
aquático é uma potencial fonte de contaminação por Salmonella (117).
Relativamente a Listeria monocytogenes, apesar de ser uma bactéria
disseminada no ambiente e com capacidade de crescimento a temperaturas mais
baixas (psicrotrófica) do que a Salmonella, poucos casos têm sido associados ao
consumo de pescado de aquacultura na Europa (41). No entanto, um estudo feito
na Finlândia, em 2005, com 510 trutas arco-íris provenientes de produção
aquícola (água salgada e doce) revelou que cerca de 9% das amostras continham
L. monocytogenes, localizada principalmente nas guelras, o que representa um
excelente meio de cultura para as bactérias. A prevalência de L. monocytogenes
nas guelras superior à da pele ou vísceras é considerada normal, visto que se
tratam dos primeiros órgãos a ficar contaminados quando grandes volumes de
45
água contaminada são filtrados através delas, indicando que possivelmente a
água da aquacultura estava contaminada com esta bactéria patogénica (118).
Relativamente ao bioindicador/indicador de higiene E. coli, verificou-se a sua
presença em 48% (n=13/27) das amostras de peixe, provenientes, quer da
truticultura, quer de sete dos oito supermercados analisados. Das outras amostras
colhidas da truticultura também se verificou a presença de E. coli em 5 amostras
ambientais (água a montante e a jusante da aquacultura; água na entrada e saída
da aquacultura e água do tanque das trutas adultas), sendo as restantes amostras
(ração das trutas e água de outro tanque de adultos) negativas para este
parâmetro. Um estudo realizado numa região estuarina de Massachussetts
(EUA), em 1988, utilizou isolados de Escherichia coli provenientes de amostras
fecais humanas para avaliar a sua evolução quando colocadas nas condições do
ambiente aquático, simulando a evolução desta bactéria que muitas vezes se
encontra naturalmente no ambiente aquático devido à sua contaminação por
matéria fecal. Neste estudo verificou-se a sobrevivência prolongada e proliferação
da espécie E. coli, cuja concentração aumentava com o aumento da temperatura
da água e com a disponibilidade de nutrientes presentes no ambiente aquático ou
utilização de reservas endógenas (61). Outro estudo realizado com carpas na
Turquia, em 2011, que também utilizou a Escherichia coli como bioindicador de
contaminação fecal, revelou a presença da bactéria em 88% das amostras
estudadas (115). A utilização desta bactéria é útil como indicadora de contaminação
fecal e más práticas de manipulação do pescado porque estes microrganismos
não estão naturalmente presentes nestes alimentos (48). Tendo em conta que,
aparentemente, os manipuladores do supermercado cumpriam as regras e boas
práticas de manipulação do pescado, a presença de E. coli, quer nas amostras de
46
águas da truticultura, quer nas de trutas à venda, sugere uma possível
contaminação no local de produção, por exemplo através das águas
contaminadas por matéria fecal (ex. água a montante).
Das amostras positivas foram confirmados como sendo E. coli e
selecionados para ensaios posteriores 37 isolados, sendo 8 provenientes das 5
amostras de águas da truticultura, 2 provenientes de 2 amostras de trutas de
aquacultura e 27 provenientes de 11 amostras de trutas de supermercado. A
maioria dos isolados de E. coli foi obtida das placas de meio seletivo sem
antibióticos (n=24), sendo os restantes obtidos das placas com ciprofloxacina
(n=13). Relativamente à estrutura populacional destes isolados obtida após
análise dos grupos filogenéticos (106) verificou-se a presença de isolados dos
grupos A0 (6/37; 16%), A1 (6/37; 16%), B1 (16/37; 43%), B2 (1/37;3%) e D (8/37;
22%) (Figura 15), disseminados em diferentes tipos de amostras. A maioria dos
isolados de E. coli pertence aos grupos filogenéticos A e B1, considerados
habitualmente comensais de animais e de humanos, tal como descrito por outros
autores para amostras alimentares e ambientais (119-126). Por outro lado, salienta-
se a presença de isolados dos grupos B2 e D, frequentemente associados com
infeções extraintestinais (ex. urinárias, septicemia, meningite) (125-128), em
amostras de trutas da aquacultura e de supermercado, sugerindo possível
contaminação fecal humana (119, 121, 128), eventualmente associada a práticas de
contaminação cruzada durante a cadeia de produção/distribuição,
armazenamento e venda do pescado. Atualmente, vários autores defendem uma
origem alimentar ou um elevado potencial de transmissão ao Homem pela cadeia
alimentar de algumas linhagens de E. coli de diversos grupos filogenéticos (ex.
47
clone D/ST69) (129, 130), sendo o papel do pescado nesta problemática ainda pouco
explorado.
Figura 15. Distribuição dos isolados de E. coli (n=37) por grupos filogenéticos e tipo de amostra
4.2. Deteção e caraterização de bactérias resistentes aos antibióticos
4.2.1. Escherichia coli
O estudo da suscetibilidade aos antibióticos foi efetuado nos isolados de E.
coli, uma vez que é a bactéria habitualmente utilizada pelos sistemas de vigilância
de resistência (131, 132). Dos 37 isolados estudados, 19 (51%) apresentaram-se
resistentes a pelo menos um dos antibióticos, representativos de 13 das 18
amostras. Assim, todos os isolados (n=10) provenientes das amostras da
truticultura (7 amostras: 5 de águas e 2 de trutas) foram resistentes a pelo menos
um dos antibióticos, comparativamente com 9 de 27 isolados provenientes das
trutas de supermercado (correspondendo a 6 das 11 amostras).
