“Avaliação dos efeitos provocados por metil jasmonato em...

“Avaliação dos efeitos provocados por metil jasmonato em Ricinus

communis através de análises do perfil protéico e rendimento fotossintético.”

JUCÉLIA DA SILVA ARAUJO GIULI

Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro Campos dos Goytacazes- RJ

2006

II




Tese apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de mestrado em Biociências e Biotecnologia, outorgado pela Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro.

Orientação: Dra. Olga Lima Tavares Machado

Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro Campos dos Goytacazes- RJ

2006

III




Tese apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de mestrado em Biociências e Biotecnologia, outorgado pela Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro.

Aprovada em 08/08/2006 Comissão Examinadora

Dr. Gilberto Barbosa Dumont

Dr. Ricardo Enrique Bressan-Smith

Dra. Tânia Jacinto Freitas da Silva

Dra. Olga Lima Tavares Machado

Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro

Campos dos Goytacazes- RJ 2006

IV

Ofereço À minha mãe Flora, meu pai Jorge “in

memorium”, meus irmão, por serem minha

família que tanto amo.

Aos meus filhos Rebeca Sally

e Davi Guilherme.

Dedico este trabalho

V

AGRADECIMENTOS

Este é o momento especial, depois de passar por tantos desafios, se cheguei

até aqui foi porque Deus renovou as minhas forças a cada manhã e permitiu que

tantas pessoas pudessem colaborar das mais diversas formas, na prática do dia a

dia, ou mesmo pela torcida e oração, ou simplesmente por existir, que é o caso da

minha “princesinha” Rebeca que com seu sorriso me trouxe luz a cada dia. Sei que

corro o risco de decepcionar ou mesmo ser injusta nesse agradecimento, mas a

minha enorme gratidão é especial a todos.

Em primeiro lugar agradeço grandiosamente a Deus...

“Não tenho palavras pra agradecer tua bondade

Dia após dia me cercas com fidelidade

Nunca me deixes esquecer

Que tudo o que tenho

Tudo o que sou

O que vier a ser

Vem de Ti Senhor

Dependo de Ti

Preciso de Ti

Espero em Ti

Descanso em Ti

Sozinha, nada posso fazer.”

Agradeço a minha querida mãe Flora, que mesmo sem ter tido oportunidade

de estudos, sempre incentivou os filhos a não medir esforços na busca do

conhecimento, por me educar no caminho da honestidade mesmo com toda

dificuldade e necessidade por qual toda a família já passou e por me ensinar não só

a lutar pelos objetivos, mas a ter objetivo na vida.

Ao meu saudoso pai Jorge, que sempre foi um exemplo de persistência,

honestidade, de trabalhador e de dedicação total a família e que me faz tanta falta.

Aos meus irmãos, Giovani, Joel, Jucelei, Jucilene, Jaime e Joelma, pelo apoio

e incentivo em todos os momentos.

Agradeço ao meu esposo Jadir, por entrar em minha vida e transformá-la.

VI

Aos meus sobrinhos “fofos”, que tenho tantas saudades, que muito me

alegram e que muitas vezes se espelham em min.

Quero registrar a minha gratidão às pessoas do grupo de oração da minha

igreja por oraram pelos meus objetivos da tese.

À Dra. Olga Lima Tavares Machado, por me dar oportunidade de participar

em uma de suas linhas de pesquisa, por me orientar assim como uma mãe que sabe

criticar para construir e sabe elogiar e incentivar em momentos que são

fundamentais. Por me ensinar inúmeras coisas não só em relação a nossa atividade

de pesquisa, mas em tantas outras de vida. Enfim por além de ser uma referência

profissional, ser uma pessoa muito humana, amiga, sensível às necessidades,

fraquezas e também ás qualidades dos seus orientados.

Ao Dr. Ricardo E. Bressan-Smith, por me co-orientar, por me receber de

braços abertos, pela dedicação e sugestões sem as quais este trabalho não seria

possível, pela paciência, compreensão e carinho a mim dispensados, e finalmente

por ser essa pessoa maravilhosa que o faz tão querido.

Aos professores Tânia e Gilberto por aceitarem participar como avaliadores

do meu trabalho

Agradeço aos professores do LQFPP, por permitir fazer o mestrado, por me

incentivarem e de alguma maneira colaborarem para realização deste trabalho.

Agradeço de forma especial ao professor Dr. Carlos Peres, por me dar

oportunidade de estagiar com ele logo que cheguei ao laboratório, e me ensinar os

primeiros passos dos experimentos bioquímicos, e à professora Dra. Kátia Valevski,

por acreditar em mim e me permitir participar de suas pesquisas, períodos estes que

muito aprendi e que possibilitou co-autoria em um de seus artigos.

O meu mais profundo agradecimento a minha amiga Adriana Uchôa, que

desde que eu cheguei ao laboratório me recebeu de maneira calorosa sem

preconceito, sem querer saber de onde vinha, muito me ensinou, me mostrou, me

apresentou... Uma grande amizade se formou, com consistência que a separação

não deformou. Você é muito especial. “Em todo tempo, ama o amigo, e na angústia

nasce o irmão”.

Não posso deixar de registrar uma grande amizade que nasceu durante este

período, apesar de convivermos a mais tempo, no ultimo ano, descobri na Viviane

Veiga uma pessoa especial, sensível, companheira, amiga com quem se pode

contar sempre. Valeu Vivi.

VII

Agradeço ao Leandro Hespanhou (Prof. Pardal), que por inúmeras vezes me

ajudou nos experimentos, me ensinou na utilização dos aparelhos, resolveu

problemas técnicos com sua habilidade e criatividade, além do mais você é um cara

muito legal.

Agradeço também ao Ernani Costa e Fabrício pelas leituras no IRGA.

Aos professores do LMGV/FV, por permitirem a utilização do setor e de

alguns aparelhos que foram necessários para realização deste trabalho.

Aos amigos que não estão mais no LQFPP, mas que suas presenças amigas

fazem grande falta, são exemplos a Valeska, a Rafaela, o Leonardo e outros tantos,

que participaram das conversas de corredor e descontração na mesa do almoço.

Agradeço à Cristiane Salles, pela enorme solidariedade ao me dar dicas e

fazer a revisão da tese, além de se mostrar uma grande amiga e companheira,

sempre disposta a ajudar.

Aos companheiros do LQFPP, pela ajuda direta ou indireta, ou simplesmente

pela convivência.

Aos funcionários do LQFPP, principalmente a Isabela Dantes, que por muitas

vezes colaborou, mesmo que fosse etiquetar tubos, sem falar nos deliciosos

almoços que sempre fez com muita disposição.

Aos amigos Joseph e Glauber, pela amizade e colaboração para o transporte

das amostras para obtenção das seqüências das proteínas.

Ao “Pink”, por estar sempre disposto a ajudar, principalmente na questão de

computadores.

Aos meus amigos companheiros diários de setor, pelas ajudas na execução

das análises, pelos papos descontraídos, pela solidariedade nos momentos difíceis,

pelas confraternizações realizadas na casa da Olga que sempre foram muito

divertidas. Por tudo agradeço individualmente à Alexandra sempre pateta e palhaça,

ao Fabinho, sempre crítico, ao Hélio reclamão, ao Thiago só na dele, à Natália

exemplo de meiguice e doçura, à Shayany fala muito, ao Keisson cana brava, porém

tímido, à Karol ainda “bebê” no laboratório, à Camila que deixou saudades.

