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190 Barth et al.
Cincia Rural, v.37, n.1, jan-fev, 2007.
Cincia Rural, Santa Maria, v.37, n.1, p190-194, jan-fev, 2007
ISSN 0103-8478
RESUMO
Realizou-se a avaliao de pirognios em produtos
veterinrios de uso parenteral, pelo mtodo da hipertermia em
coelhos, calculando-se, para o teste das amostras, doses com
concentraes de trs a sete vezes superiores teraputica.
Preconizou-se como resposta positiva o aumento de
temperatura de 0,6C. Utilizou-se tambm o ensaio do lisado
de amebcitos do Limulus (LAL) por geleificao,
semiquantitativo, executando o teste de interferentes, validandoo procedimento e estabelecendo a mxima diluio vlida
para a an lise de cada produto. Parale lamente, efe tuo u-se
avaliao comparativa de amostras com o mtodo do LAL
cromognico, quantitativo, demonstrando correlao e
reprodutibilidade dos resultados. Avaliaram-se vinte e oito
produtos de diferentes classes farmacolgicas, observando-se
que dois no cumpriram as especificaes, sendo reprovados.
Sugere-se que as especificaes estudadas sejam adotadas,
contribuindo para aprimorar o controle de contaminantes,
garantindo a qualidade e a segurana dos produtos
veterinrios.
Palavras-chave: coelhos, pirognios, teste da hipertermia,teste do lisado de amebcitos do Limulus .
ABSTRACT
The rabbit pyrogen test was used to evaluate
veterinary products, suggesting the temperature rise of 0.6C
as the ending point for the positive results. The test doses were
calculated based on the therapeutic dose increased from three
to seven times. The semi-quantitative Limulus amoebocyte
lysate (LAL) gel clot test was performed and compared to the
LAL spectrophotometric chromogenic, quantitat ive assay. The
comparative evaluation of the samples showed correlation and
reproducibility of the results. The interference test was carried
out, the procedure validated and the maximum valid dilution
established for the analysis of the products without
Pharmacopoeial specifications. Two of the twenty-eight products
of different pharmacological groups evaluated didnt meet the
requirements and were reproved. The specifications investigated
are suggested to be used for the purity evaluation of the
veterinary parenteral products, as a contribution to assure the
quality and safety of the products.
Key words: rabbit, pyrogens, temperature rise test, Limulusamoebocyte lysate test.
INTRODUO
Os pirognios podem originar-se debactrias gram-negativas, gram-positivas, de fungos ede vrus. Os moncitos/macrfagos reagem aoscomponentes microbianos, induzindo a liberao de
pirognios endgenos, como prostaglandinas e ascitocinas pr-inflamatrias: interleucina-1, interleucina-6e fator de necrose tumoral-. As endotoxinas
bacterianas so lipopolissacardios complexos de altamassa molecular (~106Da) que constituem a parede
celular de bactrias gram-negativase so formadas peloncleo polissacardico, ao qual se liga a cadeia O-antignicae a unidade lipdica A, que responsvel pelas
propriedades pirognicas. So as mais comumenteencontradas em produtos injetveis de uso veterinrioe humano. Os pirognios so quimicamenteheterogneos e podem apresentar composio eestrutura varivel, as quais influenciam os efeitos
biolgicos como febre, alterao do quadro leucocitrioe choque sptico(KLUGER, 1991; RIETSCHEL et al.,1994; HENDERSON et al., 1996).
IDepartamento de Farmcia Industrial,Universidade Federal de Santa Maria, (UFSM), 97105-900, Santa Maria, RS, Brasil. E-mail:[email protected]. * Autor para correspondncia
IIDepartamento de Cincias Biolgicas,Universidade do Contestado, Concrdia, SC, Brasil.
Avaliao de pirognios em produtos de uso veterinrio pelos testes da hipertermia emcoelhos e do lisado de amebcitos doLimulus
Thiago BarthI Volmir Joo DalmoraII Felipe Bianchini DAvilaI
Srgio Luiz DalmoraI*
Pyrogens in veterinary products by the rabbit pyrogen testand theLimulusamoebocyte lysate test
Recebido para publicao13.07.05 Aprovado em08.03.06
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O teste da hipertermia em coelhos, baseadona injeo intravenosa de solues sob pesquisa, temsido amplamente usado para o controle da qualidade
de preparaes parenterais. A resposta positiva avaliada atravs da elevao da temperatura em 0,5 ou0,6C, segundo a literatura adotada (EP., 2002;HOFFMANN et al., 2005). um teste in vivo queexpressa os efeitos fisiopatolgicos induzidos pelos
pirognios, porm qualitativo, tem baixa sensibilidade,no pode ser usado para frmacos que interferem coma resposta pirognica e utiliza animais, cuja substituioou reduo recomendada (HOFFMANN et al., 2005).