Uma vez que as etapas de enriquecimento e os diferentes meios de cultura
utilizados podem potencialmente selecionar mais do que um isolado da mesma
48
estirpe na mesma amostra, foram selecionados 23 isolados de diferentes grupos
filogenéticos e/ou perfis fenotípicos de resistência a antibióticos para posteriores
análises. Na Tabela 2 apresentam-se os diversos perfis de resistência aos
antibióticos testados por grupo filogenético e tipo de amostra. A resistência aos
antibióticos encontra-se disseminada pelos diversos grupos filogenéticos de E.
coli detetados, não se associando especificamente a nenhum deles.
Relativamente à origem das amostras verifica-se que os isolados obtidos de trutas
de supermercado se apresentaram mais frequentemente sensíveis a todos os
antibióticos testados comparativamente aos isolados de trutas de aquacultura e
das amostras de água obtidas nesse local de produção.
Os isolados estudados apresentaram resistência ao ácido nalidíxico (n=12/23;
52%), amoxicilina (n=9/23; 39%), tetraciclina (n=9/23; 39%), sulfametoxazole
(n=6/23; 26%), ciprofloxacina (n=5/23; 22%), estreptomicina (n=5/23; 22%),
trimetoprim (n=5/23; 22%) e/ou cloranfenicol (n=2/23; 9%) (Figura 16 e Tabela 2).
Todos os isolados apresentaram suscetibilidade aos aminoglicosídeos,
canamicina e gentamicina e aos β-lactâmicos de espetro alargado e ausência de
testes do duplo sinergismo positivos (Figura 16). Estes índices de resistência a
antibióticos, apesar de não serem muito elevados, são de destacar, tendo em
conta que se trata de antibióticos considerados “clinicamente relevantes”, como
quinolonas (ciprofloxacina e ácido nalidíxico), penicilinas (amoxicilina) e
aminoglicosídeos (estreptomicina), ou de “elevada importância” (caso do
sulfametoxazole, trimetoprim e cloranfenicol), que são frequentemente utilizados
no tratamento de infeções graves (71, 81).
49
Tabela 2. Perfis de resistência aos antibióticos dos isolados de E.coli (n=23)
Antibióticos
a
Ʃn (%) GFb
Amostras
Aquacultura Trutas Supermercado
(n=14) AML CIP CLO GEN KAN NAL STR SUL TET TRI Águas (n=7)
Trutas (n=2)
S R S S S R S R R S 2 (9%) B1 2
R S S S S R S S S S 1 (4%) A1 1
R S S S S S S S S S 2 (9%) A1, B1 1
1
R S S S S R S S R R 1 (4%) A1 1
R S S S S R S R S R 1 (4%) B1 1
R S S S S R S R R R 1 (4%) A1 1
R R S S S R R S R R 1 (4%) A0
1
R R R S S R R R R R 1 (4%) B2
1
S S S S S R S S S S 3 (13%) A0, D
3
R R R S S R R R R S 1 (4%) A0
1
S S S S S S R R R S 1 (4%) B1
1
S S S S S S R S R S 1 (4%) A1
1
S S S S S S S S S S 7 (30%) A0, B1, D
7
Totais: 9
(39%) 5
(22%) 2
(9%) 0
(0%) 0
(0%) 12
(52%) 5
(22%) 7
(30%) 9
(39%) 5
(22%) 23
(100%)
7 2 14
16
23 a AML, amoxicilina; CIP, ciprofloxacina; CLO, cloranfenicol; GEN, gentamicina; KAN, canamicina; STR, estreptomicina; SUL, sulfametoxazole; TET, tetraciclina; TRI, trimetoprim. R, Resistente; S, Sensível.
b GF, Grupo Filogenético.
50
Figura 16. Ocorrência da resistência aos antibióticos nos isolados de E. coli (n=23) por tipo de amostra
51
A ampla utilização de agentes antimicrobianos em clínica humana e na
produção animal (profilaxia e tratamento de infeções nos animais), incluindo em
aquaculturas, a nível mundial, pode ser a justificação para a presença destes
índices de resistência detetados a diferentes famílias de antibióticos (71, 81). Vários
autores indicam que a utilização de antibióticos no setor da produção aquícola
deverá estar na origem do aumento da resistência bacteriana (133-135). Quando os
antimicrobianos são administrados oralmente aos peixes através da ração, parte
dos antibióticos/ração pode não ser consumida pelos animais, permanecendo no
ambiente aquático (67). Assim, os animais criados nesse ambiente, contaminado
com resíduos de antibióticos, ficam sujeitos a uma maior pressão seletiva que
contribui para a seleção de estirpes resistentes e para a disseminação de genes
de resistência a antibióticos por mecanismos de transferência horizontal para
outras bactérias (68, 71, 73).
De facto, as aquaculturas são um dos tipos de produção animal onde o uso de
antibióticos é significativo, principalmente em países asiáticos, onde se situam os
maiores produtores de pescado e onde há uma menor regulamentação do seu
uso, ao contrário de regiões como a União Europeia, onde habitualmente são
aplicadas medidas de controlo e segurança, sendo o uso de antibióticos integrado
no programa de saúde animal e apenas permitido para tratar as doenças
infeciosas no peixe (controlar e/ou eliminar microrganismos patogénicos) (71, 73, 75).