Finalmente a minha gratidão a todos que se sensibilizaram e viabilizaram a

concretização deste trabalho.

VIII

SUMÁRIO

LISTA DE DIAGRAMA, FIGURAS E TABELAS.......................................................XI Diagrama....................................................................................................................XI Figuras.......................................................................................................................XI Tabelas.....................................................................................................................XIII LISTA DE ABREVIATURAS....................................................................................XIV RESUMO..................................................................................................................XVI ABSTRACT.............................................................................................................XVII 1- INTRODUÇÃO.........................................................................................................1 2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................................................3

2.1- Mamona (Ricinus communis L.) ..................................................................3

2.2- Defesa de Plantas..........................................................................................5 2.2.1- Sinalização..................................................................................................6 2.3- Alterações Protéicas em plantas e a Ação dos Jasmonatos....................8 2.4-Senescência e a Degradação da Rubisco..................................................11 2.5- Processo Fotossintético.............................................................................12 2.6- Fluorescência da Clorofila a.......................................................................13

2.6.1- Análise dos “Quenchings” ................................................................15 2.7- Fluorescência da Clorofila a e Plantas Estressadas................................15 2.8- Plantas Tratadas com Jasmonatos e a Fotossíntese...............................16

3-OBJETIVO..............................................................................................................18 3.1- Objetivo Geral..............................................................................................18 3.2 - Objetivos Específicos.................................................................................18

4- MATERIAIS............................................................................................................19 4.1.- Equipamentos.............................................................................................19 4.2- Reagentes.....................................................................................................19 4.3- Sementes......................................................................................................19 4.4- Anticorpo......................................................................................................20

5- METODOLOGIA....................................................................................................21 5.1- Cultivo das Plantas.....................................................................................21 5.2- Indução de Estresse por Metil Jasmonato................................................21

5.2.1- Primeiro Tratamento (T1) ...................................................................21

5.2.2- Segundo tratamento (T2) ...................................................................21

IX

5.3- Obtenção dos Extratos Protéicos..............................................................22 5.3.1- Primeiro Método de Extração (E1) ....................................................22 5.3.2- Segundo Método de Extração (E2) ...................................................22

5.4- Quantificação de Proteínas........................................................................23

5.5- Avaliação do Perfil Protéico Através de Eletroforese..............................23

5.5.1- Eletroforese Unidimensional..............................................................23

5.5.2- Eletroforese Bidimensional (2D-PAGE) ............................................24

5.5.2.1- Focalização Isoéletrica (IEF) .....................................................24

5.5.2.2- SDS-PAGE...................................................................................25 5.6- Visualização das Proteínas........................................................................26

5.6.1- Coloração por Azul de Coomassie....................................................26

5.6.2- Revelação com Nitrato de Prata........................................................26 5.7- Análise do Gel....................................................... ......................................27 5.8 - Digestão das Proteínas e Extração dos Peptídeos.................................27 5.9- Caracterização por Espectrometria de Massas........................................28 5.10- Eletrotransferência....................................................................................28 5.11- “Western Blotting” ....................................................................................28 5.12- Medidas Fotossintéticas...........................................................................29

5.12.1- Taxa Fotossintética...........................................................................29

5.12.2- Características da Fluorescência da Clorofila a.............................29

5.13- Pigmentos Fotossintéticos.......................................................................29 5.14- Determinação da Massa e Área Foliar.....................................................30

6- RESULTADOS.......................................................................................................31 6.1- Análise do Perfil de Proteínas Por Eletroforese Unidimensional...........31 6.2- Análise do Perfil de Proteínas Por Eletroforese Bidimensional..............34 6.3- Imunodetecção da Proteínas Separadas por 2D-PAGE...........................45 6.4- Atividade Fotossintética.............................................................................46 6.5- Desenvolvimento da Planta........................................................................47

6.6- Características da Fluorescência da Clorofila a.......................................48

6.7- Pigmentos Fotossintéticos.........................................................................52 7- DISCUSSÃO..........................................................................................................55 8-CONCLUSÃO.........................................................................................................63

X

9-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................64

XI

LISTA DE DIAGRAMA, FIGURAS E TABELAS Diagrama

Classificação da mamona............................................................................................3

Figuras Figura 1: Planta de mamona.......................................................................................3

Figura 2. Sementes de alguns cultivares de mamona.................................................4

Figura 3: Esquema adaptação do modelo proposto por Bergey e colaboradores para

sinalização da ativação de genes defensivos em resposta ao ataque de herbívoros e

patógenos em folhas de tomate. .................................................................................8

Figura 4: Síntese de jasmonatos em resposta a sinais de desenvolvimento e

ambientais..................................................................................................................10

Figura 5: Gel de eletroforese SDS-PAGE 15% de proteínas extraídas pelo método

E1 de folhas de plantas controles e tratadas pelo método (T1) após 1, 6, 14, 24, 48,

72 horas (C1, C6, C14, C24, C48, C72 e T1, T6, T14, T24, T48, T72)

respectivamente.........................................................................................................31

Figura 6: Gel de eletroforese SDS-PAGE 15%, de proteínas extraídas pelo método

E1 de folhas de plantas controles e tratadas método (T2) após 24 horas (A) e 48

horas (B). ...................................................................................................................32

Figura 7: Gel de eletroforese SDS-PAGE 15%, de proteínas extraídas pelo método

E1 de folhas de plantas controles e tratadas método (T2) após 72 horas (A) e 144

horas (B) ....................................................................................................................33

Figura 8: Eletroforese bidimensional dos extratos protéicos de folhas de mamona

controle (A) e tratadas com MeJa (B) após 1 hora...................................................35


controle (A) e tratadas com MeJa (B) após 6 horas..................................................37


controle (A) e tratadas com MeJa (B) após 14 horas................................................39



XII



Figura 13: Redução da proteína de 50 (A) e 15 kDa (B), em porcentagem de

conteúdo nas plantas tratadas em relação às plantas controles...............................45 Figura. 14: Imunodetecção após focalização isoelétrica na faixa de pH 4 a 7 e SDS-

PAGE 12% das proteínas extraídas das plantas controles (C) e tratadas com MeJa

(T), no tempo de 24 horas..........................................................................................46 Figura. 15: Rendimento Quântico Máximo Efetivo (Fv/Fm’) em função de níveis

diferentes de luz (350 e 1150 μmol m-2 s-1) de plantas controles e submetidas ao

MeJa pelo método T2.................................................................................................49 Figura.16: Taxa de transporte de elétros (ETR) em função de níveis diferentes de

luz (350 e 1150 μmol m-2 s-1) de plantas controles e submetidas ao MeJa pelo

método T2..................................................................................................................50 Figura. 17: Coeficiente de extinção fotoquímico (qP) em função de níveis diferentes

de luz (350 e 1150 μmol m-2 s-1) de plantas controles e submetidas ao MeJa pelo

método T2..................................................................................................................51 Figura. 18: Coeficiente de extinção não fotoquímico (qN) em função de níveis


MeJa pelo método T2.................................................................................................52

Figura. 19: Mudanças morfológicas ocorridas nas plantas tratadas com metil

jasmonato (A), comparadas com as plantas não tratadas (B) no tempo de

144..............................................................................................................................53 Figura. 20: Os gráficos mostram a queda no conteúdo de clorofila total e

carotenóides em relação aos respectivos controles, nos diversos tempos de

tratamento. ................................................................................................................54

