AVALIAÇÃO DE POTENCIAL GENOTÓXICO DE ... José de Melo Nunes.pdfii AVALIAÇÃO DE POTENCIAL...

AVALIACcedilAtildeO DE POTENCIAL GENOTOacuteXICO DE

ESTERILIZANTE QUIacuteMICO CANINO A BASE DE

GLUCONATO DE ZINCO

Rafael Joseacute de Melo Nunes

Rio de Janeiro

2012

RAFAEL JOSEacute DE MELO NUNES

Aluno do curso de Ciecircncias Bioloacutegicas ndash Modalidade produccedilatildeo

quiacutemico-bioloacutegica

Matriacutecula 0913800217

Avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico de esterilizante

quiacutemico canino a base de gluconato de zinco

Trabalho de conclusatildeo de curso TCC

apresentado ao curso de graduaccedilatildeo de

Ciecircncias Bioloacutegicas ndash Modalidade

produccedilatildeo quiacutemico-bioloacutegicas da UEZO

como parte dos requisitos para a

obtenccedilatildeo de grau bacharel em Ciecircncias

Bioloacutegicas sob a orientaccedilatildeo do

professor Israel Felzenszwalb

Rio de Janeiro

Dezembro de 2012

ii

AVALIACcedilAtildeO DE POTENCIAL GENOTOacuteXICO DE ESTERILIZANTE QUIacuteMICO

CANINO A BASE DE GLUCONATO DE ZINCO

Elaborado por Rafael Joseacute de Melo Nunes

aluno do curso de Ciecircncias Bioloacutegicas ndash Modalidade Produccedilatildeo Quiacutemico-Bioloacutegica

da UEZO

Este trabalho de Graduaccedilatildeo foi avaliado e aprovado com Grau ___________

Rio de Janeiro 14 de dezembro de 2012

________________________________________

Dr Israel Felzenszwalb ndash Orientador Externo

________________________________________

Raphael de Mello Carpes ndash Co-orientador Externo

________________________________________

Dra Vacircnia Luacutecia Muniz de Paacutedua ndash PresidenteExaminador 1

________________________________________

Me Adriano Arnoacutebio Joseacute da Silva e Silva ndash Examinador 2

________________________________________

Dr Faacutebio da Silva Azevedo Fortes ndash Suplente

Rio de Janeiro

Dezembro de 2012

iii

Dedico este trabalho aos meus familiares

iv

Agradecimentos

A Deus por manter-se sempre presente em minha vida em todos os momentos

A minha famiacutelia por toda compreensatildeo e apoio prestado durante as ausecircncias os

momentos de desespero e ao conforto passado quando este se fez necessaacuterio

A Larissa Rodrigues Florido Rocha que pacientemente aceitou ser trocada por

este trabalho inuacutemeras vezes e mesmo assim continuou a caminhar ao meu lado

A meus amigos pela diversatildeo pelas conversas pelos momentos de

descontraccedilatildeo e pelo apoio fiacutesico e moral para que este trabalho fosse concluiacutedo

A meus colegas de turma pela uniatildeo e pelos laccedilos criados durante todo o periacuteodo

da graduaccedilatildeo

A todos os professores que passaram pela minha vida pelo apoio prestado para

meu desenvolvimento intelectual e por sempre me encorajarem a seguir em

frente

A meu orientador Israel Felzenszwalb por ser soliacutecito e estar sempre disposto a

me ouvir e me aconselhar para o melhor desenvolvimento do trabalho

A professora Claudia Aiub pela oportunidade a mim apresentada no segundo

periacuteodo com a qual pude desenvolver meu trabalho ateacute o presente momento

A meu co-orientador Raphael de Mello Carpes pela companhia pelo

aprendizado pelos conselhos pelo acompanhamento durante a realizaccedilatildeo dos

v

experimentos e pela cobranccedila para que este trabalho pudesse ser desenvolvido

sem atrasos

A Ana Maria Azevedo Velho por ter sido a intermediadora dos meus primeiros

passos durante a iniciaccedilatildeo cientiacutefica e por ter ajudado em meu desenvolvimento

inicial

A toda esquipe do Laboratoacuterio de Mutagecircnese Ambiental (LabMut) pelo

companheirismo pelas conversas pelo suporte e por toda a ajuda prestada

Obrigado Andreacuteia Fernandes Andrea Kaezer Claudia Rainho Carlos Fernando

Francisco Mello Vanessa Gomes Mazzei Marcia Lopes e Ludmilla Bergsten

A meus ldquoirmatildeos cientiacuteficosrdquo Alessandra Quirino Marcos Felipe Julianna Siciliano

Camila Gervasio Wanderon Melo Eduardo Rodrigues e Michelle Silva sem os

quais os dias de trabalho duro no laboratoacuterio seriam mais penosos e as horas de

almoccedilo solitaacuterias

A todas as bacteacuterias e macroacutefagos que morreram para a realizaccedilatildeo deste

trabalho

vi

RESUMO

A falta de controle na natalidade de catildees em grandes cidades pode ser visto

como um problema de sauacutede puacuteblica e bem estar animal com o abandono de

diversos animais nas ruas sujeitos aos maus tratos acidentes e transmissatildeo de

zoonoses Para um controle efetivo da natalidade diversos meacutetodos vecircm sendo

estudados e adotados visando o bem estar e a sauacutede animal O meacutetodo quiacutemico

estudado desde 1977 gera lesotildees e atrofias nas ceacutelulas germinativas ou oclusotildees

no ducto deferente ou epidiacutedimo e vem sendo amplamente utilizado por ser

facilmente realizado a campo sem a necessidade de matildeo de obra especializada

e com custo reduzido com relaccedilatildeo a outros meacutetodos Um produto a base de

gluconato de zinco foi avaliado pelos ensaios Salmonellamicrossoma (Teste de

Ames) com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica e ensaio de micronuacutecleo para

identificaccedilatildeo de possiacutevel atividade citotoacutexica genotoacutexica e clastogecircnica Os

resultados sugerem que o produto possui certo risco de causar lesatildeo no DNA

para uma das linhagens bacterianas na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena e

alta citotoxicidade em concentraccedilotildees elevadas para ceacutelulas eucariotas

Palavras-chave esterilizaccedilatildeo quiacutemica gluconato de zinco toxicologia

mutagenicidade micronuacutecleo

SUMAacuteRIO

RESUMO vi

1 INTRODUCcedilAtildeO 9

11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM ESTAR

ANIMAL 9

12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA 10

13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO 12

14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS 13

2 JUSTIFICATIVA 14

3 OBJETIVOS 14

31 OBJETIVOS GERAIS 14

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 14

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 15

41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE 15

42 LINHAGENS BACTERIANAS 15

43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA 17

431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico) 17

432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico) 19

433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana 20

434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo 21

44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS 22

45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 23

5 RESULTADOS 24




513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de citotoxicidade

para preacute-incubaccedilatildeo 26


6 DISCUSSAtildeO 30

7 CONCLUSAtildeO 31

8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 32

9

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM

ESTAR ANIMAL

A falta de controle na natalidade de catildees nas grandes cidades sejam catildees

domeacutesticos ou abandonados acabam por representar um problema de sauacutede

puacuteblica e bem estar animal (WORLD HEALTH ORGANIZATION 1992 WORLD

SOCIETY FOR PROTECTION ANIMAL1999 KUTZLER amp WOOD 2006) Cada

vez mais catildees satildeo abandonados nas ruas pelos donos correndo o risco de

atropelamento recebendo maus tratos e adquirindo e transmitindo zoonoses aos

seres humanos (ARCA BRASIL 2003 KUTZLER amp WOOD 2006)

Para que haja algum controle do nuacutemero de animais inuacutemeros meacutetodos

vecircm sendo descritos para prever ou interromper o ciclo reprodutivo Dentre os

meacutetodos descritos encontram-se desde intervenccedilotildees ciruacutergicas e controle

hormonal a mais recentemente introduzida no mercado controle quiacutemico e

imunoloacutegico (CONCANNON 1995)

