Avaliação da toxicidade ambiental do agrotóxico Glifosato ... · susceptível a este tipo de...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS CENTRO DE ENGENHARIAS

CURSO DE ENGENHARIA AMBIENTAL E SANITÁRIA

Trabalho de Conclusão de Curso

Avaliação da toxicidade ambiental do agrotóxico Glifosato em solo utilizando como bioindicador

minhocas da espécie Eisenia andrei.

Bettina Rodrigues Machado

Pelotas, 2016

BETTINA RODRIGUES MACHADO

Avaliação da toxicidade ambiental do agrotóxico Glifosato em solo utilizando como bioindicador

minhocas da espécie Eisenia andrei.

Trabalho acadêmico apresentado ao Curso de Engenharia Ambiental e Sanitária, da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Engenheiro Ambiental e Sanitarista.

Orientadora: Profª. Drª. Vanessa Sacramento Cerqueira

Pelotas, 2016

Banca examinadora:Profª. Drª. Vanessa Sacramento Cerqueira - Centro de Engenharias/UFPel - OrientadoraProfª. Drª. Adriana Silva Manetti - Centro de Engenharias/UFPelProfª. Drª Cláudia Lemons e Silva - Centro de Engenharias/UFPel

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a minha família em especial a minha mãe e minha

irmã, pela dedicação, preocupação e incentivo.

Aos meus amigos por sempre entenderem o motivo da minha ausência.

Á minha orientadora Vanessa Cerqueira por acreditar no meu potencial e tornar

este trabalho possível.

Ao Professor Darci Gatto por ter cedido os laboratórios da Eng. Industrial

Madeireira para a realização dos ensaios.

Aos colegas e amigos que tive o prazer de conhecer durante a graduação.

A todos que de alguma forma me ajudaram na realização deste trabalho.

OBRIGADA.

RESUMO

MACHADO, Bettina Rodrigues. Avaliação da Toxicidade Ambiental do Agrotóxico Glifosato em Solo Utilizando como Bioindicador Minhocas da Espécie Eisenia andrei. 2016. 63 f. Trabalho de Conclusão de Curso (TCC). Graduação em Engenharia Ambiental e Sanitária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.

O aumento populacional e consequentemente da demanda por alimentos tornou o sistema de cultivo agrícola atual baseado na intensa aplicação de produtos químicos visando a máxima produtividade. Dentre os produtos químicos mais utilizados para controle de pragas, doenças e plantas daninhas destaca-se o herbicida Glifosato. Cerca de 90% dos agrotóxicos aplicados por pulverização não atingem seu alvo e muitos desses produtos demonstram persistência no ambiente e se acumulam ao longo das cadeias alimentares, alcançando concentrações altas e tóxicas. O solo é um compartimento susceptível a este tipo de contaminação e o emprego de métodos rápidos, simples e de baixo custo de detecção e avaliação do grau de toxicidade destas substâncias no ambiente se faz de extrema importância. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a toxicidade ambiental do herbicida Glifosato no solo, utilizando minhocas da espécie Eisenia andrei como bioindicadores. Foi empregado o teste de fuga ou evitamento, conforme a ISO 17512-1 (2007),como indicador de toxicidade ambiental. Este teste consiste em avaliar o comportamento de fuga de minhocas quando expostas ao mesmo tempo a solos contaminados e não contaminados. Os ensaios foram realizados empregando solo natural. Foram avaliadas as concentrações respectivas de 4.000, 6.000, 8.000 e 10.000 mg de glifosato kg

-1de solo. As unidades

experimentais foram mantidas em sala climatizada sob condições controladas de temperatura (20 ± 2°C), luminosidade (600 lux) e fotoperíodo de 12h claro/12h escuro durante 48 horas. O comportamento de fuga ao herbicida glifosato foi observado em todas as concentrações utilizadas no estudo. As concentrações de 8.000 mg.kg-1 e 10.000 mg.kg-1, causaram alterações significativas no comportamento das minhocas Eisenia andrei como ausência de movimentos e aglomeração em pontos específicos. A menor taxa de fuga (76%) ocorreu no ensaio utilizando 4.000 mg.kg-1 e a maior taxa de fuga (92%) foi relativa a concentração de 6.000 mg.kg-1. Os organismos da espécie Eisenia andrei demonstraram sensibilidade ao agrotóxico glifosato, evidenciando sua capacidade de detectar e evitar esta substância química quando presente no solo. O teste de evitamento com minhocas em solo natural se mostrou uma ferramenta eficiente, fornecendo respostas precisas em curto período de tempo, apresentando potencial de utilização no monitoramento ambiental de áreas contaminadas com o agrotóxico glifosato.

Palavras-Chave: Agrotóxico; Bioindicadores; Glifosato; Minhocas Eisenia

andrei; Toxicidade.

ABSTRACT

MACHADO, Bettina Rodrigues. Environmental Evaluation of Toxicity of Glyphosate Pesticide on Soil using as Bioindicator Earthworm of Eisenia

andrei Species. 2016. 63 f. Course Conclusion Paper (TCC). Graduation in Environmental and Sanitary Engineering. Federal University of Pelotas, Pelotas.

The population increase and therefore demand for food changed the traditionalfarming land, converted the actual system of cultive based on massive utilization of pesticides. Among those chemical substances used for control of pests is widely spread the weed killer glyphosate. Around of 90% of pesticides applied by spraying don’t reach their target and this products demonstrated persistence in the environmental and bioaccumulation in the food chains, achieving high and toxics concentrations then, became necessary quick techniques for detection of these substances. The soil compartment is vulnerable of this type of contamination and the employment of simple, easy and cheap techniques are extremely useful. This present study was aimed environmental assessment of glyphosate toxicity on soil, were used as bioindicator earthworm of Eisenia andrei species. Was employed the avoidance test, following ISO 17512-1 (2007), as indicator of environmental toxicity. These test consist in evaluate the avoidance behavior of earthworms when they are exposed at the same time at contaminated soil and control soil. The assays were realized employing natural soil. Were evaluated these concentrations 4.000, 6.000, 8.000 and 10.000 mg glyphosate kg-1 of soil. The experimental units were incubated under (20 ± 2°C) temperature, light (600 lux) and 12h light /12h dark on 48 hours. The avoidance to weed killer glyphosate was observed in all concentrations. The concentration of 8.000 mg.kg-1 and 10.000 mg.kg-1, changed the earthworms Eisenia andrei behavior, were observed absence of movements and agglomeration in specific points. The smallest rate of avoidance occurred on 4.000 mg.kg-1 and the biggest rate of avoidance was observed on concentration of 6.000 mg.kg-1 (92%). The Eisenia andreiindividuals showed ability to detect and avoid the weed killer on soil. The avoidance test with earthworm Eisenia andrei species on natural contaminated soil was considered an efficient tool on the evaluation of contaminated sites with glyphosate weed killer, providing accurate answers in a short period of time in addition to being an easy and cheap method.

Key- Words: Pesticide; Bioindicators; Glyphosate; Earthworm Eisenia andrei;

Toxicity.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO........................................................................................... 11

1.1 OBJETIVOS........................................................................................................................ 16

1.1.1 Objetivo geral .................................................................................................................. 16

1.1.2 Objetivo específico ......................................................................................................... 16

2. REVISÃO DE LITERATURA...................................................................... 17

2.1 Agrotóxicos ......................................................................................................................... 17

2.2 Glifosato .............................................................................................................................. 18

2.3 Glifosato e a Legislação ................................................................................................... 20

2.4 Mecanismo de ação e interação com o solo ................................................................. 22

2.5 Ensaios de toxicidade ....................................................................................................... 24

2.6 Indicadores de qualidade ambiental ............................................................................... 27

2.7 Utilização da E. andrei como bioindicador..................................................................... 28

3. METODOLOGIA........................................................................................... 31

3.2 Delineamento experimental.............................................................................................. 31

3.2.1 Caracterização do solo .................................................................................................. 32

3.2.2 Organismos-teste ........................................................................................................... 33

3.2.3 Unidade controle positivo .............................................................................................. 33

3.2.4 Preparação das diluições de glifosato ........................................................................ 34

3.2.5 Procedimento experimental: Teste de evitamento .................................................... 34

3.4 Análise de dados ............................................................................................................... 38

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................... 40

4.1 Validação do teste de evitamento .............................................................. 40

4.2 Testes de toxicidade .................................................................................. 41

5. CONCLUSÃO............................................................................................... 49

REFERÊNCIA ........................................................................................................................... 50

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Fórmula estrutural do glifosato.............................................................................. 19

Figura 2- E. andrei.................................................................................................................... 29

Figura 3- Remoção da cobertura vegetal e coleta do solo ................................................ 32

Figura 4- Recipiente utilizado no teste.................................................................................. 35

Figura 5- Ajuste do conteúdo de umidade............................................................................ 35