XIII

Tabelas Tabela 1- Relação dos equipamentos utilizados para realização do trabalho...........19 Tabela 2- Protocolo para revelação das proteínas por nitrato de prata.....................26 Tabela 3-Seqüências das proteínas identificadas por espectrometria de massas....34 Tabela 4- Número total de “spots” detectados nos géis nos vários tempos..............36 Tabela 5- Características dos “spots” protéicos que sofreram alteração após 1 hora

de tratamento com MeJa............................................................................................36 Tabela 6- Características dos “spots” protéicos que sofreram alteração após 6 horas

de tratamento com MeJa............................................................................................38 Tabela 7- Características dos “spots” protéicos que sofreram alteração após 14

horas de tratamento com MeJa..................................................................................40 Tabela 8- Características dos “spots” protéicos que sofreram alteração após 24

horas de tratamento com MeJa..................................................................................42 Tabela 9- Características dos “spots” protéicos que sofreram alteração após 48

horas de tratamento com MeJa..................................................................................44 Tabela 10- “Spots” protéicos com características similares encontrados em tempos

diferentes de tratamento com MeJa. .........................................................................43

Tabela 11- Taxa fotossintética (AN) e concentração interna de CO2 (Ci) de plantas

controles e tratadas com MeJa, após 144 horas........................................................47

Tabela 12- Eficiência instantânea de carboxilação (Φc = AN/Ci) e condutância

estomática (gs) de plantas controles e tratadas com MeJa após 144

horas...........................................................................................................................47 Tabela 13- Efeito do MeJa no crescimento da planta................................................48

Tabela 14- Rendimento quântico máximo (FvFm) de plantas controle e tratadas com

MeJa pelo método T2 nos diversos tempos.. ............................................................48

Tabela 15- Influência do metil jasmonato sobre o conteúdo de clorofila total e

carotenóides nos diversos tempos de tratamento......................................................53

XIV

LISTA DE ABREVIATURAS

ABA: Ácido Abscísico

AN: Taxa Fotossintética

APS: Persulfato de Amônio

AS: Ácido Salicílico

ATP: Adenosina Trifosfato

CHAPS: 3(3-cholamidopropil) dimetilamonio-1-propano sulfonato.

Ci: Concentração Interna de CO2

CO2: Dióxido de Carbono

DAB: 3,3-Diaminobenzidina tetrahidrocloreto

DMSO: Dimetilsulfóxido

DNA: Ácido Desoxiribonucléico

DTT: Ditiotreitol

EDTA: Ácido Etilenodiaminotetracético

ET: Etileno

ETR: Taxa de Transporte de Elétrons

FFF: Fluxo de Fótons Fotossintéticos

Fm: Fluorescência Máxima Fo: Fluorescência Inicial Fv/Fm: Rendimento Quântico Máximo

Fv/Fm’: Rendimento Quântico Efetivo

Fv: Fluorescência Variável

gs: Condutância Estomática

HR: Resposta Hipersensível

IAC: Instituto Agronômico de Campinas IEF: Focalização Isoelétrica

IgG Imunoglobulina G

IPG: Gradiente de pH imobilizado

IRGA: Analisador de Gás no Infra Vermelho

JA: Ácido Jasmônico

JIPs: Proteínas induzidas por Jasmonatos

LC: Cromatografia Líquida

XV

LED: Diodo Emissor de Luz

LHC: Complexo Antena Coletor de Luz

LTP: Proteínas Transportadoras de Lipídeos

MALD-TOF: “Matrix-assisted Laser-Desorption Ionization–Time of Flight Mass”

MeJa: Metil Jasmonato

MS: Espectrometria de Massas

NADH: Nicotinamida-adenina dinucleotídeo

NADP+: Nicotinamida-adenina dinucleotídeo fosfato oxidado

NADPH: Nicotinamida-adenina dinucleotídeo fosfato reduzido

OGA: Oligogalacturonídeo

PBS: Tampão fosfato de sódio salino

PCD: (Programmed cell death) Morte Celular Programada

PMSF: Fenilmetilsulfonilfluoreto

PR: Proteínas Relacionadas à Patogênese

PS I: Fotossistema um

PS II: Fotossistema dois

PVPP: Polivinilpolipirrolidona

QA: Quinona A

QB: B Quinona B

qN: Coeficiente de Extinção não Fotoquímico

qP: Coeficiente de Extinção Fotoquímico

RIP: Proteínas Inativadoras de Ribosomos

ROS: Espécies Reativas de Oxigênio

SDS: Dodecilsulfato de Sódio

TCA: Ácido tricloroacético

TEMED: N,N,N',N' - Tetrametiletileno diamina

TFA: Ácido Trifluoroacético

Tris: Hidroximetil aminometano VSPs: Proteínas de reserva vegetativa

XVI

RESUMO

As plantas são capazes de perceber alterações em seu ambiente, provocadas por muitos tipos de estresses bióticos e abióticos, alterando o seu padrão fisiológico e adaptativo. Os mecanismos de defesa de plantas em muitos casos baseiam-se na expressão de genes de defesa e alterações no conjunto de proteínas da célula. Estas mudanças podem ser mediadas por Jasmonatos. A análise do perfil de proteínas através de técnicas eletroforéticas pode ser usada para estudar e entender mecanismos fisiológicos da planta em condições normais e sob estresse. Plantas tratadas com MeJa ou expostas aos tipos de estresse que induzem a acumulação de jasmonatos, sintetizam proteínas induzidas por jasmonatos (JIPs). Concomitantemente estes tecidos reduzem ou interrompem a síntese de muitas proteínas constitutivas, como a proteína envolvida na assimilação de carbono, a Rubisco. A fotossíntese é um processo extremamente sensível a fatores ambientais por este motivo tem sido estudada como um indicador de estresse ou de adaptação de plantas após condições ambientais adversas. Medidas da fluorescência da clorofila a têm sido uma ferramenta importante para o conhecimento do desempenho da fotossíntese e do estado fisiológico da planta, permitindo avaliar sua resposta às condições de estresses. Com o objetivo de avaliar a resposta da mamona à aplicação exógena de metil jasmonato, as plantas foram submetidas ao tratamento, e após diferentes períodos de tempo foram avaliadas suas respostas em nível bioquímico e fisiológico. Eletroforeses uni- e bidimensional, e análise de imunodetecção foram realizadas para avaliarem-se alterações no perfil de proteínas. O rendimento fotossintético foi analisado por medidas de taxa fotossintética e parâmetros da fluorescência da clorofila a (Fv/Fm, Fv/Fm’, ETR, qP, qN). As análises de eletroforese unidimensional revelaram alterações no perfil de proteínas comparativamente aos controles. Duas proteínas, identificadas por espectrometria de massas como sendo as subunidades pesada e leve da Rubisco, apresentaram reduções em seus conteúdos; ensaios de imunodetecção contra cadeia pesada da Rubisco confirmaram as reduções e subprodutos da mesma foram identificados. Três proteínas principais com massas estimadas em 21, 24 e 32 KDa não encontradas nos controles, foram induzidas pelo MeJa. Resultados semelhantes foram encontrados após eletroforese bidimensional. Numerosos “spots” protéicos foram revelados após o tratamento. Alguns indicaram aumentos e outros reduções dos teores protéicos. Novos “spots” foram visualizados, indicando provavelmente indução da síntese de novas proteínas. Entre os ‘spots’ que diminuíram podemos destacar dois majoritários de massas de 50 e 15 kDa e pIs 6,1 e 7,8, respectivamente. A proteína de 50 kDa foi identificada como cadeia pesada da Rubisco, através de ensaios de “Western Blotting” e a de 15 kDa mostrou características de pI e massa molecular da cadeia leve da Rubisco. O aparelho fotossintético mostrou sofrer danos devido ao tratamento; reduções da taxa fotossintética assim como outros dados da fotossíntese sofreram alterações. Parâmetros da fluorescência da clorofila a (Fv/Fm, Fv/Fm', ETR, qP and qN) mostraram reduções com exceção da variável Fv/Fm. Observamos também a diminuição no conteúdo de pigmentos, bem como o amarelecimento das folhas e o aparecimento de manchas de necrose o que denota senescência.

