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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS Faculdade de Odontologia AVALIAÇÃO DO ÍNDICE APOPTÓTICO EM CISTOS E GRANULOMAS PERIAPICAIS Rosana Maria Leal Belo Horizonte 2003
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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS Faculdade de Odontologia
AVALIAÇÃO DO ÍNDICE APOPTÓTICO EM CISTOS E GRANULOMAS PERIAPICAIS
Rosana Maria Leal
Belo Horizonte 2003
ROSANA MARIA LEAL
AVALIAÇÃO DO ÍNDICE APOPTÓTICO EM CISTOS E GRANULOMAS PERIAPICAIS
Dissertação apresentada ao curso de
Mestrado em Clínicas Odontológicas com
ênfase em Estomatologia da Faculdade de
Odontologia da Pontifícia Universidade
Católica de Minas Gerais, como parte dos
requisitos necessários para obtenção do
grau de mestre.
Orientadora: Profa. Helenice de Andrade Marigo
Co-orientadora: Profa. Franca Arenare Jeunon
BELO HORIZONTE 2003
Rosana Maria Leal
AVALIAÇÃO DO ÍNDICE APOPTÓTICO EM CISTOS E GRANULOMAS
PERIAPICAIS
Dissertação apresentada ao curso de Mestrado em Clínicas Odontológicas
com ênfase em Estomatologia da Faculdade de Odontologia da Pontifícia
Universidade Católica de Minas Gerais,
Belo Horizonte, 16 de dezembro de 2003
Profa. Helenice de Andrade Marigo (Orientadora) – PUC Minas
Profa. Mireile São Geraldo dos Santos Souza – FAFEID Diamantina
Prof. Carlos Roberto Martins – PUC Minas
Agradeço a Deus pela vida e por estar
presente no meu coração.
Ao meu pai, José Leal (in memorium),
apesar de não estar mais ao meu lado,
sempre me incentivou e tenho certeza
que continua me abençoando sempre.
A minha querida mãe, Maria Lima Leal
pela imensa compreensão, dedicação,
estímulo, paciência e tanto amor.
Aos meus primos Maria das Graças e
Luiz Henrique pelo carinho e apoio nos
momentos difíceis.
Aos meus queridos Daniel, Thiago,
Gabriela e Luigi pelas alegrias ao
longo de todos esses anos.
O meu agradecimento em especial a
Helen Madson Queiroz (in memorium),
por tudo que realizou no curto período
que permaneceu entre nós, e por me
guiar desde o inicio da minha
caminhada e durante todos estes anos.
Agora, minha querida mestra e amiga,
você é uma estrela que brilha com
muito mais grandeza.
AGRADECIMENTOS
A Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, em nome do diretor Félix
de Araújo Souza, e do coordenador dos programas de mestrados Roberval de
Almeida Cruz, por tornar possível à realização de mais uma etapa na minha
formação profissional.
A coordenadora da graduação da Faculdade de Odontologia da Pontifícia
Universidade Católica de Minas Gerais, Franca Arenare Jeunon, pela amizade e
colaboração para que eu pudesse continuar esse processo de capacitação
profissional.
A minha orientadora Helenice de Andrade Marigo, no desenvolvimento deste
trabalho, através do incentivo, ajuda, paciência, dedicação e ensinamentos nos
caminhos da “apoptose”.
Aos professores, Hermínia Marques Capistrano, Martinho Campolina Rebelo
Horta, Ângela Ferraz Souza e Paulo Eduardo Alencar de Souza, colegas da
disciplina de Estomatologia da Faculdade de Odontologia da PUC Minas, pelo apoio,
amizade e contribuições para a realização deste trabalho.
Ao meu mestre Carlos Roberto Martins, pelo exemplo de profissionalismo e
amor a arte de ensinar.
Aos professores da disciplina de Clínica Integrada, da Faculdade de
Odontologia da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, Ana Maria Abras
da Fonseca, Margarete Teixeira Lima Fernandes, Mônica de Oliveira Santiago,
Elizete dos Reis Borges e Eduardo Nunes, pelo incentivo e amizade durante esta
jornada.
A técnica do Laboratório de Anatomia Patológica, da Faculdade de
Odontologia Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, Maria Reni Moitinha,
por sua colaboração no preparo do material utilizado na realização deste trabalho e
ao longo de todos estes anos.
Aos meus colegas do curso de pós-graduação, Paulo César de Lacerda
Dantas e Fernanda Fonseca, Fernanda Fonseca Nunes, Ramon Aluâne Hipólito e
Syvie Brener pelo apoio e incentivo.
A minha colega do curso de pós-graduação Ana Maria Rebouças Rodrigues
pela amizade, carinho e compreensão.
Ao meu aluno Ícaro Buchholz Abdala, pela dedicação durante a realização
deste trabalho.
Aos professores Hugo Pereira Godinho e Nilo Bazzoli, do programa de
pós-graduação em zoologia de vertebrados da Pontifícia Universidade Católica de
Minas Gerais, na realização da documentação fotográfica.
A professora Elizete Rizzo, pela gentileza e apoio dispensado, colocando à
disposição o Laboratório de Ictiohistologia do Departamento de Morfologia do
Instituto de Ciências Biológicas da Faculdade Federal de Minas Gerais.
Aos meus alunos, razão do meu constante aprendizado.
A todos os funcionários da Faculdade de Odontologia e do Instituto de
Ciências Biológicas e da Saúde da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais,
que de alguma forma colaboraram para a realização deste trabalho.
Aos pacientes que são a verdadeira razão da realização deste trabalho.
APOIO FINANCEIRO FIP - Fundo de Incentivo a Pesquisa, da Pontifícia Universidade Católica de Minas
Gerais.
“ A beleza é a única coisa preciosa na vida.
É difícil encontrá-la
Mas quem consegue, descobre tudo. ”
Charles Chaplin
RESUMO Apoptose é uma palavra de origem grega que significa a queda das folhas das
árvores. É um processo de morte celular programada controlada geneticamente. A
morte celular por apoptose difere da morte celular por necrose. Células que morrem
por apoptose são caracterizadas por alterações bioquímicas e morfológicas
específicas, que culminam com a diminuição do volume celular e fragmentação da
célula formando os corpos apoptóticos, que são fagocitados por macrófagos ou
células vizinhas, sem causar inflamação.
A apoptose é essencial para o desenvolvimento celular e embrionário e para a
homeostasia do tecido. Defeitos no processo de apoptose pode estar relacionado a
muitas condições patológicas humanas, inclusive câncer, doenças autoimmunes e
desordens neurodegenerativas.
Cistos e granulomas periapicais são bem reconhecidos, principalmente com relação
à proliferação. Entretanto, estudos sobre apoptose nestas lesões periapicias
inflamatórias são escassos. Portanto, este estudo pretendeu aumentar o
conhecimento sobre apoptose, analisando e comparando o índice apoptótico destas
duas lesões.
PALAVRAS-CHAVE: Apotose, Morte celular programada.
ABSTRACT Apoptosis, from a Greek word meaning the dropping of leaves from a tree, is a
process of programmed cell death genetically controlled. Cell death by apoptosis
differs considerably from cell death by necrosis. Cells dying by apoptosis is
characterized by specific biochemical and morphological features that culminate in
shrinkage of the cell and breaking up into apoptotic bodies that are engulfed by
neighboring macrophages. Since intracellular contents are not release from apoptotic
cells this process is not accompanied by inflammation.
Apoptosis is essential for normal cellular and embryonic development and tissue
homeostasis. Defects in apoptosis underlie many human pathological conditions,
including cancer, autoimmune diseases and neurodegenerative disorders.
Periapical cysts and granulomas are well recognized, specially about proliferation.
However, studies about apoptosis in these lesions are uncommon. Therefore, this
study intended to increase the knowledge on apoptose, analyzing and comparing the
apoptótic index of these two lesions.
KEYWORDS: Apoptosis, Cell death, Programmed cell death.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 17
2 REVISÃO DA LITERATURA ...................................................................... 18
2.1 Apoptose ................................................................................................. 18
2.2 Apoptose e Processos Inflamatórios ....................................................... 26
2.3 Imunologia das Lesões Periapicais ......................................................... 31
2.4 Cisto Periapical ........................................................................................ 34
2.5 Granuloma Periapical .............................................................................. 38
3 OBJETIVOS ............................................................................................... 41
3.1 Objetivo Geral .......................................................................................... 41
3.2 Objetivos Específicos .............................................................................. 41
4 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 42
4.1 Amostra e Processamento do material ................................................... 42
4.2 Coloração HE .......................................................................................... 42
4.3 Coloração em Metil-Green-Pironia .......................................................... 43
4.4 Marcação “in situ” da fragmentação do genoma ..................................... 44
4.5 Determinação da amostra mínima de campos a serem contados .......... 45
4.6 Análise estatística .................................................................................... 52
4.7 Microfotografias ....................................................................................... 52
5 RESULTADOS ........................................................................................... 53
6 DISCUSSÃO .............................................................................................. 71
7 CONCLUSÕES .......................................................................................... 77
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 78
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Média (ME), desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) das
20 médias dos índices apoptóticos obtidos em cada categoria de
números de campos sorteados para o granuloma periapical
(expressa em porcentagem) ..............................................................
47
TABELA 2 - Média (ME), desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) das
20 médias dos índices apoptóticos obtidos em cada categoria de
números de campos sorteados para o cisto periapical (expressa em
porcentagem) .....................................................................................
48
TABELA 3 - Média (ME), desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) das
20 médias dos índices apoptóticos obtidos em cada categoria de
números de campos sorteados para as células do epitélio de
revestimento da cavidade cística (expressa em porcentagem) .........
49
TABELA 4 - Média (ME), desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) das
20 médias dos índices apoptóticos obtidos em cada categoria de
números de campos sorteados para as células do infiltrado
inflamatório do cisto periapical (expressa em porcentagem)..............
50
TABELA 5 - Relação dos pacientes com granuloma periapical com os dados
relativos ao gênero, cor, idade, localização e tempo da doença .......
54
TABELA 6 - Relação dos pacientes com cisto periapical com os dados relativos
ao gênero, cor, idade, localização e tempo da doença .....................
58
TABELA 7 - Índice apoptótico (IA), média (ME) e desvio padrão (DP) de
granulomas periapical ........................................................................
66
TABELA 8 - Índice apoptótico (IA), média (ME) e desvio padrão (DP) de cistos
periapicais ..........................................................................................
67 TABELA 9 - Índice apoptótico (IA), média (ME) e desvio padrão (DP) dos
granulomas periapicais e do infiltrado inflamatório dos cistos
periapicais ..........................................................................................
68
TABELA 10 - Índice apoptótico (IA), média (ME) e desvio padrão (DP) do epitélio
e do infiltrado inflamatório dos cistos periapicais ...............................
70
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 - Coeficiente de variação versus número de campos para o
granuloma periapical .......................................................................
47
GRÁFICO 2 - Coeficiente de variação versus número de campos para o cisto
periapical .........................................................................................
48
GRÁFICO 3 - Coeficiente de variação versus número de campos para as
células do epitélio de revestimento da cavidade cística ..................
50
GRÁFICO 4 - Coeficiente de variação versus número de campos para as
células do infiltrado inflamatório do cisto periapical ........................
51
GRÁFICO 5 - Distribuição das amostras de granuloma periapical de acordo com
o gênero dos pacientes ...................................................................
53
GRÁFICO 6 - Distribuição das amostras de granuloma periapical de acordo com
a cor dos pacientes .........................................................................
53
GRÁFICO 7 - Distribuição das amostras de cisto periapical de acordo com o
gênero dos pacientes ......................................................................
57
GRÁFICO 8 - Distribuição das amostras de cisto periapical de acordo com a cor
dos pacientes ..................................................................................
57
GRÁFICO 9 - IA entre granulomas e cistos periapicais ......................................... 67
GRÁFICO 10 - IA entre granulomas e infiltrado inflamatório dos cistos periapicais 69
GRÁFICO 11 - IA entre epitélio e infiltrado inflamatório dos cistos periapicais ....... 69
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Granuloma periapical (aumento de 100x) em HE ............................... 55 FIGURA 2 - Granuloma periapical (aumento de 200x) em HE ............................... 55
FIGURA 3 - Granuloma periapical (aumento de 400x) em HE ............................... 56
FIGURA 4 - Granuloma periapical (aumento de 1000x) em HE ............................. 56
FIGURA 5 - Cisto periapical (aumento de 100x) em HE ......................................... 59
FIGURA 6 - Cisto periapical (aumento de 100x) em HE ......................................... 60
FIGURA 7 - Cisto periapical (aumento de 100x) em HE ......................................... 61 FIGURA 8 - Cisto periapical (aumento de 400x) em HE ......................................... 61
FIGURA 9 - Cisto periapical – Infiltrado inflamatório (aumento de 1000x) em
Metil-Green-Pironina ...........................................................................
63
FIGURA 10 - Granuloma periapical (aumento de 1000x) em Metil-Green-Pironina.. 63
FIGURA 11 - Cisto periapical – Epitélio cístico (aumento de 1000x) em
Metil-Green-Pironina ...........................................................................
64
FIGURA 12 - Cisto periapical (aumento de 1000x) – TUNEL (células apoptóticas).. 65
FIGURA 13 - Granuloma periapical (aumento de 1000x) – TUNEL (células
apoptóticas) .........................................................................................