Por exemplo, em 2008, um estudo realizado com pescado de aquacultura revelou
que isolados provenientes de amostras de tilápia (peixe do género Tilapia) de
países asiáticos eram mais resistentes aos antibióticos testados (Ex.: ampicilina,
cefotaxima, gentamicina, trimetoprim) do que as amostras provenientes da
Holanda (136).
52
Nos isolados de E. coli caracterizados neste estudo foram detetados genes
adquiridos que codificam para resistência à amoxicilina (blaTEM), tetraciclina
tet(A); tet(B), cloranfenicol (catA; floR), ciprofloxacina (qnrS1), aminoglicosídeos
(strA-strB) e sulfametoxazole (sul1; sul2), alguns dos quais inseridos em
integrões de classe 1. Da caracterização da região variável dos integrões foi
possível classificá-los em 3 tipos: integrão de 1000 bp com dfrA1-aadA (amostra
de água do tanque), integrão atípico apenas com intl1-dfrA1 (amostra de água à
saída do sistema) e integrão de 1500 bp com dfrA1-aadA1 (amostra de água a
jusante). Os integrões podem estar associados a resistência a múltiplos
antibióticos, uma vez que ao longo do tempo e na sua região variável pode
ocorrer a inserção de diversas cassetes de genes com resistência a diferentes
antimicrobianos (137). Este facto favorece a co seleção, em que o uso de um único
antibiótico pode selecionar não só isolados resistentes a esse antibiótico, como
também isolados resistentes a outros antibióticos, favorecendo a persistência de
genes de resistência e aumentando a oportunidade de transmissão, pois se os
integrões estiverem associados a elementos genéticos móveis (plasmídeos e
transposões) pode ocorrer a sua transferência para outras bactérias (73, 138). Os
integrões de classe 1 são considerados elementos genéticos mobilizáveis por
poderem ser facilmente transferidos entre diferentes espécies de bactérias devido
à sua localização frequente em plasmídeos e transposões (139). Este tipo de
integrões tem sido descrito em isolados de E. coli, Salmonella e outras
Enterobacteriaceae, obtidos de diferentes nichos ecológicos (humanos, ambiente,
aves, suínos) e países, incluindo Portugal (140, 141).
Relativamente aos genes de resistência a antibióticos clinicamente relevantes,
verificou-se que não foram detetados genes que codificam para ESBL, apesar de
53
já ter sido detetado um clone de E. coli produtor da ESBL SHV-12 em diversas
amostras de uma aquacultura em Portugal (142). Também em 2012, num estudo
realizado na China, foram detetados isolados de E. coli produtores de β-
lactamases (CTX-M-14, CTX-M-79 e SHV-27) em amostras de peixe de
aquacultura (143). No entanto, as evidências de E. coli produtoras de ESBLs em
aquaculturas e seus produtos são raras, em contraste com outros nichos (animais
e humanos) (144). No entanto, foi detetado em dois isolados multi-resistentes
(amoxicilina, ácido nalidíxico, sulfametoxazole, tetraciclina e trimetoprim) de E.
coli, provenientes de amostras de água à entrada do sistema e a jusante da
aquacultura, o gene qnrS1, um dos genes de resistência a quinolonas
habitualmente associado a plasmídeos (PMQR – plasmid-mediated quinolone
resistance).
Os genes qnrS são dos PMQRs mais descritos, sendo que em 2011, o gene
qnrS1 foi detetado em isolados de E. coli provenientes de amostras de
suiniculturas portuguesas (145). Adicionalmente, este gene também já foi descrito
em Salmonella enterica, Shigella flexneri, Enterobacter clocae e Klebsiella
pneumoniae em diferentes países, incluindo Portugal, fundamentalmente em
amostras de humanos e de aves para consumo, mas também de pescado
importado de países asiáticos (146-150). A deteção do gene qnrS1 em E. coli de
diferentes amostras de água obtidas na aquacultura sugere a possibilidade de
disseminação ao Homem através do consumo de pescado e/ou contacto direto
com água contaminada.
54
4.2.2. Outras Enterobacteriaceae
Para além dos isolados de E. coli foram selecionadas outras bactérias da
família Enterobacteriaceae para estudos de caracterização da resistência
adquirida a antibióticos considerados clinicamente relevantes em medicina
humana, como as cefalosporinas de espetro alargado e as fluoroquinolonas (81).
Com o objetivo de caracterização de genes de resistência adquirida aos β-
lactâmicos de largo espetro foram selecionados 146 isolados provenientes das
placas suplementadas com cefotaxima (n=63) e ceftazidima (n=83),
representativos da totalidade de amostras em estudo (6 de águas, 1 de ração e
27 de trutas). Neste estudo não foram detetados isolados portadores de genes de
resistência adquirida a β-lactâmicos de espetro alargado (blaTEM, blaSHV e blaCTX-
M), apesar de já terem sido detetados em isolados de Enterobacteriaceae de
amostras ambientais de uma aquacultura (142) e em outros nichos ecológicos em
Portugal (Ex.: aves e suínos) (140). De facto, vários autores salientam a cadeia
alimentar, nomeadamente os animais de produção, como potenciais reservatórios
de bactérias Gram negativo resistentes a ESBL (151, 152).