A intervenccedilatildeo ciruacutergica apesar de ser um meacutetodo garantido possui certas

limitaccedilotildees como 1) necessidade de ambiente controlado 2) alto custo 3)

necessidade de profissionais especializados 4) baixo nuacutemero de animais

esterilizados por dia de trabalho e 5) riscos poacutes-operatoacuterios por serem

consideradas muito invasivas e difiacuteceis de serem realizadas agrave campo

(SOERENSEN et al 2007) Muitos donos tambeacutem se negam a adotar a teacutecnica

para esterilizaccedilatildeo de seus animais alegando que eacute um meacutetodo invasivo e

incompatiacutevel com o bem estar animal (SOTO 2003 IMMEGART amp THRELFALL

2000)

Como taacutetica de controle hormonal esteroacuteides (como estrogecircnio com

progestina ou somente progestina) foram oralmente administrados em catildees de

laboratoacuterio para suprimir a ovulaccedilatildeo (BRIGGS 1983 JOHNSON 1989) Poreacutem

realizando avaliaccedilotildees a longo prazo foram constatados o aparecimento de

piometra (acuacutemulo de secreccedilotildees glandulares no uacutetero causando infecccedilatildeo

10

bacteriana) e hiperplasia ciacutestica endometrial (desenvolvimento exacerbado do

endomeacutetrio com presenccedila de cistos) nos animais mostrando ser esse um

meacutetodo arriscado de controle reprodutivo (WEIKEL amp NELSON 1977)

O controle imunoloacutegico pode ser realizado pela injeccedilatildeo de zona peluacutecida

suiacutena em fecircmeas de outras espeacutecies A zona peluacutecida eacute a regiatildeo extracelular que

recobre o ovoacutecito de todos os mamiacuteferos servindo de camada protetora ateacute a

fixaccedilatildeo embrionaacuteria no uacutetero (WOLGEMUTH et al 1984) Sua injeccedilatildeo em fecircmeas

gera reaccedilatildeo imunoloacutegica impedindo a ligaccedilatildeo e penetraccedilatildeo do espermatozoide

no ovoacutecito obtendo assim um controle temporaacuterio da fertilizaccedilatildeo Possui alto grau

de eficiecircncia e natildeo apresenta efeitos colaterais mas satildeo necessaacuterias vaacuterias

aplicaccedilotildees jaacute que eacute um meacutetodo naturalmente reversiacutevel e a resposta eacute variaacutevel

de um animal a outro (BARBER amp FAYRER-ROSKEN 2000 FAYRER-ROSKEN

et al 2000)

Os agentes quiacutemicos comeccedilaram a ser vendidos por volta do ano de 2003

com a entrada do Neutersolreg no mercado americano aprovada pela Food And

Drugs Admininstration (ANON 2003 WIEBE amp HOWARD 2009) poreacutem essa

alternativa jaacute vinha sendo testada desde a deacutecada de 70 em catildees (DIXIT et al

1975 PINEDA et al 1977 NISHIMURA et al 1992 IMMEGART amp THRELFALL

2000) e desde a deacutecada de 1950 em outros animais (FREUND et al 1953) Satildeo

soluccedilotildees injetadas nos testiacuteculos dos machos gerando atrofia das ceacutelulas

germinativas testiculares e diminuiccedilatildeo da espermatogecircnese (SILVA et al 2009)

ou no ducto deferente ou no epidiacutedimo causando oclusatildeo fibrosa dos canais

(OLIVEIRA 2007) oferecendo menos efeitos colaterais e maior seguranccedila e

vantagem durante e apoacutes o procedimento

12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA

A esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute um processo estudado haacute mais de cinco deacutecadas

(FREUND 1953) primeiramente testado em Cavia porcellus (porquinhos-da-

iacutendia) Eacute realizada com a injeccedilatildeo de um agente esclerosante no testiacuteculo no

epidiacutedimo ou no ducto deferente do animal A castraccedilatildeo por esse procedimento eacute

irreversiacutevel (TEPSUMETHANON et al 2005) devido a seus efeitos nas ceacutelulas

germinativas mas mesmo assim natildeo satildeo vistos efeitos colaterais Os agentes

11

esclerosantes agem por meio de uma resposta sistecircmica imune causando

ruptura da membrana das ceacutelulas de Sertoli sendo responsaacuteveis tambeacutem

inflamaccedilatildeo local e liberaccedilatildeo de antiacutegenos testiculares (JOHNSTON et al 2001)

Dixit et al (1975) realizaram um estudo preliminar no qual observou-se

infertilidade irreversiacutevel em animais que receberam aplicaccedilatildeo de uma injeccedilatildeo de

10 de nitrato de prata 36 de formaldeiacutedo 5 de permanganato de potaacutessio

diluiacutedos em etanol absoluto Pineda et al (1977) observaram azoospermia em

catildees 90 dias apoacutes injeccedilatildeo na cauda do epidiacutedimo de formalina a 35

solubilizada em tampatildeo salina fosfato (do inglecircs Phosfate buffer saline ndash PBS)

juntamente com gluconato de clorexidina a 15 diluiacutedo em dimetilsulfoacutexido

(DMSO) a 50 Poreacutem somente com a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo de formalina ocorre

oligospermia ou azoospermia temporaacuteria Essa condiccedilatildeo foi observada por todo o

tempo de duraccedilatildeo do experimento 357 dias e comparada com grupo controle

que recebeu injeccedilatildeo de soluccedilatildeo salina a 09 que natildeo apresentou qualquer

modificaccedilatildeo histopatoloacutegica Dixit (1979) observou atrofia testicular e epididimal e

azoospermia em catildees que receberam uma dose de 05 mL de soluccedilotildees a 100

mgmL de methallibure dexametazona metopiron niridazol -clorohidrina ou

danazol

Barnett (1985) observou azoospermia 35 dias apoacutes o tratamento ao injetar

05 mL de uma soluccedilatildeo aquosa de gluconato de clorexidina a 45 na cauda do

epidiacutedimo Essa condiccedilatildeo durou por 4 meses Nishimura et al (1992) realizou o

procedimento de esterilizaccedilatildeo quiacutemica com injeccedilatildeo de aacutecido laacutetico em testiacuteculos

de ratos e catildees obtendo tambeacutem resultados satisfatoacuterios

Fahim et al (1993) observaram azoospermia sem graves efeitos

histoloacutegicos apoacutes 90 dias da injeccedilatildeo de uma soluccedilatildeo agrave base de zinco e arginina

(100 mgmL) na cauda do epidiacutedimo Immegart e Threfall (2000) realizaram

experimentos com injeccedilatildeo intratesticular de glicerol que segundo os autores natildeo

apresentou boa difusatildeo celular e consequentemente nenhuma accedilatildeo esterilizante

No ano de 2003 ocorreu a entrada do Neutersolreg no mercado aprovada

pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos O produto utiliza

gluconato de zinco como princiacutepio ativo e eacute neutralizado pela adiccedilatildeo de arginina

Apoacutes a compra do formulado pela empresa Ark Science LLC o produto passou a

ser comercializado sob outro nome Esterilsolreg (ACCampD[1]) No Brasil haacute

12

registros de outros produtos utilizando o mesmo princiacutepio ativo Testoblockreg

(BioRelease Technologies) e Infertilereg (Rhobifarma)

13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO

Os produtos utilizando compostos agrave base de zinco possuem boa toleracircncia

por parte dos animais sem reaccedilotildees adversas nem efeitos colaterais afetando

somente as ceacutelulas no tecido em que satildeo injetados (TEPSUMETHANON 2005)

Isso se deve agrave natildeo-toxicidade sistecircmica do zinco tornando processos de

intoxicaccedilatildeo por excesso raros sendo mais grave sua deficiecircncia (LEacuteONARD et

al 1986) O zinco eacute um importante mineral como cofator de diversas enzimas

(HIDIROGLOU amp KNIPFEL 1984) e na espermatogecircnese e na composiccedilatildeo do

secircmen (FAHIM et al 1993) Poreacutem em concentraccedilotildees muito altas atua como

inibidor da divisatildeo e replicaccedilatildeo de ceacutelulas germinativas e causa fragmentaccedilatildeo no

nuacutecleo e da membrana celular (FAHIM et al 1993 BLOOMBERG 1996) assim

como outros estudos relatam tambeacutem a toxicidade do zinco no desenvolvimento e

reproduccedilatildeo animal (SAXENA et al 1989 EVERSON et al 1993)