Figura 6- Divisão do recipiente e colocação do solo teste e controle .............................. 36

Figura 7- Colocação das minhocas na linha formada pela divisória. ............................... 37

Figura 8- Recipiente após a colocação do papel filme....................................................... 37

Figura 9- Local onde o teste permaneceu no período de incubação............................... 38

Figura 10-Distribuição dos organismos nos controles negativo e positivo. .................... 41

Figura 12- Relação entre a dosagem aplicada de glifosato e a taxa de fuga (média dos

tratamentos ± desvio padrão amostral). ............................................................................... 43

Figura 13- Distribuição dos organismos no recipiente (média ± desvio padrão) ........... 45

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Classificação toxicicológica dos pesticidas ........................................... 18

Tabela 2 - Ingredientes do agrotóxico glifosato ...................................................... 20

Tabela 3- Relação das doses de glifosato aplicadas no solo teste..................... 32

Tabela 4- Composição granulométrica do solo ...................................................... 33

Tabela 5- Caracterização físico-química do solo ................................................... 33

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AGROFIT – Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários

AMPA – Ácido Aminometilfosfônico

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

CONAMA – Conselho Nacional do Meio Ambiente

E. andrei – Eisenia andrei

E. fetida – Eisenia fetida

EEC – European Economic Community

FAO – Food and Agriculture Organization

FISPQ – Ficha de Informações de Segurança de Produtos Químicos

ia – Ingrediente ativo

IBAMA – Instituto Brasileiro do Meio Ambiente

ISO – International Standard Organization

LMR – Limite Máximo de Resíduo

MS – Ministério da Saúde

OECD – Organization for Economic Co-operation and Development

SAT – Solo Artificial Tropical

SINDAG – Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Defesa Agrícola

U.S EPA – United States Environmental Protection Agency

1. INTRODUÇÃO

O aumento populacional e a crescente demanda por alimentos exigiram

modificações na agricultura tradicional, impulsionando o desenvolvimento de

práticas intensivas na agricultura (CASTRO, 2005). Em meados da década de

1970, o governo instalou o Plano Nacional de Defensivos Agrícolas,

condicionando o crédito rural ao uso obrigatório de agrotóxicos. Rapidamente a

maioria dos produtores rurais passou a só produzir com base nesses produtos

químicos (CARNEIRO et al., 2012), tornando o modelo de produção agrícola

atual dependente da utilização de produtos químicos (SIQUEIRA et al., 1994).

A intensa utilização desses produtos trouxe consigo a preocupação com

a contaminação ambiental, visto que, menos de 10% dos agrotóxicos aplicados

por pulverização atingem seu alvo e que muitos desses produtos demonstram

persistência no ambiente e se acumulam ao longo das cadeias alimentares,

alcançando concentrações altas e tóxicas (ALVES FILHO, 2002; FAY e SILVA,

2004).

Os agrotóxicos, além de proteger as culturas agrícolas das pragas,

doenças e plantas daninhas, podem oferecer riscos à saúde humana e ao

ambiente. O uso frequente de agrotóxicos oferece riscos como a contaminação

dos solos agrícolas, das águas superficiais e subterrâneas, dos alimentos,

apresentando, consequentemente, efeitos negativos em organismos terrestres

e aquáticos e de intoxicação humana pelo consumo de água e alimentos

contaminados, assim como o risco de intoxicação ocupacional de trabalhadores

e produtores rurais (SPADOTTO et al., 2004).

No Brasil, a venda de agrotóxicos aumentou de US$ 2 bilhões para mais

de US$7 bilhões entre 2001 e 2008, alcançando valores recordes de US$ 8,5

bilhões em 2011 (Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Defesa

Agrícola - SINDAG, 2011). Assim, já em 2009, alcançamos a posição de maior

consumidor mundial de agrotóxicos, ultrapassando a marca de 1 milhão de

toneladas, o que equivale a um consumo médio de 5,2 kg de defensivos

agrícolas por habitante ao ano (LONDRES, 2011).

12

Os herbicidas representam (48%) das vendas seguidas pelos inseticidas

(25%) e fungicidas (22%), os quais movimentam 95% do consumo mundial de

agrotóxicos (AGROW, 2007).

Dentre os agrotóxicos utilizados atualmente, destaca-se o glifosato (N-

(fosfonometil) glicina) como o herbicida mais usado em todo o mundo. O

Glifosato é um organofosfato que atua como herbicida de contato. Em diversos

tipos de cultivo, o glifosato costuma ser pulverizado sendo, em geral, absorvido

na planta através de suas folhas e dos caulículos novos. O herbicida é, então,

transportado por toda a planta, agindo nos vários sistemas enzimáticos,

inibindo o metabolismo de aminoácidos. As plantas tratadas com glifosato

morrem lentamente, em poucos dias ou semanas e, devido ao transporte por

todo o sistema, nenhuma parte da planta sobrevive (AMARANTE JUNIOR et

al., 2002). Por não ser seletivo, pode danificar safras importantes mesmo

quando utilizado de acordo com as especificações. Por essa razão, têm sido

desenvolvidas e patenteadas plantas geneticamente modificadas, como soja,

milho e algodão, resistentes ao glifosato (KATZUNG et al., 2012).

A aplicação de Glifosato pode resultar na presença de resíduos tanto na

colheita quanto em animais usados na alimentação humana. No ambiente,

concentrações altas dos compostos (glifosato e seu metabólito, o ácido

aminometilfosfônico (AMPA)) foram encontradas no solo (AMARANTE JUNIOR

et al., 2002).

Segundo Castro (2005), foi possível observar a persistência do Glifosato

e seu metabólito AMPA mesmo após quatro meses de sua aplicação no solo,

embora em baixas concentrações. A ocorrência de Glifosato nas águas

também vem sendo evidenciada em diversos estudos, dentre eles Dutra da

Silva (2003) apontou a presença do herbicida glifosato em águas superficiais

decorridos 30 e 60 dias após a sua aplicação. Amaral (2009) analisou locais

que apresentavam grande exposição ao glifosato e constatou a presença desta

substância em açudes e rios próximos a área agrícola mesmo após cerca de

20 dias após a aplicação do princípio ativo nas culturas.

13

O Brasil possui uma legislação evoluída, exigente e restritiva, que cuida

além da necessidade de comprovação de eficiência agronômica, das garantias

da minimização dos perigos ao ser humano e das ameaças ao meio ambiente

(SPADOTTO et al., 2006). Porém, não existe nenhuma legislação específica

que defina os limites máximos de resíduos de Glifosato e AMPA no solo,

tornando este compartimento susceptível a contaminação ambiental. A Lei

Federal nº. 7.802, de 11 de Julho de 1989, dispõe sobre a pesquisa, a

experimentação, a produção, a embalagem e rotulagem, o transporte, o

armazenamento, a comercialização, a propaganda comercial, a utilização, a

importação, a exportação, o destino final dos resíduos e embalagens, o

registro, a classificação, o controle, a inspeção e a fiscalização de agrotóxicos,

seus componentes e afins. Entretanto, faz-se necessária a avaliação dos riscos

ambientais que cada produto pode apresentar, considerando além da

ecotoxicidade, a exposição dos organismos nos diferentes compartimentos

ambientais (SPADOTTO et al., 2006).

Dentre as formas de se avaliar a contaminação ambiental estão os

métodos analíticos tradicionais, capazes de avaliar agrotóxicos sendo

realizados normalmente por cromatografia em camada delgada (CCD),

cromatografia gasosa (CG) ou cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

(LACORTE e BARCELÓ, 1995; YUN-SUK et al., 1997). Porém, estes métodos

exigem mão de obra especializada e apresentam elevado custo operacional,

tornando inviável o emprego destas técnicas em larga escala em pequenos

laboratórios e/ou para instalações laboratoriais de campo (PERES e

MOREIRA, 2003). Assim, a busca por métodos mais simples, de baixo custo e

de resposta rápida torna-se extremamente necessária. Neste contexto, os

métodos de avaliação ambiental utilizando bioindicadores ou biomarcadores

(Bioensaios), torna-se uma interessante ferramenta, uma vez que podem ser

facilmente reproduzidos em larga escala em pequenos laboratórios não

dispendendo de grandes quantidades de recursos financeiros além de

fornecerem resultados rápidos.

14

No Brasil, não há exigência por parte dos órgãos ambientais do emprego

de testes ecotoxicológicos com organismos de solo para avaliação de

contaminação, que se baseia somente em indicadores químicos (BIANCHI et

al., 2010). Mas, somente a avaliação dos parâmetros químicos não refletem o

comportamento da substância tóxica nos organismos do solo (VAN

STRAALEN, 2002). A utilização de testes ecotoxicológicos para a avaliação de

contaminação de solos é reconhecida internacionalmente como uma

ferramenta complementar à análise química (CROUAU e MOIA, 2006).