As ESBLs conferem resistência a vários antibióticos β-lactâmicos e estão
normalmente associadas a plasmídeos os quais podem ser facilmente
transferíveis entre os isolados do mesmo nicho (153). Neste grupo de antibióticos
destacam-se as cefalosporinas de 3ª e 4ª geração consideradas clinicamente
relevantes, dado que são utilizadas na produção animal e, ao mesmo tempo, são
das poucas soluções para o tratamento de infeções provocadas por
Enterobacteriaceae, incluindo causadas por bactérias zoonóticas como
Salmonella (81, 144).
55
Relativamente ao estudo dos genes de resistência adquiridos a
fluoroquinolonas foram selecionados 81 isolados das placas suplementadas com
ciprofloxacina, representativos da totalidade de amostras recolhidas na truticultura
(6 de águas, 2 de trutas e 1 de ração) e de 23 amostras de trutas de
supermercado (de um total de 25). Foram detetados diferentes genes designados
habitualmente por PMQR dispersos em diversas amostras (truticultura e trutas) e
espécies da família Enterobacteriaceae (E. coli, Hafnia alvei, Proteus vulgaris e do
complexo Citrobacter freundii), num total de 8 isolados (10%) (Tabela 3). Apesar
de todos os isolados serem considerados clinicamente suscetíveis à
ciprofloxacina (Tabela 3) pelos critérios do CLSI (107), apresentaram
concentrações mínimas inibitórias superiores aos ECOFF (epidemiological cut-off
value) propostos pelo EUCAST para as respetivas espécies (Proteus vulgaris,
Hafnia alvei e E. coli) ou géneros (Citrobacter spp.) (154). Adicionalmente, todos os
isolados com PMQR apresentaram resistência a um ou mais antibióticos de
outras famílias, o que poderá facilitar a sua co seleção no ambiente de produção
aquático.
Os genes PMQR têm sido descritos em diferentes géneros de bacilos Gram
negativo, particularmente da família Enterobacteriaceae, e em diversos nichos
ecológicos (hospital, comunidade, animais, ambiente e alimentos) e localizações
geográficas (60, 70, 87, 143, 155, 156). No ambiente aquático de diferentes países (Japão,
Taiwan, França – rio Sena), também já foram detetados isolados de diferentes
espécies (Ex.: Aeromonas spp., Enterobacter cloacae, E. coli) produtores de
genes de resistência a fluoroquinolonas mediados por plasmídeos (Ex.: qnrA1,
qnrB2, qnrS1, qnrS2) (92, 157, 158). Em aquaculturas, os estudos são escassos, mas
mesmo em Portugal já foram detetados genes PMQR em isolados de amostras
56
ambientais e de trutas de aquacultura, tais como qnrS2, qnrS3, variantes de qnrB
e oqxAB (159).
Neste estudo foram detetadas duas variantes do gene qnrS, qnrS1 em E. coli
de 2 amostras de água (água à entrada da truticultura e no rio a jusante),
descritos no capítulo anterior (4.2.1) e qnrS2 em Hafnia alvei em 2 amostras de
trutas de dois supermercados. Várias variantes do gene qnrS têm sido detetadas
fundamentalmente em bactérias da família Enterobacteriaceae isoladas de
amostras clínicas de hospitais de diversos países (92, 147, 160, 161). Em Portugal, o
gene qnrS2 foi detetado, em 2012, em isolados de Aeromonas spp., provenientes
de amostras de águas de aquacultura (159). Adicionalmente, também noutras
amostras de origem aquática têm sido detetadas bactérias produtoras de qnrS,
como por exemplo, num estudo efetuado com amostras de água de diferentes
pontos do rio Seine (Paris, França) foram detetados isolados de Aeromonas
punctata e Aeromonas media portadores do gene qnrS2, sugerindo que estas
bactérias possam estar a funcionar como um reservatório destes genes PMQR
(158).
A bactéria Hafnia alvei pode ser isolada de fezes de indivíduos aparentemente
saudáveis assim como de mamíferos em geral, pássaros, répteis e peixe, mas
também pode ser encontrada no ambiente (solo, água e esgotos) (162). Assim, a
deteção do gene qnrS2 em isolados de Hafnia alvei obtidos de trutas de
supermercado poderá sugerir que a bactéria já se encontrava no peixe desde o
local de produção (ex. contaminação do peixe a partir do reservatório aquático).
57
Tabela 3. Caracterização dos isolados de Enterobacteriaceae com genes PMQR
Genes PMQR Espécie Nº
isolados Data
Origema
amostra Fenótipo
b (genótipo) de resistência
CMI ciprofloxacina (µg/mL)
c
qnrS1 Escherichia coli 2 Mai-12 TA AML (blaTEM), NAL, SUL (sul1), TET (tetA), TRI 0,25 d
qnrS2 Hafnia alvei 2 Jun-12 SM I, SM VII AMC, AML, CLO (floR), NAL, STR (strA-strB), SUL (sul1) 0,25 d
qnrD Proteus vulgaris 1 Jun-12 SM IV AML, TET 0,25 d
qnrB10 Citrobacter
freundii 2 Mai-12 TA NAL, TET (tetA) 0,5
d
nova variante qnrB
Citrobacter freundii
1 Mai-12 SM VI NAL, STR (aadA), TET 0,38 d
a TA- Aquacultura; SM, Supermercado (I a VIII)
b AML, amoxicilina; CLO, cloranfenicol; NAL, ácido nalidíxico; STR, estreptomicina; SUL, sulfametoxazole; TET, tetracicline; TRI, trimetoprim. Resistência Natural
c CMI, Concentração mínima inibitória
d CMI superior ao ECOFF para a espécie (EUCAST)
(154) - Escherichia coli: ≤ 0,064; Hafnia alvei: ≤ 0,125; Proteus vulgaris: ≤ 0,064; Citrobacter spp.: ≤ 0,125
58
O gene qnrD, o gene qnr mais recentemente descrito num isolado de
Salmonella de uma amostra de origem humana (161), foi neste estudo detetado
num isolado de Proteus vulgaris proveniente de uma amostra de truta de
supermercado. Ao contrário do gene qnrS que se encontra largamente
disseminado, o gene qnrD ainda tem sido raramente descrito noutras
Enterobacteriaceae. Em 2011, foi detetado em isolados clínicos de Proteus
mirabilis e de Morganella morganii em Itália (163). Em 2012, na China, o gene qnrD
foi detetado num isolado de Proteus vulgaris obtido de uma amostra clínica de um
hospital (164) e, mais recentemente em abril de 2013, em isolados de E. coli
provenientes de amostras de produtos cárneos e de humanos do mesmo país
(165). Tanto quanto sabemos esta é a primeira vez que é detetado em isolados de
pescado, neste caso, trutas de aquacultura.