Por sua vez, as observaes de quepreparaes de endotoxinas de Escherichia colicausavam coagulao extracelular do sangue docaranguejo Limulus polyphemus fundamentaram o
desenvolvimento do teste do lisado de amebcitos doLimulus(LAL) in vitro, especfico e altamente sensvelpara detectar endotoxinas de bactrias gram-negativas(LEVIN & BANG, 1964). O teste pode apresentarresultados falsos (negativo ou positivo) com alguns
produtos, antibiticos e vacinas virais (FENNRICH etal., 1999; POOLE & GAINES DAS, 2001).
Os testes da hipertermia em coelhos e doLAL so recomendados pela Farmacopia BritnicaVeterinria (B.P. Vet., 2003), que oficializa tambm asespecificaes descritas pela Europia (EP., 2002). Essestestes so essenciais para o controle de contaminantes
pirognicos nos produtos injetveis e para a validao
das metodologias sob investigao, baseadas no usode linhagens celulares (MOESBY et al., 1999), na culturade sangue total ou de moncitos de sangue humano(FENNRICH et al., 1999; ANDRADE et al., 2003).
O presente trabalho teve por objetivo realizara avaliao de pirognios em medicamentosveterinrios de uso parenteral, pelos testes dahipertermia em coelhos, e do LAL, sugerindo doses eespecificaes que contribuem para aprimorar ocontrole da qualidade e da segurana dos produtos.
MATERIAL E MTODOS
Padro de referncia, reagentes e produtos veterinriosUtilizou-se o segundo padro internacional
de endotoxinas bacterianas, contendo 10.000 unidadesendotxicas (UE) /ampola (WHO 94/580), doado pelo
National Institute for Biological Standards and Control(Inglaterra). Utilizou-se reagente lisado de amebcitosdoLimuluscom sensibilidade de 0,06UE ml-1, CapeCode (EUA) e Biowhittaker (EUA), e tambm novo azulde metileno, Sigma (EUA). Produtos veterinriosinjetveis, disponveis comercialmente, foramselecionados, observando-se o lote e prazo devalidade, e identificados nas tabelas respectivas com
base na subs tnc ia at iva e na concen tr ao ,
acrescentando-se tambm as seguintes associaes:A - dipropionato de imidocarb 120mg e vitamina B120,024mg por ml; B - enrofloxacino 100mg e piroxicam
12mg por ml; C - penicilinas G procana 1.500.000UI,potssica 1.500.000UI, benzatina 3.000.000UI eestreptomicina 2,5g por frasco; D - penicilina G procana200.000UI, estreptomicina 80mg e piroxicam 6mg porml; E - Soluo: cido brico 40mg, gluconato de clcio230mg, cloreto de magnsio 1,6mg, glicerofosfato desdio 30mg, efedrina 0,5mg e glicose 30mg por ml; F -sulfadiazina 400mg e trimetoprima 80 mg por ml; G sulfadoxina 200mg, trimetoprima 40mg e piroxicam 12mg
por ml.
AnimaisForam usados coelhos machos e fmeas da
linhagem Nova Zelndia, provenientes do BiotrioCentral da Universidade Federal de Santa Maria(UFSM).
Teste da hipertermia em coelhosO teste foi executado de acordo com as
recomendaes da literatura (F.BRAS., 1988; EP., 2002),adotando-se as especificaes farmacopicasdisponveis, injetando-se trs coelhos com cadaamostra e registrando-se o aumento individual detemperatura durante trs horas consecutivas. Para osdemais produtos, calcularam-se as dosagens com basena maior posologia recomendada por kg de massa
corporal, pelo Laboratrio Produtor. Para asassociaes com composio expressa em massa,somaram-se os teores das substncias ativas presentesna dosagem sugerida e estabeleceu-se a dose inicial.Por sua vez, para as formulaes com composiodeclarada em unidades e miligramas, avaliou-se aquantidade de cada componente na dosagemteraputica, planejando-se o teste com base naindicao farmacolgica do produto e no frmaco
presente em maior teor, usando-se sua expresso depotncia para a especificao. Em ambos os casos, asdoses foram especificadas com concentraesaproximadas, trs a sete vezes superiores teraputica,
conforme a tabela 1.Validou-se o procedimento para produtoscom excipientes oleosos por via subcutnea,designando-se trs grupos de animais, respectivamente,
para controle positivo, amostra e amostra contaminadacom a dose pirognica equivalente a 15UE ml-1kg-1dosegundo padro internacional de endotoxinas
bacterianas (SILVEIRA et al., 2004). Prolongou-se otempo de leitura, registrando-se as respostascorrespondentes durante quatro horas.