Testes agudos e crônicos são tradicionalmente utilizados para avaliar a

toxicidade de contaminantes. Os métodos dos testes frequentemente operam

em diferentes classes de sensibilidade (letal e subletal) utilizando como

parâmetros mortalidade, mudanças de biomassa, taxas de reprodução e

mudanças comportamentais. O parâmetro mortalidade é relativamente sensível

a altas concentrações de poluentes e indica o maior dano provável ao

organismo. Contudo, concentrações subletais de um poluente também podem

ter efeitos ecológicos nas populações, como a diminuição da taxa de

reprodução ou emigração (YOUNG e ULRICH, 2008).

Em específico, o ensaio de comportamento é proposto para testar a

qualidade de solos e a toxicidade de substâncias químicas utilizando o

organismo terrestre Eisenia fetida ou Eisenia andrei (minhoca). Esse ensaio

pode ser aplicado como um método rápido para determinar a biodisponibilidade

de substâncias químicas ou de contaminantes no solo para E. fetida/ andrei,

em que o comportamento de fuga é usado como indicador (KANASHIRO,

2015).

As minhocas se destacam como bioindicadores nos testes

ecotoxicológicos devido ao seu nicho ecológico, isto é, por meio de seus

deslocamentos elas revolvem o solo misturando os horizontes e, pelos seus

hábitos alimentares, influenciam as transformações da matéria orgânica em

decomposição e a ciclagem de nutrientes (PAPINI e ANDREA, 2004), estando

em contato com a substância tóxica a ser avaliada. As minhocas foram

adotadas como organismos padrões para testes ecotoxicológicos pela União

15

Européia (EEC 1984) e Organização para a Cooperação e Desenvolvimento

Econômico (OECD 1984). Além destas, a Organização Internacional de

Padronização (ISO 1993,1998) e a Agência de Proteção Ambiental dos

Estados Unidos (US EPA 1988) produziram guias em relação aos testes de

toxicidade em minhocas. Nestes estudos, as espécies Eisenia fetida/andrei

foram escolhidas pela facilidade de cultivo em laboratório (TOMLIN e MILLER,

1989) e também pelo extenso banco de dados sobre os efeitos de todas as

classes de químicos existentes para essas espécies (EDWARDS e BOHLEN,

1996).

16

1.1 OBJETIVOS

1.1.1 Objetivo geral

Avaliar a toxicidade do herbicida glifosato em solos utilizando como

organismo-teste a minhoca Eisenia andrei.

1.1.2 Objetivo específico

- Avaliar o comportamento dos indivíduos da espécie Eisenia andrei em

diferentes concentrações do herbicida glifosato no solo;

- Determinar a menor concentração capaz de causar o comportamento

de fuga aos indivíduos da espécie Eisenia andrei.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Agrotóxicos

Segundo a Lei Nº 7.802, de 11 de julho de 1989, agrotóxicos e afins são

definidos como produtos e agentes de processos físicos, químicos ou

biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e

beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas,

nativas ou implantadas, e de outros ecossistemas e também de ambientes

urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da

flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos

considerados nocivos ou substâncias e produtos, empregados como

desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento.

São utilizados nas florestas nativas e plantadas, nos ambientes hídricos,

urbanos e industriais e, em larga escala, na agricultura e nas pastagens para a

pecuária, sendo também empregados nas campanhas sanitárias para o

combate a vetores de doenças (PERES e MOREIRA, 2003). Os agrotóxicos

englobam uma vasta gama de substâncias químicas- além de algumas de

origem biológica- que podem ser classificadas de acordo com o tipo de praga

que controlam, com a estrutura química das substâncias ativas e com os

efeitos à saúde humana e ao meio ambiente (AGROFIT, 1998).

O termo agrotóxico, ao invés de defensivo agrícola, passou a ser

utilizado no Brasil a partir da Constituição Federal de 1988, sendo esta

modificação fruto de grande mobilização da sociedade civil organizada. Mais do

que uma simples mudança de terminologia, este termo coloca em evidência a

toxicidade desses produtos para o meio ambiente e para a saúde humana

(BRASIL, 2010). O termo agrotóxico inclui inseticidas (controle de insetos),

fungicidas (controle de fungos), herbicidas (combate às plantas invasoras),

fumigantes (combate às bactérias do solo), algicidas (combate a algas),

avicidas (combate a aves), nematicidas (combate aos nematoides),

moluscicidas (combate aos moluscos), acaricidas (combate aos ácaros), além

de reguladores de crescimento, desfoliantes (combate às folhas indesejadas) e

dissecantes (BAIRD, 2006; FAY e SILVA, 2004).

18

Existem mais de mil formulações diferentes de agrotóxicos, incluindo

inseticidas, herbicidas, fungicidas, nematicidas, fumigantes e outros compostos

orgânicos, além de substâncias usadas como reguladores de crescimento,

desfoliantes e dissecantes (BRAIBANTE e ZAPPE, 2012).

Os herbicidas representam a maior parte do volume total de pesticidas

aplicados na agricultura (ARAÚJO et al., 2008). Dentre os herbicidas, o

Glifosato (N-[fosfonometil] glicina), é um dos mais aplicados em cultivos

agrícolas e atualmente representa 60% do mercado mundial de herbicidas não

seletivos (AMARANTE JUNIOR; DOS SANTOS; BRITO; RIBEIRO, 2002). O

glifosato é a molécula herbicida de maior participação no mercado mundial,

com mais de 150 marcas comerciais sendo comercializado em mais de 119

países, com registro para mais de uma centena de culturas (HARTZLER, 2006;

TONI et al., 2006).

Segundo recomendações da ANVISA, todos os agrotóxicos devem

conter no seu rótulo a devida classificação toxicológica (Tabela 1).

Tabela 1- Classificação toxicicológica dos pesticidas

CLASSE TOXICIDADE COR NO RÓTULO DO

PRODUTO

I Extremamente Tóxico Vermelha

II Altamente Tóxico Amarela

III Medianamente Tóxico Azul

IV Pouco Tóxico Verde

Fonte: ANVISA, 2011

2.2 Glifosato

O glifosato (N-[fosfonometil] glicina), cuja estrutura química está

apresentada na Figura 1, é um ácido orgânico fraco constituído de uma glicina

e metade de fosfometil. A fórmula molecular é C3H8NO5P. O glifosato é

19

usualmente formulado como um sal de ácido de glifosato deprotonado e um

cátion, como isopropilamina ou trimetilsulfonio.

Figura 1- Fórmula estrutural do glifosato

Fonte: ANVISA, 2010.

O glifosato é vendido em concentrações de 48% (m/v) e as doses

aplicadas são em torno de 5 L/ha. No Brasil, esse herbicida é formulado com

diferentes sais, como o sal potássico, sal de isopropilamina e o sal de amônio

(RODRIGUES e ALMEIDA, 2005). É indicado no controle de ervas daninhas

anuais e perenes, monocotiledôneas ou dicotiledôneas, em culturas de arroz

irrigado, cana-de-açúcar, café, citros, maçã, milho, pastagens, soja (plantio

direto ou indireto), fumo, uva e soqueira em cana-de-açúcar. É indicado, ainda,

para as culturas de ameixa, banana, cacau, nectarina, pêra, pêssego,

seringueira e plantio direto do algodão (AMARANTE JÚNIOR et al., 2002).

De acordo com a classificação toxicológica o glifosato é um herbicida de

classe IV - Pouco tóxico, já quanto ao potencial de periculosidade ambiental, é

considerado um produto perigoso ao meio ambiente.

O glifosato é um herbicida pós-emergente, orgânico e não-seletivo que é

usado tanto em áreas agrícolas como não agrícolas em todo o mundo. É

aplicado em várias culturas com várias formulações comerciais. A principal

formulação é o Roundup® da empresa Monsanto. As taxas de aplicação

recomendadas não excedem 5,8 kg de ingrediente ativo por hectare e são

20

dependentes do tipo de uso. A exposição ambiental pode ocorrer por causa da

deposição devido à deriva e lançamento acidental (WHO, 1994).

Na Tabela 2, estão os ingredientes do glifosato e culturas onde costuma

ser utilizado.

Tabela 2 - Ingredientes do agrotóxico glifosato

Princípio ativo do agrotóxico GLIFOSATO

Fórmula estrutural

Nome químico (IUPAC) N- (fosfonometil) glicina

Fórmula molecular C3 H8 NO5 P

Grupo químico Glicina substituída

Classe Herbicida

Funções orgânicas Ácido Carboxílico, amina

Culturas onde é utilizado Algodão, ameixa, arroz, banana, cacau, café,

cana-de-açúcar, citros, coco, feijão, fumo, maçã,

mamão, milho, nectarina, pastagens, pera,

pêssego, soja, trigo, uva.