Também importante foi a ocorrência de 2 variantes do gene qnrB (qnrB10 e
uma nova variante de qnrB ainda não classificada) em isolados do complexo de
espécies de Citrobacter freundii obtidas de amostras de trutas à venda em
supermercados. O gene qnrB é o mais frequentemente detetado em espécies de
Citrobacter (166), tendo sido em Portugal descrita a presença de diferentes
variantes em isolados do complexo Citrobacter freundii obtidos de amostras de
água não tratada para consumo humano (167) e em truticulturas (159). Devido à
diversidade de variantes de qnrB detetadas em Citrobacter spp. e à sua
localização ser habitualmente cromossómica tem sido sugerido que este género
possa ser a origem dos genes qnrB, disseminados em diversas bactérias Gram
negativo patogénicas, e um importante hotspot para a evolução dos mesmos (166).
59
5. Conclusões
1) As trutas disponíveis para consumo humano não revelaram constituir uma
fonte das bactérias patogénicas Listeria monocytogenes e Salmonella,
apesar de 48% das amostras conterem o bioindicador de contaminação fecal
E. coli.
2) A caraterização de E. coli (de diversos grupos filogenéticos) e de outras
Enterobacteriaceae indica que as trutas disponíveis para consumo humano
podem constituir um potencial veículo de bactérias/genes de resistência a
antibióticos com relevância clínica.
3) A deteção de Enterobateriaceae portadoras de genes PMQR, incluindo uma
nova variante de qnrB, em diversas amostras da truticultura e de trutas de
supermercado reforça a importância do nicho aquático como reservatório e
do pescado como veículo de bactérias/genes potencialmente relevantes em
medicina humana.
4) Este estudo realça a necessidade de avaliar a ocorrência da resistência a
antibióticos associada com peixe de aquacultura e compreender melhor os
possíveis fatores que contribuem para a presença de bactérias
multirresistentes nas unidades de produção aquícola. Adicionalmente,
reforça a necessidade de formação de todos os intervenientes na cadeia
alimentar, incluindo das unidades de alimentação coletiva, no sentido da
prevenção e controlo da contaminação bacteriana, através do uso de
temperaturas adequadas de confeção e de práticas que evitem a
contaminação cruzada, com o objetivo de evitar a disseminação destas
bactérias portadoras de genes de resistência a antibióticos.
60
61
6. Referências Bibliográficas
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160. Bou G, Cartelle M, Tomas M, Canle D, Molina F, Moure R, et al. Identification and Broad Dissemination of the CTX-M-14 b-Lactamase in Different Escherichia coli Strains in the Northwest Area of Spain. Journal of Clinical Microbiology. 2002; 40(11):4030-36. 161. Cavaco LM, Hansen DS, A F-M, Aarestrup FM, Hasman H, Frimodt-Møller N. First detection of plasmid-mediated quinolone resistance (qnrA and qnrS) in Escherichia coli strains isolated from humans in Scandinavia. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2007; 59(4):804-05. 162. McBee ME, Schauer DB. The Genus Hafnia. 3 ed. Dworkin M, Falkow S. The Prokaryotes: Vol 6: Proteobacteri: Gamma Subclass. 2006. 215-18. 163. Mazzariol A, Kocsis B, Koncan R, Kocsis E, Lanzafame P, Cornaglia G. Description and plasmid characterization of qnrD determinants in Proteus mirabilis and Morganella morganii. Clinical Microbiology and Infection. 2011; 18(3):46-48. 164. Hu Y-y, Cai J-c, Zhang R, Zhou H-w, Sun Q, Chen G-x. Emergence of Proteus mirabilis Harboring blaKPC-2 and qnrD in a Chinese Hospital. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2012; 56(5):2278-82. 165. Zhang S, Sun J, Liao XP, Hu QJ, Liu BT, Fang LX, et al. Prevalence and Plasmid Characterization of the qnrD Determinant in Enterobacteriaceae Isolated from Animals, Retail Meat Products, and Humans. Microbial Drug Resistance. 2013 166. Jacoby GA, Griffin C, Hooper DC. Citrobacter spp. as a source of qnrB alleles. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2011; 55(11):4979-84. 167. Ribeiro T, Silva R, Novais A, Novais C, Sousa J, Peixe L. Untreated warter for human consumption as a reservoir of clinically relevante antibiotic resistance genes an Escherichia coli clones. In: Antimicrobial Resistance in Zoonotic Bacteria and Foodborne Pathogens in Animals, Humans, and the Environment; Aix-en-Provence, France. ASM Conferences; 2012. 168. Wang R-F, Cao W-W, Cerniglia CE. PCR Detection and Quantitation of Predominant Anaerobic Bacteria in Human and Animal Fecal Samples. Applied and Environmental Microbiology. 1996; 62(4):1242-47.