Teste do lisado de amebcitos doLimulus(LAL)Calculou-se o limite de endotoxinas
bacterianas (LEC) para produtos veterinrios de uso
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parenteral, sem especificaes farmacopicas, com basena dose teraputica, pela equao:LEC = K/M, em queK = menor dose pirognica por kg de peso animal, igual
a 5UE kg-1
e M = dose mxima do produto recomendadapor kg de peso no perodo de uma hora.Calculou-se amxima diluio vlida (MDV), que deve apresentarresposta negativa, e realizou-se o teste paraconfirmao da sensibilidade do reagente LAL.
Teste de interferentes e validaoRealizou-se o teste de inibio/
potencializao da resposta pela adio do segundopadro internacional de endotoxinas bacterianas adiferentes diluies de cada produto veterinrio,inferiores a MDV, que, em teste anterior, haviamfornecido resultado negativo, mas que se tornaram
positivas aps a contaminao. A mdia geomtrica(M) para as solues foi calculada pela equao M =antilog (e/f), em quee= soma dos logaritmos damenor concentrao de endotoxinas com reao
positiva em cada srie de diluies da amostra ef=nmero de replicatas. Considerou-se a amostra semfatores interferentes quando a sensibilidade do LAL(), determinada na presena da soluo do produto,foi igual ou maior que 0,5e igual ou menor que 2(EP., 2002; SILVEIRA et al., 2004).
Ensaio por geleificaoO ensaio foi realizado em placas de Petri ou
em tubos de ensaio (SILVEIRA et al., 2004), ajustando-se os volumes dos reagentes e mantendo-se a relaoconstante. Em placa de polietileno, adicionaram-se, emduplicata, 10l do reagente LAL e 10l de cada diluioda amostra ou padro. Incubou-se em estufa a 37 1C
por uma hora. Para leitura da formao de gel ,adicionou-se 1l da soluo de novo azul de metileno0,2% sobre cada ponto de reao, observando-se suamistura (reao negativa) ou distribuio na superfciedo gel (reao positiva). Calculou-se o resultado,multiplicando-se a maior diluio, na qual a respostafoi positiva, e a menor diluio, na qual foi negativa,
pela sensibilidade do reagente LAL. Esses valores
representam a faixa de concentrao de endotoxinasbacterianas em unidades endotxicas.
Ensaio cromognicoO ensaio foi realizado em microplacas de 96
cavidades a 37 1C (EP., 2002), adicionando-se 50ldo padro ou das amostras, respectivamente.Acrescentaram-se, ento, 50l da soluo de lisado deamebcitos doLimuluse procedeu-se incubao damicroplaca por 10 minutos a 371C. A seguir, foram
pipetados 100l da soluo de substrato cromognicoe, aps seis minutos de incubao a 371C,interrompeu-se a reao pela adio de 100l de cido
actico 25%. A absorbncia foi medida em leitor de
placas a 405nm, os valores projetados na curva deendotoxinas padro e os resultados expressos em UEml-1.
RESULTADOS
Realizou-se o teste em coelhos, registrando-se os aumentos individuais de temperatura,concluindo-se pela aprovao ou reprovao de cadafrmaco com base nas especificaes estabelecidas,conforme mostra a tabela 1. Do mesmo modo, foramavaliadas as amostras de florfenicol e ivermectina, emveculo oleoso, que forneceram resultados negativos.
Para o teste do LAL por geleificao,confirmou-se a sensibilidade do reagente do LAL de0,06UE ml-1e, ento, determinou-se a menor diluio
aceitvel e validou-se o teste para os produtos da tabela 2,na qual se observa a mdia geomtrica entre0,5e2,com recuperao de 50 a 200% em relao sensibilidade especificada, bem como os resultadosobtidos.
Pode-se observar, nas tabelas 1 e 2, quealguns produtos, por cumprirem os requisitos do testedo LAL, foram submetidos a avaliao pelos doismtodos, demonstrando a concordncia das respostas
Tabela 1 - Concentraes injetadas e resultados do teste dahipertermia em coelhos, em produtos veterinrios deuso parenteral.