Classificação toxicológica IV – Pouco tóxico

Fonte: ANVISA, 2009

2.3 Glifosato e a Legislação

Em âmbito nacional, a Portaria 518 do Ministério da Saúde(MS),

publicada em março de 2004, estabelece em seu Art. 14 uma lista de

substâncias químicas dentre elas, o glifosato, que representam riscos à saúde.

O limite permitido de glifosato em água para fins de abastecimento humano é

de 500 µg/L (LONDRES, 2011). Porém, em 14 de dezembro de 2011, o

21

Ministério da Saúde publicou no Diário Oficial da União a Portaria nº 2.914, de

12 de Dezembro de 2011, que dispõe sobre os procedimentos de controle e de

vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de

potabilidade. Esta portaria revogou e substituiu integralmente a Portaria MS nº

518 de 25 de Março de 2004, entretanto o limite permitido de glifosato em água

para fins de abastecimento humano permaneceu inalterado.

A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (US EPA)

estabelece limite de 700 µg/L de glifosato em água potável como “limite

consultivo de saúde”. Entretanto, a Comunidade Econômica Européia (EEC)

estabelece como “concentração máxima admissível” para pesticidas em água

potável, como substâncias individuais, o limite de 0,1 µg/L, desde que a

concentração total de pesticidas não ultrapasse 0,5 µg/L. No Brasil, a CONAMA

(Conselho Nacional do Meio Ambiente) 357 estabelece os valores máximos de

glifosato em água de acordo com a Classe.

A quantidade máxima de resíduo de determinado pesticida que pode

ser aceita em cada alimento destinado ao consumo humano é chamada de

Limite Máximo de Resíduo (LMR). Estes limites são estabelecidos pelo “Codex

Alimentarius Commission”, um corpo subsidiário da FAO (Food and Agriculture

Organization) e da WHO (1994).

Na legislação brasileira os pesticidas têm seus LMR, ou tolerância, e

intervalo de segurança, ou carência (intervalo entre a aplicação do pesticida e a

colheita), estabelecidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(ANVISA).

A resolução CONAMA Nº 420, de 28 de dezembro de 2009, dispõe

sobre critérios e valores orientadores de qualidade do solo quanto à presença

de substâncias químicas e estabelece diretrizes para o gerenciamento

ambiental de áreas contaminadas por essas substâncias em decorrência de

atividades antrópicas, porém, não dispõem LMR referentes ao Glifosato e

AMPA.

22

2.4 Mecanismo de ação e interação com o solo

O glifosato é um importante herbicida por apresentar grande capacidade

de translocação na planta (SHANER, 2009). O herbicida Glifosato atua na

planta como um inibidor da enzima 5- enolpiruvilshiquimato-fosfato sintase

(EPSPS). Esta enzima é responsável pela síntese de três aminoácidos

essenciais para as plantas (triptofano, fenilalanina e tirosina). Com a inibição da

biossíntese desses aminoácidos ocorre uma paralisação do crescimento da

planta e morte posterior por deficiência metabólica (BORGES FILHO, 2001).

Apesar dos agrotóxicos serem utilizados apenas com o propósito de

controlar alguns dos fatores que alteram a produtividade, essas substâncias

causam efeitos indesejáveis ao meio ambiente, atuando especificamente na

destruição de espécies não-alvo, na contaminação do solo e de águas

subterrâneas ou superficiais, no desenvolvimento de imunidade contra os

agrotóxicos e na acumulação dessas substâncias na cadeia alimentícia,

repassando-a a vários ecossistemas (RODRIGUES, 2007).

A contaminação no solo por agrotóxicos pode ser realizada de forma

direta ou indireta, sendo as principais fontes de contaminação direta

evidenciadas no ato da aplicação, quando o produto é lançado diretamente no

solo ou quando há vazamentos ou derramamento do equipamento por má

conservação ou uso inadequado. Já a contaminação realizada de forma

indireta pode ocorrer por meio da percolação, processo de arrasto mecânico do

agrotóxico ou outro composto pela água, chegando aos lençóis freáticos; e

também através da volatilização dos compostos aplicados nos cultivos e

formação de poeira do solo contaminado pela pulverização de agrotóxicos, que

podem ser transportados por correntes aéreas e se depositarem no solo e na

água, distantes das áreas onde foram originalmente usados (BARREIRA e

PHILIPPI JÚNIOR, 2002).

O problema da contaminação do solo por agrotóxicos se agrava pelo

fato de que boa parte do que é aplicado em campo é perdido. Estima-se que

90% não atingem o alvo, sendo dissipados para o ambiente e tendo como

23

ponto final reservatórios de água e principalmente, o solo (BETTIOL e GHINI,

2003). As características do solo onde é aplicado o agrotóxico apresenta muita

influência no impacto que este último pode causar ao meio ambiente. Algumas

propriedades presentes no solo, como teores de argila, concentração de óxidos

e matéria orgânica, pH, capacidade de troca de cátions, área superficial

específica, porosidade, teor de umidade e diversidade microbiana presente,

são fatores físico-químicos que interferem na degradação e na retenção de

pesticidas em solos (PRATA et al., 2002).

Quando a molécula de um herbicida chega ao solo, pode sofrer os

processos de degradação e/ou adsorção (MORAES e ROSSI, 2010). Segundo

Locke et al. (2009), a fotodegradação e degradação química não são

significativas na dissipação de glifosato em solos. O glifosato no solo apresenta

alta capacidade de adsorção e devido a isto, muitos são os estudos que tentam

explicar os mecanismos de ligação entre glifosato e solo (TONI et al., 2006). Os

mecanismos mais comuns são a troca de ligantes com os óxidos de ferro e

alumínio e as pontes de hidrogênio formadas entre o glifosato e as substâncias

húmicas presentes no solo (FENG e THOMPSON, 1990). A adsorção reduz a

concentração dos herbicidas na fração solubilizada do solo, removendo parte

de sua ação potencial. O resultado é observado pelo decréscimo da

disponibilidade biológica, na aceleração da velocidade de degradação química

ou, simplesmente, devido ao retardamento do movimento de lixiviação (TONI et

al., 2006).

Dentre os processos biológicos que determinam a persistência dos

herbicidas no solo, a degradação microbiana constitui o de maior importância

(ARAÚJO; MONTEIRO; ABAKERLI; SOUZA, 2003). A principal via de

decomposição do glifosato no ambiente glifosato é através da biodegradação.

O glifosato é rapidamente degradado pelos microrganismos do solo, o seu

principal metabólito é o AMPA. O AMPA é degradado em taxas mais lentas do

que o glifosato. Estudos demonstram que no solo, 79-86% do glifosato é

biodegradado a dióxido de carbono num período de até 6 meses (FRANZ et al.,

1997).

24

Em relação ao ambiente aquático, o glifosato é considerado de baixo

risco devido a sua baixa mobilidade no solo, sendo este fortemente adsorvido

pelas partículas do solo, o que restringe sua lixiviação para águas

subterrâneas. Entretanto, este pode ser carreado ao ambiente aquático através

da erosão do solo (ARAÚJO et al., 2008).

As contaminações das águas superficiais são ocasionadas pelo

escoamento superficial dos agrotóxicos dissolvidos na água da chuva, sendo

estas substâncias levadas às partes mais baixas da topografia, podendo

chegar até os rios, córregos, lagos e açudes. O lançamento dessas

substâncias em cursos d´água é responsável por inúmeros episódios de

mortalidade da fauna aquática, principalmente de peixes (VEIGA et al., 2006).

Já a contaminação do aquífero é decorrente do transporte vertical da

água carreando os contaminantes, podendo atingir as águas subterrâneas

(SPADOTTO et al., 2006). O volume, a intensidade e a frequência das chuvas

tem uma grande influência no transporte e na perda de agrotóxicos por meio do

escoamento superficial e da percolação da água no solo. Dentre os problemas

de contaminação das águas subterrâneas por agrotóxicos destaca-se o fato de

ser utilizada para consumo humano, o que poderá acarretar sérios problemas

de saúde pública.

2.5 Ensaios de toxicidade

Testes de toxicidade são ensaios laboratoriais, realizados sob condições

experimentais específicas e controladas, utilizados para estimar a toxicidade de

substâncias, efluentes industriais e amostras ambientais (águas ou

sedimentos) (COSTA et al., 2008).

Os ensaios de toxicidade podem ser classificados segundo os efeitos

que os organismos venham apresentar durante o tempo de exposição dos

ensaios (NIPPER, 2000; BORRELY, 2001).

- Aguda: única ou múltiplas exposições a uma substância, por qualquer

via, em curto período – aproximadamente 24 horas. As manifestações

25

geralmente ocorrem de forma rápida, surgem de imediato ou no decorrer de

alguns dias, no máximo duas semanas (DUX, 1988).