65
ABREVIATURAS
APAF - Fator ativador da apoptose
APAF1 - Fator ativador da apoptose 1
IL-1 - Interleucina-1
IL-1α - Interleucina-1alfa
IL-1β - Interleucina 1beta
IL-2 - Interleucina-2
IL-4 - Interleucina-4
IL-6 - Interleucina-6
IL-8 - Interleucina-8
IL-10 - Interleucina-10
IL-13 - Interleucina-13
INF-γ - Interferon-gama
PG - Prostaglandina
TNF - Fator de necrose tumoral
TNF-α - Fator de necrose tumoral-alfa
TGF-β - Fator de crescimento transformador-beta
TGF-β1 - Fator de crescimento transformador-beta1
PDGF - Fator de crescimento derivado de plaquetas
G-CSF - Fator estimulador de colônias de granulócitos
MG-CSF - Fator estimulador de colônias de granulócitos monócitos
NFkB - Fator nuclear-kB
ICE - Enzima conversora de interleucina 1β
DD - Domínio da morte
FasL - Ligante Fas
FADD - Domínio da morte associado ao Fas
TNFr - Receptor para o fator de necrose tumoral
TRADD - Domínio da morte associado ao TNFr
MPTP - Poro de transição de permeabilidade mitocondrial
NK - Linfócito natural killer
Th - Linfócito T helper (auxiliar)
Ts - Linfócito T supressor (citotóxico)
PMN - Polimorfonucleares neutrófilos
HE - Hematoxilina eosina
µm - Micrômetro
µm2 - Micrometro quadrado
µl - Microlitro
MM - Milímolar
Ml - Mililitro
Mm - Milímetros
Cm - Centímetro
Kda - kilodalton
PBS - Tampão fosfato salina 0C - Grau centígrado
TUNEL -Terminal dioxynucleotidyl transferase mediated digoxigenin-UTP-nick-
end-label (marcação das porções finais do genoma fragmentado através
da inserção de nucleotídeos)
IA - Índice apoptótico
ME - Média
DP - Desvio padrão
CV - Coeficiente de variação
P - Probabilidade
1. INTRODUÇÃO
Apoptose é uma forma de morte celular que se distingue da necrose por dois
aspectos básicos: primeiro porque é um processo ativo, durante o qual os
componentes celulares se reorganizam e se agrupam, formando posteriormente
fragmentos celulares envoltos por membrana (corpos apoptóticos), os quais não
sofrem autólise, mas são fagocitados por células vizinhas; o outro aspecto básico é
que a apoptose acomete células individualmente ou em pequenos grupos celulares.
A apoptose é encontrada nos processos fisiológicos, como os que ocorrem
durante a morfogênese dos órgãos, tanto na vida embrionária como após o
nascimento. Como processo patológico, a apoptose é observada em lesões
induzidas por agressão imunitária celular, por radiações ionizantes ou por drogas
citotóxicas e por neoplasias malignas.
Na literatura, os cistos e granulomas periapicais são muito bem reconhecidos e
descritos, inclusive com relação ao índice mitótico, entretanto, os estudos sobre
apoptose nestas lesões são escassos. Portanto, com este trabalho, pretendeu-se
aumentar o conhecimento sobre apoptose, analisando e comparando o índice
apoptótico destas duas lesões.
18
2 . REVISÃO DA LITERATURA
2.1 APOPTOSE
A manutenção da homeostasia tecidual nos organismos multicelulares é
assegurada por diferentes mecanismos biológicos regulatórios, entre os quais a
apoptose. O termo apoptose descrito pela primeira vez por KERR, WYLLIE &
CURRIE, em 1972, é de origem grega (apo=separação, ptosis=queda) e significa a
queda de folhas das árvores ou das pétalas de uma flor em analogia para
representar a morte celular fisiológica que implica em renovação (COHEN, 1991;
HÄCKER, 2000; VAUGHAN et al., 2002).
Além de seu papel fisiológico que regula a população celular, a apoptose
controla os processos de desenvolvimento embrionário e morfogênese e limita as
reações imunes. Desempenha também, um papel importante nos processos
patológicos, como nas lesões induzidas por agressão imunitária celular
(células T citotóxicas e linfócitos “Natural Killer” (NK), por radiações ionizantes ou por
drogas citotóxicas e em neoplasias malignas não tratadas (COHEN, 1997; JIANG et
al., 2000; KUWANO & HARA, 2000; AMEISEN, 2002).
As alterações morfológicas observadas são representadas por compactação
das organelas, principalmente mitocôndrias e ribossomos, tornando a célula mais
arredondada. Os desmossomas são destruídos e os espaços intercelulares
aumentados. O retículo endoplasmático, as mitocôndrias, os lisossomas e a
membrana plasmática permanecem intactos (JÄNICKE et al., 1998; MILLS et al.,
1999; ZHANG & XU, 2000).
19
As alterações morfológicas e bioquímicas no núcleo são representadas por
picnose e condensação da cromatina, em forma de meia lua, na periferia da
membrana nuclear, e pela clivagem internucleossômica da cromatina que forma
fragmentos de DNA, de tamanho entre 180 e 200 pares de base ou seus múltiplos.
A medida que o fenômeno prossegue, a célula separa-se das células adjacentes,
perde as microvilosidades e forma protuberâncias na superfície, fragmentando-se e
formando estruturas circundadas por membrana, contendo partes do núcleo e/ou
citoplasma e/ou organelas intactas denominadas de corpos apoptóticos. Através de
uma enzima denominada flipase, a membrana celular altera o posicionamento de
seus lipídios, principalmente da fosfatidilserina, servindo de sinalizador para que
fagócitos englobem os corpos celulares e completem o processo (COTTER et al.,
1990; FESUS et al., 1991; WYLLIE, 1992; UEDA & SUDHIR, 1993; NAGATA et al.,
2003).
O estudo pioneiro no nematóide Caenorhaditis elegans, que contém 1090
células, permitiu através de sua transparência, observar o desaparecimento de 131
células durante o seu desenvolvimento e também conhecer todos 14 genes
envolvidos no processo de apoptose. Os mais caracterizados são o ced-3 e o ced-4,
considerados reguladores positivos da morte celular programada e o ced-9
considerado regulador negativo da apoptose (DUKE et al., 1996; LI et al., 1998).
Um número crescente de genes tem sido identificado como capazes de atuar
no processo de morte celular programada. Entre eles encontra-se a família das
proteínas bcl-2, que desempenha papel fundamental na regulação da apoptose em
condições fisiológicas ou patológicas. Pelo menos 15 membros dessa família já
foram identificados nos mamíferos. Algumas dessas proteínas, como bcl-2, bcl-xl,
20
bcl-w e mcl-1 são anti-apoptóticos, enquanto outras, como a bax, bad e bid são
pró-apoptóticas (ADAMS & CORY, 1998, WOO et al., 2000).
Muitos membros da família bcl-2 residem na membrana externa da
mitocôndria, na membrana nuclear e no retículo endoplasmático. Na mitocôndria,
distribuem-se focalmente, nos locais de contato entre a membrana interna e externa.
Três funções têm sido descritas para essas proteínas: dimerização, atividade
formadora de poro ou canal de íons, e ligação a outras proteínas. A formação de
heterodímeros entre proteínas agonistas e antagonistas, pode inibir a apoptose pela
neutralização das agonistas ou promover a apoptose pelo deslocamento de fatores
pró-apoptóticos ligados a antagonistas, como por exemplo, o fator-1 ativador da
apoptose (APAF-1) (JARPE et al., 1998; HUMLOVÁ, 2002; SCORRANO &
KORSMEYER, 2003).
Os principais antagonistas da apoptose, bcl-2 e bcl-xl, localizam-se
principalmente, na membrana mitocondrial e acredita-se que um dos mecanismos
pelos quais essas proteínas mantêm a homeostasia celular, seja o de regulação da
permeabilidade das membranas nas quais se distribuem. A proteína bcl-2, também
bloqueia a penetração nuclear de perfurina e granzima-B, substâncias liberadas
pelos linfócitos T citotóxicos contra seus alvos e que podem ser ativadoras de
caspases. Os membros pró-apoptóticos da família bcl-2 são encontrados
normalmente no citosol e quando ativados, se translocam para a mitocôndria,
alterando a permeabilidade da membrana dessa organela, permitindo a liberação de
proteínas pró-apoptóticas, tais como o citocromo c, o fator indutor da apoptose e
pró-caspases 2 e 9 (HIDALGO & VIEIRO, 1999; REED, 2000; WOO et al., 2000;
LAHM et al., 2003; OPFERMAN & KORSMEYER, 2003).
21
O p53, também envolvido no processo de morte celular programada é uma
proteína codificada por um gene, que leva o mesmo nome (gene p53), em
conseqüência de seu peso molecular de 53 Kda. Este gene está situado no
cromossomo de número 17. Sua principal função está relacionada à preservação da
integridade do código genético em cada célula, ou seja, a manutenção da mesma
seqüência de nucleotídeos ao longo de toda a molécula de DNA (IRWIN & KAELIN,
2001). Durante o ciclo de divisão celular, essa proteína policia o genoma, verificando
a ocorrência de uma mutação na seqüência do código genético em busca de uma
duplicação defeituosa do DNA (erro de replicação). Quando ocorre o defeito no DNA,
há dois caminhos que poderão ser seguidos: a correção da mutação através da
ativação de proteínas de reparo ou a indução da apoptose (BRINCK et al., 2002).
Devido a esta função de detecção de alterações no DNA e conseqüente reparo ou
morte celular, a proteína p53 é considerada como uma guardiã do genoma, e é um
importante elemento na prevenção do desenvolvimento de tumores, sendo seu gene
codificador classificado como gene supressor de tumor (RALHAN et al., 2000).
O gene c-myc codifica uma fosfoproteína nuclear (c-myc) a qual liga-se a
seqüências específicas do DNA induzindo a transcrição de certos genes importantes
na regulação da proliferação celular. Ele não está diretamente envolvido no
processo apoptótico. Quando o c-myc está ativado com os genes envolvidos no
processo de apoptose, a morte celular programada poderá ser induzida ou não.
Quando o c-myc está associado ao p53 a apoptose poderá acontecer. Quando
associado ao bc-2 o processo será inibido (SUSUMU et al., 2001; VERMEULEN
et al., 2003).
A apoptose pode ser induzida por estímulos externos, através de receptores
específicos na superfície celular denominados receptores da morte ou por estímulos
22
internos, como lesão do DNA ou perturbações no ciclo celular ou nas vias
metabólicas. Essas diferentes vias culminam com a ativação de proteases
conhecidas como caspases, que desempenham um papel fundamental no processo
de morte celular programada (PAROLIN & REASON, 2001). As caspases estão
presentes no citosol sob a forma de pró-enzimas inativas, tornado-se ativas após
clivagem proteolítica à altura de resíduos do ácido aspártico. Pelo menos
14 membros dessa família já foram identificados nos mamíferos e estão envolvidos
no processo de apoptose (THORNBERRY, 1999; SUSIN et al., 2000). Uma vez
ativada, a maioria das caspases tem a habilidade de catalizar a ativação de muitos
outros membros dessa família, resultando em amplificação da cascata proteolítica.
Alguns membros, como a caspase-8, agem como reguladores e iniciadores,
enquanto outros como a caspase-3, agem como efetores da fragmentação celular
(SALVESEN & VISHVA, 1999). As caspases têm substratos restritos, o que lhes
assegura um processo de seletividade e especificidade no processo de proteólise.
Tais substratos incluem proteínas envolvidas no reparo de danos e replicação do
DNA, no ciclo celular, na transdução e na manutenção da integridade da estrutura
celular (HOWARD & XIAOLU, 2000; FALEIRO & LAZEBNIK, 2000; WOO et al.,
2000; LeBLANC, 2003).
Um dos mecanismos pelos quais a apoptose pode ser iniciada é através dos
receptores da morte presentes na superfície celular, que são ativados em resposta
ao acoplamento de ligantes específicos. A maioria dos receptores da morte
identificados é membro da superfamília de receptores para o fator de necrose
tumoral (TNFr) e é caracterizada por apresentar uma porção extracelular rica em
cisteína e uma região citoplasmática, denominada domínio da morte
(death domain = DD), essencial para a transdução intracelular do sinal da morte.
23
Entre esses receptores, um dos mais estudados e bem reconhecidos é o receptor
Fas (CD95 ou APO-1). Quando o ligante-Fas (Fas L) se acopla ao receptor Fas, as
moléculas individuais do receptor se trimerizam formando um agregado de cadeias
da morte, permitindo que as mesmas se liguem a uma proteína adaptadora presente
no citosol, denominada domínio da morte associada ao Fas (Fas-associated death
domain ou FADD). A ligação desse complexo a pró-caspase-8 resulta na ativação
dessa enzima por clivagem proteolítica. A caspase-8 pode então, diretamente ativar
a caspase-3 (AMARANTE-MENDES & GREEN, 1999; CECCONI, 1999; GULBINS
et al., 2000; DUCKETT, 2002; BRIDGHAM et al., 2003).