Fahim et al (1993) foram os primeiros a testar e comprovar a eficiecircncia de

soluccedilotildees agrave base de zinco em um procedimento de castraccedilatildeo canina com agente

esclerosante A azoospermia induzida pela injeccedilatildeo de zinco e arginina (soluccedilatildeo a

11 M) apareceu trecircs meses apoacutes a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo e perdurou por um ano

apoacutes a aplicaccedilatildeo (todo o periacuteodo do experimento)

O primeiro produto comercialmente aprovado pela FDA a base de

gluconato de zinco foi o Neutersolreg com a finalidade de esterilizaccedilatildeo quiacutemica

animal mas antes passou por diversos testes para comprovar sua eficaacutecia

(WANG 2002) No Brasil o primeiro produto com gluconato de zinco como

princiacutepio ativo foi o Testoblockreg (BioRelease Technologies Birmingham AL

USA) lanccedilado em 2003 Sua eficaacutecia foi comprovada por Oliveira et al (2006) e

os resultados foram corroborados por Oliveira (2007) Silva (2009) e Muller

(2010)

Em Satildeo Paulo no municiacutepio de Ibiuacutena outro produto a base de gluconato

de zinco (Infertilereg) foi testado em ensaios com catildees abandonados no abrigo

ldquoLar Satildeo Francisco de Assisrdquo (SOTO et al 2007 e 2009) Os animais

13

apresentaram mudanccedilas nas ceacutelulas germinativas do testiacuteculo produzindo menos

ceacutelulas espermaacuteticas e com altas taxas de defeitos de formaccedilatildeo

Figura 1 Infertile (fonte http2bpblogspotcom--p_N-

3hKAeITwUBCoqXznIAAAAAAAABrwimRGYZlSbows16000252C252C18878555-

FMMP252C00jpg)

14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS

Para avaliaccedilatildeo de potenciais substacircncias mutagecircnicas o ensaio mais

utilizado eacute o ensaio de reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma por ser um

meacutetodo de baixo custo raacutepido seguro e amplamente utilizado por vaacuterios

laboratoacuterios Neste ensaio organismos procariotos satildeo postos em contato com a

substacircncia a ser testada para averiguaccedilatildeo de possiacutevel dano ao DNA E para

mimetizar a metabolizaccedilatildeo de organismos eucariotos pode-se fazer uso de um

mix de enzimas do complexo P450 (citocromo P) conhecido como S9 mix para

uma avaliaccedilatildeo completa da accedilatildeo da substacircncia (MARON amp AMES 1983)

A importacircncia de estudos genotoacutexicos sobre uma certa amostra estaacute na

detecccedilatildeo da capacidade de agentes quiacutemicos ou fiacutesicos de gerar danos ao DNA

direta ou indiretamente Atraveacutes dos testes de genotoxicidade os processos que

causam lesatildeo ao DNA podem ser identificados assim como tambeacutem pode-se

indicar o risco que a amostra possui Em caso de resultados positivos tanto em

testes in vitro como in vivo essa amostra apresenta substacircncias com potenciais

14

atividades mutagecircnicas e carcinogecircnicas para a espeacutecie humana (OECD

4711997)

2 JUSTIFICATIVA

O controle populacional de animais nas grandes cidades eacute um problema e

diversos meacutetodos foram descritos visando uma soluccedilatildeo O meacutetodo de

esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute o que tem se mostrado mais economica e praticamente

viaacutevel No entanto devido ao seu potencial genotoacutexico e citotoacutexico satildeo

necessaacuterios estudos que comprovem que sua accedilatildeo eacute local O presente trabalho

se justifica devido agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica ser baseada em accedilatildeo

genotoacutexicacitotoacutexica para ceacutelulas germinativas A utilizaccedilatildeo de meacutetodos in vitro

permite a avaliaccedilatildeo do potencial genotoacutexico e citotoacutexico da droga em eventos

sistecircmicos

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVOS GERAIS

Realizar a anaacutelise toxicoloacutegica de um produto agrave base de gluconato de zinco

utilizado para esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina (Infertilereg)

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

1 Identificar se haacute atividade citotoacutexica ou mutagecircnica pelo ensaio de

reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica

2 Observar se o produto possui atividade clastogecircnica a partir do ensaio

de micronuacutecleo

15

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE

Os ensaios toxicoloacutegicos foram realizados com ampolas do produto

(Infertile) de lote 00109 gentilmente cedidas pela professora Helena de Godoy

Bergallo do Laboratoacuterio de Ecologia de Pequenos Mamiacuteferos da Univeridade do

Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Para realizaccedilatildeo da diluiccedilotildees utilizadas durante

os testes o solvente utilizado foi o DMSO

42 LINHAGENS BACTERIANAS

Linhagens bacterianas de Salmonella typhimurium com mutaccedilotildees no gene

His+ satildeo utilizadas como indicadoras de danos no DNA para o ensaio

Salmonellamicrossoma (teste de Ames) Cada linhagem possui uma mutaccedilatildeo

diferente no gene His+ que pode ser revertida de acordo com o efeito da

substacircncia testada como mudanccedila no quadro de leitura substituiccedilatildeo deleccedilatildeo ou

adiccedilatildeo de pares de bases (MARON amp AMES 1983)

As linhagens bacterianas mais utilizadas consideradas como linhagens

baacutesicas padratildeo satildeo TA97 TA98 TA100 e TA102 (OECD 4711997) Cada uma

delas possui uma mutaccedilatildeo em determinado locus de seu DNA locus esse

responsaacutevel pela biossiacutentese do aminoaacutecido histidina tornando cada linhagem

sensiacutevel a um dano especiacutefico (MARON amp AMES 1983)

A linhagem TA97 apresenta uma mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD6610 e

hisO1242 com a adiccedilatildeo de citocinas) que ao ser revertida por deleccedilatildeo de pares

de bases GC gera um aumento de colocircnias revertentes caracterizando uma

mutaccedilatildeo induzida do tipo ldquoframeshiftrdquo (alteraccedilatildeo no quadro de leitura do RNA

mensageiro) A linhagem TA98 possui mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD3052) que

quando alterada por adiccedilatildeo de pares de bases CG indicando uma mutaccedilatildeo do

tipo ldquoframeshiftrdquo restaura o quadro de leitura para a siacutentese de histidina A

linhagem TA100 possui mutaccedilatildeo (hisG46) que substitui o aminoaacutecido prolina (no

fenoacutetipo selvagem) pela leucina (substituiccedilatildeo do par de bases GC para AT) Esta

16

linhagem detecta mutaacutegenos que substituem pares de base AT por GC A

linhagem TA102 possui uma mutaccedilatildeo no locus hisG428 Ao contraacuterio das outras

linhagens esta possui o par AT no local criacutetico da reversatildeo identificando

mutaccedilotildees por substituiccedilatildeo de pares de bases GC por AT (LEVIN et al 1982

MARON amp AMES 1983)

Aleacutem das modificaccedilotildees no gene His+ as linhagens tambeacutem possuem

outras mutaccedilotildees para aumentar sua sensibilidade agraves diversas substacircncias

testadas A mutaccedilatildeo uvrB eacute uma deleccedilatildeo do gene que codificaria uma proteiacutena

envolvida no sistema de reparo por excisatildeo de nucleotiacutedeos Sua ausecircncia resulta

em um aumento da sensibilidade na detecccedilatildeo de diversos mutaacutegenos que ao

lesarem o DNA requeiram esta via de reparo A linhagem TA102 natildeo apresenta

esta mutaccedilatildeo pois seu objetivo eacute detectar mutaacutegenos que exigem o bom

funcionamento deste sistema A mutaccedilatildeo rfa (presente em todas as linhagens)

confere perda parcial da barreira de polissacariacutedeo da membrana celular

aumentando a permeabilidade e facilitando a entrada de grandes moleacuteculas As

linhagens tambeacutem apresentam o plasmiacutedeo pKM101 (R+) que confere resistecircncia

ao antibioacutetico ampicilina A linhagem TA102 ainda conteacutem o plasmiacutedeo pAQ1 que

confere resistecircncia ao antibioacutetico tetraciclina A presenccedila do plasmiacutedeo aumenta

a detecccedilatildeo a mutaacutegenos em contraste a fraca ou nula detecccedilatildeo quando ausente