- Sobreaguda ou Subcrônica: Exposições diárias repetidas a uma

substância, por qualquer via, aparecem em um período de aproximadamente

10% do tempo de vida de exposição do organismo ou alguns meses (DUX,

1988). Denomina-se toxicidade sobreaguda quando ocorre exposição durante

período menor ou igual a um mês. Enquanto que, para períodos entre um e

três meses, classifica-se como toxicidade subcrônica (RUPPENTHAL, 2013).

- Crônica: Os efeitos tóxicos ocorrem após repetidas exposições, por um

longo período de tempo, geralmente durante toda a vida do indivíduo ou

aproximadamente 80% do tempo de sua vida (DUX, 1988).

Segundo a severidade:

- Leve: Os distúrbios produzidos no organismo podem ser rapidamente

reversíveis e desaparecem com o término da exposição (DUX, 1988).

- Moderada: Os distúrbios produzidos no organismo são reversíveis e

não são suficientes para provocar danos físicos sérios ou prejuízos à saúde

(DUX, 1988).

- Severa: Causa mudanças irreversíveis ao organismo humano,

suficientemente severo para produzirem lesões graves ou a morte (DUX,

1988).

Os testes da OECD (Organização Européia de Cooperação e

Desenvolvimento Econômico), da EPA (Agência Americana de Proteção do

Ambiente) e da ISO (Organização Internacional para Padronização) entre

outros, adotaram a espécie E. fetida para os testes de toxicidade aguda desde,

respectivamente 1984, 1991 e 1993, e posteriormente para os testes de

reprodução e rejeição ou evitamento de compostos químicos. No Brasil, o

IBAMA (Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e Desenvolvimento dos Recursos

Naturais Renováveis) solicita apenas o teste de toxicidade aguda (ABNT, 2007)

26

e aceita resultados obtidos por meio das metodologias dos testes das

organizações internacionais (ANDRÉA, 2010).

Pode-se definir um veneno como um agente capaz de produzir uma

resposta prejudicial em um sistema biológico. A relação dose-resposta

relaciona as características de exposição a um agente e seu espectro de

efeitos. Os testes de toxicidade não são projetados para demonstrar que um

produto químico é seguro, mas para caracterizar os efeitos tóxicos que um

produto químico é capaz de produzir.

O teste de letalidade aguda é primeiro teste de toxicidade realizado em

um novo produto químico. A DL50 (Dose letal média) e outros efeitos tóxicos

agudos são determinados após uma ou mais vias de administração (uma

sendo a via oral ou a via prevista de exposição) em uma ou mais espécies

animais. Fazem-se a verificação diária dos animais e a catalogação do número

de animais que morrem em um período de 14 dias após uma única dose. Os

testes de toxicidade aguda fornecem uma estimativa quantitativa da toxicidade

aguda (DL50), identificam os órgãos-alvo e outras manifestações clínicas da

intoxicação aguda, identificam diferenças entre espécies e espécies sucetíveis;

estabelecem a reversibilidade da resposta tóxica; e fornecem orientação nas

doses a serem usadas em outros estudos (KLAASSEN e WATKINS, 2012).

Se há uma probabilidade razoável de exposição dérmica ou por inalação

ao material, estudos de toxicidade aguda por via inalatória e dérmica são

realizados. Quando os animais são expostos de forma aguda a substâncias

químicas no ar que respiram ou na água em que vivem (peixes), a

concentração letal 50 (CL50), é geralmente determinada para um tempo de

exposição conhecido, que é a concentração da substância química no ar ou na

água que provoca a morte de 50% dos animais. Estudos de letalidade aguda

são essenciais para caracterizar os efeitos tóxicos dos produtos químicos e

seus perigos para seres humanos. As informações mais significantes derivadas

dos ensaios de letalidade aguda vem de observações clínicas e de exames

post mortem dos animais, e não dos valores específicos da DL50 (KLAASSEN e

WATKINS, 2012).

27

2.6 Indicadores de qualidade ambiental

Distúrbios ocasionados pela ação antrópica no ambiente vem causando

preocupações cada vez maiores, o que leva a busca por indicadores que

apresentem capacidade e sensibilidade para medir e avaliar atributos e

processos que interfiram no equilíbrio dos ecossistemas. Alterações causadas

no ambiente geralmente agridem o solo, a base dos ecossistemas terrestres. O

solo é um sistema dinâmico onde fatores de natureza física, química e bilógica

interagem continuamente. Todos esses fatores, principalmente as

transformações microbianas relacionadas aos ciclos biogeoquímicos e as

diferentes reações químicas, podem ser alteradas de acordo com os tipos de

uso e manejo adotado (BINI, 2009).

O uso de indicadores de qualidade do solo permite monitorar os efeitos

de seu uso e manejo como um corpo vivo, e para tal, esses indicadores devem

ter capacidade e sensibilidade para medir e avaliar atributos e processos do

solo que interfiram na promoção das formas de vida que dele dependem

(DUMANSKI e PIERI, 2000).

Os indicadores biológicos são muito úteis devido à sua especificidade a

certos tipos de impacto já que inúmeras espécies são comprovadamente

sensíveis a um tipo de poluente, mas tolerantes a outros (WASHINGTON,

1984). Assim, índices podem ser criados especificamente para detectar

lançamento de compostos quimicos, considerando as respostas de diversas

espécies da comunidade de macroinvertebrados. Os índices que têm as

comunidades como unidades de estudo são eficientes para o monitoramento

rápido de grandes áreas, apresentando relativo baixo custo (PERES e

MOREIRA, 2003; WATZIN e MCINTOSH, 1999).

Exemplos de organismos que possuem os requisitos para serem

utilizados como possíveis indicadores do nível de poluição são as minhocas,

uma vez que, segundo Paoletti (1999a,b) e Papini (2003), elas são os

organismos que entram em contato direto com as substâncias químicas que

atingem o solo, devido ao seu nicho ecológico. De acordo com esses autores,

28

essas substâncias podem também ser ingeridas juntamente com partículas de

solo, quando esses animais se alimentam, e também ser absorvidas

diretamente através da cutícula destes, quando os poluentes estão dissolvidos

na solução do solo (VAMPRÉ et al., 2010).

2.7 Utilização da E. andrei como bioindicador

Por meio de seus deslocamentos e de ingestão de solo ou serrapilheira

contaminados, as minhocas entram em contato com poluentes que atingem ou

são aplicados no solo e nele podem permanecer adsorvidos nas partículas

minerais, na matéria orgânica e na solução do solo (SPADOTTO et al. 2010).

Elas podem ainda se expor e absorver os contaminantes da solução do solo

por meio de contato direto e passagem pela cutícula (VIJVER et al., 2003;

CASTELLANOS e HERNANDEZ, 2007). A partir desse contato, as minhocas

podem se intoxicar, morrer, ou sobreviver, incorporar e até bioacumular esses

poluentes em seus tecidos (CURRY, 2004).

A determinação das concentrações de poluentes em organismos

bioindicadores é útil porque fornece informações sobre a biodisponibilidade dos

poluentes e o padrão de contaminação (BEEBY 2001; NICHOLSON e LAM,

2005). O potencial bioindicativo de organismos dos níveis tróficos mais baixos

tem sido crescentemente estudado para avaliações dos possíveis perigos

ambientais associados com a transferência e biomagnificação dos poluentes ao

longo das diferentes teias alimentares (VASSEUR e COSSU-LEGUILLE 2006).

Portanto, o nicho ecológico e a importante posição trófica das minhocas, que

se situam nos níveis mais baixos das teias alimentares terrestres, servindo de

alimento para vários animais e como rota de transferência e biomagnificação

de contaminantes ao longo dessas teias, além do conhecimento já acumulado

sobre seus hábitos alimentares e habitats, fazem das minhocas excelentes

bioindicadores de ecotoxicidade de substâncias químicas no solo, pois elas

indicam a bioacumulação potencial ao longo dessas teias (CASTELLANOS e

HERNANDEZ, 2007; NAHMANI et al. 2007; PAOLETTI, 1999).

29

Acredita-se que no mundo existam mais de 8 mil espécies diferentes de

minhocas. No Brasil, são conhecidas entre 240 e 260 espécies, sendo que a

maioria é composta de minhocas nativas (SCHIEDECK et al., 2006).

A E. andrei (Figura 2) apresenta corpo uniformemente avermelhado com

listras pouco aparentes entre os segmentos. Sims e Gerard (1999), informam

que o corpo de um espécime adulto pode variar entre 3 e 6 mm de diâmetro e

entre 60 a 120 mm de comprimento.

Figura 2- E. andrei

Fonte: STEWART, 2016.