O receptor Fas é expresso em uma variedade de células, incluindo células
epiteliais, hematopoiéticas e linfócitos B e T ativados. O padrão de expressão
tecidual do ligante Fas é mais restrito, sendo expresso nos linfócitos T maduros
CD4+ e CD8+ e nas células NK ativadas. A expressão simultânea de receptor Fas e
Fas L, em linfócitos maduros ativados, pode representar um mecanismo de
autolimitação da resposta imunológica. Citocinas inflamatórias, tais como a
interleucina-1, ou a presença de estresse oxidativo, que resulta na lesão de DNA e
ativação do p53, podem aumentar a expressão dos receptores Fas, tornando as
células mais susceptíveis a apoptose pelo sistema Fas (LAHM et al., 2003;
MEDEMA, 2003).
Além dos receptores da morte, a apoptose pode também ser induzida por
sinais de estresse intracelular que resultam em disfunção mitocondrial e alterações
nas vias metabólicas, através do aumento do cálcio intracelular, da redução do pH
ou do estresse oxidativo, por drogas, toxinas ou privação dos fatores de
crescimento. Na presença desses sinais, ocorre a translocação de proteínas
pró-apoptóticas do citosol para a mitocôndria, resultando na liberação do
24
citocromo-c, presente no espaço existente entre a membrana mitocondrial externa e
interna. No citosol, o citocromo-c forma um complexo com o fator ativador da
apoptose (APAF), levando à ativação da caspase-9, que ativa caspases efetoras
(REED, 2000; SEGAL & BEEM, 2001; BALIGA & KUMAR, 2003).
A mitocôndria participa da manutenção de funções celulares vitais, tais como
respiração celular e síntese de ATP, regulação osmótica, controle do pH,
homeostasia do cálcio no citosol e sinalização intracelular. Paradoxalmente, a
mitocôndria reserva no espaço intermembranoso substâncias letais, capazes de
provocar o processo de morte celular programada, entre as quais o citocromo-c.
Quando liberado da mitocôndria, o citocromo-c se associa a duas proteínas
presentes no citosol – APAF-1 e a pró-caspase-9 e na presença de ATP, ativa a
caspase-9. A caspase-9, por sua vez, ativa as pró-caspases-3 e 7, que executam o
processo de apoptose. A caspase-3 pode amplificar a cascata de proteólise pela
ativação da caspase-8 e pela clivagem da proteína anti-apoptótica bcl-2 que,
normalmente, garante a integridade da membrana mitocondrial (CRYNS & YUAN,
1998; ROSETO & BRENNER, 1999; DEGLI, 2003).
Para a manutenção da integridade celular é necessário que os componentes
pró-apoptóticos, presentes no interior da mitocôndria, não sejam liberados para o
citosol. Existe na membrana mitocondrial interna uma estrutura protéica denominada
poro de transição de permeabilidade mitocondrial (MPTP), que se mantém
habitualmente fechado, assegurando a sobrevivência celular. Seu fechamento é
facilitado pelo magnésio intracelular, pelo potencial elevado da membrana
mitocondrial, pela expressão das proteínas bcl-2 e bcl-xl, pela maior expressão da
superperóxido dismutase mitocondrial, rica em manganês, que atua como
25
removedora de radicais de superperóxido, e pela translocação do fator nuclear-kB
(NFkB) (JIANG et al., 2000; VAN GURP et al., 2003).
Diferentes estímulos podem causar a abertura do poro de permeabilidade,
resultando na morte celular pela ativação das caspases, como a ligação do fator de
necrose tumoral-alfa (TNF-α), ligantes-Fas, ou do fator de crescimento
transformador-β1 (TGF-β1) aos respectivos receptores na membrana celular ou a
entrada de granzima-B, liberada pelos linfócitos T citotóxicos e facilitada pela
perfurina. A caspase-8 ativada cliva a proteína pró-apoptótica bid, presente no
citosol, gerando um fragmento dessa proteína, que se liga à mitocôndria,
permeabilizando as suas membranas (GRANVILLE et al., 1999; DUCKETT, 2002;
VAN LOO et al., 2002).
Uma das conseqüências da abertura do poro de permeabilidade é a expansão
da matriz mitocondrial devido a sua hiperosmolaridade. A membrana mitocondrial
interna, apresentando várias pregas, pode acomodar o aumento do volume da
matriz, enquanto a membrana externa se rompe, liberando componentes
pró-apoptóticos, como o fator indutor de apoptose e o citocromo-c. Outra
conseqüência é a entrada de prótons na matriz, causando colapso no potencial de
membrana mitocondrial e comprometendo a síntese de ATP (DEGTEREV et al.,
2001).
A abertura do poro de permeabilidade mitocondrial causa, simultaneamente,
ativação das caspases (potencialmente levando à apoptose) e depleção de ATP
(potencialmente levando à necrose). Essa disputa entre ativação das caspases e
depleção de ATP irá orientar a morte celular, seja por apoptose, seja por necrose.
A disputa pode ser vencida pelas caspases quando estas são diretamente ativadas
pelos receptores da superfície celular ou granzima-B e quando o poro de
26
permeabilidade se abre em apenas algumas mitocôndrias, permitindo que as demais
sintetizem ATP. Nestas circunstâncias, a célula entra no processo de morte
programada. Por outro lado, se o poro de permeabilidade é aberto rapidamente e a
célula não pode obter energia suficiente a partir da glicólise anaeróbia, a depleção
do ATP impede que a apoptose se instale e a célula desenvolve o processo de
necrose (GREEN & REED, 1998).
A morte celular, definida como perda irreversível da estrutura e funções vitais
da célula, ocorre por dois processos morfologicamente distintos: necrose e
apoptose. A necrose se caracteriza pela perda da integridade da membrana
plasmática e alteração de seus gradientes eletroquímicos promovendo a liberação
dos constituintes intracelulares para o meio extracelular, estimulando a resposta
inflamatória e ampliando a lesão tecidual (BRASILEIRO FILHO, 1993; ZHANG & XU,
2000; DENECKER, 2001).
2.2 APOPTOSE NOS PROCESSOS INFLAMATÓRIOS
Os últimos anos presenciaram considerável avanço na compreensão dos
mecanismos genéticos e moleculares envolvidos na regulação da apoptose,
elucidando seu papel na fisiopatologia de diversas doenças. As doenças em que
este processo de morte celular programada parece exercer um papel importante
podem ser divididas em dois grupos: 1) doenças com inibição parcial da apoptose,
como por exemplo, neoplasias (câncer colorretal, gliomas, hepatocarcinomas,
linfomas, neuroblastoma, carcinoma epidermóide e câncer de próstata), doenças
autoimunes (artrite reumatóide, miastenia gravis e lupus eritematoso sistêmico) e
doenças inflamatórias (inflamações intestinais e hepáticas) e 2) doenças com
27
apoptose excessiva, como por exemplo, doenças neurodegenerativas (Alzheimer e
Parkinson), epilepsia, alcoolismo, anemia aplástica, síndromes mielodisplásicas,
isquemia miocárdica e cerebral e doença renal policística (BOSMAN et al., 1996;
ROSETO & BRENNER, 1999; RAMOS et al., 2000; SATCHELL et al., 2003).
Durante os processos inflamatórios, citocinas pró-inflamatórias como TNF-α,
moléculas como o FasL, glicocorticóides e granzimas podem induzir apoptose em
varias populações celulares, enquanto outras citocinas como a interleucina-1 (IL-1),
interleucina-6 (IL-6) e fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF)
normalmente, inibem este processo (OBERHOLZER et al., 2001). Níveis
aumentados dessas citocinas pró-inflamatórias são relatadas nas síndromes
sépticas e nas endotoxemias (CASEY et al., 1993) e em traumas severos (MARTIN
et al., 1997).
PAROLIN & REASON (2001) relatam que a presença de corpos apoptóticos
em espécimes de biópsia hepática de portadores de hepatites virais é um achado
comum e ilustra a participação da apoptose nestas infecções. O principal mecanismo
efetor de morte das células infectadas pelo vírus é mediado pelos linfócitos T
citotóxicos e pelas células NK.
A apoptose via sistema Fas, tem sido documentada como um dos
mecanismos de citotoxidade pelos quais os linfócitos T citotóxicos induzem a morte
dos hepatócitos nas hepatites virais. Para assegurar o sucesso dessa função, visto
que muitos vírus desenvolvem estratégias anti-apoptóticas, produzindo proteínas
capazes de inativar o p53 ou estimular a maior expressão de bcl-2, os linfócitos T
citotóxicos dispõem de diferentes mecanismos para levar a morte celular por
apoptose, incluindo o sistema Fas e TNF-α, bem como a liberação de perfurina e
grazima-B (PESSAYRE et al., 1999; SOLÁ et al., 2001).
28
O vírus Epstein-Barr, que causa a mononucleose e está associado ao câncer
linfático, produz proteínas semelhantes a bcl-2 que inibe a apoptose (DUKE et al.,
1996), e o papilomavírus, principal causa do câncer de colo uterino, desativa ou
degrada a p53 indutora da apoptose (LILES, 1997).
A resolução do processo inflamatório crônico proliferativo ou sua evolução
para a esclerose nas glomerulonefrites está relacionada à presença ou ausência de
fatores desencadeantes ou inibidores do processo de morte celular programada. Em
pacientes com doenças glomerulares, foram identificados imunohistoquimicamente,
células positivas para o Fas e para o bcl-2, indicando que a apoptose mediada pelo
sistema Fas é responsável pela perda de células glomerulares na evolução dessas
infecções e que a expressão aumentada de bcl-2 está relacionada à persistência da
hipercelularidade (TAKEMURA et al., 1995; MAKINO et al., 1996; BONINI et al.,
2000).
Em modelo experimental de glomerulonefrite, em camundongos,
demonstrou-se que, em estágios iniciais da inflamação, o fator de crescimento
derivado de plaquetas (PDGF) e outras citocinas, diminuem a expressão do receptor
Faz. Há síntese de proteínas que inibem o sistema de apoptose mediado por Fas em
células mesangiais, favorecendo o padrão proliferativo da glomerulonefrite.
Entretanto, em estágios avançados da inflamação, células mesangiais podem ser
deletadas por este sistema, desde que a produção dessas proteínas inibidoras
esteja suprimida e o receptor Fas seja expresso na superfície celular (YASUTOMO
et al., 1996).
VAISHNAW et al (1997) e RABINOVICH (2000) demonstraram através de
estudos de imunohistoquímica, que a produção de citocinas pró-inflamatórias como
a interleucina-1beta (IL-1β) e o TNF-α estão relacionadas com a inibição da
29
apoptose na artrite reumatóide, através da expressão aumentada de bcl-2,
contribuindo para a degradação tecidual e destruição óssea e cartilaginosa nesta
doença.
A apoptose é detectada em várias doenças bucais, como por exemplo, líquen
plano (ARENARE-JEUNON, 1999), ceratocisto odontogênico (MURAKI et al., 1997),
leucoplasia, papiloma escamoso, carcinoma de células escamosas (MARIGO, 1999),
linfoma oral (REGEZI et al., 1998), úlcera aftosa (HONNA et al., 1985), eritema
multiforme (CHRYSOMALI et al., 1997), síndrome de Sjögren (ISHIMARU et al.,
2000), candidíase mucocutânea (HEIDENREICH et al., 1996) e doença periodontal
(KOULOURI et al., 1999).
JEWETT et al (2000) por imunohistoquímica, verificaram o papel da bactéria
Fusobacterium nucleatum, na indução da apoptose em células mononucleares e
polimorfonucleares neutrófilos (PMN), demonstrando que a morte celular
programada nestas células foi induzida por uma proteína da superfície bacteriana e
regulada através de proteínas sinalizadoras como a ICE (enzima conversora de
interleucina 1β) e fator nuclear kB (NF-kB) das células alvo. Além disso, observaram
que a apoptose prematura destas células, pode diminuir a resistência do hospedeiro
e desempenhar um papel importante no inicio e progressão da doença periodontal.
KATO et al (2000) demonstraram, imunohistoquimicamente, que o
Actinobacillus actinomycetemcomitans induz apoptose nas células epiteliais orais
através de sua toxicidade mediada por endonucleases endógenas e está envolvido
na iniciação e progressão da periodontite, particularmente a do tipo agressiva.
A periodontite é a maior causa da perda de dentes em adultos e é
caracterizada pela presença de células mononucleares compostas por linfócitos T e
B e plasmócitos, as quais persistem por um longo período de tempo (WASSENAAR
30
et al., 1995). A cronicidade dessa doença também pode ser explicada pela ausência
da interleucina-4 (IL-4) na gengiva inflamada inibindo a apoptose dos macrófagos
(YAMAMOTO et al., 1996).
Na doença periodontal, o sistema Fas/FasL desempenha um importante papel
no controle da morte celular programada, principalmente nos linfócitos T e B
(NAGATA, 1997). As proteínas bcl-2 e bcl-xl, são expressas nos linfócitos das lesões
periodontais indicando inibição da apoptose nestas células (KROEMER, 1997).
A proteina bax, também é expressa na população linfocítica das lesões do
periodonto e sua interação com a bcl-2 pode inibir a apoptose (PARIJS & ABBAS,
1998).