(MARON amp AMES 1983)

17

Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella

typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames

Linhagem Mutaccedilatildeo em

His+

Plasmiacutedeos Outras

mutaccedilotildees

Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel

TA97 hisD6610

hisO1242

pKM101 rfa

(uvrB chl

bio)

Frameshift Adiccedilatildeo de um

par GC

TA98 hisD3052 pKM101 rfa

(uvrB chl

bio)

Frameshift Deleccedilatildeo de

um par GC

TA100 hisG46 pKM101 rfa

(uvrB chl

bio)

Substituiccedilatildeo GC para AT

TA102 pAQ1

(hisG428)

pKM101

pAQ1

Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC

Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo

mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a

complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9

A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute

composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-

tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no

nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos

compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute

necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico


43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA

431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)

18

Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees

As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria

Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)

acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina

(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a

fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio

contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e

284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo

bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e

vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL

extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do

produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos

controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas

foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste

ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de

crescimento

O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na

concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os

experimentos foram realizados em triplicata

Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)

19

432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)


As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB

acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para

TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109

ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo

tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo

bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de

histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio

miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto

puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados

no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento

bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas

Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de

crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos

Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-

oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98

azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e

mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como

controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102

e H2O destilada para TA100

Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)

20

433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana


As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria

Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de

ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do

produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou

negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-

mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos

foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L

de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de

citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de

histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi

vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo

incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas

Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo

foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a

linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)

(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)

(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de

metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97

e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e

TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St

Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97

TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100

A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade

quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o

nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma

resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi

encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)

Todos os experimentos foram realizados em triplicata

21

Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana

434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo

Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10

microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute

retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular

final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota

(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram

incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas


A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor

ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a

sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle

negativo

22

Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo

44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS

O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do

nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de

cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal

O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A

linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em

confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma

lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium

(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de

NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-

serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de

ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle

Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e

penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com

atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos

Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo

e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10

do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o

meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM

23

Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por

24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle

negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-

nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM

Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o

meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de

Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas

com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido

ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a

temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-

phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos

lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e

postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do

iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as

percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram

analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de

comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata

Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago

45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

24

Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de

citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em

macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi

realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel

em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)

5 RESULTADOS



O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito

citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as

diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram

fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi

observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade

relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens

bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana

TA98 com os controles negativo e positivo

25

Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98



mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as

diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por

placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e

comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de

induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das

concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo

mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles

negativo e positivo

26


513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de

citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo

Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees

das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios

quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar

numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos

Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo

Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena

27

Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena

Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia

TA97 0 10 144 plusmn 114 100

10 13 182 plusmn 159 100

20 11 1643 plusmn 46 100

50 08 1223 plusmn 222 100

100 11 154 plusmn 87 100

Positivo 45 6467 plusmn 574 100

TA98 0 10 217 plusmn 106 100

10 18 38 plusmn 125 100

20 20 427 plusmn 6 100

50 25 55 plusmn 3 100

100 27 577 plusmn 49 100


TA100 0 10 172 plusmn 92 100

10 14 2343 plusmn 117 100

20 15 253 plusmn 276 100

50 17 2937 plusmn 333 100

100 18 3127 plusmn 595 100


TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100

10 11 3155 plusmn 587 100

20 07 2005 plusmn 361 100

50 07 2107 plusmn 325 100

100 07 2005 plusmn 1082 100


1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela

amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2

Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa

valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia

lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002

As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta

significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e

com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98

expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial

com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo

do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua

28

concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de

reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena

Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena


TA97 0 1 1235 plusmn 21 100

10 06 78 plusmn 42 100

20 07 81 plusmn 0 100

50 06 775 plusmn 49 100

100 07 845 plusmn 177 998


TA98 0 1 175 plusmn 07 100

10 09 155 plusmn 21 100

20 09 165 plusmn 49 89

50 17 295 plusmn 07 100

100 16 285 plusmn 21 100


TA100 0 1 1675 plusmn 12 100

10 16 261 plusmn 99 100

20 18 302 plusmn 41 100

50 12 2045 plusmn 163 100

100 14 228 plusmn 49 100


TA102 0 1 5225 plusmn 134 100

10 07 3915 plusmn 785 30

20 08 4095 plusmn 78 199

50 07 3765 plusmn 78 411

100 07 367 plusmn 85 339


1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela





Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou

resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia

muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes

29

metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de

revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as

cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo

exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles

positivos


O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na

tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e

no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores

concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose

evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto

Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile

Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo

DMSO 44 04 03 06

10 40 03 06 18

Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

100 03 01 184 01

ControlePositivo 60 15 19 20

1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058

No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros

analisados pelo ensaio circulados em vermelho

30

Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares

A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO

O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo

utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e

incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp

Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho

Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo

Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o

produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados

Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia

de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das

linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto

31

se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no

quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice

mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a

possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito

mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo

substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de

metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para

nenhuma das linhagens

O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico

do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de

mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo

Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular

jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a

diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com

micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de

dano celular de efeito toacutexico

Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero

de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito

clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um

aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na

concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em

concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e

Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade

do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do

animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto

A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria

local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose

eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido

intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o

local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios

7 CONCLUSAtildeO

32

O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria

e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e

controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de

micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato

de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina

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castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo

ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007

SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP

estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos

eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia

Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e

Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p

SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB

HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either

associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs

Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007

SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009

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RAFAEL JOSEacute DE MELO NUNES

Aluno do curso de Ciecircncias Bioloacutegicas ndash Modalidade produccedilatildeo

quiacutemico-bioloacutegica

Matriacutecula 0913800217

Avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico de esterilizante

quiacutemico canino a base de gluconato de zinco

Trabalho de conclusatildeo de curso TCC

apresentado ao curso de graduaccedilatildeo de

Ciecircncias Bioloacutegicas ndash Modalidade

produccedilatildeo quiacutemico-bioloacutegicas da UEZO

como parte dos requisitos para a

obtenccedilatildeo de grau bacharel em Ciecircncias

Bioloacutegicas sob a orientaccedilatildeo do

professor Israel Felzenszwalb

Rio de Janeiro

Dezembro de 2012

ii





da UEZO



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Agradecimentos












frente







v


sem atrasos



inicial










trabalho

vi

RESUMO


















SUMAacuteRIO

RESUMO vi



ANIMAL 9




2 JUSTIFICATIVA 14

3 OBJETIVOS 14













5 RESULTADOS 24







6 DISCUSSAtildeO 30

7 CONCLUSAtildeO 31


9



ESTAR ANIMAL





















2000)






10













et al 2000)



















11


















danazol
















12




























(2010)




13





FMMP252C00jpg)
















14


4711997)

2 JUSTIFICATIVA









sistecircmicos

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVOS GERAIS







de micronuacutecleo

15





























16





















17




His+


mutaccedilotildees


TA97 hisD6610

hisO1242

pKM101 rfa

(uvrB chl

bio)


par GC


(uvrB chl

bio)


um par GC


(uvrB chl

bio)