Segundo Domínguez (2004), a expectativa de vida desta espécie varia

entre 4-5 anos em cativeiro, mas em condições naturais, pode ser alterada,

devido a um grande número de parasitas e predadores. E. andrei atinge a

maturidade sexual entre 21-28 dias. A cópula ocorre próxima à superfície do

alimento e a postura do primeiro casulo ocorre cerca de 48h após. Cada

indivíduo produz entre 0,35 a 0,5 casulos por dia, sendo o tempo de incubação

até o início da eclosão variável entre 18 e 26 dias. A taxa de viabilidade de

eclosão oscila ao redor de 72% e 82%, sendo o número de descendentes

estimado entre 2,5 e 3,8 por casulo, variando conforme a temperatura

(DOMÍNGUEZ e EDWARDS, 2010).

O nicho ecológico das minhocas as caracteriza como organismos muito

importantes no solo e como bioindicadores ambientais. Suas características,

especialmente das espécies Eisenia fetida Savigny, 1826 e E. andrei Bouché,

1972, as qualificaram para testes de toxicidade para fins de registro de

30

agrotóxicos, junto aos órgãos regulamentadores de diversos países. Além da

relativa facilidade de criação de E. fetida e E. andrei, as condições desses

testes são internacionalmente aceitas e permitem padronização de estudos e

comparações internacionais; informam sobre toxicidade relativa às espécies

endêmicas; permitem avaliações preliminares em relação a intervalos de doses

do poluente para os testes; fornecem estimativas sobre o CENO (concentração

sem efeito observável) para exposição contínua, e ajudam no estabelecimento

de condições para testes de efeitos subletais e sub-crônicos (ANDRÉA, 2010).

Esses estudos são feitos por meio da determinação de doses subletais

sobre biomarcadores – componentes celulares ou bioquímicos, estruturas e

funções de organismos bioindicadores (ANDRÉA et al., 2007 a,b; NICHOLSON

e LAM, 2005; LAM e KUEH, 2008) – e auxiliados pelas análises de solos,

sedimentos e águas, que são os meios onde são encontrados os

bioindicadores (MIGUEL et Al., 1999; GEVAO et al., 2001; FIGUEIREDO-

BARROS et al., 2001).

Dessa forma, as medidas de bioindicadores têm sido usadas para

apontar a probabilidade de um agente estressor (contaminante, alterações das

condições físicas, etc.) causar efeito adverso no ambiente e nas populações.

Essas medidas são também feitas para caracterizar a saúde do ambiente,

indicar o grau de perigo e dar suporte às determinações dos possíveis riscos

ecológicos de mudanças na saúde do ambiente (ANDRÉA, 2008).

3. METODOLOGIA

Para os testes de toxicidade do glifosato no solo e os efeitos na

comunidade biológica do solo, em específico, nas minhocas da espécie E.

andrei, foram utilizados como guias consultivos, os guias propostos pela

Comunidade Econômica Européia (EEC 1984), Agência de Proteção Ambiental

dos Estados Unidos (U.S EPA 1988) e Organização para a Cooperação e

Desenvolvimento Econômico (OECD 1984).

A norma utilizada especificamente na realização do ensaio de fuga foi a

ISO 17512-1 (2007) – Soil quality- Avoidance test for testing the quality of soils

and effects of chemical on behavior. Part 1: Test with earthworms.

3.1 Delineamento experimental

Para avaliação da toxicidade de solos contaminados com o agrotóxico

glifosato foi determinado o comportamento de fuga de minhocas quando

expostas ao mesmo tempo a solos contaminados e não contaminados, de

acordo com o estabelecido na norma ISO 17512-1 (2007). Esta norma fornece

as diretrizes necessárias à realização do ensaio de fuga para avaliar a

qualidade de solos e efeitos de substâncias químicas no comportamento das

minhocas. Este ensaio é normatizado com as espécies de minhocas Eisenia

fetida e Eisenia andrei.

A fim de avaliar a toxicidade de solos contaminados com glifosato foram

idealizados experimentos com diferentes dosagens. Foram montados 4

tratamentos com doses crescentes de glifosato e 2 tratamentos controles

(negativo e positivo), conforme mostrado na Tabela 3. Os ensaios foram

realizados em quintuplicata.

32

Tabela 3- Relação das doses de glifosato aplicadas no solo teste.

Tratamento Dose aplicada (mg/Kg)

Controle negativo 0

Controle positivo (H3BO3) 0

T1 4000

T2 6000

T3 8000

T4 10000

3.1.1 Caracterização do solo

As amostras de solo foram coletadas no Município de Rio Grande/RS

(Figura 3), (Latitude 32º 12’37.3” Sul Longitude 52º 18’60.8’’ Oeste) em área

sem histórico de aplicação de agrotóxico.

Figura 3- Remoção da cobertura vegetal e coleta do solo

O solo foi encaminhado ao Laboratório de Bioprocessos e Biotecnologia

Ambiental da Universidade Federal de Pelotas, onde foi homogeneizado e

peneirado em peneira com 2,00 mm de abertura. Posteriormente, o solo foi

33

desfaunado sob três ciclos de congelamento e descongelamento de 48h/ciclo

(LUZ et al., 2008).

A caracterização do solo expressa nas Tabelas 4 e 5 foi realizada pelo

Departamento de Solos - Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel da

Universidade Federal de Pelotas.

Tabela 4- Composição granulométrica do solo

Areia (%) Silte (%) Argila (%)

96,02 1,68 2,3

Tabela 5- Caracterização físico-química do solo

Parâmetros Resultado Método de análise

pH 5,0 pH em água 1:1

Umidade 11 %

Matéria Orgânica 1,52 % Digestão úmida

Argila 4% Densímetro

3.1.2 Organismos-teste

O bioindicador ambiental utilizado nos ensaios foi a minhoca da espécie

Eisenia andrei. Foram utilizadas apenas minhocas adultas cliteladas pesando

entre 300-600 mg.

Ao longo dos ensaios, não foi fornecido nenhum tipo de suplementação

(alimentação) às minhocas.

3.1.3 Unidade controle positivo

Para testar o lote de organismos utilizados nos experimentos, foi

utilizado o ácido bórico (H3BO3), substância tóxica recomendada pela ISO. O

34

ácido bórico é um biocida não seletivo efetivo que atende aos critérios

estabelecidos pela norma ISO 17512-1.

O comportamento de fuga das minhocas deve ser observado na

concentração de 750 mg H3BO3/ kg de solo.

3.1.4 Concentrações de glifosato

As diluições aplicadas em solo foram feitas a partir da formulação

comercial de Glifosato (Roundup original) da Empresa Monsanto.

Para preparar as soluções de glifosato aplicadas às amostras de solo, foi

utilizada a bula do produto e a Ficha de Informações de Segurança de

Produtos Químicos (FISPQ).

Os volumes de solução de glifosato aplicados no teste foram

determinados baseados na quantidade de solo e a concentração requerida em

cada amostra. Foram aplicadas as concentrações de 4.000, 6.000, 8.000 e

10.000 mg.Kg-1.

3.1.5 Procedimento experimental: Teste de evitamento

O teste de evitamento seguiu os procedimentos descritos pela norma

ISO 17512-1 (2007) - Soil quality- Avoidance test for testing the quality of soils

and effects of chemical on behavior.

Os recipientes utilizados foram de plástico, com formato retangular

(dimensões: 19 cm de comprimento, 13,5 de largura e 12 cm de profundidade)

e com capacidade de 2500 mL (Figura 4). Os recipientes por serem

transparentes foram forrados com papel alumínio para evitar efeitos laterais da

luz.

35

Figura 4- Recipiente utilizado no teste

Inicialmente, foi realizado o ajuste do conteúdo de umidade dos solos

utilizando água destilada (Figura 5). O solo foi ajustado a 60% da capacidade

de retenção de água.

Figura 5- Ajuste do conteúdo de umidade

36

Nos solos denominados testes foram aplicadas as concentrações de

glifosato de acordo com o citado na Tabela 3.

Para a montagem das unidades experimentais, foi inicialmente colocado

um divisor de plástico no centro do recipiente e posteriormente foram

colocados de um lado do recipiente o solo controle (solo não contaminado) e

do outro o solo teste (contaminado), conforme mostrado na Figura 6.

Figura 6- Divisão do recipiente e colocação do solo teste e controle

Em seguida, o divisor foi retirado e 10 minhocas todas adultas e

previamente aclimatadas, com clitelo e peso entre 300 - 600mg, foram

colocadas na linha divisória entre os dois substratos (Figura 7). As minhocas,

após a pesagem, foram aclimatadas ao solo durante 24 horas antes do início

do teste.

37

Figura 7- Colocação das minhocas na linha formada pela divisória.

Logo após a colocação dos organismos, os recipientes foram cobertos

por papel filme perfurado manualmente, visando permitir trocas gasosas,

(Figura 8) e distribuídos nas prateleiras de modo que os lados do recipiente

que contém o solo contaminado ficassem sempre na mesma direção (Figura 9).