SAWA et al (1999) analisaram, por métodos imunohistoquímicos, a expressão
de proteínas bcl-2, bax e bcl-xl em linfócitos isolados de lesões periodontais e
compararam-nas com linfócitos periféricos dos mesmos doadores. Estes autores
observaram que, tanto bcl-2 quanto bcl-xl, mostraram menor expressão nos linfócitos
das lesões periodontais do que nos periféricos. A expressão de bax foi superior à da
bcl-2 nos linfócitos das lesões periodontais sugerindo que estas células são
susceptíveis à apoptose. Investigaram também a interação entre Fas/FasL,
demonstrando que o receptor Fas é mais expresso do que o FasL, sendo
insuficiente para a interação deste sistema de sinalização e por isso, relacionada a
persistência dessas células inflamatórias mantendo a cronicidade da doença.
TAKAHASHI et al (1999) investigaram através da hibridização in situ e da
imunohistoquímica a síntese celular, proliferação e apoptose em lesões periapicais.
Neste estudo foram selecionadas 25 amostras de tecido periapical, sendo 15
granulomas e 10 cistos radiculares, obtidos de 13 indivíduos do gênero masculino e
12 do feminino, submetidos a exodontias ou a apicetomias. A idade média destes
31
pacientes foi de 38,8 anos e as lesões se apresentavam radiograficamente com
aproximadamente, 5 mm de diâmetro. Foi demonstrado que os achados
morfológicos característicos da apoptose não foram claramente observados nas
secções coradas em HE, entretanto, a fragmentação nuclear dos PMN foi bem
evidenciada através do método in situ-end labelling (ISEL). Células apoptóticas
foram detectadas em 23 dos 25 casos selecionados. Segundo os autores o processo
de apoptose ocorreu predominantemente em PMN, presentes nas lesões
periapicais.
2.3 IMUNOPATOLOGIA DAS LESÕES PERIAPICAIS
As principais alterações patológicas que acometem os tecidos periapicais são
de natureza inflamatória, ocorrendo como resultado de estimulação antigênica
contínua pelo egresso de bactérias e seus produtos dos canais radiculares estando
associadas à resposta imunológica do hospedeiro, no intuíto de conter o avanço da
infecção endodôntica. Quando a agressão é persistente e não resolvida pela
mobilização dos mecanismos de defesa do hospedeiro, instala-se um processo
crônico caracterizado por uma resposta imunológica adaptativa, de caráter
especifico (MARTON & KISS, 2000; RUIZ et al., 2003).
Os achados histopatológicos das lesões periapicais são os mesmos vistos em
outros tecidos de granulação, envolvendo o tecido conjuntivo circundante ao local
agredido. Um achado comum a estas lesões, independente da causa, é a
exsudação persistente de um número grande de células imunocompetentes, como
PMN, macrófagos, linfócitos, plasmócitos, células gigantes, células NK e mastócitos
(PIATTELLI et al., 1991; KETTERING & TORABINEJAD, 1993).
32
Os PMN e os macrófagos são as células envolvidas na resposta imune inata,
mediada pela fagocitose dos microorganismos opsonizados e células mortas. As
células B e T são componentes predominantes nas lesões periapicais humanas, as
quais desempenham um papel importante na resposta imune antígeno-específica.
Vários estudos sugerem que, ambas as respostas imunes, humoral e celular, estão
envolvidas na patogênese destas lesões periapicais (STERN et al., 1982;
TAKAHASHI, 1998).
Para determinar o perfil celular e as diferenças nas proporções destas células
imunocompetentes, bem como o seu envolvimento na patogênese das lesões
periapicais crônicas, estudos imunohistoquímicos têm sido realizados nestas últimas
décadas. TORABINEJAD & KETTERING (1985), procuraram confirmar a presença
de células T e determinar a média entre as células T e B em 13 amostras de lesões
periapicais, sendo 9 granulomas e 4 cistos perirradiculares, representados por um
infiltrado inflamatório crônico, predominantemente de linfócitos e plasmócitos.
Os resultados mostraram que todas as lesões foram positivas para linfócitos T e B.
Demonstraram também, que o número de células T, foi maior do que o de células B,
não havendo diferenças significativas nas proporções de linfócitos T helper (Th) e T
supressor (Ts), nas duas lesões.
STASHENKO & YU (1989), ALAVI (1998) e De OLIVEIRA & LARA (2001),
demonstraram os mesmos achados nas proporções de células T e B, entretanto,
verificaram que durante a fase ativa do desenvolvimento das lesões periapicais,
o número de células Th era maior, enquanto as células Ts aumentavam,
numericamente nas fases mais tardias, sugerindo que linfócitos Th podem mediar
atividades envolvidas na destruição óssea e expansão, enquanto as Ts, atuariam na
estabilização da lesão.
33
LIAPATAS et al (2003), em 45 amostras de lesões periapicais, sendo 25
granulomas, 17 cistos e 3 fibroses cicatriciais, mostraram que nenhuma diferença
estatisticamente significativa foi observada no infiltrado inflamatório crônico entre
granuloma e cisto periapical. Nas duas lesões, a maioria das células inflamatórias
era representada por linfócitos T, B e macrófagos, indicando a persistência da
resposta inflamatória, induzida por exposição prolongada dos tecidos periapicais a
vários agentes desencadeando uma reação imunológica. Estes autores também
verificaram que as células T se encontravam em maior número do que as células B.
A proporção de Th foi maior do que a de Ts. Estes achados demonstraram que
granuloma e cisto radicular representam dois estágios diferentes no
desenvolvimento dos processos periapicais crônicos resultantes de uma resposta
imune que não pode ser inibida.
Os macrófagos representam uma grande população de células nas lesões
periapicais, atuando na imunidade inata (fagocitose) e na adaptativa como células
apresentadoras de antígeno e produtoras de citocinas, contribuindo para a iniciação
e regulação do processo inflamatório (METZGER, 2000). Estas células podem ainda,
estar envolvidas com alguns sinais e sintomas clínicos como expansão e
sensibilidade à percussão (De OLIVEIRA & LARA, 2001).
As citocinas pró-inflamatórias mais comumente presentes nas lesões
periapicais são as interleucina-1alfa (IL-1α), interleucina-1beta (IL-1β) e TNF-α,
produzidas por macrófagos. Estas citocinas estão envolvidas na estimulação de
osteoclastos na reabsorção óssea, no aumento da resposta vascular local e na
estimulação de linfócitos (STASHENKO et al., 1992). Os PMN também são capazes
de gerar citocinas como IL-1β, TNF-α, IL-6 e interleucina-8 (IL-8), envolvidas nos
processos de reabsorção óssea (TAKAHASHI et al., 1995).
34
As citocinas antinflamatórias são principalmente a interleucina-4 (IL-4),
interleucina-10 (IL-10) e o fator transformador de crescimento-beta (TGF-β).
O TGF-β, está envolvido no processo de reparação nas lesões periapicais, inibindo a
formação de osteoclastos, estimulando a proliferação de fibroblastos, atuando na
síntese de fibras colágenas e na angiogênese local. Esta citocina, também
desempenha um papel importante na regulação do tônus muscular e na produção de
vasoconstritores (STASHENKO et al., 1998; DANIN et al., 2000).
WALKER et al (2000), KABASHIMA et al (2001) e LIAPATAS et al (2003),
analisando a expressão de citocinas em lesões periapicais, demonstraram que a
natureza da resposta imune é determinada, particularmente pelas subclasses das
células T, e como parte desse arsenal, as células T sintetizam e secretam uma
variedade de citocinas que podem ser divididas em duas categorias: as que
aumentam as funções citotóxicas das células T, principalmente a interleucina-2 (IL-2)
e o interferon-gama (INF-γ), secretadas pelos linfócitos Th1 e aquelas que
promovem uma resposta do tipo humoral, como IL-4, IL-5, IL-6, secretadas pelos
linfócitos Th2. Além disso, o envolvimento marcante da expressão da citocina
pró-inflamatória IL-10, demonstra que as células inflamatórias estão empenhadas na
regulação da resposta inflamatória modelando a atividade da doença.
2.4 CISTO PERIAPICAL
Os cistos periapicais também denominados de cistos radiculares,
perirradiculares ou periodontais apicais são cistos inflamatórios dos ossos maxilares
formados nos ápices de dentes com polpas necróticas e infectadas, sendo
considerados seqüelas direta dos granulomas periapicais, embora nem todo
35
granuloma torne-se um cisto durante o seu desenvolvimento (FIGUEIREDO et al.,
1999).
A transformação cística ocorre por estimulação dos restos epiteliais de
Malassez presentes no ligamento periodontal, que passam a proliferar em
decorrência de estímulos inflamatórios na região periapical, promovidos pelas
bactérias e seus produtos, anteriormente presentes na polpa dental, acionando os
mecanismos de defesa do hospedeiro (TORABINEJAD & KETTERING, 1985;
BARKHORDAR & De SOUZA, 1988).
O cisto periapical, como todo processo crônico, é caracterizado pela
participação da resposta imunológica adaptativa de caráter específico. A formação
cística ocorre assim que o epitélio prolifera para ajudar a separar o estímulo
inflamatório do osso ao redor. A decomposição de restos celulares dentro da luz dos
cistos aumenta a concentração de proteínas, produzindo uma pressão osmótica
maior, resultando no transporte de fluídos através do revestimento epitelial para o
lúmen da cavidade cística. A passagem do fluído ajuda no crescimento do cisto
externamente. Com a reabsorção osteoclástica do osso, o cisto se expande. Outros
fatores de reabsorção óssea, como as prostaglandinas (PG), interleucinas e
proteinases, provenientes das células inflamatórias e células da lesão, também
permitem o aumento do cisto (ROCHA, 1991; SIQUEIRA JR & LOPES, 1999; RAITZ
et al., 2000).
Embora o sistema imune disponha de mecanismos para eliminar as células
epiteliais em proliferação nos cistos radiculares, elas continuam a se multiplicar em
razão da manutenção do fator etiológico, ou seja, da infecção endodôntica que
determina as reações imunológicas. Entretanto, quando a fonte de irritação é
removida, através do tratamento endodôntico, a proliferação epitelial tende a cessar
36
e o sistema imune promove a destruição e remoção das células epiteliais
proliferadas e a lesão reduz-se ou desaparece (SHAH, 1988; ROCHA, 1991;
CALISKAN & TÜRKÜN, 1997; SOARES & GOLDBERG, 2001).
Os cistos periapicais representam quase a metade de todos os cistos
relatados na literatura. Acomete mais pessoas do gênero masculino, entre a terceira
e sexta década de vida, embora seja relativamente incomum na primeira década,
ainda que cárie e dentes sem vitalidade sejam freqüentes neste grupo etário
(LALONDE & LUEBKE, 1968; STOCKDATE & CHANDLER, 1988; GOMEZ et al.,
1992; RAITZ et al., 2000). A maioria dos cistos periapicais localiza-se na maxila,
região anterior, seguido pela região maxilar posterior, região posterior da mandíbula
e, região anterior inferior (MORTENSEN et al., 1970; CABRINI et al., 1970; SOUZA
et al., 1985; SOUZA et al., 2003).
A maior parte dos cistos periapicais é assintomática, e são descobertos, com
freqüência durante exames radiográficos de rotina. Radiograficamente, o cisto
periapical não pode ser diferenciado do granuloma periapical. A radiolucidez
associada a um cisto periapical é circular ou ovóide, com margem esclerótica
estreita contígua com a lâmina dura do elemento dental envolvido. Esta margem
esclerótica pode não estar presente, quando o cisto periapical encontra-se
aumentando de tamanho. A lesão varia desde 0,5 cm ou menos, até vários
centímetros de diâmetro, embora a maioria apresente menos de 1,5 cm. Nos cistos
periapicais de longa duração, pode-se notar a reabsorção radicular do dente
envolvido e, ocasionalmente, dos dentes vizinhos (PEREIRA, 1985; BARBOSA,
1990; ALMEIDA et al., 2001).
Radiograficamente, o diagnóstico diferencial para o cisto periapical deve
incluir o granuloma periapical. Em áreas previamente tratadas de alterações
37
patológicas periapicais, devem ser considerados defeitos cirúrgicos ou cicatriz
periapical (NEVILLE et al., 1998; REGEZI & SCIUBBA, 2000). Na região anterior
inferior, uma radiolucidez periapical deve ser diferenciada da fase precoce da
displasia cementária periapical (SANTA CECÍLIA et al., 2000). Nos quadrantes
posteriores deve ser considerado o cisto ósseo traumático (GADRE & ZUBAIRY,
2000). Ocasionalmente, tumores odontogênicos, lesões de células gigantes,
doenças metastáticas e tumores ósseos primários podem imitar um cisto periapical.
Em todas as condições discutidas, os elementos dentais apresentam-se com
vitalidade pulpar (SCHOLL et al., 1999).
Histologicamente, o cisto periapical é forrado por um epitélio pavimentoso
estratificado não ceratinizado de espessura variável. Espongiose e transmigração de
células inflamatórias através do epitélio são achados comuns. Na cápsula fibrosa, o
tecido conjuntivo, pode estar focal ou difusamente infiltrado por uma população
mista de células inflamatórias. Na direção do epitélio, predominam os PMN, mais
profundamente no tecido conjuntivo os linfócitos são mais comuns (STERN et al.,
1982; BARBOSA, 1990). Infiltrado plasmocitário associado com os corpúsculos de
Russell, refratáveis e esféricos, são encontrados freqüentemente e, algumas vezes
dominam a imagem microscópica. Focos de calcificação distrófica, fendas de
colesterol e células gigantes multinucleadas podem ser encontrados, além de
hemorragias na parede do cisto (PESCE & FERLONI, 2002; SINAN et al., 2002).