XVII

ABSTRACT Different types of biotic and abiotic stresses can alter plant normal growth and

development. In many cases, defense mechanisms of plants are based on gene expression and alterations to a specific group of proteins. These changes can be mediated by jasmonates. The analysis of the protein pattern through electrophoretic techniques can be used to study and understand physiological mechanisms of plants in normal conditions and under stress. Jasmonate-induced proteins (JIPs) can be observed in plants treated with MeJa or exposed to types of stresses which induce jasmonate accumulation. In addition, these plants can repress or interrupt synthesis of many constitutive proteins, such as Rubisco. Photosynthesis is an extremely sensitive process and it has been employed as a stress indicator for adverse environmental conditions. Fluorescence measurements of chlorophyll have been considered as an important tool for the knowledge of photosynthetic performance and for monitoring of physiological status in normal or stresses conditions. This work has the objective of evaluating how external application of methyl jasmonate could interfere on castor bean leaves protein metabolism. Castor bean plants were submitted to methyl jasmonate treatment, and after different intervals of time, biochemical and physiological parameters were evaluated. Uni and bidimensional electrophoresis, as well as immunodetection analysis were made to evaluate possible alterations in protein pattern. Photosynthetic performance was analyzed by measurement of photosynthetic rate and fluorescence parameters of the chlorophyll a (Fv/Fm, Fv/Fm ', ETR, qP, qN). Unidimensional electrophoresis revealed alterations in protein pattern when comparing control and treated plants. Two proteins, identified by mass spectrometry, as being the LSU and SSU Rubisco subunits, were reduced by the treatment; immunodetection analyses against the LSU confirmed such reductions and subproducts of this subunit were identified. Three major proteins with molecular masses of 21, 24 and 32 kDa were induced only after MeJa treatment. Bidimensional electrophoresis revealed numerous new protein spots after the treatment what suggests induction of new proteins synthesis. It was observed that some protein spots increased and some reduced their areas in 2D-PAGE. Among the ‘spots ' that decreased two majority proteins were observed, with molecular masses of 50 and 15 kDa and pI values of 6.1 and 7.8, respectively. The 50 kDa protein was identified as the heavy chain of Rubisco through western blotting and the one with 15 kDa showed pI and molecular mass characteristics of the SSU. The photosynthetic apparatus showed damages due to the treatment. Reductions on the photosynthesis performance as well as other photosynthetic parameters changed after treatment. Chlorophyll fluorescence parameters (Fv/Fm, Fv/Fm', ETR, qP and qN) showed reductions except for Fv/Fm. We also observed decreases in pigment contents, leaf yellowing and necrosis. All these characteristics could denote senescence.

1-INTRODUÇÃO

Como os animais, os vegetais sofrem constantes agressões por agentes

bióticos e abióticos. Em geral, são agentes não-biológicos radiação ultravioleta,

salinidade, temperatura, umidade e outros produtos tóxicos presentes em rejeitos

industriais e domésticos que alteram o ambiente (Margis-Pinheiro et al., 1999).

Agentes naturais como insetos, vírus, bactérias e fungos tentam criar nas plantas

diferentes habitats como fonte de nutrientes (Baron & Zambryski, 1995). Apesar da

aparente passividade, as plantas percebem as agressões, e sua alta capacidade de

adaptação torna possível que sobrevivam, mesmo tendo muitas vezes seu

desenvolvimento prejudicado. As plantas desenvolveram sofisticados mecanismos

de resposta para se defenderem e se protegerem das várias formas de estresse

ambiental (Holey et al., 2003). Os mecanismos de defesa de plantas em muitos

casos baseiam-se na expressão de genes de defesa e alterações no conjunto de

proteínas da célula. Estas mudanças podem ser mediadas por jasmonatos (metil

jasmonato [MeJa] e ácido jasmônico [JA]).

Jasmonatos são moléculas da via de sinalização octadecanóide, são

hormônios de plantas com diversas funções, Os jasmonatos apresentam importante

papel em muitos aspectos no desenvolvimento e crescimento em diversas espécies

de plantas. Como exemplos embriogênese, germinação da semente, senescência e

abscisão de folhas e fechamento de estômatos de folhas (Wasternack & Parthier,

1997; Sembdner & Parthier, 1993), incluindo participação potencial no mecanismo

de defesa de plantas, aos mais diversos tipos de estresses (Rakwal & Komatsu,

2000). Plantas tratadas com metil jasmonato ou exposta a tipos de estresse que

induzem a acumulação de jasmonatos, sintetizam altos níveis de polipeptídeos

chamados JIPs Proteínas Induzidas por Jasmonatos) . Concomitantemente estes

tecidos reduzem ou interrompem a síntese de muitas proteínas presentes antes do

tratamento por metil jasmonato (Reinbothe et al., 1994). O papel do metil jasmonato

em promover senescência evidenciado por clorose e redução da síntese de

proteínas como as subunidades da Rubisco já foi previamente descrito (He et al.,

2002; Rossato et al., 2002; Cavalcante et al., 1999; Sembdner & Parthier, 1993).

A análise do perfil de proteínas por de técnicas eletroforéticas tem sido muito

usada para estudar e entender mecanismos fisiológicos e biológicos da planta em

condições normais ou sob os mais diversos tipos de estresse (Schiltz et al., 2004).

1

Processos fisiológicos podem estar sendo alterados devido ao tratamento. A

fotossíntese é um processo extremamente sensível a fatores ambientais e, como tal

a estes fatores, a fotossíntese tem sido extensivamente estudada como um

indicador de adaptação às diversas condições de estresse. (Gratani et al., 2000).

Medidas da fluorescência da clorofila a têm sido uma ferramenta importante para

conhecimento do desempenho da fotossíntese e do estado fisiológico da planta,

podendo avaliar sua resposta às condições de estresses tanto bióticos como

abióticos (Baker et al., 2001). As variáveis da fluorescência da clorofila a têm sido

utilizadas como ferramenta para abordagem dos efeitos do metil jasmonato no

processo fotossintético (Jung, 2004; Wierstra & Kloppstech, 2000).

A mamona (Ricinus communis) foi escolhida como modelo para nossos

estudos por ser muito resistente, se adaptando com facilidade aos diversos tipos de

solos e climas, por isso, acreditamos que ela seja adequada para a compreensão do

mecanismo de defesa de plantas. Neste trabalho, verificamos as alterações no perfil

protéico das folhas de mamona após tratamento com metil jasmonato por

eletroforese uni e bidimensional, a fim de verificar o papel deste hormônio na rota de

sinalização no mecanismo de defesa da mamona. O rendimento fotossintético

também foi avaliado através de medidas dos parâmetros fotossintéticos de trocas

gasosas e variáveis da fluorescência da clorofila a, rendimento quântico máximo e

efetivo (Fv/Fm e Fv/Fm’), taxa de transporte de elétrons (ETR), “Quenchings”

fotoquímicos e não fotoquímcos (qP e qN).

