Avaliação de Pirogênios Em Produtos de Uso Veterinário Pelos Testes Da Hipertermia Em Coelhos e...

7/24/2019 Avaliao de Pirognios Em Produtos de Uso Veterinrio Pelos Testes Da Hipertermia Em Coelhos e Do LAL

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190 Barth et al.

Cincia Rural, v.37, n.1, jan-fev, 2007.

Cincia Rural, Santa Maria, v.37, n.1, p190-194, jan-fev, 2007

ISSN 0103-8478

RESUMO

Realizou-se a avaliao de pirognios em produtos

veterinrios de uso parenteral, pelo mtodo da hipertermia em

coelhos, calculando-se, para o teste das amostras, doses com

concentraes de trs a sete vezes superiores teraputica.

Preconizou-se como resposta positiva o aumento de

temperatura de 0,6C. Utilizou-se tambm o ensaio do lisado

de amebcitos do Limulus (LAL) por geleificao,

semiquantitativo, executando o teste de interferentes, validandoo procedimento e estabelecendo a mxima diluio vlida

para a an lise de cada produto. Parale lamente, efe tuo u-se

avaliao comparativa de amostras com o mtodo do LAL

cromognico, quantitativo, demonstrando correlao e

reprodutibilidade dos resultados. Avaliaram-se vinte e oito

produtos de diferentes classes farmacolgicas, observando-se

que dois no cumpriram as especificaes, sendo reprovados.

Sugere-se que as especificaes estudadas sejam adotadas,

contribuindo para aprimorar o controle de contaminantes,

garantindo a qualidade e a segurana dos produtos

veterinrios.

Palavras-chave: coelhos, pirognios, teste da hipertermia,teste do lisado de amebcitos do Limulus .

ABSTRACT

The rabbit pyrogen test was used to evaluate

veterinary products, suggesting the temperature rise of 0.6C

as the ending point for the positive results. The test doses were

calculated based on the therapeutic dose increased from three

to seven times. The semi-quantitative Limulus amoebocyte

lysate (LAL) gel clot test was performed and compared to the

LAL spectrophotometric chromogenic, quantitat ive assay. The

comparative evaluation of the samples showed correlation and

reproducibility of the results. The interference test was carried

out, the procedure validated and the maximum valid dilution

established for the analysis of the products without

Pharmacopoeial specifications. Two of the twenty-eight products

of different pharmacological groups evaluated didnt meet the

requirements and were reproved. The specifications investigated

are suggested to be used for the purity evaluation of the

veterinary parenteral products, as a contribution to assure the

quality and safety of the products.

Key words: rabbit, pyrogens, temperature rise test, Limulusamoebocyte lysate test.

INTRODUO

Os pirognios podem originar-se debactrias gram-negativas, gram-positivas, de fungos ede vrus. Os moncitos/macrfagos reagem aoscomponentes microbianos, induzindo a liberao de

pirognios endgenos, como prostaglandinas e ascitocinas pr-inflamatrias: interleucina-1, interleucina-6e fator de necrose tumoral-. As endotoxinas

bacterianas so lipopolissacardios complexos de altamassa molecular (~106Da) que constituem a parede

celular de bactrias gram-negativase so formadas peloncleo polissacardico, ao qual se liga a cadeia O-antignicae a unidade lipdica A, que responsvel pelas

propriedades pirognicas. So as mais comumenteencontradas em produtos injetveis de uso veterinrioe humano. Os pirognios so quimicamenteheterogneos e podem apresentar composio eestrutura varivel, as quais influenciam os efeitos

biolgicos como febre, alterao do quadro leucocitrioe choque sptico(KLUGER, 1991; RIETSCHEL et al.,1994; HENDERSON et al., 1996).

IDepartamento de Farmcia Industrial,Universidade Federal de Santa Maria, (UFSM), 97105-900, Santa Maria, RS, Brasil. E-mail:[email protected]. * Autor para correspondncia

IIDepartamento de Cincias Biolgicas,Universidade do Contestado, Concrdia, SC, Brasil.