Em uma pequena percentagem de cistos periapicais, corpúsculos hialinos,
denominados corpúsculos de Rushton, podem ser encontrados. Estes corpúsculos
no revestimento epitelial são caracterizados por uma forma levemente encurvada,
laminação concêntrica e mineralização basofílica ocasional. Acredita-se que a
38
origem destes corpúsculos seja relacionada com hemorragia prévia (ROCHA, 1991;
KUC et al., 2000).
As opções terapêuticas para as lesões císticas periapicais variam entre o
tratamento não cirúrgico, correspondendo ao tratamento endodôntico convencional
ou retratamento do sistema de canais radiculares, e o tratamento cirúrgico, através
de apicetomias ou de marsupialização. Em lesões de grande extensão a manobra
de marsupialização, ocasiona descompressão da cavidade cística e alívio da
pressão interna sobre as células circunvizinhas na área afetada (NEAVERTH &
BURG, 1982; SHAH, 1988; TSURUMACHI & SAITO, 1995; GALLEGO et al., 2002).
2.5 GRANULOMA PERIAPICAL
O termo granuloma periapical ou periodontite apical crônica refere-se a uma
massa de tecido de granulação cronicamente inflamado, no ápice de um dente não
vital. Esta denominação, comumente utilizada, não é totalmente correta, pois a lesão
não demonstra, microscopicamente, uma inflamação granulomatosa verdadeira
(NEVILLE et al., 1998).
Os granulomas periapicais podem se originar após a estabilização de um
abscesso periapical ou desenvolver-se como uma alteração periapical inicial. Estas
lesões não são estáticas e podem se transformar em cistos radiculares ou
desenvolver exacerbações agudas com a formação de abscessos (PAIVA &
ANTONIAZZI, 1988).
A maioria dos granulomas periapicais é assintomática, e o dente envolvido,
caracteristicamente, não apresenta mobilidade ou sensibilidade significativa à
percussão. O tecido mole que recobre a região periapical pode ou não estar sensível
39
e o elemento dental envolvido não responde aos testes pulpares térmicos ou
elétricos. Esta alteração patológica representa mais ou menos 75% das lesões
inflamatórias apicais (SOUZA et al., 1985; BARBOSA, 1990; LEDESMA-MONTES
et al., 2000; SATORRES et al., 2001).
Grande parte dos granulomas periapicais é descoberta durante exames
radiográficos de rotina. Inicialmente, observa-se um espessamento do ligamento
periodontal. Com a proliferação do tecido de granulação e a concomitante
reabsorção óssea, a lesão aparece como uma área radiolúcida ligada ao ápice
radicular, de tamanho variável, podendo ser bem circunscrita por uma linha
radiopaca ou difusa, sem limites precisos com o osso circunjacente. A reabsorção
radicular não é incomum. Embora as lesões maiores do que 2 cm de diâmetro
representem muitas vezes cistos periapicais, vários pesquisadores não têm sido
capazes de diferenciar granulomas periapicais de cistos periapicais, tomando como
base somente o tamanho e o aspecto radiográfico (NAIR et al., 1996; ROCHA et al.,
1998).
Histologicamente, os granulomas periapicais consistem em um tecido de
granulação inflamado, circundado por uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso.
O tecido de granulação apresenta um infiltrado linfocítico denso variável,
freqüentemente mesclado com poucos neutrófilos, plasmócitos, macrófagos e,
menos freqüentemente, mastócitos e eosinófilos. Podem estar presentes
corpúsculos de Russell. Restos epiteliais de Malassez podem ser identificados no
tecido de granulação. Coleções de cristais de colesterol com células gigantes
multinucleadas associadas e áreas de extravasamento de hemácias com
pigmentação por hemossiderina podem estar presentes (KUC et al., 2000; SINAN et
al., 2002).
40
O tratamento centraliza-se na redução e eliminação dos microrganismos
agressores. Se o elemento dental puder ser preservado, o tratamento endodôntico
deve ser realizado. Os elementos dentais sem possibilidades de serem restaurados
devem ser extraídos, seguidos pela curetagem de todo o tecido de granulação
periapical (BARBOSA, 1990; MARIN et al., 2000).
Nos relatos dos autores consultados, os cistos e granulomas periapicais, têm
o comportamento biológico e os achados radiográficos muito semelhantes, por isso
justifica a colheita do material em determinados tipos de tratamento, como por
exemplo, nas exodontias seguidas por curetagem e nas apicetomias para análise
anátomo-patológica, para estabelecer o correto diagnóstico entre ambas.
41
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Identificar a ocorrência de apoptose em cistos e granulomas periapicais.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
A. Estudar morfologicamente a ocorrência de apoptose em cistos e
granulomas periapicais,
B. Quantificar os índices apoptóticos (IA) destas lesões,
C. Verificar se há diferenças quantitativas entre o índice apoptótico dos
granulomas peripicais e o índice apotótico dos cistos periapicais,
D. Verificar se há diferenças entre o índice apoptótico dos infiltrados
inflamatórios entre cistos e granulomas,
E. Verificar se há diferenças entre o índice apoptótico do epitélio e o
índice apoptótico do infiltrado inflamatório do cisto periapical.
42
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Amostra e processamento do material
Para este estudo, foram selecionadas 15 amostras de granuloma periapical e
15 de cisto periapical, todas provenientes do laboratório de Anatomia Patológica da
Faculdade de Odontologia da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais.
O material já se encontrava fixado em formal a 10%, processado e incluído em
blocos de parafina. Os blocos foram cortados em secções de 4�m de espessura e
corados com hematoxilina e eosina (HE), para realização do diagnóstico
histopatológico e com Metil-Green-Pironina, para a avaliação da ocorrência de
células apoptóticas respectivamente.
4.2 Coloração em HE
Os blocos cortados em secções de 4 µm de espessura foram desparafinados
em três banhos de xilol, de três minutos cada um. Em seguida, foram hidratados em
baterias sucessivas de álcool absoluto, 700, 500 e água corrente. As lâminas foram
mergulhadas na hematoxilina, deixadas durante um minuto no corante e lavadas em
água corrente. Logo após, foram mergulhadas na eosina durante trinta segundos e
lavadas rapidamente em água corrente. As lâminas foram desidratadas utilizando-se
álcool em concentrações crescentes (500, 700 e absoluto). Em seguida, foram
diafanizadas e montadas com Entelan.
43
4.3 Coloração em Metil-Green-Pironina
O método de Metil-Green-Pironina é específico para DNA, pois se liga aos
grupos fosfóricos do DNA. Desta forma, as modificações ocorridas nos núcleos das
células em apoptose são mais facilmente detectáveis (McELROY, 1992).
Solução Estoque de Metil-Green:
Metil-Green ................................... 2 gramas
Água destilada ............................... 100 ml
Purificação do Metil-Green através do clorofórmio:
Para 100 ml de Metil-Green, foi colocado 100ml de clorofórmio. Deixou-se em
repouso por uma noite e, no dia seguinte, o clorofórmio que se encontrava no fundo
do funil separador foi desprezado. O mesmo volume de clorofórmio foi acrescentado
e a troca foi sendo realizada até o clorofórmio sair sem corante.
Solução Estoque de Pironina:
Pironina ....................................... 1 grama
Água destilada ............................. 100 ml (Aquecer, para melhor solubilidade)
Solução de uso:
70 ml de Metil-Green – solução estoque
30 ml de Pironina – solução estoque
Os blocos cortados em secções de 4 µm de espessura foram desparafinados
em três banhos de xilol, de três minutos cada um. Em seguida, foram hidratados em
baterias sucessivas de álcool absoluto, 700, 500 e água corrente, por 2 minutos cada.
A seguir, as lâminas foram colocadas na solução de uso durante 4 minutos e
depois envolvidas em papel filtro por 5 minutos. Logo após, as lâminas foram
lavadas em água destilada (duas lavagens rápidas) e colocadas em álcool etílico
44
80%, gelado a 5 graus negativos, por 10 minutos. A seguir iniciou-se a desidratação
das lâminas em xilol puro e depois foram montadas com Entelan.
4.4 Marcação “in situ” da fragmentação do genoma (TUNEL)
O método TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated
fluorescein-UTP-nick-End-Label) é um método de hibridização “in situ” associado a
imunohistoquímica utilizado para marcação das porções finais do genoma
fragmentado durante o processo de apoptose. Esta técnica consiste na inserção de
nucleotídeo marcado, o qual deverá se ligar às regiões internucleossomais
resultantes da fragmentação do DNA (MORENO et al., 2000). Para este método foi
utilizado o kit comercial In situ cell death detection, (cat. n0 1.684 817, Roche).
Os blocos foram cortados em secções de 3µm de espessura e montados em
lâminas silanizadas. As lâminas foram desparafinadas em três banhos de xilol, de 3
minutos cada. Em seguida os cortes foram hidratados em baterias sucessivas de
álcool absoluto, 950, 900, 800 e 700, por 3 minutos cada.
Logo a seguir, as lâminas foram lavadas em água destilada e em tampão
fosfato salina (PBS: 1,0 M de Na2HPO4 e 1,0 M de NaH2 PO4, pH 7.4). Aplicou-se a
solução de bloqueio da peroxidase endógena (3 ml de H2O2 P.A. em 97 ml de
metanol P.A.), durante 10 minutos. Logo após, as mesmas foram lavadas duas
vezes em PBS, por 3 minutos cada.
Em seguida, aplicou-se a proteinase K (20µg/ml) em todas as lâminas e estas
foram incubadas por 30 minutos a uma temperatura de 370C. Logo depois, lavou-se
duas vezes com PBS, por 3 minutos cada.
45
Após retirar o excesso de PBS ao redor dos cortes, aplicou-se a enzima TdT
(enzyme solution) 50µl diluída em 450µl de solução de marcação (label solution) em
toda a amostragem. Foram incubadas novamente em uma câmera úmida a 370C,
durante uma noite.
Após este período, as lâminas foram lavadas em PBS, por três vezes cada e
por 3 minutos. Secou-se a área ao redor das amostras e adicionou-se 50µl de
solução convertedora ligada a peroxidase (converter-POD) e logo a seguir,
incubadas na câmara úmida por 30 minutos, a uma temperatura de 370C.
Lavou-se novamente com PBS, por tres vezes e por 3 minutos cada. A seguir
foi adicionada a diaminobenzidina (DAB) e H2o2 e incubadas durante 3 minutos a
250C. A seguir, as lâminas foram lavados tres vezes, por 3 minutos cada com PBS.
A seguir, fez-se a contra-coloração com verde luz (2g /100 ml de água destilada) por
10 minutos. As lâminas foram desidratadas em álcoois em concentrações crescentes
(800, 900, 950, absoluto), diafanizadas em xilol e montadas com Permount.
Para o controle positivo utilizou-se Dnase I, grau I (3 U/ml em 50 mM de
TRIS-HCL, pH 7.5). Para o controle negativo utilizou-se apenas a solução de
marcação (label solution) dispensando a solução de enzimas (enzyme solution).
4.5 Determinação da amostra mínima de campos a serem contados
Para determinar a amostra mínima representativa de campos a serem
contados, foi utilizado o método descrito por SAMPAIO (1998). Foi escolhida uma
lâmina ao acaso, para cada tipo de lesão e realizada a contagem de células
apoptóticas, corpos apoptóticos e do número total de células que não apresentavam
este processo. O número de células foi quantificado em campos obtidos no
46
analisador de imagens Kontron Eletronic KS-400 localizado no Laboratório de
Ictiohistologia do Departamento de Morfologia do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Minas Gerais. Este aparelho utiliza um microscópio Carl
Zeiss, onde a imagem é captada por uma microcâmera e transferida para um
monitor de alta definição onde os campos foram selecionados e gravados e, as
células contadas. Foi utilizada a objetiva de imersão de 1000X que proporciona uma
área total de contagem de 8.533,37 µm2.
Nas lâminas de granuloma periapical e cisto periapical selecionadas
aleatoriamente, foram avaliados 178 e 168 campos, respectivamente.
Através de um aplicativo do software Microsoft Excell, foi realizado os sorteios
e cálculos preconizados por SAMPAIO (1998) e que podem ser vistos nas
TAB. 1 e 2, seguidas dos respectivos GRAF. 1 e 2, onde determinou-se o número
mínimo de campos a serem contados nas duas lesões.
A variação do índice apoptótico (IA) para o granuloma periapical e para o cisto
periapical estabilizou-se a partir de vinte e cinco campos, quando o incremento de
campos estudados não resultou em redução considerável do coeficiente de variação
(GRAF. 1 e 2 ). Portanto, em ambas as lesões, foram contados 25 campos em todas
as amostras.
Para determinar a amostra mínima representativa de campos a serem
contados, separadamente, das células do epitélio de revestimento da cavidade
cística e das células do infiltrado inflamatório do cisto periapical, foi escolhida uma
lâmina ao acaso e realizada a contagem de células apoptóticas, corpos apoptóticos
e do número total de células que não apresentavam este processo, no epitélio e no
infiltrado inflamatório. O número de células também foi quantificado em campos
obtidos no analisador de imagens Kontron Eletronic KS-400.