2

2-REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1- Mamona (Ricinus communis L.)

A mamona (Ricinus communis) é uma árvore pequena, com hábito arbustivo

(figura 1), bem difundida nos trópicos e regiões de temperatura morna do mundo

(Ilavarasana et al., 2006). No Brasil, a mamona é conhecida sob as denominações

de mamoneira, rícino, carrapateira, baga, bafureira e palma-criste; nos EUA e países

de língua inglesa, pelo nome de “castor bean” e “castor seed”. A mamona é nativa

da África tropical, mas se adaptou bem em regiões tropicais e subtropicais úmidas.

Em algumas regiões selvagens da Nigéria, a mamona cresce de forma

descontrolada e é tratada como praga. Considerando a habilidade de germinar e

crescer com sucesso em áreas com condições de distúrbios ambientais, a mamona

tem sido alvo de interesse para muitos estudos (Vwioko & Fashemi, 2005). É uma

planta considerada bastante resistente à seca, dotada de elevado nível de

xerofitismo, e também heliófila, não tolera a salinidade nem a sodicidade do solo, e

tem metabolismo fotossintético C3 (Beltrão & Cardoso, 2004). A mamona é

infestável por pragas como percevejo verde cigarrinhas, ácaros e lagartos (Souza et

al., 2004).

Classificação da mamona (http://www.cnpgc.embrapa.br/publicacoes/livros/

plantastoxicas/mamoma.jpg)

Reino - Plantae

Subreino - Tracheobionta

Superdivisão - Spermatophyta

Divisão - Magnoliophyta

Classe - Magnoliopsida

Subclasse - Roside

Ordem - Euphorbiales

Família - Euphorbiaceae

Gênero - Ricinus L.

Espécie - Ricinus communis L

Fig 1: Planta de mamona

3

http://www.cnpgc.embrapa.br/publicacoes/livros/%20plantastoxicas/mamoma.jpg

http://www.cnpgc.embrapa.br/publicacoes/livros/%20plantastoxicas/mamoma.jpg

Entre os principais países produtores de mamona estão o Brasil, China e

Índia (Koutroubas et al., 1999). No Brasil, a cultura da mamona é uma das mais

tradicionais do semi-árido brasileiro, é bastante cultivada por pequenos e médios

produtores de quase todos os estados da região, em especial da Bahia (Beltrão &

Cardoso, 2004). Nessa região a cultura se apresenta como uma alternativa de

relevante importância econômica e social (Souza et al., 2004). A União Européia tem

sido o principal importador de grandes quantidades do óleo e da semente, e a

expectativa é que a demanda venha a crescer muito nos próximos anos (Grigoriou &

Ntalos, 2001).

A cultura da mamona reveste-se de importância pelas várias aplicações que

seu óleo encontra no mundo moderno. Suas sementes (figura 2), que possuem em

torno de 55% de óleo, sendo principal componente, o ácido graxo ricinoléico

(Koutroubas et al., 1999).

Fig 2. Sementes de alguns cultivares de mamona.

O óleo da semente de mamona era usado primeiramente com propostas

medicinais e como lubrificante industrial. Subseqüentemente o óleo e seus derivados

foram se tornando mercadorias importantes devido ao aumento na variabilidade de

seus usos nas indústrias do mundo, que incluem setores da agricultura, indústria

têxtil e de papel, engenharia de plásticos e borrachas, indústria farmacêutica e

cosmética (Sujatha & Sailaja, 2004). Também curtume, indústria de tintas e vernizes,

4

além de ser excelente óleo lubrificante para motores de alta rotação e carburante de

motores a diesel (Souza et al., 2004). O subproduto, a torta, que possui enquanto

fertilizante, a capacidade de restauração de terras esgotadas, destacando-se seu

emprego, na Bahia, na lavoura fumageira. Apesar de seu alto teor de proteínas (32 a

40%), a torta, por conter produtos tóxicos e alergênicos como a ricina e ricinina e um

complexo de proteínas chamado CB-1A, não se presta à alimentação animal. Porém

esta torta pode ser usada na composição de ração animal após destoxificada. Por se

tratar de um processo de destoxificação bastante complexo e, muitas vezes, caro, as

usinas de óleo preferem vender a torta apenas como fertilizante

(http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Mamona/CultivodaMam

ona/importancia.htm).

A demanda energética mundial precisa ser atendida, entretanto, as fontes

convencionais estão em vias de esgotamento, além de provocarem efeitos

ambientais agressivos. Diante destes aspectos tem-se pesquisado fontes

energéticas renováveis, destacando-se a mamoneira como excelente alternativa

(Azevedo et al., 1997). A mamona possui grande possibilidade de se tornar uma das

matérias-primas para a produção de biodiesel, devido ao seu óleo possuir a

vantagem de ter elevado rendimento, mais de 99,0% na conversão em biodiesel, via

transesterificação alcoólica, na presença de um catalisador, NaOH, KOH, ou um

outro de natureza metálica, além disto, a transesterificação a frio devido a

solubilidade do óleo da mamona em álcool (metílico ou etílico), é também

combustível e comburente ao mesmo tempo devido a hidroxila (OH) colocada

estrategicamente no carbono 12 uma característica particular do óleo da mamona

(Beltrão & Cardoso, 2004).

2.2- Defesa de Plantas

As plantas são constantemente agredidas por agentes bióticos e abióticos,

como não podem se mover dos locais em que vivem elas desenvolveram

mecanismos que lhe permitissem defender-se e se adaptarem as mudanças

ambientais. As defesas de plantas podem ser físicas, como espinhos, pêlos,

componentes da parede celular (celulose, lignina) e químicas, como toxinas e

repelentes (Nomuro et al., 2000). Em resposta aos ataques de muitos organismos as

plantas desenvolveram uma variedade de defesas químicas, para repelir, deter ou

5

http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Mamona/CultivodaMamona/importancia.htm

http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Mamona/CultivodaMamona/importancia.htm

matar seu inimigo. As barreiras são de natureza química quando há envolvimento de

substâncias químicas nos mecanismos de defesa como a presença de alcalóides,

aminoácidos não protéicos, flavonóides, e outras substâncias de baixo peso

molecular, ou ainda presença de proteínas tóxicas como lectinas, inibidores de

proteinases e amilases (Xavier-Filho, 1993). As defesas podem ser constitutivas ou

induzidas. Constitutivas são aquelas que são expressas independente do ataque.

São características próprias da planta, por exemplo, algumas substâncias como

aminoácidos não protéicos, alcalóides, lectinas, fenóis e outros (Bezemer & van

Dam, 2005). As defesas induzidas são aumentadas durante o evento do ataque ou

estresse, por exemplo, a indução de genes de inibidores de proteinases (PIs). Estas

respostas induzidas podem ser produzidas por uma grande variedade de

organismos como fungos, bactérias e insetos. A resposta de defesa pode ocorrer no

local atacado ou ser expressa em partes remotas não danificadas da planta, que é a

indução sistêmica (Bezemer & van Dam, 2005).