TA102 pAQ1

(hisG428)

pKM101

pAQ1














18
















crescimento





19























20































21













negativo

22





















23




















24






5 RESULTADOS











25











negativo e positivo

26










27



TA97 0 10 144 plusmn 114 100

10 13 182 plusmn 159 100

20 11 1643 plusmn 46 100

50 08 1223 plusmn 222 100

100 11 154 plusmn 87 100


TA98 0 10 217 plusmn 106 100

10 18 38 plusmn 125 100

20 20 427 plusmn 6 100

50 25 55 plusmn 3 100

100 27 577 plusmn 49 100


TA100 0 10 172 plusmn 92 100

10 14 2343 plusmn 117 100

20 15 253 plusmn 276 100

50 17 2937 plusmn 333 100

100 18 3127 plusmn 595 100


TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100

10 11 3155 plusmn 587 100

20 07 2005 plusmn 361 100

50 07 2107 plusmn 325 100

100 07 2005 plusmn 1082 100













28





TA97 0 1 1235 plusmn 21 100

10 06 78 plusmn 42 100

20 07 81 plusmn 0 100

50 06 775 plusmn 49 100

100 07 845 plusmn 177 998


TA98 0 1 175 plusmn 07 100

10 09 155 plusmn 21 100

20 09 165 plusmn 49 89

50 17 295 plusmn 07 100

100 16 285 plusmn 21 100


TA100 0 1 1675 plusmn 12 100

10 16 261 plusmn 99 100

20 18 302 plusmn 41 100

50 12 2045 plusmn 163 100

100 14 228 plusmn 49 100


TA102 0 1 5225 plusmn 134 100

10 07 3915 plusmn 785 30

20 08 4095 plusmn 78 199

50 07 3765 plusmn 78 411

100 07 367 plusmn 85 339










29





positivos









DMSO 44 04 03 06

10 40 03 06 18

Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

100 03 01 184 01





30


A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











31































7 CONCLUSAtildeO

32











20112012



143


2003 p 3







2000

33





NYpp 73-95 1983












1993



34



Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















35









UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























37







3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

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Agradecimentos












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sem atrasos



inicial










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RESUMO


















SUMAacuteRIO

RESUMO vi



ANIMAL 9




2 JUSTIFICATIVA 14

3 OBJETIVOS 14













5 RESULTADOS 24







6 DISCUSSAtildeO 30

7 CONCLUSAtildeO 31


9



ESTAR ANIMAL





















2000)






10













et al 2000)



















11


















danazol
















12




























(2010)




13





FMMP252C00jpg)
















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4711997)

2 JUSTIFICATIVA









sistecircmicos

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVOS GERAIS







de micronuacutecleo

15





























16





















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His+


mutaccedilotildees


TA97 hisD6610

hisO1242

pKM101 rfa

(uvrB chl

bio)


par GC


(uvrB chl

bio)


um par GC


(uvrB chl

bio)


TA102 pAQ1

(hisG428)

pKM101

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18
















crescimento





19























20































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negativo

22





















23




















24






5 RESULTADOS











25











negativo e positivo

26










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TA97 0 10 144 plusmn 114 100

10 13 182 plusmn 159 100

20 11 1643 plusmn 46 100

50 08 1223 plusmn 222 100

100 11 154 plusmn 87 100


TA98 0 10 217 plusmn 106 100

10 18 38 plusmn 125 100

20 20 427 plusmn 6 100

50 25 55 plusmn 3 100

100 27 577 plusmn 49 100


TA100 0 10 172 plusmn 92 100

10 14 2343 plusmn 117 100

20 15 253 plusmn 276 100

50 17 2937 plusmn 333 100

100 18 3127 plusmn 595 100


TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100

10 11 3155 plusmn 587 100

20 07 2005 plusmn 361 100

50 07 2107 plusmn 325 100

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TA98 0 1 175 plusmn 07 100

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50 12 2045 plusmn 163 100

100 14 228 plusmn 49 100


TA102 0 1 5225 plusmn 134 100

10 07 3915 plusmn 785 30

20 08 4095 plusmn 78 199

50 07 3765 plusmn 78 411

100 07 367 plusmn 85 339










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positivos









DMSO 44 04 03 06

10 40 03 06 18

Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

100 03 01 184 01





30


A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











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2003 p 3







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NYpp 73-95 1983












1993



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Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















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UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























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3 n 1-2 pp 167-177 1977









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SUMAacuteRIO

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ANIMAL 9




2 JUSTIFICATIVA 14

3 OBJETIVOS 14













5 RESULTADOS 24







6 DISCUSSAtildeO 30

7 CONCLUSAtildeO 31


9



ESTAR ANIMAL





















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2 JUSTIFICATIVA









sistecircmicos

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVOS GERAIS







de micronuacutecleo

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His+


mutaccedilotildees


TA97 hisD6610

hisO1242

pKM101 rfa

(uvrB chl

bio)


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um par GC


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bio)


TA102 pAQ1

(hisG428)

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crescimento





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negativo

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5 RESULTADOS











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TA97 0 10 144 plusmn 114 100

10 13 182 plusmn 159 100

20 11 1643 plusmn 46 100

50 08 1223 plusmn 222 100

100 11 154 plusmn 87 100


TA98 0 10 217 plusmn 106 100

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TA100 0 10 172 plusmn 92 100

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TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100

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50 07 2107 plusmn 325 100

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100 14 228 plusmn 49 100


TA102 0 1 5225 plusmn 134 100

10 07 3915 plusmn 785 30

20 08 4095 plusmn 78 199

50 07 3765 plusmn 78 411

100 07 367 plusmn 85 339










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positivos









DMSO 44 04 03 06

10 40 03 06 18

Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

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A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











31































7 CONCLUSAtildeO

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2003 p 3







2000

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NYpp 73-95 1983












1993



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Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















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UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











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3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

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Agradecimentos












frente







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RESUMO


















SUMAacuteRIO

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ANIMAL 9




2 JUSTIFICATIVA 14

3 OBJETIVOS 14













5 RESULTADOS 24







6 DISCUSSAtildeO 30

7 CONCLUSAtildeO 31


9



ESTAR ANIMAL





















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2 JUSTIFICATIVA









sistecircmicos

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVOS GERAIS







de micronuacutecleo

15





























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His+


mutaccedilotildees


TA97 hisD6610

hisO1242

pKM101 rfa

(uvrB chl

bio)


par GC


(uvrB chl

bio)


um par GC


(uvrB chl

bio)


TA102 pAQ1

(hisG428)

pKM101

pAQ1














18
















crescimento





19























20































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negativo

22





















23




















24






5 RESULTADOS











25











negativo e positivo

26










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TA97 0 10 144 plusmn 114 100

10 13 182 plusmn 159 100

20 11 1643 plusmn 46 100

50 08 1223 plusmn 222 100

100 11 154 plusmn 87 100


TA98 0 10 217 plusmn 106 100

10 18 38 plusmn 125 100

20 20 427 plusmn 6 100

50 25 55 plusmn 3 100

100 27 577 plusmn 49 100


TA100 0 10 172 plusmn 92 100

10 14 2343 plusmn 117 100

20 15 253 plusmn 276 100

50 17 2937 plusmn 333 100

100 18 3127 plusmn 595 100


TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100

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50 06 775 plusmn 49 100

100 07 845 plusmn 177 998


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TA102 0 1 5225 plusmn 134 100

10 07 3915 plusmn 785 30

20 08 4095 plusmn 78 199

50 07 3765 plusmn 78 411

100 07 367 plusmn 85 339










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positivos









DMSO 44 04 03 06

10 40 03 06 18

Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

100 03 01 184 01





30


A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











31































7 CONCLUSAtildeO

32











20112012



143


2003 p 3







2000

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NYpp 73-95 1983












1993



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Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















35









UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























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3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

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RESUMO


















SUMAacuteRIO

RESUMO vi



ANIMAL 9




2 JUSTIFICATIVA 14

3 OBJETIVOS 14













5 RESULTADOS 24







6 DISCUSSAtildeO 30

7 CONCLUSAtildeO 31


9



ESTAR ANIMAL





















2000)






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et al 2000)



















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FMMP252C00jpg)
















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2 JUSTIFICATIVA









sistecircmicos

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVOS GERAIS







de micronuacutecleo

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His+


mutaccedilotildees


TA97 hisD6610

hisO1242

pKM101 rfa

(uvrB chl

bio)