Avaliao de pirognios em produtos de uso veterinrio pelos testes da hipertermia emcoelhos e do lisado de amebcitos doLimulus

Thiago BarthI Volmir Joo DalmoraII Felipe Bianchini DAvilaI

Srgio Luiz DalmoraI*

Pyrogens in veterinary products by the rabbit pyrogen testand theLimulusamoebocyte lysate test

Recebido para publicao13.07.05 Aprovado em08.03.06


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O teste da hipertermia em coelhos, baseadona injeo intravenosa de solues sob pesquisa, temsido amplamente usado para o controle da qualidade

de preparaes parenterais. A resposta positiva avaliada atravs da elevao da temperatura em 0,5 ou0,6C, segundo a literatura adotada (EP., 2002;HOFFMANN et al., 2005). um teste in vivo queexpressa os efeitos fisiopatolgicos induzidos pelos

pirognios, porm qualitativo, tem baixa sensibilidade,no pode ser usado para frmacos que interferem coma resposta pirognica e utiliza animais, cuja substituioou reduo recomendada (HOFFMANN et al., 2005).

Por sua vez, as observaes de quepreparaes de endotoxinas de Escherichia colicausavam coagulao extracelular do sangue docaranguejo Limulus polyphemus fundamentaram o

desenvolvimento do teste do lisado de amebcitos doLimulus(LAL) in vitro, especfico e altamente sensvelpara detectar endotoxinas de bactrias gram-negativas(LEVIN & BANG, 1964). O teste pode apresentarresultados falsos (negativo ou positivo) com alguns

produtos, antibiticos e vacinas virais (FENNRICH etal., 1999; POOLE & GAINES DAS, 2001).

Os testes da hipertermia em coelhos e doLAL so recomendados pela Farmacopia BritnicaVeterinria (B.P. Vet., 2003), que oficializa tambm asespecificaes descritas pela Europia (EP., 2002). Essestestes so essenciais para o controle de contaminantes

pirognicos nos produtos injetveis e para a validao

das metodologias sob investigao, baseadas no usode linhagens celulares (MOESBY et al., 1999), na culturade sangue total ou de moncitos de sangue humano(FENNRICH et al., 1999; ANDRADE et al., 2003).

O presente trabalho teve por objetivo realizara avaliao de pirognios em medicamentosveterinrios de uso parenteral, pelos testes dahipertermia em coelhos, e do LAL, sugerindo doses eespecificaes que contribuem para aprimorar ocontrole da qualidade e da segurana dos produtos.

MATERIAL E MTODOS

Padro de referncia, reagentes e produtos veterinriosUtilizou-se o segundo padro internacional

de endotoxinas bacterianas, contendo 10.000 unidadesendotxicas (UE) /ampola (WHO 94/580), doado pelo

National Institute for Biological Standards and Control(Inglaterra). Utilizou-se reagente lisado de amebcitosdoLimuluscom sensibilidade de 0,06UE ml-1, CapeCode (EUA) e Biowhittaker (EUA), e tambm novo azulde metileno, Sigma (EUA). Produtos veterinriosinjetveis, disponveis comercialmente, foramselecionados, observando-se o lote e prazo devalidade, e identificados nas tabelas respectivas com

base na subs tnc ia at iva e na concen tr ao ,

acrescentando-se tambm as seguintes associaes:A - dipropionato de imidocarb 120mg e vitamina B120,024mg por ml; B - enrofloxacino 100mg e piroxicam

12mg por ml; C - penicilinas G procana 1.500.000UI,potssica 1.500.000UI, benzatina 3.000.000UI eestreptomicina 2,5g por frasco; D - penicilina G procana200.000UI, estreptomicina 80mg e piroxicam 6mg porml; E - Soluo: cido brico 40mg, gluconato de clcio230mg, cloreto de magnsio 1,6mg, glicerofosfato desdio 30mg, efedrina 0,5mg e glicose 30mg por ml; F -sulfadiazina 400mg e trimetoprima 80 mg por ml; G sulfadoxina 200mg, trimetoprima 40mg e piroxicam 12mg

por ml.