72
73
Anexos
Tabela 4. Descrição e sequências nucleotídicas dos primers, reagentes, condições de amplificação e tamanho do produto esperado para as diferentes
reações de PCR.
Objetivo Primers Reagentes Condições de Amplificação
Tamanho do Produto (bp)
Referências
Identificação da espécie por 16S rDNA
SEQA
AGA GTT TGA T…yTy AGA
SEQB
ACG yTA CCT T...GAC TTC
PCR Super MIx (Invitrogen®);
0,3 µM de cada Primer e 2 µl de DNA
95°C - 10 minutos (1 ciclo); 94°C - 30 segundos, 55°C - 1 minuto, 72°C - 2 minutos (30 ciclos); 72°C - 10 minutos (1 ciclo)
Variável (105)
Pesquisa de Escherichia coli
ECO 1
GACCTCGGTTTAGTTCACAGA
ECO 2
CACACGCTGACGCTGACCA
Tampão 1x; MgCL2; dNTPs; Primers; Go Taq
® DNA
Polymerase (Volume final = 23µL+2µL DNA)
94ºC – 15 segundos (1 ciclo); 94ºC – 3 segundos, 50ºC - 10 segundos, 74ºC – 35 segundos (35 ciclos); 74ºC – 2 minutos, 45ºC – 2 segundos (1 ciclo)
585bp (168)
Pesquisa dos grupos filogenéticos de Escherichia coli
ChuA.1
GACGAACCAACGGTCAGGAT
ChuA.2
TGCCGCCAGTACCAAAGACA
YjaA.1
TGAAGTGTCAGGAGACGCTG
YjaA.2
ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC
TspE4C2.1
GAGTAATGTCGGGGCATTCA
TspE4C2.2
CGCGCCAACAAAGTATTACG
Tampão 1x; 1,5 mM de MgCl2; 200 µM de cada dNTP; Primer 0,2 µM de cada; Go Taq
® DNA
Polymerase 0,5U (Promega) e 2 µl de DNA
94°C - 5 minutos (1 ciclo); 94°C - 30 segundos, 55°C - 30 segundos, 72°C - 30 segundos (30 ciclos); 72°C - 7 minutos (1 ciclo)
ChuA – 279bp
YjaA – 211bp
TspE4C2 – 152bp
(106)
Pesquisa de integrões de classe 1
5’CS
GGCATCCAAGCAGCAAG PCR Super MIx (Invitrogen
®),
0,3 µM de cada Primer e 2 µl
94°C - 5 minutos (1 ciclo); 94°C - 1 minuto, 53°C - 1 minuto, 72°C - 6 minutos (35 ciclos);
Variável (100)
74
3’CS
AAGCAGACTTGACCTGA
de DNA 72°C - 16 minutos (1 ciclo)
Caracterização da zona variável dos integrões classe 1
DFRA12-R
GCATTGGGAAGAAGGCGTCAC
ANT(3’’)-IA-R
ATTGCCCAGTCGGCAGCG
PCR Super MIx (Invitrogen®),
0,3 µM de cada Primer e 2 µl de DNA
94°C - 5 minutos (1 ciclo); 94°C - 30 segundos, 58°C - 30 segundos, 72°C - 3 minuto (30 ciclos); 72°C - 5 minutos (1 ciclo)
Variável
(102)
(101)
DHFRL-R
AGCTGTTCACCTTTGGC
PCR Super MIx (Invitrogen®),
0,3 µM de cada Primer e 2 µl de DNA
94°C - 5 minutos (1 ciclo); 94°C - 30 segundos, 53°C - 30 segundos, 72°C - 3 minuto (30 ciclos); 72°C - 5 minutos (1 ciclo)
Variável (100)
Pesquisa de genes de resistência às sulfonamidas (sul1 e sul2) e integrase de classe 1 (intI 1)
SUL1-F
CGGCGTGGGCTACCTGAACG
SUL1-R
GCCGATCGCGTGAAGTTC
SUL2-F
GCGCTCAAGGCAGATGGCATT
SUL2-R
GCGTTTGATACCGGCACCCGT
INT-F
GCCACTGCGCCGTTACCACC
INT-R
GGCCGAGCAGATCCTGCACG
Tampão 1x; 1,5 mM de MgCl2; 200 µM de cada dNTP; Primer 0,2 µM de cada; Go Taq
® DNA
Polymerase 0,5U (Promega) e 2 µl de DNA
94°C - 5 minutos (1 ciclo); 94°C - 30 segundos, 69°C - 30 segundos, 72°C - 1 minuto (30 ciclos); 72°C - 8 minutos (1 ciclo)
sul1 – 433bp
sul2 – 293bp
intI1 – 898bp
(98)
Pesquisa do gene de resistência às sulfonamidas sul3
SUL3-F
CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA
SUL3-R
GAGCAAGATTTTTGGAATCG
PCR Super MIx (Invitrogen®),
0,3 µM de cada Primer e 2 µl de DNA