2.2.1- Sinalização Uma planta a partir do momento que é injuriada ela pode mobilizar seu

sistema de defesa para reparar danos nos tecidos e evitar subseqüente invasão pelo

agente agressor (Zhang et al., 2004). Similar ao sistema imunológico dos animais,

respostas de defesas induzidas de plantas envolvem uma cascata de transdução de

sinal e uma rápida ativação da expressão de genes de defesa (Yang et al., 1997). A

ativação de genes de defesa em plantas atacadas por patógenos ou herbívoros, ou

agredida por um outro ferimento mecânico, pode resultar da ação de uma variedade

de moléculas que são liberadas em uma rota temporal complexa, seguida do início

da invasão dos tecidos (Farmer & Ryan, 1990). Estes sinais são transportados

localmente por difusão através de fluidos intracelulares e extracelulares que

penetram o local do ferimento ou da infecção, ou sistemicamente através do sistema

vascular da planta (Farmer & Ryan, 1990). A cascata de sinalização envolve entre

outras moléculas, de ácido salicílico (AS), o ácido jasmônico (JA) e seu metil ester,

metil jasmonato (MeJa) e o etileno (ET), como principais compostos capazes de

induzir a expressão de muitos genes relacionados à defesa por meio de rotas

diferentes (Pervieux et al., 2004). Nos últimos 40 anos o sistema de sinalização nas

defesas induzidas tem sido muito estudado, Ryan & Balls (1962) em suas pesquisas

6

se constatou a presença de inibidores de proteinases (PIs) em Solanáceas. O papel

defensivo dos inibidores de proteinases foi demonstrado por Green & Ryan (1972),

utilizando plantas de tomate e batata. Os estudos revelaram que os PIs são

induzidos e acumulados nos tecidos aéreos da plantas, como direta conseqüência

do ferimento causado tanto por insetos como por ferimento mecânico na folha. Foi

comprovado que a ação dos PIs depende da habilidade dessas moléculas em inibir

proteinases do trato digestivo do inseto (Damle et al., 2005). Duas subfamílias de

inibidores (PI-1e PI-2) foram encontradas em Solanácea, como de batata e tomate

(Ryan, 1990). Alguns PIs têm sido identificados entre outros como inibidores serino

proteinases, cisteino proteinases e aspártico proteinases (Bergey et al., 1996).

A ocorrência de defesa induzida em locais considerados distantes do local

atacado foi primeiramente estudada por Walker-Simmons & Ryan (1977) que

acreditavam na existência de um fator molecular móvel que promovia a resposta de

defesa sistêmica. Este fenômeno leva a crer que existe uma rede de sinalização

regulatória e complexa, capaz de gerar, transportar e interpretar sinais de alarme

produzidos na interface planta-herbívoro (Schilmiller & Howe, 2005). Farmer e Ryan

(1990) mostraram que o metil jasmonato, um composto volátil derivado de um ácido

graxo, é requerido na indução da síntese de PIs por via aérea. A investigação dos

sinais sistêmicos em plantas de tomate mostrou que os oligogalactoronídeos

(OGAs), derivados da parede celular das plantas, são indutores de genes de

inibidores de proteinases. Quitina e oligômeros de quitosana derivados da parede

celular de fungos também se mostram indutores ativos de proteínas de defesa

(figura 3), Dessa maneira os oligossacarídeos mostram estar entre os sinais

produzidos que auxiliam na produção de defesas químicas localizadas (Bergey et

al., 1996).

Um polipeptídio de 18 aminoácidos chamado sistemina foi identificado como

sinal sistêmico em plantas de tomate. A sistemina é um hormônio protéico vegetal,

que mostrou ser um milhão de vezes mais potente que oligossacarídeos na indução

da síntese de genes de defesa em folhas de tomate, sendo considerado o primeiro

exemplo de um polipeptídio sinal em plantas (Pearce et al., 1991 e 1993). A

sistemina é produzida da clivagem proteolítica da região C terminal de um precursor

de 200 aminoácidos chamado pró-sistemina (figura 2), é transportada através do

floema e induz a síntese de inibidores de proteinases (Pearce et al., 1991).

7

Sistemina

Processamento da prosistemina

Cascata de reações

Proteínas de

defesa

Membrana

Herbívoros Sinal Sistêmico

PatógenosSinal Local

Oligogalactoronídeos

QuitosanaTransporteSistemina

Processamento da prosistemina

Cascata de reações

Proteínas de

defesa

Membrana

Herbívoros Sinal Sistêmico

PatógenosSinal Local

Oligogalactoronídeos

QuitosanaTransporte

Fig. 3: Esquema adaptado do modelo proposto por Bergey e colaboradores (1996)

para sinalização da ativação de genes defensivos em resposta ao ataque de

herbívoros e patógenos em folhas de tomate.

2.3- Alterações Protéicas em plantas e a Ação dos Jasmonatos Quando as plantas são infectadas por algum microrganismo patogênico,

injuriada ou atacada por vários estímulos exógenos como poluição ou radiação

ultravioleta, elas induzem uma séries de respostas para se defender que leva a

produzir proteínas relacionadas à defesa (Hoffmann-Sommergruber, 2000). Algumas

proteínas induzidas são expressas para proteger o mecanismo celular e minimizar

danos nos mesmos, podendo citar como exemplo enzimas antioxidantes envolvidas

na desintoxicação de espécies reativas de oxigênio, chaperoninas que previne

associações incorretas de proteínas, proteinases que devem destruir proteínas

inativas (Salekdeh et al., 2002), proteínas relacionadas à patogênese (PRs), que tem

efeito inibitório no crescimento e multiplicação dos patógenos e constitui um grupo

8

de 14 famílias (Lu et al., 2006; Kombrink & Somssich,1997) e inibidores de

proteinases que interferem no processo digestivo dos insetos (Green & Ryan, 1972).

A indução de genes relacionados à defesa de plantas por um agente indutor é

chamada resistência induzida (Hammerschmidt & Kuc, 1995). Muitos artigos têm

sido publicados relatando alterações protéicas em plantas ocorridas sob os mais

diversos estímulos como metal pesado (Gianazza et al., 2005; Labra et al., 2003);

ferimento (Reymond et al., 2000; Pearce et al., 1991) estresse salino (Hmida-Sayari

et al., 2005), estresse hídrico por falta de água (Umezawa et al. 2004), fungos (Kim

et al., 2003), temperatura (Boothe et al., 1995), tratamento químico (Hause et al.,

1996; Hildmann et al., 1992).

Ácido jasmônico e seu metil ester, metil jasmonato são coletivamente

chamados de jasmonatos, estes hormônios além de atuarem no sistema de defesa

(figura 4) em resposta a ataques por pestes e patógenos e estresse ambiental como

seca, baixa temperatura e salinidade (Wasternack & Parthier, 1997) afetam uma

variedade de processos em plantas que incluem crescimento da raiz,

amadurecimento de frutos, senescência, desenvolvimento do pólen, formação de

tubérculos, alteram também a transcrição de genes, o processamento e a translação

de RNA (Li et al., 2004; Xie et al., 1998; Creelman & Mulle, 1997; Sembdner &

Parthier, 1993).

9

EmbriogêneseGerminaçãoCrescimento da raizFertilidadeAmadurecimento de frutosSenescência

Membrana

Jasmonatos

SinalPatógenosInsetosInjúriaEstresse abiótico(seca, salinidade)Metabolismo 2ª

DESENVOLVIMENTO MEIO AMBIENTEDESENVOLVIMENTO MEIO AMBIENTE

REGULAÇÃO DEFESA

Fig. 4 - Síntese de jasmonatos em resposta a sinais de desenvolvimento e

ambientais. Adaptado de Cheong & Choi, 2003.