AnimaisForam usados coelhos machos e fmeas da

linhagem Nova Zelndia, provenientes do BiotrioCentral da Universidade Federal de Santa Maria(UFSM).

Teste da hipertermia em coelhosO teste foi executado de acordo com as

recomendaes da literatura (F.BRAS., 1988; EP., 2002),adotando-se as especificaes farmacopicasdisponveis, injetando-se trs coelhos com cadaamostra e registrando-se o aumento individual detemperatura durante trs horas consecutivas. Para osdemais produtos, calcularam-se as dosagens com basena maior posologia recomendada por kg de massa

corporal, pelo Laboratrio Produtor. Para asassociaes com composio expressa em massa,somaram-se os teores das substncias ativas presentesna dosagem sugerida e estabeleceu-se a dose inicial.Por sua vez, para as formulaes com composiodeclarada em unidades e miligramas, avaliou-se aquantidade de cada componente na dosagemteraputica, planejando-se o teste com base naindicao farmacolgica do produto e no frmaco

presente em maior teor, usando-se sua expresso depotncia para a especificao. Em ambos os casos, asdoses foram especificadas com concentraesaproximadas, trs a sete vezes superiores teraputica,

conforme a tabela 1.Validou-se o procedimento para produtoscom excipientes oleosos por via subcutnea,designando-se trs grupos de animais, respectivamente,

para controle positivo, amostra e amostra contaminadacom a dose pirognica equivalente a 15UE ml-1kg-1dosegundo padro internacional de endotoxinas

bacterianas (SILVEIRA et al., 2004). Prolongou-se otempo de leitura, registrando-se as respostascorrespondentes durante quatro horas.

Teste do lisado de amebcitos doLimulus(LAL)Calculou-se o limite de endotoxinas

bacterianas (LEC) para produtos veterinrios de uso


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parenteral, sem especificaes farmacopicas, com basena dose teraputica, pela equao:LEC = K/M, em queK = menor dose pirognica por kg de peso animal, igual

a 5UE kg-1

e M = dose mxima do produto recomendadapor kg de peso no perodo de uma hora.Calculou-se amxima diluio vlida (MDV), que deve apresentarresposta negativa, e realizou-se o teste paraconfirmao da sensibilidade do reagente LAL.

Teste de interferentes e validaoRealizou-se o teste de inibio/

potencializao da resposta pela adio do segundopadro internacional de endotoxinas bacterianas adiferentes diluies de cada produto veterinrio,inferiores a MDV, que, em teste anterior, haviamfornecido resultado negativo, mas que se tornaram

positivas aps a contaminao. A mdia geomtrica(M) para as solues foi calculada pela equao M =antilog (e/f), em quee= soma dos logaritmos damenor concentrao de endotoxinas com reao

positiva em cada srie de diluies da amostra ef=nmero de replicatas. Considerou-se a amostra semfatores interferentes quando a sensibilidade do LAL(), determinada na presena da soluo do produto,foi igual ou maior que 0,5e igual ou menor que 2(EP., 2002; SILVEIRA et al., 2004).

Ensaio por geleificaoO ensaio foi realizado em placas de Petri ou

em tubos de ensaio (SILVEIRA et al., 2004), ajustando-se os volumes dos reagentes e mantendo-se a relaoconstante. Em placa de polietileno, adicionaram-se, emduplicata, 10l do reagente LAL e 10l de cada diluioda amostra ou padro. Incubou-se em estufa a 37 1C

por uma hora. Para leitura da formao de gel ,adicionou-se 1l da soluo de novo azul de metileno0,2% sobre cada ponto de reao, observando-se suamistura (reao negativa) ou distribuio na superfciedo gel (reao positiva). Calculou-se o resultado,multiplicando-se a maior diluio, na qual a respostafoi positiva, e a menor diluio, na qual foi negativa,

pela sensibilidade do reagente LAL. Esses valores

representam a faixa de concentrao de endotoxinasbacterianas em unidades endotxicas.