Frmacos Doses kg-1
ResultadoAbamectina 10mg ml-1 0,6 mg/ml Aprovado
Bromexina 30mg/ml-1 0,9 mg/ml Aprovado
Ceftiofur 50mg ml-1 15 mg/5ml Aprovado
Cetoprofeno 100mg ml-1 9 mg/ml Aprovado
Dexametasona 2mg ml-1 0,15 mg/ml Aprovado
Enrofloxacino 25mg ml-1 7,5 mg/ml Aprovado
Florfenicol 300mg ml-1 150 mg/ml* Aprovado
Flumetasona 0,5mg ml-1 0,063 mg/ml Aprovado
Furosemida 10mg ml-1 0,75 mg/ml Aprovado
Heparina 5000UI ml-1 2000 UI/ml Aprovado
Ivermectina 10mg ml-1 1 mg/ml* Aprovado
Levamisol 75mg ml-1 20 mg/ml Aprovado
Metoclopramida 5mg ml-1
3 mg/ml AprovadoOxitetraciclina 200mg ml-1 5 mg/ml1 Aprovado
Sulfxido de albendazol150mg ml-1
10 mg/2ml Aprovado
Associao A 15 mg/ml Aprovado
Associao B 30 mg/ml Aprovado
Associao C 4000 UI/ml Reprovado**
Associao D 4000 UI/ml Aprovado
Associao E 996 mg/6ml Reprovado**
Associao F 2160 mg/3ml Aprovado
Associao G 100 mg/ml Aprovado
*Via subcutnea;1B.P. Veterinria. **Reprovado=presena depirognios.
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e a vantagem de cada procedimento, qualitativo esemiquantitativo.
Realizou-se tambm a avaliaocomparativa de diferentes produtos veterinrios peloteste do LAL com leitura da resposta por geleificao,semiquantitativa, e cromognica espectrofotomtrica,quantitativa. A tabela 3 mostra a reprodutibilidade e aconcordncia dos resultados de acordo com asespecificidades de cada procedimento.
DISCUSSO
Os testes de pirognios so necessriospara avaliar-se a contaminao de frmacos, produtosveterinrios injetveis e materiais de uso hospitalar.Executou-se o teste da hipertermia em coelhos,tambm preconizado para medicamentos de usohumano, adotando-se como resposta positiva oaumento de temperatura de 0,6C (HOFFMANN etal., 2005). Observa-se que as doses-teste foram
planejadas com base na dosagem teraputica,aumentada a fim de detectar-se, com maior segurana,
possveis contaminantes atravs de seu efeitofarmacolgico. Para produtos com veculos oleosos,usados em preparaes de ao prolongada, sugerida, preferencialmente, a avaliao doscomponentes da formulao, ou, havendonecessidade, do produto acabado. As amostras nocumpriram os parmetros de validao do teste doLAL, sendo ento submetidas ao ensaio em coelhos,como mostra a tabela 1.
O mtodo do lisado de amebcitos doLimulus(LAL) foi validado, sempre que possvel, paracada medicamento sob estudo, pois podem serencontrados resultados falsos, devidos interferncia
da substncia ativa ou dos componentes da formulao,estabelecendo-se as especificaes descritas na tabela 2.Alm disso, justificam-se os experimentos comparativoscom o mtodo cromognico, pois rotineiramente tem sidoadotado o mtodo por geleificao, por sua simplicidadee custo, cumprindo os requisitos do controle daqualidade (EP., 2002), em especial da rea veterinria(BRASIL, 2004).
Conclui-se este trabalho, destacando aimportncia do mtodo da hipertermia em coelhos para aavaliao especialmente de associaes de frmacoslargamente empregadas na rea veterinria, bem comodo teste do LAL in vitro,que se constitui um mtodo deescolha com vantagens para os produtos que cumpremos parmetros de validao. Sugere-se que asespecificaes estudadas sejam adotadas para o controlede impurezas contaminantes, contribuindo para garantira qualidade, segurana e eficcia dos produtosveterinrios de uso parenteral.
REFERNCIAS
ANDRADE, S.S. et al. Comparative evaluation of the humanwhole blood and human peripheral blood monocyte tests forpyrogens. International Journal of Pharmaceutics, v.265,p.115-124 , 2003.
Tabela 2 - Resultados do teste de inibio/potencializao e avaliao de produtos veterinrios pelo ensaio do lisado de amebcitos doLimulus(LAL), com sensibilidade de 0,06 UE/ml.