Figura 8- Recipiente após a colocação do papel filme

38

Figura 9- Local onde o teste permaneceu no período de incubação

As unidades experimentais foram incubadas durante 48 h à temperatura

de 20 ± 2ºC, sob intensidade luminosa constante de 600 lux e fotoperíodo de

12 horas de luz e 12 horas no escuro.

Após 48 horas, o divisor foi novamente introduzido nos recipientes,

separando o solo teste do solo controle, e foi feita a contagem do número de

minhocas em cada um dos lados.

3.2 Análise de dados

Para avaliação dos resultados foi avaliada a porcentagem de minhocas

encontradas em cada compartimento do recipiente e também a taxa de fuga

(taxa de evitamento- avoidance).

A ISO recomenda a equação descrita abaixo para determinar a taxa de

evitamento das minhocas às diferentes concentrações de contaminantes.

39

Equação 1

� = ��−�� 100

A = fuga (avoidance), em porcentagem (%);

C = número de minhocas no solo controle;

T= número de minhocas na amostra;

N= número total de minhocas inoculadas (10 em cada recipiente).

De acordo com a ISO 17512-1 (2007), a amostra de solo é considerada

tóxica para os organismos (função de habitat limitado) se, mais de 80% dos

indivíduos estiverem no compartimento controle (ou menos de 20% estiverem

no solo teste), o que corresponde a mais de 60% de evitamento (avoidance)

(Equação 1).

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Critérios de validade- Teste de evitamento

Para que o teste de evitamento seja considerado válido, devem ser

atendidos os critérios de validade estabelecidos pela norma ISO 17512-1

(2007). A norma estabelece que devam ser realizados controles negativo e

positivo e que os resultados devem estar dentro da faixa preconizada como

aceitável.

O tratamento controle negativo também chamado de “dual control test”

consiste em utilizar em ambos os lados do recipiente o solo sem contaminação,

permitindo assim observar a distribuição dos organismos no recipiente e inferir

se existem outros fatores que possam estar causando interferência na

distribuição dos organismos além da substância tóxica (RINKE e

WIECHERING, 2001; YEARDLEY et al.,1996). Na presente pesquisa, os solos

foram submetidos a desfaunagem com o intuito de assegurar a existência

somente do organismo desejado.

De acordo com o observado na Figura 10, no tratamento controle

negativo, as minhocas se distribuíram de forma satisfatória visto que

apresentaram distribuição de 60%:40% para cada lado. De acordo com a ISO,

no controle negativo a taxa de minhocas deve estar dentro da faixa 60%:40%.

Neste caso considera-se que não houve a manifestação do comportamento de

fuga, comprovando não haver preferência por parte das minhocas por um dos

lados do recipiente.

A norma ISO também recomenda que seja realizado um tratamento

denominado controle positivo, no qual é utilizado como substância tóxica de

referência, o ácido bórico (H3BO3) na concentração de 750 mg.Kg-1. O ácido

bórico é utilizado como substância referência por ser um quimioesterilizante de

solo com função biocida. Ele é efetivo em concentrações relativamente baixas,

é relativamente estável e persistente, não volatiliza rapidamente e pode ser

facilmente misturado em solos (ISO, 2007).

41

Figura 10-Distribuição dos organismos nos controles negativo e positivo.

O controle positivo tem a finalidade de avaliar o lote de organismos, os

quais devem manifestar o comportamento de fuga quando em contato com a

substância tóxica de referência. De acordo com a norma, quando os solos

contaminados apresentar menos do que 20% do número total de minhocas,

estes são classificados como tendo função habitat limitada. Conforme

mostrado na Figura 10, observa-se que o ensaio controle positivo apresentou-

se dentro dos padrões aceitáveis.

Tendo em vista que os resultados obtidos nos testes controles

permaneceram dentro dos padrões estabelecidos pela norma, o teste foi

validado.

4.2 Testes de toxicidade

Para avaliação da toxicidade de solos contaminados com o agrotóxico

glifosato foi determinado o comportamento de fuga de minhocas quando

expostas ao mesmo tempo a solos contaminados e não contaminados.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Controle negativo Controle positivo

Dis

trib

uíç

ão

do

s o

rga

nis

mo

s (%

)

Controle

Teste

42

O procedimento padrão preconiza a utilização de um solo artificial como

substrato para adição das substâncias tóxicas, a fim de eliminar interferências

externas (SISINNO et al., 2006). Um dos desafios atuais para a avaliação de

áreas contaminadas diz respeito à substituição do substrato artificial pelas

amostras de solo obtidas a campo (SISINNO et al., 2006).

No presente trabalho, foi possível notar que a utilização de solos

naturais ao invés do solo artificial tropical (SAT), recomendado pela ISO, se

mostrou satisfatória visto que, os controles foram validados e os resultados não

se mostraram discrepantes dos estudos relativos ao glifosato já existentes. Os

resultados obtidos foram precisos, não sendo observados resultados com

grandes variações. Em estudos como o realizado por Lima (2006), o qual

buscou a caracterização da atividade de Bom Repouso (MG) e avaliação por

meio de testes toxicológicos com a minhoca E. fetida, este comportamento não

foi verificado, visto que Lima obteve problemas na validação do teste e no teste

de evitamento, apontando como prováveis interferências as diferenças físico-

químicas (pH, matéria orgânica, quantidade de areia, conteúdo de argila,

nutrientes, umidade) nos tipos de solo natural utilizados e entre o solo artificial

tropical. Embora a utilização de SAT distancie os resultados obtidos em

laboratório das situações de contaminação ambiental a campo, talvez neste

caso a utilização do SAT tivesse se mostrado satisfatória, tendo em vista que

as características do solo interferem diretamente no comportamento dos

organismos, contribuindo para a grande variabilidade entre as réplicas nos

resultados.

Em estudos realizados por Cantelli (2011), avaliando a toxicidade aguda

de carbofurano e carbendazim em minhocas utilizando solo natural, mostraram

que a utilização de solo artificial tropical (SAT) modifica de certa forma a

sensibilidade do organismo teste à substância tóxica, logo, deve-se dar

preferência a utilização do solo natural visto que este melhor representa as

condições de contaminação a campo.

43

A Figura 12 mostra a taxa de evitamento obtido nos tratamentos aos

quais foram aplicados o herbicida glifosato nas doses de 4.000, 6.000, 8.000 e

10.000 mg.kg-1.

A partir dos resultados obtidos, observa-se que houve o comportamento

positivo de fuga ao contaminante em todas as doses testadas.

De acordo com a ISO 17512-1, o solo somente pode ser considerado

como tóxico ou de baixa qualidade (função de habitat limitado), quando mais do

que 80% dos organismos são encontrados no solo controle, o que corresponde

a taxa de evitamento maior que 60% (fórmula de evitamento- avoidance).

Todas as concentrações manifestaram função de habitat limitado.

Figura 11- Relação entre a dosagem aplicada de glifosato e a taxa de fuga (média dos tratamentos ± desvio padrão amostral).

Observando a Figura 11, pode-se notar que o comportamento de fuga

não acompanhou o aumento das dosagens aplicadas em solo, tendo a

concentração de 6.000 mg de glifosato/ kg de solo apresentado a maior taxa de

0

20

40

60

80

100

120

4.000 6.000 8.000 10.000

Ev

ita

me

nto

(%

)

Dosagem aplicada (mg kg-1)

Fuga

44

evitamento (92%). As concentrações de 8.000 mg.kg-1 e 10.000 mg.kg-1

apresentaram o mesmo índice de fuga ao contaminante (84%). A concentração

de 4.000 mg.kg-1 foi a dosagem que apresentou o menor valor de evitamento

ao contaminante (76%).

Schiedeck et al (2010) sugere que em situações de intoxicação aguda, a

minhoca pode não conseguir fugir da substância tóxica, induzindo ao erro nos

resultados.

Foi possível notar mudança comportamental nas minhocas quanto

maiores as dosagens de glifosato aplicadas no solo. As minhocas submetidas a

menor concentração (4.000 mg de glifosato/ kg de solo) se mostraram mais

ativas e dispersas no recipiente. Os organismos presentes nas unidades 8.000

mg kg-1 e 10.000 mg kg-1, em sua maioria mostraram ausência ou lentidão nos

movimentos e agrupamento em ponto específico. Este tipo de comportamento

foi relatado por Schiedeck et al (2010) em testes de aceitação de alimento

como sendo comportamento característico de rejeição ao alimento testado.

As minhocas podem absorver os contaminantes da solução do solo por

meio de contato direto e passagem pela cutícula (BUCH, 2010). Assim, podem

se intoxicar, morrer ou sobreviver, incorporar ou até bioacumular esses

poluentes em seus tecidos (CORTET et al., 1999; BURGER, 2006;

VISWANATHAN, 1994), podendo levar a biomagnificação da substância ao

longo da cadeia trófica.