47
TABELA 1 Média (ME), desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) das 20 médias dos índices apoptóticos obtidos em cada categoria de números de campos sorteados para o granuloma periapical (expressa em porcentagem)
GRÁFICO1 Coeficiente de variação versus número de campos para o granuloma periapical
0
2
4
6
8
10
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
NÚMERO DE CAMPOS
CO
EFI
CIE
NTE
DE
V
AR
IAÇ
ÃO
GRUPO Número de campos em cada grupo
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
1 6,61 6,46 6,33 6,24 5,95 5,77 6,32 6,05 6,39 6,12
2 5,07 5,56 6,03 6,15 5,9 5,86 5,93 5,86 6,27 6,08
3 6,23 5,87 5,37 6,38 5,69 5,84 6,29 6,08 6,05 6,29
4 5,67 5,91 6,09 6,53 6,31 5,72 5,78 5,9 6,02 6,05
5 6,01 6,26 5,8 6,08 6,03 5,46 5,78 6,02 5,21 6,13
6 6,99 5,93 5,79 5,89 6,09 5,92 6,36 6,01 6,03 6,52
7 5,71 6,39 6,03 6,44 5,77 5,98 5,8 6,06 5,8 5,94
8 6,07 5,74 5, 47 5,78 6,25 5,89 5,79 5,83 6,38 5,63
9 6,25 5,53 6,21 5,9 6,44 5,88 5,91 6,08 5,99 6
10 5,87 5,72 5,75 5,79 6,33 5,54 5,9 5,84 6,05 5,93
11 6,41 6, 29 5,49 6,16 6,45 5,82 5,89 5,93 6,15 6,2
12 6,46 6 ,74 6,11 5,6 5,97 5,57 5,7 5,77 6,12 5,92
13 6,51 6,33 5,88 5,96 5,91 6,21 5,96 5,76 5,98 6,18
14 5,69 5,97 5,57 6,25 5,71 6,05 6,28 5,78 6,05 5,88
15 5,73 6,49 6,23 5,71 5,82 6,04 6,06 6,21 5,98 6,02
16 6,57 6,29 6,33 5,66 6,05 6,39 5,8 5,75 5,99 6,04
17 6,61 5,64 5,67 6,35 6,03 5,99 5,48 5,72 6,09 6,12
18 4,7 5,68 6 6,17 6,08 6,02 5,89 6,35 5,98 5,59
19 6,07 6,95 5,83 6,48 5,77 6 5,84 6,45 5,87 5,98
20 6,39 5,25 5,73 5,98 5,83 6,21 5,71 6,42 5,98 5,73
MÉDIA 6,081 5,998333 5,907368 6,075 6,019 5,908 5,9235 5,9935 6,019 6,0175
DP 0,551027 0,430639 0,277626 0,284614 0,234406 0,230094 0,231796 0,223943 0,24048 0,215819
CV 9,06145 7,179312 4,699651 4,685008 3,894439 3,894614 3,913153 3,736424 3,995344 3,586515
48
TABELA 2 Média (ME), desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) das 20 médias dos índices apoptóticos obtidos em cada categoria de números de campos sorteados para o cisto periapical (expressa em porcentagem)
GRÁFICO 2 Coeficiente de variação versus número de campos para o cisto periapical
02468
101214
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
NÚMERO DE CAMPOS
CO
EFI
CIE
NTE
DE
V
AR
IAÇ
ÃO
GRUPO Número de campos em cada grupo
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
1 8,38 8,1 7,46 9,05 8,96 8,94 8,92 8,51 8,27 8,8
2 7,88 9,05 8,89 7,33 8,24 9,5 8,47 8,84 8,54 9,56
3 8,9 9,16 8,47 7,87 9,58 8,73 9,31 8,87 8,21 8,79
4 8,2 9,53 8,85 8,18 8,29 9,82 9,13 8,27 8,13 9,67
5 8,36 8,76 9,4 9,01 8,82 9,2 8,06 9,39 8,37 9,22
6 10,48 7,3 9,07 7,64 8,87 9,22 8,23 8,57 8,3 8,02
7 8,54 9,09 9,74 8,91 9,01 8,03 8,8 9,01 8,42 8,55
8 9,76 10,08 8,38 7,16 8,59 8,42 9,17 7,85 9,62 8,33
9 9,04 7,77 9,05 8,19 8,57 8,75 8,73 8,12 8,38 8,71
10 9,53 8,17 9,15 8,05 7,51 8,17 9,92 9,05 8,74 8,96
11 8,12 8,95 7,57 8,07 9,48 8,6 8,72 8,32 8,48 8,99
12 10,39 7,31 8,67 8,01 8,39 8,36 8,6 8,97 9,33 9,2
13 9,14 7,71 10,01 7,78 8,36 9,29 8,99 8,7 8,76 7,77
14 8,7 7,09 8,93 8,88 8,56 9,19 9,63 8,17 8,02 9,39
15 7,64 9,18 8 10,35 8,74 9,16 8,47 8,4 8,04 8,81
16 11,73 9,44 9,41 9,35 8,82 8,8 9,24 9,01 8,98 9,33
17 9,43 9,54 9,4 9,33 8,95 8,57 9,11 8,99 8,77 8,7
18 7,56 10,87 8,5 8,49 8,49 8,29 8,36 9,64 9,65 8,62
19 11,65 7,13 8,8 8,64 8,61 8,25 9,54 8,13 8,88 8,44
20 9,09 9,79 9,31 8,74 7,89 8,59 9,12 9,38 8,24 9,22
MÉDIA 9,126 8,701 8,853 8,4515 8,6365 8,794 8,926 8,7095 8,6065 8,854
DP 1,193197 1,075105 0,659738 0,774075 0,478597 0,483533 0,484338 0,485446 0,485314 0,49272
CV 13,0747 12,35611 7,452136 9,159027 5,541567 5,498443 5,426147 5,573751 5,638918 5,564938
49
Na lâmina de cisto periapical selecionada aleatoriamente, foram avaliados 28
campos para as células do epitélio de revestimento da cavidade cística e 91 campos
para as células do infiltrado inflamatório do cisto periapical.
Através do mesmo aplicativo do software Microsoft Excell, foi realizado os
sorteios e cálculos preconizados por SAMPAIO (1998) e que podem ser vistos nas
TAB. 3 e 4 seguidas dos respectivos GRAF. 3 e 4, onde determinou-se o número
mínimo de campos a serem contados para os dois tipos de células do cisto
periapical.
TABELA 3
Média (ME), desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) das 20 médias dos índices apoptóticos obtidos em cada categoria de números de campos sorteados para as células do epitélio de revestimento da cavidade cística (expressa em porcentagem)
GRUPO Número de campos para o epitélio de revestimento da cavidade cística
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
1 8,22 6,36 7,33 7,28 7,15 6,89 7,08 7,26 6,87 7,01
2 6,84 6,09 6,62 6,81 6,78 7,02 6,82 6,79 7,02 7
3 6,35 6,7 6,91 6,87 6,82 6,58 6,61 6,83 6,82 6,84
4 6,72 6,89 6,88 6,59 6,61 6,78 6,72 6,56 6,54 6,52
5 7,73 7,18 7,52 6,78 6,67 6,73 6,68 6,74 6,72 6,7
6 7,51 6,89 7,16 7,02 6,98 7,01 6,76 7,03 6,98 6,89
7 6,06 7,46 6,9 6,69 6,65 6,95 6,89 6,66 6,64 6,54
8 6,18 6,43 7,26 6,47 6,48 6,74 6,73 6,48 6,49 6,48
9 6,43 5,97 6,96 6,81 6,75 6,82 6,68 6,81 6,8 6,78
10 5,54 7,02 7,14 6,83 6,73 7 6,87 6,58 6,54 6,52
11 6,07 6,95 6,52 6,63 6,59 6,46 7,02 7,01 6,97 6,86
12 5,78 6,61 5,86 6,79 6,75 6,84 6,68 6,8 6,7 6,65
13 7,13 6,59 6,21 6,8 6,81 6,78 6,65 6,81 6,82 6,83
14 6,88 7,17 6,81 6,74 6,72 6,71 6,72 6,76 6,75 6,72
15 7,95 7,73 7,76 6,9 6,87 6,42 6,38 6,87 6,86 6,84
16 6,56 7,63 6,94 6,71 6,7 6,84 6,58 6,69 6,71 6,69
17 7,88 6,59 6,71 6,92 6,89 6,95 6,86 6,84 6,87 6,85
18 5,26 7,07 6,63 6,7 6,68 6,72 6,67 6,68 6,64 6,59
19 6,4 6,13 7,33 6,84 6,99 6,87 6,88 6,82 7,03 6,97
20 7,92 6,58 6,43 7,05 7,04 6,79 7,03 6,81 6,98 6,74
MÉDIA 6,7705 6,802 6,894 6,8115 6,783 6,795 6,7655 6,7915 6,7875 6,751
DP 0,866211 0,491278 0,451435 0,175747 0,165342 0,16637 0,168912 0,173971 0,164729 0,163704
CV 12,79389 7,222546 6,548232 2,580155 2,43759 2,448417 2,496669 2,561605 2,426941 2,424883
50
GRÁFICO 3 Coeficiente de variação versus número de campos para as células do epitélio
de revestimento da cavidade cística
02468
101214
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
NÚMERO DE CAMPOS
CO
EFI
CIE
NTE
DE
V
AR
IAÇ
ÃO
TABELA 4
Média (ME), desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) das 20 médias dos índices apoptóticos obtidos em cada categoria de números de campos sorteados para as células do infiltrado inflamatório do cisto periapical (expressa em porcentagem)
GRUPO Número de campos para o infiltrado inflamatório do cisto periapical
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
1 9,25 8,25 9,99 9,73 9,67 10,98 10,85 10,54 10,52 10,31
2 8,54 9,6 9,98 9,17 10,58 9,78 9,97 10,09 10,02 9,99
3 11,43 10,7 9,04 9,89 10,42 10,61 10,62 10,56 10,51 10,32
4 7,39 10,9 9,56 9,74 10,24 10,54 10,58 10,52 10,26 10,11
5 9,87 10,23 10,65 9,31 8,7 9,69 9,75 9,32 9,26 9,23
6 7,01 9,82 10,56 10,68 10,58 10,57 10,52 10,47 10,68 10,32
7 12,85 12,01 10,14 10,83 10,69 10,11 9,98 9,89 9,62 9,58
8 10,63 8,29 11,56 9,56 9,9 9,74 10,05 9,68 9,72 9,57
9 11,14 10,12 11,15 10,21 10,09 9,47 10,23 9,42 9,38 9,46
10 9,49 8,38 9,23 9,06 9,57 11,2 11,12 10,98 10,83 10,55
11 11,58 9,6 11,02 11,93 10,62 9,98 9,73 9,76 9,73 9,74
12 13,22 9,79 11,11 10,08 10,14 10,04 9,75 9,64 9,59 9,53
13 7,74 9,22 11,99 10,23 9,82 10,05 9,45 9,42 9,41 9,45
14 10,73 11,46 11,19 9,76 10,4 10,1 9,67 9,47 9,42 9,33
15 8,12 10,51 11,16 10,42 10,1 9,76 11,12 9,34 9,32 9,31
16 11,45 11,01 12,18 9,68 10,11 9,58 10,04 10,02 10 10,03
17 10,12 10,46 11,49 10,87 9,62 9,95 9,97 9,52 9,46 9,4
18 11,19 10,05 10,37 11,28 10,38 10,68 11,02 10,1 10,02 11,1
19 9,09 11,66 11,37 9,08 9,41 11,13 10,83 10,65 10,62 10,37
20 8,88 13,04 9,37 11,04 9,38 9,85 10,02 9,75 9,74 10,05
MÉDIA 9,986 10,255 10,6555 10,1275 10,021 10,1905 10,2635 9,957 9,9055 9,8875
DP 1,750766 1,242788 0,917786 0,785023 0,513798 0,522197 0,524758 0,508207 0,505647 0,504432
CV 17,53221 12,11885 8,613262 7,751404 5,127213 5,124346 5,11286 5,104021 5,104707 5,101711
51
GRÁFICO 4 Coeficiente de variação versus número de campos para as células do
infiltrado inflamatório do cisto periapical
0
5
10
15
20
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
NÚMERO DE CAMPOS
CO
EFI
CIE
NTE
DE
V
AR
IAÇ
ÃO
A variação do IA para as células do epitélio de revestimento da cavidade
cística estabilizou-se a partir de vinte campos, quando o incremento de campos
estudados não resultou em redução considerável do coeficiente de variação
(GRAF. 3).
A variação do IA para as células do infiltrado inflamatório do cisto periapical
estabilizou-se a partir de vinte e cinco campos, quando o incremento de campos
estudados não resultou em redução considerável do coeficiente de variação
(GRAF. 4).
O critério proposto por LIPPONEN & AALTOMAA (1994), para identificação e
contagem das células e corpos apoptóticos foi utilizado quantificando as células que
apresentavam condensação nuclear e citoplasmática e fragmento de citoplasma
contendo densa condensação de cromatina.