94°C - 5 minutos (1 ciclo); 94°C - 30 segundos, 52°C- 30 segundos, 72°C- 1 minuto (30 ciclos); 72°C- 8 minutos (1 ciclo)
sul3 – 789bp
(99)
Pesquisa de genes de resistência à tetraciclina (tetA, tetB e tetG)
tetA-F
GCTACATCCTGCTTGCCT
tetA-R
CATAGATCGCCGTGAAGA
tetB-F
TTGGTTAGGGGCAAGTTTTG
tetB-R
Tampão 1x; 1,5 mM de MgCl2; 200 µM de cada dNTP; Primer 0,2 µM de cada; Go Taq
® DNA
Polymerase 0,5U (Promega) e 2 µl de DNA
94 °C - 5 minutos (1 ciclo); 94°C - 30 segundos, 55°C - 30 segundos, 72°C - 1 minuto (30 ciclos); 72°C - 8 minutos (1 ciclo)
tetA – 210bp
tetB – 600bp
(97)
75
GTAATGGGCCAATAACACCG
tetG-F
GCTCGGTGGTATCTCTGC
tetG-R
AGCAACAGAATCGGGAAC
tetG – 500bp
Pesquisa de genes de resistência ao cloranfenicol (catA, cmlA e floR)
catA-F
CCACCGTTGATATATCCC
catA-R
CCTGCCACTCATCGCAGT
cmlA-F
TGTCATTTACGGCATACTCG
cmlA-R
ATCAGGCATCCCATTCCCAT
floR-F
CACGTTGAGCCTCTATAT
floR-R
ATGCAGAAGTAGAACGCG
Tampão 1x; 1,5 mM de MgCl2; 200 µM de cada dNTP; Primer 0,2 µM de cada; Super Hot Taq
® DNA
Polymerase 0,5U (GENAXXON) e 2 µl de DNA
94°C - 5 minutos (1 ciclo); 94°C - 30 segundos, 55°C - 30 segundos, 72°C- 1 minuto (30 ciclos); 72°C- 8 minutos (1 ciclo)
catA – 623bp
cmlA – 435bp
floR – 868bp
(97)
Pesquisa de genes de resistência à estreptomicina (strA e strB)
strA-F
CCTGGTGATAACGGCAATTC
strA-R
CCAATCGCAGATAGAAGG
Tampão 1x; 1,5 mM de MgCl2; 200 µM de cada dNTP; Primer 0,2 µM de cada; Go Taq
® DNA
Polymerase 0,5U (Promega) e 2 µl de DNA
94°C - 5 minutos (1 ciclo); 94°C - 30 segundos, 55°C - 30 segundos, 72°C - 1 minuto (30 ciclos); 72°C- 8 minutos (1 ciclo)
strA – 548bp
(97)
strB-F
ATCGTCAAGGGATTGAAACC
strB-R
GGATCGTAGAACATATTGGC
Tampão 1x; 1,5 mM de MgCl2; 200 µM de cada dNTP; Primer 0,2 µM de cada; Go Taq
® DNA
Polymerase 0,5U (Promega) e 2 µl de DNA
94°C - 5 minutos (1 ciclo); 94°C - 30 segundos, 58°C- 30 segundos, 72°C - 1 minuto (30 ciclos); 72°C- 8 minutos (1 ciclo)
strB – 509bp
Pesquisa de genes de resistência às quinolonas
qnrAm-F
AGAGGATTTCTCACGCCAGG
qnrAm-R
TGCCAGGCACAGATCTTGAC
Tampão 1x; MgCL2; dNTPs; Primers; Go Taq
® DNA
Polymerase (Volume final = 23µL+2µL)
94ºC – 10 minutos (1 ciclo); 94ºC – 1minuto, 64ºC – 1 minuto, 72ºC – 1 minuto (35 ciclos); 72ºC – 10 minutos (1 ciclo)
580bp (88)
qnrA-F
ATTTCTCACGCCAGGATTTG
Tampão 1x; MgCL2; dNTPs; Primers; Go Taq
® DNA
Polymerase (Volume final =
94ºC – 10 minutos (1 ciclo); 94ºC – 1minuto, 53ºC – 1 minuto, 72ºC – 1 minuto (35
580bp (89)
76
qnrA-R
GATCGGCAAAGGTTAGGTCA
23µL+2µL) ciclos); 72ºC – 10 minutos (1 ciclo)
qnrBm-F
GGMATHGAAATTCGCCACTG
qnrBm-R
TTTGCYGYYCGCCAGTCGAA
Tampão 1x; MgCL2; dNTPs; Primers; Go Taq
® DNA
Polymerase (Volume final = 19µL+2µL)
94ºC – 10 minutos (1 ciclo); 94ºC – 1minuto, 62ºC – 1 minuto, 72ºC – 1 minuto (35 ciclos); 72ºC – 10 minutos (1 ciclo)
264bp (88)
qnrB-F
GATCGTGAAAGCCAGAAAGG
qnrB-R
ACGATGCCTGGTAGTTGTCC
Tampão 1x; MgCL2; dNTPs; Primers; Go Taq
® DNA
Polymerase (Volume final = 23µL+2µL)
94ºC – 10 minutos (1 ciclo); 94ºC – 1minuto, 60ºC – 1 minuto, 72ºC – 1 minuto (35 ciclos); 72ºC – 10 minutos (1 ciclo)
600bp (89)
qnrC-F