O nível de JA em plantas varia em função do tecido e tipo celular, estágio de

desenvolvimento e em resposta a estímulo ambiental, e quando aplicado em

plantas, o ácido jasmônico e seu metil éster alteram a expressão de genes e

desencadeiam a síntese de uma variedade de proteínas diferentes chamadas JIPs

(Proteínas Induzidas por Jasmonatos) (Sembdner & Parthier, 1993). A aplicação de

jasmonatos em folhas induz a perda de clorofila e diminui a expressão de genes do

cloroplasto e núcleo envolvidos na fotossíntese (Weidhase et al., 1987).

A primeira observação de produtos gênicos induzidos por jasmonatos

foi feita em folhas de cevada após tratamento com jasmonatos, tratamento com este

compostos resultou em sintomas de senescência. As análises de eletroforese

revelaram a síntese de novas proteínas, e a diminuição de algumas proteínas pré-

existentes importantes como rubisco e polipeptídios do plastídio (Weidhase et al.,

1987). Farmer e Ryan (1990) observaram que a aplicação exógena de MeJa e JA

em folhas de tomate, tabaco e alfafa induz a expressão de Pis. Bolter (1993)

identificou um inibidor de papaína em folhas de tomate tratadas com MeJa. Muitas

proteínas que são induzidas ou reprimidas pela ação do tratamento com jasmonatos

têm sido identificadas. Entre as induzidas pode-se citar classes de inibidores de

proteinases, tioninas, proteínas ricas em prolina, enzimas envolvidas no

metabolismo de fenilpropanóide e proteínas inativadoras de ribossomos. Entre as

que são reprimidas estão as proteínas dos cloroplastos codificadas no núcleo, a

10

cadeia leve da Rubisco (SSU) e as codificadas nos plastídios, a cadeia pesada da

Rubisco (LSU), e proteínas que fazem parte do fotossistema II (PS II) de massas 68

e 66 kDa (Reinbothe et al., 1994). Estas proteínas que são negativamente reguladas

por jasmonatos estão envolvidas na assimilação de carbono fotossintético e estes

efeitos de redução são sintomas característicos de senescência. O fenômeno de

redução da Rubisco após tratamento com MeJa foi verificado em muitas plantas

entre elas, Brassica napus (Rossato et al., 2002), arroz (Rakwal & Komatsu 2001),

Ricinus communis (Cavalcante et al 1999) e cevada (Reinbothe et al., 1993 e 1992).

2.4-Senescência e a Degradação da Rubisco

A morte de conjuntos específicos de células é um evento essencial do

crescimento e desenvolvimento de muitos organismos eucariontes, incluindo plantas

e animais. Como o organismo controla o início e a execução do processo de morte

celular, este evento é chamado de morte celular programada (PCD). PDC em

plantas pode atuar por senescência e morte celular associada à HR (resposta

hipersensível). Senescência é uma morte celular relativamente lenta dos tecidos no

final da vida do organismo e envolve um desarranjo ordenado de componentes

celulares do tecido em senescência que permite a recuperação máxima de

nutrientes para reciclagem de parte da planta que sobrevive. Nos eventos

associados a ocorrências de HR, a morte celular é iniciada nas células da planta ao

redor do ponto de infecção por alguns patógenos. Esta morte celular é mais

importante, uma vez que matar o tecido hospedeiro antes do patógeno se estabilizar

é mais importante do que recuperar nutrientes (Buchanan et al, 2000).

O desenvolvimento da senescência é determinado por fatores que incluem

estresses, bióticos e abióticos (Noodén et al, 1997). A senescência causada por

fatores externos ou internos é mediada por complexas interações entre várias

moléculas incluindo hormônios. A determinação para iniciar a senescência em

plantas depende da interação de vários sinais, incluindo reguladores endógenos de

crescimento, mas não limitado por eles. Senescência está associada a um

decréscimo no conteúdo de proteína e clorofila, caracterizado pelo amarelecimento

da folha (Feller & Fischer, 1994). Também é caracterizada por decréscimo da

enzima fixadora de carbono fotossintético, a Rubisco, declínio na fotossíntese,

aumento na proteólise, mudança na estrutura das organelas, perdas de DNA e RNA,

11

aumento no rompimento de membranas e extravazamento de íons (Noodén, 1988).

A aplicação exógena de JA promove senescência típica precoce em Arabdopsis.

Genes que codificam enzimas para biossíntese de JA são diferencialmente ativados

durante o evento de senescência das folhas (He et al., 2002).

Ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase é uma enzima bifuncional que

ocorre no estroma dos cloroplastos e catalisa duas reações: fixação fotossintética de

dióxido de carbono e oxidação fotorrespiratória do carbono. Em folhas senescentes

a Rubisco é a principal fonte de nitrogênio, fornecedora de aminoácidos para

desenvolvimento de órgãos (Feller & Fischer, 1994). A Rubisco é uma proteína

composta por oito cadeias pesadas codificada no cloroplasto (50-55 kDa) e oito

cadeias leves codificadas no núcleo (12-18 kDa) (Yoshida & Minamikawa, 1996).

A degradação da Rubisco em folhas senescentes tem sido interpretada por

dois pontos de vista: o primeiro considera o vacúolo como o maior compartimento

intracelular responsável pela degradação, baseado na analogia de que este

compartimento contém um número de hidrolases ácidas e tem função similar ao

lisossomo animal; o outro ponto de vista é que a Rubisco é hidrolisada por ação de

enzimas proteolíticas dentro do cloroplasto com a exportação dos produtos digeridos

(Yoshida & Minamikawa, 1996). Estudos realizados em folhas de ervilhas confirmam

a Rubisco como uma fonte importante na mobilização de nitrogênio em folhas

senescentes durante preenchimento das sementes. Os baixos níveis de Rubisco

estão relacionados ao aumento e subunidades reguladoras de proteases do

cloroplasto e de proteínas relacionadas ao aparelho fotossintético (rubisco activase,

proteínas ligadoras de Rubisco) e chaperoninas. O papel destas proteínas na

manutenção da ativação da Rubisco e reparação do fotossistema ll durante intensa

atividade proteolítica dentro do cloroplasto têm sido propostos (Schiltz et al., 2004).

2.5- Processo Fotossintético No processo fotossintético, a luz é absorvida por pigmentos do complexo

coletor de luz (do inglês, Light Harvesting Complex – LHC), que excitados,

transferem energia para os centros de reação dos fotossistemas (PS) I e II (P700 e

P680, respectivamente) (Yong & Frank, 1996). A energia da luz absorvida é utilizada

para dirigir um fluxo de elétrons da água para o NADP+. Nas membranas tilacoidais,

esta energia é carregada por bombeamento de prótons do estroma lateral para o

12

lúmen. Esta força próton-motriz é usada por uma F-ATPase para gerar ATP (Brack &

Frank, 1998). Posteriormente, os produtos ATP e NADPH são utilizados no Ciclo de

Calvin-Benson para fixação de CO2. (Horton, 2000).

O excesso de energia absorvida pelas moléculas de clorofila pode ser

dissipado em forma de calor ou re-emitida como fluorescência, isto é a clorofila

excitada pode re-emitir um fóton e assim, retornar ao seu estado-basal (Maxwel &

Johnson, 2000).