A contagem das células e corpos apoptóticos e do número total de células
dos dois tipos de lesões e a obtenção do IA foi feita, por um único examinador, no
analisador de imagens Kontron Eletronic KS 400.
52
4.6 Análise estatística
Foi realizada uma analise paramétrica na comparação de dois grupos
independentes, com distribuição normal utilizando o teste t de student para testar as
hipóteses de haver ou não diferenças significantes entre o índice apoptótico de
cistos e granulomas periapicais, entre o infiltrado inflamatório dos granulomas e
cistos periapicais e entre o epitélio e o infiltrado inflamatório dos cistos periapicais.
4.7 Microfotografias
Neste estudo, a documentação fotográfica das lâminas coradas em HE,
Metil-Green-Pironina e pelo Túnel, foi feita em um microscópio Olympus BX50 com
lentes plano-apocromáticas, acoplado a uma câmera fotográfica Olympus.
53
5. RESULTADOS
Clinicamente, das 15 amostras selecionadas de granuloma periapical,
6 (60%) eram do gênero feminino e 9 (40%) do gênero masculino (GRAF. 5).
GRÁFICO 5 Distribuição das amostras de granuloma periapical de acordo com o gênero dos
pacientes
40%
60%
FemininoMasculino
Quanto a cor, na amostra total de granuloma periapical, 8 (53%) eram
leucodermas, 4 (27%) feodermas e 3 (20%) melanodermas (GRÁF. 6).
GRÁFICO 6 Distribuição das amostras de granuloma periapical de acordo com a cor dos
pacientes
53%27%
20%
LeucodermaFeodermaMelanoderma
Os elementos dentais envolvidos nas lesões do granuloma periapical foram
os 11, 12, 14, 16, 17, 22, 23, 26, 28 e 36 e nenhum destes, apresentava
54
sintomatologia dolorosa. Quanto ao tempo da doença, em 10 casos foi
indeterminado e os demais variou de 4 meses a 8 anos (60,8±43,57). A idade variou
entre 20 e 62 anos (40,2±15,22) (TAB. 5).
TABELA 5 Relação dos pacientes com granuloma periapical com os dados relativos ao gênero, cor, idade, localização e tempo da doença
Casos Gênero Cor Idade Localização Tempo da Doença
1 M L 20 11 INDETERMINADO
2 M M 37 28 INDETERMINADO
3 F F 45 14 INDETERMINADO
4 M L 34 23 INDETERMINADO
5 F L 21 36 8 ANOS
6 M M 62 22 4 MESES
7 M L 55 16 INDETERMINADO
8 F L 60 12 7 ANOS
9 M M 21 36 INDETERMINADO
10 F L 33 26 2 ANOS
11 F F 54 11 8 ANOS
12 M L 43 12 INDETERMINADO
13 F F 34 16 INDETERMINADO
14 M F 24 17 INDETERMINADO
15 M L 42 26 INDETERMINADO
Dados obtidos dos arquivos da Laboratório de Anatomia Patológica da FOPUC/MG M= masculino L= leucoderma F= feoderma
Histologicamente, todas as amostras do granuloma periapical foram
representadas por um tecido de granulação inflamado, circundado por uma cápsula
de tecido conjuntivo fibroso. O infiltrado inflamatório era predominantemente, do tipo
linfocítico, mesclado com plasmócitos, macrófagos e poucos neutrófilos (FIG.1,2,3, e
4). Áreas hemorrágicas, hemossiderina e alguns corpúsculos de Russell também
foram observados. Nenhum cordão ou ilhota de epitélio odontogênico (restos
epiteliais de Malassez) foi encontrado.
55
FIGURA 1 – Granuloma periapical coloração em HE (aumento de 100X), observa-se um
tecido de granulação.
FIGURA 2– Granuloma periapical coloração em HE (aumento de 200X), observa-se um
tecido conjunto fibroso com um infiltrado inflamatório mononuclear.
56
FIGURA 3 – Granuloma periapical coloração em HE (aumento de 400X), observa-se um
tecido conjuntivo fibroso com um infiltrado inflamatório mononuclear.
FIGURA 4 – Granuloma periapical coloração em HE (aumento de 1000X), observa-se um
tecido conjunto fibroso com um infiltrado inflamatório mononuclear, (linfócitos,
plasmóitos e macrófagos).
57
Em 9 (60%) secções do granuloma periapical, o infiltrado inflamatório
mostrou-se denso nas porções mais centrais e moderado na parte mais externa. Em
6 (40%) secções, o infiltrado inflamatório foi moderado tanto nas porções centrais
quanto nas partes mais periféricas. As áreas hemorrágicas, da amostragem total,
estavam distribuídas homogeneamente em toda a extensão do tecido inflamado, e
as áreas contendo hemossiderina estavam mais localizadas próximas à periferia.
Dos achados clínicos das 15 amostras de cisto periapical, 9 (60%) foram
representadas pelo gênero masculino e 6 (40%) pelo gênero feminino (GRAF. 7).
Gráfico 7 Distribuição das amostras de cisto periapical de acordo com o gênero dos pacientes
40%
60%MasculinoFeminino
Quanto a cor, 5 (34%) eram leucodermas, 5 (33%) feodermas e 5 (33%)
melanodermas (GRAF. 8).
Gráfico 8 Distribuição das amostras de cisto periapical de acordo com a cor dos pacientes
33%
33% 33%
LeucodermaFeodermaMelanoderma
58
No cisto periapical, os elementos dentais envolvidos eram os 11, 12, 13, 16,
22, 23, 26, 27, 35 e 36, todos sem sintomatologia dolorosa. O tempo da doença, em
9 casos foi indeterminado e os demais variou de 2 meses a 10 anos (38±48,06).
A idade mostrou variar entre 9 e 70 anos (36,1±14,93) (TAB.6)
TABELA 6 Relação dos pacientes com cisto periapical com os dados relativos a sexo, cor, idade, localização e tempo da doença
Casos Sexo Cor Idade Localização Tempo da Doença 1 M F 29 22 INDETERMINADO
2 F M 35 36 6 MESES
3 M M 41 12 INDEERMINADO.
4 F L 29 35 INDETERMINADO
5 M L 30 11,12 e 13 4 MESES
6 F M 70 11,12, 21 e 22 INDETERMINADO
7 M F 12 26 2 MESES
8 M L 42 23 INDETERMINADO
9 M F 9 36 INDETERMINADO
10 M M 53 12 e 13 INDETERMINADO
11 M F 45 16 INDETERMINADO
12 F M 39 22 2 ANOS
13 F L 42 22 10 ANOS
14 F F 37 27 INDETERMINADO
15 M L 29 11 e 12 6 ANOS
Dados obtidos dos arquivos da Laboratório de Anatomia Patológica da FOPUC/MG M= masculino L= leucoderma F= feoderma
Os achados histopatológicos da amostragem total dos cistos periapicais foi
representada por uma cavidade cística revestida por um epitélio do tipo pavimentoso
estratificado não ceratinizado e hiperplasiado, com a camada basal bem delimitada e
corada e por uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso apresentando um infiltrado
inflamatório do tipo mononuclear, com predominância de linfócitos, além de
plasmócitos e macrófagos (FIG. 5,6,7 e 8). Os neutrófilos foram pouco
representativos. Observou-se corpúsculos de Russell nas lesões e alguns
aglomerados de corpúsculos de Rushton. Imagem negativa de cristais de colesterol
59
puderam ser identificadas. Áreas hemorrágicas e hemossiderina, também foram
vistas.
FIGURA 5- Cisto periapical corado em HE (aumento de 100X), observa-se cavidade cística
revestida por um tecido epitelial estratificado pavimentoso com áreas
hiperplasiadas e atróficas e uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso com
infiltrado inflamatório mononuclear e vasos sanguíneos dilatados.
60
FIGURA 6- Cisto periapical corado em HE (aumento de 100X), observa-se cavidade cística
revestida por um tecido epitelial estratificado pavimentoso paraceratinizado
hiperplasiado e uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso com infiltrado
inflamatório mononuclear e vasos sanguíneos dilatados.
61
FIGURA 7- Cisto periapical corado em HE (aumento de 100X), observa-se cavidade cística
revestida por um tecido epitelial estratificado pavimentoso paraceratinizado
atrófico e uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso com infiltrado inflamatório
mononuclear e vasos sanguineos dilatados.
FIGURA 8 - Cisto periapical corado em HE (aumento de 400X), observa-se um tecido
conjuntivo fibroso com infiltrado inflamatório mononuclear.
62
Em 8 (53,3%) secções de cistos periapicais avaliadas, o revestimento epitelial
mostrou-se aproximadamente com 15 a 20 camadas de células epiteliais. Em
4 (26,6%) secções, o epitélio de revestimento da cavidade cística apresentou-se
com 10 a 15 camadas de células. Em 3 (20,1%) secções, o epitélio cístico mostrava-
se atrófico, exibindo de 3 a 5 camadas de células. Em 6 (40%) amostras avaliadas, o
infiltrado inflamatório era denso logo abaixo da camada basal do revestimento
epitelial e moderado na parte mais central e próximo a periferia. Em 5 (33,4%)
secções, mostrou-se moderado, próximo a camada basal do epitélio cístico e denso
na parte central e periférica. Em 4 (26.6%) amostras, era moderado em toda a sua
extensão.
No infiltrado inflamatório das amostras de granuloma e cisto periapical
coradas com metil-green-pironina, para avaliar as alterações morfológicas das
células em apoptose, os nucléos das células apoptóticas, mostraram-se com uma
coloração azulada, bem mais intensa do que as células não apoptóticas. Os núcleos
estavam bem condensados, podendo apresentar-se em forma de meia lua.
Os corpos apoptóticos foram observados como fragmentos citoplasmáticos contendo
cromatina no seu interior (FIG. 9 e 10).
63
FIGURA 9- Cisto periapical corado em Metil-Green-Pironina (aumento de 1000X), observa-se
tecido conjuntivo fibroso com infiltrado inflamatório mononuclear e células
apoptóticas.
FIGURA 10- Granuloma periapical corado em Metil-Green-Pironina (aumento de 1000X),
observa-se um tecido conjuntivo fibroso com infiltrado inflamatório mononuclear
e células apoptóticas e corpos apoptóticos.
64
As células do revestimento epitelial dos cistos perirradiculares
apresentaram-se de cor rosa. As células epiteliais em apoptose mostraram-se
condensadas com os núcleos corados mais intensamente. Observa-se um halo claro
ao redor destas células (FIG. 11).
FIGURA 11- Cisto periapical corado em Metil-green-Pironina (aumento de 1000X),
observa-se cavidade cística revestida por um tecido epitelial estratificado
pavimentoso com células apoptóticas.
No tecido conjuntivo, as fibras colágenas foram coradas em rosa e as
hemácias que formavam as áreas hemorrágicas coraram-se em tons de verde e
azul.
A confirmação do processo de apoptose foi feita pela técnica do TUNEL.
Através deste método, confirmou-se a ocorrência de apoptose, já observada
65
morfologicamente, nas colorações em Metil-Green-Pironina nas duas lesões
(FIG. 12 e 13).
FIGURA 12 - Cisto periapical corado pelo TUNEL (aumento de 1000X), observa-se marcação
positiva dos fragmentos de DNA nas células do infiltrado inflamatório.
FIGURA 13- Granuloma periapical corado pelo TUNEL (aumento de 1000X), observa-se
marcação positiva dos fragmentos de DNA nas células do infiltrado inflamatório.
66
O índice apoptótico (IA) dos granuloma periapicais variou de 0,056 a 0,101
(0,078±0,014; n=15) (TAB. 7).
TABELA 7
Índice apoptótico (IA), média (ME) e desvio padrão (DP) dos granulomas periapicais
GRANULOMA PERIAPICAL CASO IA
1 0,101
2 0,088
3 0,097
4 0,090
5 0,078
6 0,082
7 0,056
8 0,056
9 0,068
10 0,065
11 0,084
12 0,087
13 0,074
14 0,065 15 0,073
MÉDIA 0,078 DESVIO PADRÃO 0,014
O índice apoptótico (IA) dos cistos periapicais variou de 0,055 a 0,115
(0,075±0,017; n=15) (TAB. 8).
A analise estatística entre o IA dos granulomas periapicais e dos cistos
periapicais, mostrou que não houve diferença estatisticamente significativa entre
estas duas lesões (p=0,05; GRAF. 9).
67
TABELA 8
Índice apoptótico (IA), média (ME) e desvio padrão (DP) dos cistos periapicais
CISTO PERIAPICAL CASO IA
1 0,073
2 0,083
3 0,058
4 0,087
5 0,064
6 0,056
7 0,065
8 0,085
9 0,115
10 0,055
11 0,067
12 0,087
13 0,097
14 0,063
15 0,063
MÉDIA 0,075
DESVIO PADRÃO 0,017
GRÁFICO 9 IA entre granulomas e cistos periapicais
68
O índice apoptótico (IA) do infiltrado inflamatório dos granuloma periapicais e
do infiltrado inflamatório dos cistos periapicais, variou de 0,056 a 0,101
(0,078±0,014) e 0,054 a 0,101 (0,073±0,013), respectivamente (TAB. 9).