Mesmo quando as moléculas da substância tóxica não afetam

significativamente a sobrevivência das minhocas, podem afetar hábitos e

comportamentos, resultando na redução da população e/ou atividade das

minhocas, o que pode ser influenciado pelo funcionamento do solo (LAL et al.,

2001; LUO et al., 1999; SLIMAK 1997). O estresse causado pela presença do

contaminante faz com que a energia, para crescimento, reprodução e

escavação seja utilizada para garantir a sobrevivência do organismo (GIBBS et

al., 1996; ODUM 1982). Logo se acredita que este tipo de comportamento é

45

característico da espécie quando submetida a condições de estresse como

forma de garantir a sua sobrevivência.

Entretanto, não é possível afirmar a razão pela qual as minhocas não

manifestaram o comportamento de fuga gradativo seguido do aumento da

dosagem de glifosato.

Vale ressaltar que as dosagens utilizadas no estudo estão

intencionalmente bem acima das taxas recomendadas de aplicação no campo

pelo fabricante. As dosagens foram determinadas de modo que simulassem

condições de derramamento acidental do produto.

Em teste preliminar, foi aplicado ao solo o dobro (11, 52 mg ia. ha-1) da

dose máxima (5,46 mg ia.ha-1) recomendada pelo fabricante na bula do

produto, que é para a cultura de taboca (Guadua angustifolia). Neste ensaio, os

organismos não manifestaram comportamento de rejeição ao solo contendo o

glifosato, pelo contrário, observando a Figura 13 é possível notar maior

distribuição no lado contendo 11,52 mg ia. ha-1 (53,33%) se comparado ao

controle (46,67%).

Figura 12- Distribuição dos organismos no recipiente (média ± desvio padrão)

0

10

20

30

40

50

60

70

11,52 mg /ha Controle

Dis

trib

uiç

ão

do

s in

div

ídu

os(

%)

Tratamentos

46

Buch (2010) realizou estudo para analisar a utilização da espécie

Eisenia andrei como bioindicadora de solos contaminados por agrotóxicos. As

concentrações de Glifosato Pica-Pau aplicadas em solo foram 0, 7, 14, 21, 30 e

47 mg ia. de glifosato kg-1 em solo artificial tropical (SAT). Foram considerados

como habitat limitado as concentrações de 30 e 47 mg i.a kg-1.

No presente estudo o dobro da dose recomendada (11,52 mg i.a ha-1)

não demonstrou toxicidade aos organismos, ao contrário do estudo de Buch

que observou toxicidade já nas doses recomendadas de utilização a campo.

O Glifosato Pica-Pau utilizado nos ensaios por Buch apresenta

classificação toxicológica superior ao Roundup original, logo, como esperado

demostrou maior toxicidade aos organismos em doses menores.

Em estudo semelhante ao de Buch, mas, com a utilização da formulação

comercial Roundup, Chini (2014), não observou o comportamento de fuga

necessário para caracterizar o solo como habitat limitado.

Mesmo que em baixas concentrações não sejam notados

comportamentos de fuga à substância tóxica, não se pode concluir que em

situações de exposição prolongada não haja efeitos adversos aos organismos

(ANDRÉA, 2008; BURATINI e BRANDELLI, 2006).

Com base no presente estudo e nos estudos de Kanashiro (2015) e

Chini (2014), podemos concluir que só é possível observar os efeitos de

toxicidade ao glifosato Roundup em solo nos organismos terrestres E. andrei e

E. fetida em altas concentrações.

O produto utilizado no estudo (Roundup original) não contém dados

relativos a ecotoxicidade para minhocas em sua Ficha de informação de

segurança do produto químico (FISPQ). Para este produto há dados

ecotoxicológicos relativos a algas, crustáceos e peixes. Assim, foi tomado

como base para o delineamento experimental, os dados ecotoxicológicos com

minhocas contidos na FISPQ do produto Roundup transorb r, o qual apresenta

valores de CL50, 14 dias > 10.000 mg/kg para Eisenia foetida e Roundup N.A

47

com valores de CL50 de 6964,39 mg/Kg. Os produtos Roundup transorb r e

Roundup N.A foram escolhidos como base por apresentarem composição

química semelhante ao composto utilizado no ensaio.

Foi possível notar a manifestação do comportamento de fuga e

alterações comportamentais em minhocas quando submetidas a concentração

≥ 4.000 mg de glifosato kg-1 de solo, concentração inferior a menor CL50

utilizada como base no teste.

Kanashiro (2015) avaliou a toxicidade ambiental do glifosato em

concentrações de 96 a 10.000 mg.kg-1 e de deltametrina em concentrações de

5 a 1.500 mg.kg-1 no solo através de ensaios de mortalidade, biomassa e

reprodução. As minhocas E. andrei manifestaram o comportamento de

toxicidade aguda (mortalidade) em concentrações iguais e superiores a 6.000

mg de glifosato kg-1. Os ensaios de evitamento não foram realizados no estudo

de Kanashiro, porém, fazendo uma comparação entre os estudos pode-se

notar que as concentrações nas quais houveram manifestações de fuga e

toxicidade aguda foram semelhantes, exceto a concentração de 4.000 mg.kg-1

que se configurou como habitat limitado no teste de evitamento no presente

estudo, enquanto que, a concentração mais próxima avaliada por Kanashiro de

4.500 mg.kg-1 não demonstrou toxicidade aos organismos.

O ensaio de evitamento é o bioensaio que melhor se assemelha as

condições encontradas no ambiente natural, pois, no ambiente as populações

naturais têm a habilidade de fugir do contaminante antes que efeitos letais ou

sub-letais ocorram. Isso demonstra a relevância ecológica de estudos sobre o

comportamento de fuga dos organismos, pois testes onde os mesmos ficam

confinados tornam os resultados distantes da realidade, nos casos em que a

fuga seja provável (LOPES et al.,2004).

O teste de evitamento parte do princípio que as minhocas por terem

quimioreceptores, são capazes de detectar e evitar a presença de substâncias

tóxicas, evitando permanecer no solo que as contém (LIMA, 2010).

48

Dentre as vantagens da utilização do teste de fuga, o período de

duração do teste (48 horas) quando comparado a testes agudos como

mortalidade (14 dias) e reprodução (56 dias) se constituí em um diferencial,

tornando o teste uma ferramenta importante na avaliação de solos

contaminados.

A sensibilidade é outro parâmetro que se destaca quando comparado

aos testes agudos. Relatado por vários autores, os níveis de detecção da

contaminação no solo são menores no teste de fuga.

A utilização do teste de evitamento com minhocas da espécie Eisenia

andrei se mostrou uma ferramenta eficiente na análise de solos contaminados

por glifosato sendo capaz de fornecer informações rápidas que auxiliam na

tomada de decisões.

O organismo teste mostrou altas taxas de fuga a todas as concentrações

aplicadas se mostrando sensível ao contaminante em altas concentrações.

Porém, recomenda-se estudos com concentrações menores que 4.000 mg de

glifosato/kg de solo para que se consiga estabelecer com precisão a mínima

concentração de glifosato que apresenta o comportamento de fuga das

minhocas Eisenia andrei. Também, se faz interessante a ampliação dos

estudos, utilizando outros cenários de contaminação, como exposições

múltiplas e também a utilização de outros testes que auxiliem o entendimento

do efeito a longo prazo nos organismos terrestres como ensaios de

reprodução, biomassa e mortalidade.

5. CONCLUSÃO

Os organismos da espécie Eisenia andrei demonstraram sensibilidade

ao agrotóxico glifosato, evidenciando sua capacidade de detectar e evitar esta

substância química quando presente no solo, deste modo podem ser utilizadas

para auxiliar no monitoramento ambiental de áreas contaminadas.

As minhocas manifestaram o comportamento de fuga nas concentrações

de 4.000, 6.000, 8.000 e 10.000 mg.kg-1, sendo a maior taxa de fuga (92%)

relativa a concentração de 6.000 mg.kg-1.

A menor concentração testada capaz de causar o comportamento de

fuga dos organismos da espécie Eisenia andrei e que atende aos critérios

estabelecidos pela ISO 17512-1 (2007) de habitat limitado foi a concentração

de 4.000 mg.kg-1 de solo.

As concentrações de 8.000 mg kg-1 e 10.000 mg kg-1, causaram

alterações significativas no comportamento das minhocas Eisenia andrei como

ausência de movimentos e aglomeração em pontos específicos.

O teste de evitamento com minhocas da espécie Eisenia andrei em solo

natural contaminado com glifosato se mostrou uma ferramenta eficiente na

avaliação de áreas contaminadas, fornecendo respostas precisas em curto

período de tempo além de ser um método de fácil operação e de baixo custo.

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