Ensaio cromognicoO ensaio foi realizado em microplacas de 96

cavidades a 37 1C (EP., 2002), adicionando-se 50ldo padro ou das amostras, respectivamente.Acrescentaram-se, ento, 50l da soluo de lisado deamebcitos doLimuluse procedeu-se incubao damicroplaca por 10 minutos a 371C. A seguir, foram

pipetados 100l da soluo de substrato cromognicoe, aps seis minutos de incubao a 371C,interrompeu-se a reao pela adio de 100l de cido

actico 25%. A absorbncia foi medida em leitor de

placas a 405nm, os valores projetados na curva deendotoxinas padro e os resultados expressos em UEml-1.

RESULTADOS

Realizou-se o teste em coelhos, registrando-se os aumentos individuais de temperatura,concluindo-se pela aprovao ou reprovao de cadafrmaco com base nas especificaes estabelecidas,conforme mostra a tabela 1. Do mesmo modo, foramavaliadas as amostras de florfenicol e ivermectina, emveculo oleoso, que forneceram resultados negativos.

Para o teste do LAL por geleificao,confirmou-se a sensibilidade do reagente do LAL de0,06UE ml-1e, ento, determinou-se a menor diluio

aceitvel e validou-se o teste para os produtos da tabela 2,na qual se observa a mdia geomtrica entre0,5e2,com recuperao de 50 a 200% em relao sensibilidade especificada, bem como os resultadosobtidos.

Pode-se observar, nas tabelas 1 e 2, quealguns produtos, por cumprirem os requisitos do testedo LAL, foram submetidos a avaliao pelos doismtodos, demonstrando a concordncia das respostas

Tabela 1 - Concentraes injetadas e resultados do teste dahipertermia em coelhos, em produtos veterinrios deuso parenteral.

Frmacos Doses kg-1

ResultadoAbamectina 10mg ml-1 0,6 mg/ml Aprovado

Bromexina 30mg/ml-1 0,9 mg/ml Aprovado

Ceftiofur 50mg ml-1 15 mg/5ml Aprovado

Cetoprofeno 100mg ml-1 9 mg/ml Aprovado

Dexametasona 2mg ml-1 0,15 mg/ml Aprovado

Enrofloxacino 25mg ml-1 7,5 mg/ml Aprovado

Florfenicol 300mg ml-1 150 mg/ml* Aprovado

Flumetasona 0,5mg ml-1 0,063 mg/ml Aprovado

Furosemida 10mg ml-1 0,75 mg/ml Aprovado

Heparina 5000UI ml-1 2000 UI/ml Aprovado

Ivermectina 10mg ml-1 1 mg/ml* Aprovado

Levamisol 75mg ml-1 20 mg/ml Aprovado

Metoclopramida 5mg ml-1

3 mg/ml AprovadoOxitetraciclina 200mg ml-1 5 mg/ml1 Aprovado

Sulfxido de albendazol150mg ml-1

10 mg/2ml Aprovado

Associao A 15 mg/ml Aprovado

Associao B 30 mg/ml Aprovado

Associao C 4000 UI/ml Reprovado**

Associao D 4000 UI/ml Aprovado

Associao E 996 mg/6ml Reprovado**

Associao F 2160 mg/3ml Aprovado

Associao G 100 mg/ml Aprovado

*Via subcutnea;1B.P. Veterinria. **Reprovado=presena depirognios.


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e a vantagem de cada procedimento, qualitativo esemiquantitativo.