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um par GC


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TA102 pAQ1

(hisG428)

pKM101

pAQ1














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crescimento





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20































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negativo

22





















23




















24






5 RESULTADOS











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negativo e positivo

26










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TA97 0 10 144 plusmn 114 100

10 13 182 plusmn 159 100

20 11 1643 plusmn 46 100

50 08 1223 plusmn 222 100

100 11 154 plusmn 87 100


TA98 0 10 217 plusmn 106 100

10 18 38 plusmn 125 100

20 20 427 plusmn 6 100

50 25 55 plusmn 3 100

100 27 577 plusmn 49 100


TA100 0 10 172 plusmn 92 100

10 14 2343 plusmn 117 100

20 15 253 plusmn 276 100

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100 18 3127 plusmn 595 100


TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100

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20 07 2005 plusmn 361 100

50 07 2107 plusmn 325 100

100 07 2005 plusmn 1082 100













28





TA97 0 1 1235 plusmn 21 100

10 06 78 plusmn 42 100

20 07 81 plusmn 0 100

50 06 775 plusmn 49 100

100 07 845 plusmn 177 998


TA98 0 1 175 plusmn 07 100

10 09 155 plusmn 21 100

20 09 165 plusmn 49 89

50 17 295 plusmn 07 100

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TA100 0 1 1675 plusmn 12 100

10 16 261 plusmn 99 100

20 18 302 plusmn 41 100

50 12 2045 plusmn 163 100

100 14 228 plusmn 49 100


TA102 0 1 5225 plusmn 134 100

10 07 3915 plusmn 785 30

20 08 4095 plusmn 78 199

50 07 3765 plusmn 78 411

100 07 367 plusmn 85 339










29





positivos









DMSO 44 04 03 06

10 40 03 06 18

Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

100 03 01 184 01





30


A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











31































7 CONCLUSAtildeO

32











20112012



143


2003 p 3







2000

33





NYpp 73-95 1983












1993



34



Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















35









UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























37







3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

vi

RESUMO


















SUMAacuteRIO

RESUMO vi



ANIMAL 9




2 JUSTIFICATIVA 14

3 OBJETIVOS 14













5 RESULTADOS 24







6 DISCUSSAtildeO 30

7 CONCLUSAtildeO 31


9



ESTAR ANIMAL





















2000)






10













et al 2000)



















11


















danazol
















12




























(2010)




13





FMMP252C00jpg)
















14


4711997)

2 JUSTIFICATIVA









sistecircmicos

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVOS GERAIS







de micronuacutecleo

15





























16





















17




His+


mutaccedilotildees


TA97 hisD6610

hisO1242

pKM101 rfa

(uvrB chl

bio)


par GC


(uvrB chl

bio)


um par GC


(uvrB chl

bio)


TA102 pAQ1

(hisG428)

pKM101

pAQ1














18
















crescimento





19























20































21













negativo

22





















23




















24






5 RESULTADOS











25











negativo e positivo

26










27



TA97 0 10 144 plusmn 114 100

10 13 182 plusmn 159 100

20 11 1643 plusmn 46 100

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100 11 154 plusmn 87 100


TA98 0 10 217 plusmn 106 100

10 18 38 plusmn 125 100

20 20 427 plusmn 6 100

50 25 55 plusmn 3 100

100 27 577 plusmn 49 100


TA100 0 10 172 plusmn 92 100

10 14 2343 plusmn 117 100

20 15 253 plusmn 276 100

50 17 2937 plusmn 333 100

100 18 3127 plusmn 595 100


TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100

10 11 3155 plusmn 587 100

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100 07 2005 plusmn 1082 100













28





TA97 0 1 1235 plusmn 21 100

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100 07 845 plusmn 177 998


TA98 0 1 175 plusmn 07 100

10 09 155 plusmn 21 100

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50 17 295 plusmn 07 100

100 16 285 plusmn 21 100


TA100 0 1 1675 plusmn 12 100

10 16 261 plusmn 99 100

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100 14 228 plusmn 49 100


TA102 0 1 5225 plusmn 134 100

10 07 3915 plusmn 785 30

20 08 4095 plusmn 78 199

50 07 3765 plusmn 78 411

100 07 367 plusmn 85 339










29





positivos









DMSO 44 04 03 06

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Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

100 03 01 184 01





30


A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











31































7 CONCLUSAtildeO

32











20112012



143


2003 p 3







2000

33





NYpp 73-95 1983












1993



34



Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















35









UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























37







3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

SUMAacuteRIO

RESUMO vi



ANIMAL 9




2 JUSTIFICATIVA 14

3 OBJETIVOS 14













5 RESULTADOS 24







6 DISCUSSAtildeO 30

7 CONCLUSAtildeO 31


9



ESTAR ANIMAL





















2000)






10













et al 2000)



















11


















danazol
















12




























(2010)




13





FMMP252C00jpg)
















14


4711997)

2 JUSTIFICATIVA









sistecircmicos

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVOS GERAIS







de micronuacutecleo

15





























16





















17




His+


mutaccedilotildees


TA97 hisD6610

hisO1242

pKM101 rfa

(uvrB chl

bio)


par GC


(uvrB chl

bio)


um par GC


(uvrB chl

bio)


TA102 pAQ1

(hisG428)

pKM101

pAQ1














18
















crescimento





19























20































21













negativo

22





















23




















24






5 RESULTADOS











25











negativo e positivo

26










27



TA97 0 10 144 plusmn 114 100

10 13 182 plusmn 159 100

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100 11 154 plusmn 87 100


TA98 0 10 217 plusmn 106 100

10 18 38 plusmn 125 100

20 20 427 plusmn 6 100

50 25 55 plusmn 3 100

100 27 577 plusmn 49 100


TA100 0 10 172 plusmn 92 100

10 14 2343 plusmn 117 100

20 15 253 plusmn 276 100

50 17 2937 plusmn 333 100

100 18 3127 plusmn 595 100


TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100

10 11 3155 plusmn 587 100

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28





TA97 0 1 1235 plusmn 21 100

10 06 78 plusmn 42 100

20 07 81 plusmn 0 100

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100 07 845 plusmn 177 998


TA98 0 1 175 plusmn 07 100

10 09 155 plusmn 21 100

20 09 165 plusmn 49 89

50 17 295 plusmn 07 100

100 16 285 plusmn 21 100


TA100 0 1 1675 plusmn 12 100

10 16 261 plusmn 99 100

20 18 302 plusmn 41 100

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100 14 228 plusmn 49 100


TA102 0 1 5225 plusmn 134 100

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20 08 4095 plusmn 78 199

50 07 3765 plusmn 78 411

100 07 367 plusmn 85 339










29





positivos









DMSO 44 04 03 06

10 40 03 06 18

Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

100 03 01 184 01





30


A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











31































7 CONCLUSAtildeO

32











20112012



143


2003 p 3







2000

33





NYpp 73-95 1983












1993



34



Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















35









UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























37







3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999




6 DISCUSSAtildeO 30

7 CONCLUSAtildeO 31


9



ESTAR ANIMAL





















2000)






10













et al 2000)



















11


















danazol
















12




























(2010)




13





FMMP252C00jpg)
















14


4711997)

2 JUSTIFICATIVA









sistecircmicos

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVOS GERAIS







de micronuacutecleo

15





























16





















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His+


mutaccedilotildees


TA97 hisD6610

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(uvrB chl

bio)


par GC


(uvrB chl

bio)


um par GC


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bio)


TA102 pAQ1

(hisG428)

pKM101

pAQ1














18
















crescimento





19























20































21













negativo

22





















23




















24






5 RESULTADOS











25











negativo e positivo

26










27



TA97 0 10 144 plusmn 114 100

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TA100 0 10 172 plusmn 92 100

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28





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TA98 0 1 175 plusmn 07 100

10 09 155 plusmn 21 100

20 09 165 plusmn 49 89

50 17 295 plusmn 07 100

100 16 285 plusmn 21 100


TA100 0 1 1675 plusmn 12 100

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TA102 0 1 5225 plusmn 134 100