ResultadoFrmacos
Mxima
diluiovlida
Menor
diluiovlida
MdiaUE/ml Limite de endotoxinas UE/ml Final
Amoxicilina 150mg ml-1 1:625 1:32 0,06 0,25 UE/mg2 < 0,06 ABromexina 30mg ml-1 1:833 1:64 0,04 16 UE/mg1 < 0,06 ACetoprofeno 100mg ml-1 1:283 1:32 0,03 1,7 UE/mg1 0,96 1,92 ADexametasona 2mg ml-1 1:3333 1:32 0,04 100 UE/mg1 < 0,06 ADipirona 500mg ml-1 1:5833 1:8 0,03 0,7 UE/mg1 < 0,06 AEnrofloxacino 25mg ml-1 1:416 1:32 0,06 1 UE/mg1 < 0,06 AFenilbutazona 200mg ml-1 1:416 1:32 0,06 0,125 UE/mg1 0,06 0,12 AFlorfenicol 992mcg mg-1 1:625 1:16 0,06 0,125 UE/mg1 0,06 0,12 AFlumetasona 0,5mg ml-1 1:3333 1:8 0,03 400 UE/mg1 < 0,06 AFurosemida 10mg ml-1 1:583 1:64 0,04 3,5 UE/mg2 0,12 0,24 AGentamicina 40mg ml-1 1:1113 1:128 0,06 1,67 UE/mg2 < 0,06 AHeparina 5000UI ml-1 1:2500 1:8 0,03 0,03 UE/UI1 < 0,06 ALevamisol 75mg ml-1 1:1662 1:512 0,03 1,33 UE/mg1 < 0,06 AMetoclopramida 5mg ml-1 1:416 1:16 0,03 5 UE/mg1 0,12 0,24 A
Ocitocina 10UI ml-1 1:8333 0 0,04 50 UE/UI1 < 0,06 AXilazina 20mg ml-1 1:5533 1:2 0,06 16,6 UE/mg1 3,84 7,68 AAssociao C 1:500 1:16 0,06 0,01 UE/100 UI Penicilina G1 61 122 R Associao D 1:333 1:128 0,06 0,01 UE/100 UI Penicilina G1 < 0,06 AAssociao E 1:83 0 0,06 0,015 UE/mg1 491 983 R Associao F 1:1600 1:32 0,03 0,2 UE/mg1 < 0,06 AAssociao G 1:1000 1:128 0,03 0,3 UE/mg1 < 0,06 A
1Calculado DFI; 2EP., 2002; UE=unidades endotxicas; A=aprovado; R=reprovado (presena de pirognios).
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Tabela 3 Resultados dos ensaios para geleificao e cromognico do lisado de amebcitos doLimulus(LAL), em produtos veterinrios.
Teste do LAL
FrmacosLimite de endotoxinas Gel UE ml-1
Cromognico UEml-1
Resultado
Amoxicilina 150mg ml-1 0,25 UE/mg2 < 0,06 < 0,06 Aprovado
Bromexina 30mg ml-1 16 UE/mg1 < 0,06 < 0,06 Aprovado
Cetoprofeno 100mg ml-1 1,7 UE/mg1 0,96 1,92 1,26 Aprovado
Dexametasona 2mg ml-1 100 UE/mg1 < 0,06 < 0,06 Aprovado
Dipirona 500mg ml-1 0,7 UE/mg1 < 0,06 < 0,06 Aprovado
Enrofloxacino 25mg ml-1 1 UE/mg1 < 0,06 < 0,06 Aprovado
Fenilbutazona 200mg ml-1 0,125 UE/mg1 0,06 0,12 0,09 Aprovado
Florfenicol 992mcg mg-1 0,125 UE/mg1 0,06 0,12 0,10 Aprovado
Flumetasona 0,5mg ml-1
400 UE/mg1
< 0,06 < 0,06 AprovadoFurosemida 10mg ml-1 3,5 UE/mg2 0,12 0,24 0,17 Aprovado
Gentamicina 40mg ml-1 1,67 UE/mg2 < 0,06 < 0,06 Aprovado
Heparina 5000UI ml-1 0,03 UE/UI1 < 0,06 < 0,06 Aprovado
Levamisol 75mg ml-1 1,33 UE/mg1 < 0,06 < 0,06 Aprovado
Metoclopramida 5mg ml-1 5 UE/mg1 0,12 0,24 0,13 Aprovado
Ocitocina 10UI ml-1 50 UE/UI1
< 0,06 < 0,06 Aprovado
Xilazina 20mg ml-1 16,6 UE/mg1 3,84 7,68 4,88 Aprovado
Associao C 0,01 UE/100 UI Penicilina G1 61 122 83,6 Reprovado
Associao D 0,01 UE/100 UI Penicilina G1 < 0,06 < 0,06 Aprovado
Associao E 0,015 UE/mg1
491 983 500,24 Reprovado
Associao F 0,2 UE/mg1 < 0,06 < 0,06 Aprovado
Associao G 0,3 UE/mg1 < 0,06 < 0,06 Aprovado
1Calculado DFI; 2EP., 2002; UE=unidades endotxicas.
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