Realizou-se tambm a avaliaocomparativa de diferentes produtos veterinrios peloteste do LAL com leitura da resposta por geleificao,semiquantitativa, e cromognica espectrofotomtrica,quantitativa. A tabela 3 mostra a reprodutibilidade e aconcordncia dos resultados de acordo com asespecificidades de cada procedimento.

DISCUSSO

Os testes de pirognios so necessriospara avaliar-se a contaminao de frmacos, produtosveterinrios injetveis e materiais de uso hospitalar.Executou-se o teste da hipertermia em coelhos,tambm preconizado para medicamentos de usohumano, adotando-se como resposta positiva oaumento de temperatura de 0,6C (HOFFMANN etal., 2005). Observa-se que as doses-teste foram

planejadas com base na dosagem teraputica,aumentada a fim de detectar-se, com maior segurana,

possveis contaminantes atravs de seu efeitofarmacolgico. Para produtos com veculos oleosos,usados em preparaes de ao prolongada, sugerida, preferencialmente, a avaliao doscomponentes da formulao, ou, havendonecessidade, do produto acabado. As amostras nocumpriram os parmetros de validao do teste doLAL, sendo ento submetidas ao ensaio em coelhos,como mostra a tabela 1.

O mtodo do lisado de amebcitos doLimulus(LAL) foi validado, sempre que possvel, paracada medicamento sob estudo, pois podem serencontrados resultados falsos, devidos interferncia

da substncia ativa ou dos componentes da formulao,estabelecendo-se as especificaes descritas na tabela 2.Alm disso, justificam-se os experimentos comparativoscom o mtodo cromognico, pois rotineiramente tem sidoadotado o mtodo por geleificao, por sua simplicidadee custo, cumprindo os requisitos do controle daqualidade (EP., 2002), em especial da rea veterinria(BRASIL, 2004).

Conclui-se este trabalho, destacando aimportncia do mtodo da hipertermia em coelhos para aavaliao especialmente de associaes de frmacoslargamente empregadas na rea veterinria, bem comodo teste do LAL in vitro,que se constitui um mtodo deescolha com vantagens para os produtos que cumpremos parmetros de validao. Sugere-se que asespecificaes estudadas sejam adotadas para o controlede impurezas contaminantes, contribuindo para garantira qualidade, segurana e eficcia dos produtosveterinrios de uso parenteral.

REFERNCIAS

ANDRADE, S.S. et al. Comparative evaluation of the humanwhole blood and human peripheral blood monocyte tests forpyrogens. International Journal of Pharmaceutics, v.265,p.115-124 , 2003.

Tabela 2 - Resultados do teste de inibio/potencializao e avaliao de produtos veterinrios pelo ensaio do lisado de amebcitos doLimulus(LAL), com sensibilidade de 0,06 UE/ml.

ResultadoFrmacos

Mxima

diluiovlida

Menor

diluiovlida

MdiaUE/ml Limite de endotoxinas UE/ml Final

Amoxicilina 150mg ml-1 1:625 1:32 0,06 0,25 UE/mg2 < 0,06 ABromexina 30mg ml-1 1:833 1:64 0,04 16 UE/mg1 < 0,06 ACetoprofeno 100mg ml-1 1:283 1:32 0,03 1,7 UE/mg1 0,96 1,92 ADexametasona 2mg ml-1 1:3333 1:32 0,04 100 UE/mg1 < 0,06 ADipirona 500mg ml-1 1:5833 1:8 0,03 0,7 UE/mg1 < 0,06 AEnrofloxacino 25mg ml-1 1:416 1:32 0,06 1 UE/mg1 < 0,06 AFenilbutazona 200mg ml-1 1:416 1:32 0,06 0,125 UE/mg1 0,06 0,12 AFlorfenicol 992mcg mg-1 1:625 1:16 0,06 0,125 UE/mg1 0,06 0,12 AFlumetasona 0,5mg ml-1 1:3333 1:8 0,03 400 UE/mg1 < 0,06 AFurosemida 10mg ml-1 1:583 1:64 0,04 3,5 UE/mg2 0,12 0,24 AGentamicina 40mg ml-1 1:1113 1:128 0,06 1,67 UE/mg2 < 0,06 AHeparina 5000UI ml-1 1:2500 1:8 0,03 0,03 UE/UI1 < 0,06 ALevamisol 75mg ml-1 1:1662 1:512 0,03 1,33 UE/mg1 < 0,06 AMetoclopramida 5mg ml-1 1:416 1:16 0,03 5 UE/mg1 0,12 0,24 A