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50 07 3765 plusmn 78 411

100 07 367 plusmn 85 339










29





positivos









DMSO 44 04 03 06

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Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

100 03 01 184 01





30


A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











31































7 CONCLUSAtildeO

32











20112012



143


2003 p 3







2000

33





NYpp 73-95 1983












1993



34



Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















35









UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























37







3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

9



ESTAR ANIMAL





















2000)






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et al 2000)



















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danazol
















12




























(2010)




13





FMMP252C00jpg)
















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4711997)

2 JUSTIFICATIVA









sistecircmicos

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVOS GERAIS







de micronuacutecleo

15





























16





















17




His+


mutaccedilotildees


TA97 hisD6610

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pKM101 rfa

(uvrB chl

bio)


par GC


(uvrB chl

bio)


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(uvrB chl

bio)


TA102 pAQ1

(hisG428)

pKM101

pAQ1














18
















crescimento





19























20































21













negativo

22





















23




















24






5 RESULTADOS











25











negativo e positivo

26










27



TA97 0 10 144 plusmn 114 100

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100 27 577 plusmn 49 100


TA100 0 10 172 plusmn 92 100

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TA98 0 1 175 plusmn 07 100

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TA100 0 1 1675 plusmn 12 100

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29





positivos









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Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

100 03 01 184 01





30


A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











31































7 CONCLUSAtildeO

32











20112012



143


2003 p 3







2000

33





NYpp 73-95 1983












1993



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Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















35









UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























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3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

10













et al 2000)



















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danazol
















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(2010)




13





FMMP252C00jpg)
















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4711997)

2 JUSTIFICATIVA









sistecircmicos

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVOS GERAIS







de micronuacutecleo

15





























16





















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His+


mutaccedilotildees


TA97 hisD6610

hisO1242

pKM101 rfa

(uvrB chl

bio)


par GC


(uvrB chl

bio)


um par GC


(uvrB chl

bio)


TA102 pAQ1

(hisG428)

pKM101

pAQ1














18
















crescimento





19























20































21













negativo

22





















23




















24






5 RESULTADOS











25











negativo e positivo

26










27



TA97 0 10 144 plusmn 114 100

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100 07 2005 plusmn 1082 100













28





TA97 0 1 1235 plusmn 21 100

10 06 78 plusmn 42 100

20 07 81 plusmn 0 100

50 06 775 plusmn 49 100

100 07 845 plusmn 177 998


TA98 0 1 175 plusmn 07 100

10 09 155 plusmn 21 100

20 09 165 plusmn 49 89

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TA100 0 1 1675 plusmn 12 100

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29





positivos









DMSO 44 04 03 06

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Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

100 03 01 184 01





30


A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











31































7 CONCLUSAtildeO

32











20112012



143


2003 p 3







2000

33





NYpp 73-95 1983












1993



34



Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















35









UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























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3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

11


















danazol
















12




























(2010)




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FMMP252C00jpg)
















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4711997)

2 JUSTIFICATIVA









sistecircmicos

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVOS GERAIS







de micronuacutecleo

15





























16





















17




His+


mutaccedilotildees


TA97 hisD6610

hisO1242

pKM101 rfa

(uvrB chl

bio)


par GC


(uvrB chl

bio)


um par GC


(uvrB chl

bio)


TA102 pAQ1

(hisG428)

pKM101

pAQ1














18
















crescimento





19























20































21













negativo

22





















23




















24






5 RESULTADOS











25











negativo e positivo

26










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TA97 0 10 144 plusmn 114 100

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TA98 0 1 175 plusmn 07 100

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positivos









DMSO 44 04 03 06

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50 74 131 19 47

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A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











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7 CONCLUSAtildeO

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Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















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UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











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USA WSPA v53 1999

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(2010)




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2 JUSTIFICATIVA









sistecircmicos

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVOS GERAIS







de micronuacutecleo

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His+


mutaccedilotildees


TA97 hisD6610

hisO1242

pKM101 rfa

(uvrB chl

bio)


par GC


(uvrB chl

bio)


um par GC


(uvrB chl

bio)


TA102 pAQ1

(hisG428)

pKM101

pAQ1














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crescimento





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20































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negativo

22





















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5 RESULTADOS











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negativo e positivo

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TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100

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TA97 0 1 1235 plusmn 21 100

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50 06 775 plusmn 49 100

100 07 845 plusmn 177 998


TA98 0 1 175 plusmn 07 100

10 09 155 plusmn 21 100

20 09 165 plusmn 49 89

50 17 295 plusmn 07 100

100 16 285 plusmn 21 100


TA100 0 1 1675 plusmn 12 100

10 16 261 plusmn 99 100

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TA102 0 1 5225 plusmn 134 100

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20 08 4095 plusmn 78 199

50 07 3765 plusmn 78 411

100 07 367 plusmn 85 339










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positivos









DMSO 44 04 03 06

10 40 03 06 18

Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

100 03 01 184 01





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A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











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7 CONCLUSAtildeO

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Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















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UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











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3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

13





FMMP252C00jpg)
















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2 JUSTIFICATIVA









sistecircmicos

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVOS GERAIS







de micronuacutecleo

15





























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His+


mutaccedilotildees


TA97 hisD6610

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(uvrB chl

bio)


par GC


(uvrB chl

bio)


um par GC


(uvrB chl

bio)


TA102 pAQ1

(hisG428)

pKM101

pAQ1














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crescimento





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20































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negativo

22





















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5 RESULTADOS











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negativo e positivo

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positivos









DMSO 44 04 03 06

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A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











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Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















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UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











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3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

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2 JUSTIFICATIVA









sistecircmicos

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVOS GERAIS







de micronuacutecleo

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His+


mutaccedilotildees


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(uvrB chl

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TA102 pAQ1

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pKM101

pAQ1














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crescimento





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negativo

22





















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5 RESULTADOS











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negativo e positivo

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A Mitose

B Micronuacutecleo

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Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











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USA WSPA v53 1999

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His+


mutaccedilotildees


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(uvrB chl

bio)


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(uvrB chl

bio)


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bio)


TA102 pAQ1

(hisG428)

pKM101

pAQ1














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crescimento





19























20































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negativo

22





















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5 RESULTADOS











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negativo e positivo

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50 07 2107 plusmn 325 100

100 07 2005 plusmn 1082 100













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positivos









DMSO 44 04 03 06

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Infertile 20 85 12 09 99

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A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











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35









UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























37







3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

16





















17




His+


mutaccedilotildees


TA97 hisD6610

hisO1242

pKM101 rfa

(uvrB chl

bio)


par GC


(uvrB chl

bio)


um par GC


(uvrB chl

bio)


TA102 pAQ1

(hisG428)

pKM101

pAQ1














18
















crescimento





19























20































21













negativo

22





















23




















24






5 RESULTADOS











25











negativo e positivo

26










27



TA97 0 10 144 plusmn 114 100

10 13 182 plusmn 159 100

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TA98 0 10 217 plusmn 106 100

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20 20 427 plusmn 6 100

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TA100 0 10 172 plusmn 92 100

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50 07 2107 plusmn 325 100

100 07 2005 plusmn 1082 100













28





TA97 0 1 1235 plusmn 21 100

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TA98 0 1 175 plusmn 07 100

10 09 155 plusmn 21 100

20 09 165 plusmn 49 89

50 17 295 plusmn 07 100

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TA100 0 1 1675 plusmn 12 100

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100 07 367 plusmn 85 339










29





positivos









DMSO 44 04 03 06

10 40 03 06 18

Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

100 03 01 184 01





30


A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











31































7 CONCLUSAtildeO

32











20112012



143


2003 p 3







2000

33





NYpp 73-95 1983












1993



34



Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















35









UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























37







3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

17




His+


mutaccedilotildees


TA97 hisD6610

hisO1242

pKM101 rfa

(uvrB chl

bio)


par GC


(uvrB chl

bio)


um par GC


(uvrB chl

bio)