TABELA 9 Índice apoptótico (IA), média (ME) e desvio padrão (DP) do infiltrado inflamatório dos granulomas periapicais e do infiltrado inflamatório dos cistos periapicais
GRANULOMA PERIAPICAL INFILTRADO INFLAMATÓRIO DO CISTO PERIAPICAL
CASO IA CASO IA
1 0,101 1 0,070
2 0,088 2 0,079
3 0,097 3 0,061
4 0,090 4 0,079
5 0,078 5 0,063
6 0,082 6 0,061
7 0,056 7 0,079
8 0,056 8 0,101
9 0,068 9 0,054
10 0,065 10 0,068
11 0,084 11 0,083
12 0,087 12 0,090
13 0,074 13 0,065
14 0,065 14 0,084
15 0,073 15 0,064
MÉDIA 0,078 MÉDIA 0,073
DESVIO PADRÃO 0,014 DESVIO PADRÃO 0,013
A analise estatística entre o IA do infiltrado inflamatório dos granulomas
periapicais e do infiltrado inflamatório dos cistos periapicais, mostrou que não houve
diferença estatisticamente significativa entre estas duas lesões (p > 0,05; GRAF. 10).
69
GRÁFICO 10 IA entre granulomas e infiltrado inflamatório dos cistos periapicais
O índice apoptótico (IA) do infiltrado inflamatório e do epitélio de revestimento
cístico dos cistos periapicais, variou de 0,054 a 0,101 (0,073±0,013) e 0,048 a 0,098
(0,083±0,015), respectivamente (TAB. 10).
A analise estatística entre o IA do infiltrado inflamatório e do epitélio da
cavidade cística dos cistos periapicais, mostrou que não houve diferença
estatisticamente significativa entre estas duas lesões (p > 0,05; GRAF. 11).
GRÁFICO 11 IA entre epitélio e infiltrado inflamatório dos cistos periapicais
70
TABELA 10 Índice apoptótico (IA), média (ME) e desvio padrão (DP) do epitélio e do infiltrado inflamatório dos cistos periapicais
CISTO PERIAPICAL - EPITÉLIO CISTO PERIAPICAL – INF. INFLAMATÓRIO
CASO IA CASO IA
1 0,048 1 0,070
2 0,069 2 0,079
3 0,084 3 0,061
4 0,095 4 0,079
5 0,095 5 0,063
6 0,097 6 0,061
7 0,087 7 0,079
8 0,098 8 0,101
9 0,083 9 0,054
10 0,067 10 0,068
11 0,085 11 0,083
12 0,069 12 0,090
13 0,094 13 0,065
14 0,073 14 0,084
15 0,097 15 0,064
MÉDIA 0,083 MÉDIA 0,073
DESVIO PADRÃO 0,015 DESVIO PADRÃO 0,013
71
6. DISCUSSÃO
A apoptose é um processo fisiológico que tem como finalidade o controle da
população celular e eliminação de células envelhecidas que perderam a sua função
ou que sofreram algum tipo de alteração no seu genoma.
Ao revisar a literatura, observou-se a presença da morte celular programada
em diversos processos inflamatórios agudos ou crônicos, como na artrite reumatóide
(RABINOVICH, 2000), nas doenças periodontais (SAWA et al., 1999) e no líquen
plano bucal (ARENARE-JEUNON, 1999).
Nos maxilares, as lesões inflamatórias mais comumente encontradas são os
cistos e granulomas periapicais, pois são formados nos ápices de dentes com polpas
necróticas. Até o presente momento, o único trabalho que relacionou a apoptose
nestas lesões foi o de TAKAHASKI et al (1999). Desta forma, a apoptose será
analisada neste estudo e nestas lesões, de forma a contribuir para o entendimento
da patogenia das mesmas.
Ao analisar as características clínicas do granuloma periapical neste trabalho,
notou-se uma prevalência maior no gênero masculino (60%) e em indivíduos
leucodermas (53%). A análise dos achados clínicos do cisto periapical mostrou uma
prevalência maior no gênero masculino (60%) e também em pessoas leucodermas
(33%). Nas duas lesões, a faixa etária variou entre a terceira e sexta década de vida.
A localização foi, preferencialmente, na maxila. E o tempo da doença foi
indeterminado na maior parte das amostras. Estes achados estão concordantes com
os relatados na literatura por LALONDE & LUEBKKE (1968), MORTENSEN et al
(1970), STOCKDATE & CHANDLER (1988), GOMEZ et al (1992), LEDESMA-
MONTES et al (2000) e SATORRES et al (2001).
72
As secções coradas em HE apresentaram os achados histológicos principais
para o diagnóstico dos granulomas e cistos radiculares.
No granuloma periapical, foram observados um tecido de granulação
cronicamente inflamado, circundado por um tecido conjuntivo fibroso. O infiltrado
inflamatório era formado principalmente por linfócitos, além de plasmócitos,
macrófagos e poucos neutrófilos (KUC et al., 2000; SINAN et al., 2002).
Os cistos periapicais são considerados seqüelas diretas dos granulomas
(FIGUEIREDO et al., 1999). Há proliferação dos restos epiteliais de Malassez com
posterior destruição das células mais centrais, devido a hipóxia, iniciando a formação
da cavidade revestida por um epitélio do tipo estratificado pavimentoso não
ceratinizado e hiperplasiado. Na cápsula cística, observa-se a presença de um
tecido conjuntivo fibroso e um infiltrado inflamatório mononuclear, variando de
escasso a intenso (ROCHA, 1991; SIQUEIRA JR & LOPES, 1999; RAITZ et al.,
2000; PESCE & FERLONI, 2002; SINAN et al., 2002).
Acredita-se que, inicialmente, o processo inflamatório nos granulomas
periapicais inicia-se pela ativação da resposta imune inata, mediada por PMN e
macrófagos, que fagocitam microrganismos e células mortas no local inflamado,
para conter a disseminação de bactérias e seus produtos (MARTÓN & KISS, 2000;
RUIZ et al., 2003). Há formação de um tecido de granulação com a presença de um
infiltrado inflamatório mononuclear, neoformação de vasos sanguíneos e uma fibrose
circunscrevendo e delimitando o processo. Os PMN estão presentes nas áreas
adjacentes ao forame apical onde se verifica a maior quantidade de antígenos
bacterianos. Sua quantidade é pequena quando comparada às células
mononucleares, indicando que o processo inflamatório é crônico, devido à
73
persistência do agente agressor (STERN et al., 1982; TAKAHASHI, 1998; KUC
et al., 2000).
Quando se determina o perfil celular das células imunocompetentes nas
lesões periapicais, de granulomas e cistos radiculares, observa-se que linfócitos T e
B são componentes predominantes destas duas lesões. Porém, as células T
encontram-se em maior número que as células B. (TORABINEJAD & KETTERING,
1985; STASHENKO & YU, 1989; ALAVI, 1998; De OLIVEIRA & LARA, 2001). Ao
avaliar as proporções de linfócitos Th e Ts, os estudos de TORABINEJAD &
KETTERING (1985) não demonstraram diferenças significativas entre estes dois
tipos celulares, nas duas lesões. Entretanto, os trabalhos realizados por
STASHENKO & YU (1989), ALAVI (1998), De OLIVEIRA & LARA (2001) e
LIAPATAS et al., (2003) mostraram diferenças nas proporções de linfócitos Th e Ts,
em ambas as lesões periapicais. Estes autores acima citados, também
demonstraram que, as células Th estavam aumentadas nas fases iniciais do
desenvolvimento destas lesões, enquanto as células Ts estavam em maior número
nas fases mais tardias do desenvolvimento dos granulomas e cistos periapicais.
Desta forma, sugere-se que a resposta imune específica está envolvida na
patogênese destas duas lesões periapicais. Os linfócitos Th poderiam mediar
atividades de destruição óssea e expansão enquanto os linfócitos Ts atuariam na
estabilização das duas alterações patológicas (STASHENKO & YU, 1989; ALAVI,
1998, De OLIVEIRA & LARA, 2001 e LIAPATAS et al., 2003).
Ao analisarem a expressão de citocinas nas lesões periapicais, WALKER
et al (2000) e LIAPATTAS et al (2003), demonstraram que os linfócitos T,
dependendo do estímulo diferenciam-se em linfócitos Th1, que são produtores de
IL-2, IFN-γ, TNF-β e fator estimulador de colônias de granulócitos e monócitos
74
(GM-GSF), consideradas citocinas pró-inflamatórias e em Th2, que são produtores
de IL-4, IL-5 e IL-10, consideradas citocinas antiinflamatórias. Estas duas subclasses
de linfócitos T, (Th1 e Th2) , atuam exercendo efeitos inversos, ou seja, quando um
antígeno estimula uma forte resposta Th1, a resposta Th2 é fraca e vice-versa.
Citocinas como TNF são capazes de induzir a apoptose em células
inflamatórias através do TNFr, que se ligam a uma proteína adaptadora presente no
citosol, denominada domínio da morte associada ao TNFr ou TRADD
(TNFR- associated death domain). A ligação da proteína adaptadora a
pró-caspase-8, resulta na ativação das caspases iniciadoras e efetoras, concluindo o
processo de morte celular programada (GULBINS et al., 2000; DUCKETT, 2002;
BRIDGHAM et al., 2003).
Citocinas pró-inflamatórias como IL-1, IL-6 e GM-GSF normalmente inibem o
processo de apoptose no local da agressão (OBERHOLZER et al., 2001), uma vez
que elas devem manter e perpetuar o processo inflamatório.
A apoptose via sistema Fas/FasL também é importante na indução deste
processo, principalmente pela expressão de FasL nas populações de células
inflamatórias (OBERHOLZER et al., 2001). A união do FasL a seu receptor, promove
a ativação de uma proteína adaptadora FADD, de modo semelhante ao TRADD,
havendo sua ligação a pró-caspase-8, resultando na ativação das caspases
indutoras e efetoras, completando o processo de apoptose (AMARANTES-MENDES
& GREEN, 1999; CECCONI, 1999).
Para a quantificação das células e corpos apoptóticos, foi utilizado o critério
proposto por LIPPONEN & AALTOMAA (1994), que é baseado nas características
morfológicas de condensação nuclear e citoplasmática e fragmentos de citoplasma
contendo cromatina. Não foi possível identificar, satisfatoriamente, estes critérios nas
75
secções coradas em HE. Fato este, relatado por TAKAHASHI et al (1999). Nas
células epiteliais do revestimento da cavidade cística, as alterações morfológicas das
células apoptóticas foram bem reconhecidas em HE, entretanto, nas células do
infiltrado inflamatório, nas duas lesões, estas mesmas alterações não puderam ser
evidenciadas com clareza, uma vez que em linfócitos, o citoplasma é escasso e o
núcleo condensado (FIG. 4). Portanto, utilizou-se para a contagem das células e
corpos apoptóticos as secções coradas em Metil-Green-Pironina, que é especifica
para ácidos nucléicos, pois estes corantes ligam-se aos grupos fosfóricos do DNA,
tornando as modificações nucleares das células em apoptose mais facilmente
detectáveis (McELROY, 1992).
A média do IA entre granuloma periapical (0,078) e o cisto radicular (0,075)
não mostrou haver diferenças estatisticamente significativas entre estas duas lesões.
Dados estes, que corroboram com o fato das lesões terem a mesma etiopatogenia, o
mesmo perfil celular e comportamento biológico. Além disto, ao se comparar o valor
da média do IA do infiltrado inflamatório dos cistos radiculares (0,073) e do
granuloma periapical (0,078) também não se observou diferenças estatisticamente
significativas. Acredita-se que o IA aumente neste infiltrado inflamatório mononuclear
quando o agente agressor for eliminado. Nestas lesões, após o tratamento
endodôntico, observa-se a redução do infiltrado inflamatório (ALAVI, 1998;
LIAPATAS et al., 2003).
Neste estudo, identificou-se as células apoptóticas no infiltrado inflamatório
mononuclear das lesões periapicais e no epitélio de revestimento da cavidade
cística. Estes resultados contradizem o trabalho de TAKAHASHI et al (1999), que
observaram a apoptose predominantemente em PMN, sugerindo que, o que foi
76
detectado por estes autores acima citados, foram os corpos apoptóticos, que são
morfologicamente semelhantes aos PMN fragmentados.
Quando se comparou a média do IA do epitélio cístico (0,083) e do infiltrado
inflamatório (0,073) dos cistos periapicais, observou-se que não houve diferenças
estatisticamente significativas, apesar da média absoluta do IA do epitélio cístico ter
sido maior do que o do infiltrado inflamatório. Tal fato demonstra que, as células
epiteliais sofrem o processo de diferenciação e terminam por descamar na
superfície, o que no caso dos cistos ocorreria dentro da cavidade dos mesmos.
77
7. CONCLUSÕES
1. As células apoptóticas foram observadas morfologicamente no infiltrado
inflamatório crônico de cistos e granulomas periapicais e no epitélio cístico.
2. Não foram observadas diferenças estatisticamente significantes entre os IA’s
das duas lesões.
3. Também não foram identificadas diferenças estatisticamente significativas
entre o IA do infiltrado inflamatório das duas lesões.
4. O IA entre o epitélio e o infiltrado inflamatório cístico também não mostrou
diferenças estatisticamente significativas.
78
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