Ocitocina 10UI ml-1 1:8333 0 0,04 50 UE/UI1 < 0,06 AXilazina 20mg ml-1 1:5533 1:2 0,06 16,6 UE/mg1 3,84 7,68 AAssociao C 1:500 1:16 0,06 0,01 UE/100 UI Penicilina G1 61 122 R Associao D 1:333 1:128 0,06 0,01 UE/100 UI Penicilina G1 < 0,06 AAssociao E 1:83 0 0,06 0,015 UE/mg1 491 983 R Associao F 1:1600 1:32 0,03 0,2 UE/mg1 < 0,06 AAssociao G 1:1000 1:128 0,03 0,3 UE/mg1 < 0,06 A

1Calculado DFI; 2EP., 2002; UE=unidades endotxicas; A=aprovado; R=reprovado (presena de pirognios).


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Tabela 3 Resultados dos ensaios para geleificao e cromognico do lisado de amebcitos doLimulus(LAL), em produtos veterinrios.

Teste do LAL

FrmacosLimite de endotoxinas Gel UE ml-1

Cromognico UEml-1

Resultado

Amoxicilina 150mg ml-1 0,25 UE/mg2 < 0,06 < 0,06 Aprovado

Bromexina 30mg ml-1 16 UE/mg1 < 0,06 < 0,06 Aprovado

Cetoprofeno 100mg ml-1 1,7 UE/mg1 0,96 1,92 1,26 Aprovado

Dexametasona 2mg ml-1 100 UE/mg1 < 0,06 < 0,06 Aprovado

Dipirona 500mg ml-1 0,7 UE/mg1 < 0,06 < 0,06 Aprovado

Enrofloxacino 25mg ml-1 1 UE/mg1 < 0,06 < 0,06 Aprovado

Fenilbutazona 200mg ml-1 0,125 UE/mg1 0,06 0,12 0,09 Aprovado

Florfenicol 992mcg mg-1 0,125 UE/mg1 0,06 0,12 0,10 Aprovado

Flumetasona 0,5mg ml-1

400 UE/mg1

< 0,06 < 0,06 AprovadoFurosemida 10mg ml-1 3,5 UE/mg2 0,12 0,24 0,17 Aprovado

Gentamicina 40mg ml-1 1,67 UE/mg2 < 0,06 < 0,06 Aprovado

Heparina 5000UI ml-1 0,03 UE/UI1 < 0,06 < 0,06 Aprovado

Levamisol 75mg ml-1 1,33 UE/mg1 < 0,06 < 0,06 Aprovado

Metoclopramida 5mg ml-1 5 UE/mg1 0,12 0,24 0,13 Aprovado

Ocitocina 10UI ml-1 50 UE/UI1

< 0,06 < 0,06 Aprovado

Xilazina 20mg ml-1 16,6 UE/mg1 3,84 7,68 4,88 Aprovado

Associao C 0,01 UE/100 UI Penicilina G1 61 122 83,6 Reprovado

Associao D 0,01 UE/100 UI Penicilina G1 < 0,06 < 0,06 Aprovado

Associao E 0,015 UE/mg1

491 983 500,24 Reprovado

Associao F 0,2 UE/mg1 < 0,06 < 0,06 Aprovado

Associao G 0,3 UE/mg1 < 0,06 < 0,06 Aprovado

1Calculado DFI; 2EP., 2002; UE=unidades endotxicas.

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