TA102 pAQ1

(hisG428)

pKM101

pAQ1














18
















crescimento





19























20































21













negativo

22





















23




















24






5 RESULTADOS











25











negativo e positivo

26










27



TA97 0 10 144 plusmn 114 100

10 13 182 plusmn 159 100

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100 11 154 plusmn 87 100


TA98 0 10 217 plusmn 106 100

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TA100 0 10 172 plusmn 92 100

10 14 2343 plusmn 117 100

20 15 253 plusmn 276 100

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100 18 3127 plusmn 595 100


TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100

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100 07 2005 plusmn 1082 100













28





TA97 0 1 1235 plusmn 21 100

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50 06 775 plusmn 49 100

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TA98 0 1 175 plusmn 07 100

10 09 155 plusmn 21 100

20 09 165 plusmn 49 89

50 17 295 plusmn 07 100

100 16 285 plusmn 21 100


TA100 0 1 1675 plusmn 12 100

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50 07 3765 plusmn 78 411

100 07 367 plusmn 85 339










29





positivos









DMSO 44 04 03 06

10 40 03 06 18

Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

100 03 01 184 01





30


A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











31































7 CONCLUSAtildeO

32











20112012



143


2003 p 3







2000

33





NYpp 73-95 1983












1993



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Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















35









UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























37







3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

18
















crescimento





19























20































21













negativo

22





















23




















24






5 RESULTADOS











25











negativo e positivo

26










27



TA97 0 10 144 plusmn 114 100

10 13 182 plusmn 159 100

20 11 1643 plusmn 46 100

50 08 1223 plusmn 222 100

100 11 154 plusmn 87 100


TA98 0 10 217 plusmn 106 100

10 18 38 plusmn 125 100

20 20 427 plusmn 6 100

50 25 55 plusmn 3 100

100 27 577 plusmn 49 100


TA100 0 10 172 plusmn 92 100

10 14 2343 plusmn 117 100

20 15 253 plusmn 276 100

50 17 2937 plusmn 333 100

100 18 3127 plusmn 595 100


TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100

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100 07 2005 plusmn 1082 100













28





TA97 0 1 1235 plusmn 21 100

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20 07 81 plusmn 0 100

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100 07 845 plusmn 177 998


TA98 0 1 175 plusmn 07 100

10 09 155 plusmn 21 100

20 09 165 plusmn 49 89

50 17 295 plusmn 07 100

100 16 285 plusmn 21 100


TA100 0 1 1675 plusmn 12 100

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100 14 228 plusmn 49 100


TA102 0 1 5225 plusmn 134 100

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50 07 3765 plusmn 78 411

100 07 367 plusmn 85 339










29





positivos









DMSO 44 04 03 06

10 40 03 06 18

Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

100 03 01 184 01





30


A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











31































7 CONCLUSAtildeO

32











20112012



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2003 p 3







2000

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NYpp 73-95 1983












1993



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Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















35









UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























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3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

19























20































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negativo

22





















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5 RESULTADOS











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negativo e positivo

26










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TA97 0 10 144 plusmn 114 100

10 13 182 plusmn 159 100

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TA98 0 10 217 plusmn 106 100

10 18 38 plusmn 125 100

20 20 427 plusmn 6 100

50 25 55 plusmn 3 100

100 27 577 plusmn 49 100


TA100 0 10 172 plusmn 92 100

10 14 2343 plusmn 117 100

20 15 253 plusmn 276 100

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TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100

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TA97 0 1 1235 plusmn 21 100

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TA98 0 1 175 plusmn 07 100

10 09 155 plusmn 21 100

20 09 165 plusmn 49 89

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TA102 0 1 5225 plusmn 134 100

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29





positivos









DMSO 44 04 03 06

10 40 03 06 18

Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

100 03 01 184 01





30


A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











31































7 CONCLUSAtildeO

32











20112012



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2003 p 3







2000

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NYpp 73-95 1983












1993



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Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















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UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























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3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

20































21













negativo

22





















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5 RESULTADOS











25











negativo e positivo

26










27



TA97 0 10 144 plusmn 114 100

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TA98 0 10 217 plusmn 106 100

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100 27 577 plusmn 49 100


TA100 0 10 172 plusmn 92 100

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20 15 253 plusmn 276 100

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TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100

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TA97 0 1 1235 plusmn 21 100

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TA98 0 1 175 plusmn 07 100

10 09 155 plusmn 21 100

20 09 165 plusmn 49 89

50 17 295 plusmn 07 100

100 16 285 plusmn 21 100


TA100 0 1 1675 plusmn 12 100

10 16 261 plusmn 99 100

20 18 302 plusmn 41 100

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100 14 228 plusmn 49 100


TA102 0 1 5225 plusmn 134 100

10 07 3915 plusmn 785 30

20 08 4095 plusmn 78 199

50 07 3765 plusmn 78 411

100 07 367 plusmn 85 339










29





positivos









DMSO 44 04 03 06

10 40 03 06 18

Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

100 03 01 184 01





30


A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











31































7 CONCLUSAtildeO

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20112012



143


2003 p 3







2000

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NYpp 73-95 1983












1993



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Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















35









UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























37







3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

21













negativo

22





















23




















24






5 RESULTADOS











25











negativo e positivo

26










27



TA97 0 10 144 plusmn 114 100

10 13 182 plusmn 159 100

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50 08 1223 plusmn 222 100

100 11 154 plusmn 87 100


TA98 0 10 217 plusmn 106 100

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100 27 577 plusmn 49 100


TA100 0 10 172 plusmn 92 100

10 14 2343 plusmn 117 100

20 15 253 plusmn 276 100

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100 18 3127 plusmn 595 100


TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100

10 11 3155 plusmn 587 100

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50 07 2107 plusmn 325 100

100 07 2005 plusmn 1082 100













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TA97 0 1 1235 plusmn 21 100

10 06 78 plusmn 42 100

20 07 81 plusmn 0 100

50 06 775 plusmn 49 100

100 07 845 plusmn 177 998


TA98 0 1 175 plusmn 07 100

10 09 155 plusmn 21 100

20 09 165 plusmn 49 89

50 17 295 plusmn 07 100

100 16 285 plusmn 21 100


TA100 0 1 1675 plusmn 12 100

10 16 261 plusmn 99 100

20 18 302 plusmn 41 100

50 12 2045 plusmn 163 100

100 14 228 plusmn 49 100


TA102 0 1 5225 plusmn 134 100

10 07 3915 plusmn 785 30

20 08 4095 plusmn 78 199

50 07 3765 plusmn 78 411

100 07 367 plusmn 85 339










29





positivos









DMSO 44 04 03 06

10 40 03 06 18

Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

100 03 01 184 01





30


A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











31































7 CONCLUSAtildeO

32











20112012



143


2003 p 3







2000

33





NYpp 73-95 1983












1993



34



Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















35









UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























37







3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

22





















23




















24






5 RESULTADOS











25











negativo e positivo

26










27



TA97 0 10 144 plusmn 114 100

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Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















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UFRPE 2010



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UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























37







3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

29





positivos









DMSO 44 04 03 06

10 40 03 06 18

Infertile 20 85 12 09 99

50 74 131 19 47

100 03 01 184 01





30


A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











31































7 CONCLUSAtildeO

32











20112012



143


2003 p 3







2000

33





NYpp 73-95 1983












1993



34



Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















35









UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























37







3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

30


A Mitose

B Micronuacutecleo

C Apoptose

D Necrose

6 DISCUSSAtildeO











31































7 CONCLUSAtildeO

32











20112012



143


2003 p 3







2000

33





NYpp 73-95 1983












1993



34



Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















35









UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























37







3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

31































7 CONCLUSAtildeO

32











20112012



143


2003 p 3







2000

33





NYpp 73-95 1983












1993



34



Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















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UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











36























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3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

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20112012



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2003 p 3







2000

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NYpp 73-95 1983












1993



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Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















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UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











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3 n 1-2 pp 167-177 1977









USA WSPA v53 1999

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NYpp 73-95 1983












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Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















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UFRPE 2010



Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











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USA WSPA v53 1999

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Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984




















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Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











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USA WSPA v53 1999

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Develop v 38 p 263-266 1992


Mutation Test 1997











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USA WSPA v53 1999

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USA WSPA v53 1999

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