GGGTTGTACATTTATTGAATC
qnrC-R
TCCACTTTACGAGGTTCT
Tampão 1x; MgCL2; dNTPs; Primers; Go Taq
® DNA
Polymerase (Volume final = 23µL+2µL)
94ºC – 10 minutos (1 ciclo); 94ºC – 1minuto, 52ºC – 1 minuto, 72ºC – 1 minuto (35 ciclos); 72ºC – 10 minutos (1 ciclo)
447bp (90)
qnrD-F
CGAGATCAATTTACGGGGAATA
qnrD-R
AACAAGCTGAAGCGCCTG
Tampão 1x; MgCL2; dNTPs; Primers; Go Taq
® DNA
Polymerase (Volume final = 23µL+2µL)
94ºC – 10 minutos (1 ciclo); 94ºC – 1minuto, 64ºC – 1 minuto, 72ºC – 1 minuto (35 ciclos); 72ºC – 10 minutos (1 ciclo)
600bp (91)
qnrS-Fc
GCAAGTTCATTGAACAGGGT
qnrS-Rc
TCTAAACCGTCGAGTTCGGCG
Tampão 1x; MgCL2; dNTPs; Primers; Go Taq
® DNA
Polymerase (Volume final = 23µL+2µL)
94ºC – 10 minutos (1 ciclo); 94ºC – 1minuto, 56ºC – 1 minuto, 72ºC – 1 minuto (35 ciclos); 72ºC – 10 minutos (1 ciclo)
428bp (88)
qnrS-F
CAATCATACATATCGGCACC
qnrS-R
TCAGGATAAACAACAATACCC
Tampão 1x; MgCL2; dNTPs; Primers; Go Taq
® DNA
Polymerase (Volume final = 23µL+2µL)
94ºC – 10 minutos (1 ciclo); 94ºC – 1minuto, 64ºC – 1 minuto, 72ºC – 1 minuto (35 ciclos); 72ºC – 10 minutos (1 ciclo)
657bp (92)
qepA-F
CGTGTTGCTGGAGTTCTTC
qepA-R
CTGCAGGTACTGCGTCATG
Tampão 1x; MgCL2; dNTPs; Primers; Go Taq
® DNA
Polymerase (Volume final = 23µL+2µL)
94ºC – 10 minutos (1 ciclo); 94ºC – 1minuto, 56ºC – 1 minuto, 72ºC – 1 minuto (35 ciclos); 72ºC – 10 minutos (1 ciclo)
502bp
(93)
ACC6’-F
TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTA
Tampão 1x; MgCL2; dNTPs; Primers; Go Taq
® DNA
Polymerase (Volume final =
94ºC – 10 minutos (1 ciclo); 94ºC – 1minuto, 66ºC – 1 minuto, 72ºC – 1 minuto (35
482bp
77
ACC6’-R
CTCGAATGCCTGGCGTGTTT
23µL+2µL) ciclos); 72ºC – 10 minutos (1 ciclo)
oqxA-F
CTTGCACTTAGTTAAGCGCC
oqxA-R
GAGGTTTTGATAGTGGAGGTAGG
Tampão 1x; MgCL2; dNTPs; Primers; Go Taq
® DNA
Polymerase (Volume final = 23µL+2µL)
94ºC – 10 minutos (1 ciclo); 94ºC – 1minuto, 62ºC – 1 minuto, 72ºC – 1 minuto (35 ciclos); 72ºC – 10 minutos (1 ciclo)
392bp
(94)
oqxB-a
GCGGTGCTGTCGATTTTA
oqxB-s
TACCGGAACCCATCTCGAT
Tampão 1x; MgCL2; dNTPs; Primers; Go Taq
® DNA
Polymerase (Volume final = 23µL+2µL)
94ºC – 10 minutos (1 ciclo); 94ºC – 1minuto, 64ºC – 1 minuto, 72ºC – 1 minuto (35 ciclos); 72ºC – 10 minutos (1 ciclo)
512bp
Pesquisa de genes de resistência a beta-lactamases
TEM-F
ATGAGTATTCAACATTTCCG
TEM-R
CTGACAGTTACCAATGCTTA
Tampão 1x; MgCL2; dNTPs; Primers; Go Taq
® DNA
Polymerase (Volume final = 19µL+2µL)
94ºC – 5 minutos (1 ciclo); 95ºC – 1minuto, 58ºC – 1 minuto, 72ºC – 1 minuto (35 ciclos); 72ºC – 7 minutos (1 ciclo)
900bp (95)
SHV-1
GGGTTATTCTTATTTGTCGC
SHV-2
TTAGCGTTGCCAGTGCTC
Tampão 1x; MgCL2; dNTPs; Primers; Go Taq
® DNA
Polymerase (Volume final = 19µL+2µL)
94ºC – 5 minutos (1 ciclo); 95ºC – 1minuto, 56ºC – 1 minuto, 72ºC – 1 minuto (35 ciclos); 72ºC – 7 minutos (1 ciclo)
930bp
(96)
CTX-M group F
TTTGCGATGTGCAGTACCAGTAA
CTX-M group R
CGATATCGTTGGTGGTGCCATA
Tampão 1x; MgCL2; dNTPs; Primers; Go Taq
® DNA
Polymerase (Volume final = 19µL+2µL)
94ºC – 2 minutos (1 ciclo); 95ºC – 20 segundos, 53ºC – 30 segundos, 72ºC – 30 segundos (35 ciclos); 72ºC – 3 minutos (1 ciclo)
544bp