Os três processos pelos quais a energia absorvida pode ser utilizada

(dissipação fotoquímica, fluorescência e dissipação na forma de calor) ocorrem em

competição, de forma que algum aumento de eficiência de um, resultará na queda

de rendimento de outro (Maxwel & Johnson, 2000). A fotossíntese é um processo

fisiológico que é afetado por condições ambientais. As plantas são capazes de

adaptar seu sistema fotossintético a estas variações e a sensibilidade da

fotossíntese a condições de estresse varia de planta para planta. Devido a estes

fatores, a fotossíntese tem sido extensivamente estudada como um indicador de

adaptação às diversas condições de estresse. (Gratani et al., 2000). O transporte de

elétrons é um regulador chave na fotossíntese e decisivo no controle de processos

pelos quais as plantas são capazes de perceber e modular suas respostas a

mudanças ambientais (Cleland, 1998).

2.6- Fluorescência da Clorofila a

Aspectos da fluorescência da clorofila a mostram estar intimamente ligados

ao metabolismo do carbono e trocas gasosas em folhas (Bolhar-Nordenkampf et al.,

1989). Um tecido fotossinteticamente ativo quando iluminado irá emitir fluorescência

continuamente, porém poucas informações se obtêm sobre os processos

fisiológicos. Quando este material é transferido do escuro para a luz ocorre um

aumento no rendimento fotossintético em um curto período de tempo, em torno de 1

segundo. Esta elevação pode ser explicada como uma conseqüência da redução de

receptores de elétrons no aparelho fotossintético, notavelmente nas plastoquinonas,

particularmente na quinona A (QA). Uma vez que o PSII absorveu luz e QA recebeu

um elétron, QA não é capaz de receber outro até que o primeiro tenha passado para

o subseqüente transportador de elétrons, no caso a quinona B (QB). Durante este

período, o centro de reação é dito estar “fechado”. Assim, quando uma folha

13

adaptada ao escuro por um período de tempo é submetida para condições de luz

saturante, os centros de reação do PSII são progressivamente fechados, o que leva

a um aumento no rendimento da fluorescência da clorofila a (Maxwel & Johnson,

2000).

O rendimento da fluorescência pode ser quantificado por exposição da folha a

luz em um definido comprimento de onda, e medida a quantidade de luz re-emitida

em comprimento de onda mais longo, e assim uma variedade de parâmetros

diferentes podem ser calculados (Maxwel & Johnson, 2000). Parâmetros que serão

citados a seguir.

Quando uma folha é adaptada ao escuro e recebe um pulso de luz incidindo

sobre a área mantida no escuro gera uma fluorescência inicial, (F0), que é a

intensidade de fluorescência quando todos os centros de reação do PSII estão

“abertos”, ou seja, oxidados (van Kooten & Snel, 1990). Com o centro de reação

”fechado” isto é, QA completamente reduzida, ocorre um aumento na emissão da

fluorescência de um mínimo a um máximo, denominada fluorescência máxima (Fm).

Fm que é definida como a intensidade de fluorescência em que todos os centros de

reação do PS II estão fechados, a extinção fotoquímica é igual a zero e todos os

processos de extinção não-fotoquímica estão no mínimo (van Kooten & Snel, 1990).

Por meio dos registros de F0 e Fm, calcula-se a fluorescência variável (Fv= Fm -

F0), por onde se obtém o rendimento quântico máximo (Fv/Fm). Valores de Fv/Fm

refletem a rendimento quântico do PSII, isto é, expressa a eficiência de captura da

energia de excitação pelos centros de reação abertos do PSII (Butler & Kitajima

1975) e é o principal parâmetro utilizado como um indicador eficiente do

desempenho fotossintético da planta (Maxwel & Johnson, 2000).

Como já dito anteriormente na condição de ausência de luz e antes da

aplicação do pulso saturante de luz, se obtém a emissão da fluorescência inicial, e

durante a aplicação do pulso saturante de luz, a emissão da fluorescência máxima, e

a partir daí o rendimento quântico máximo. Porém durante uma iluminação com

emissão de uma fluorescência F, pode-se obter emissão da fluorescência máxima

durante a luz (Fm’), e o rendimento quântico é denominado efetivo ( Fv’/Fm’) (Genty et

al., 1989).

Valores de (Fv/Fm) aceitáveis na ausência de estresse variam de 0,75 a 0,85

(Butler & Kitajima, 1975). Valores abaixo destes aparecem quando as plantas estão

expostas a algum tipo de estresse ambiental, indicando em particular o fenômeno da

14

fotoinibição (Mawxel & Johnson, 2000). Com a queda do rendimento quântico

(Fv/Fm) ocorre diminuição da fotossíntese podendo haver redução na atividade de

algumas enzimas do ciclo de Kalvin e mudança nas rotas bioquímicas (Wright et al.,

1995)

2.6.1- Análise dos “Quenchings” O fenômeno denominado “Quenching” da fluorescência é explicado de duas

maneiras. Primeiramente existe um aumento na taxa de transporte de elétrons do

PSII, devido principalmente à ativação de enzimas envolvidas no metabolismo do

carbono induzida pela luz e abertura dos estômatos, esta dissipação é chamada de

coeficiente de extinção fotoquímico (qP). Ao mesmo tempo existe um aumento na

eficiência com que a energia é convertida em calor, este processo é chamado de

coeficiente de extinção não-fotoquímico (qN) (Maxwell & Johnson, 2000).

“Quenching” fotoquímico reflete, portanto a taxa relativa de separação de

carga no centro de reação do PSII (Hill et al., 2005).

Os processos de dissipação não fotoquímicos têm um papel importante de

proteção da inibição da fotossíntese induzida pela luz, fenômeno que ocorre quando

a absorção de energia pelo sistema fisiológico é muito maior que a utilização no

processo fotoquímico. O excesso de energia pode provocar danos no aparelho

fotossintético da planta, por isto as plantas desenvolveram um excelente regulador

para dissipar o excesso de energia. O processo NQP promove a dissipação térmica

e consequentemente diminui o rendimento da fluorescência da clorofila a (Vasil'ev et

al., 1998). A indução deste processo tem sido associada com a diminuição do pH no

lúmen dos tilacóides, indução do ciclo das xantofilas (conversão de violaxantina em

zeaxantina) e aglomeração dos coletores de luz do complexo II (Cogdell, 2006).

2.7- Fluorescência da Clorofila a e Plantas Estressadas

Medidas da fluorescência da clorofila a têm sido uma ferramenta importante

para conhecimento do desempenho da fotossíntese e o estado fisiológico da planta,

podendo avaliar sua resposta a condições de estresses tanto bióticos como

abióticos (Baker et al., 2001). Quando as plantas são expostas a estes tipos de

estresse, alterações no estado funcional das membranas dos tilacóides dos

15

cloroplastos provocam mudanças nas características dos sinais de fluorescência, os

quais podem ser quantificados nas folhas (Baker & Rosenqvst, 2004).

Com o desenvolvimento comercial de fluorômetros pôde-se determinar o

rendimento quântico dos processos fotoquímicos (Baker et al., 2001). Também obter

parâmetros de fluorescência inicial e máxima, rendimento quântico máximo e efetivo,

dissipação fotoquímica e não fotoquímica e taxa de transporte de elétrons, esta

ultima é um excelente indicador de estresse ambiental e um dos primeiros eventos

para registrar danos nos cloroplastos (Costa et al., 2003)

A análise da fluorescência da clorofila a tem sido muito utilizada para avaliar

alteração na capacidade fotossintética da planta como resposta aos mais diversos

tipos de estresse como temperatura (Campbell et al., 2006; Costa et al., 2003),

salinidade (Jiang et al., 2006; Sayed, 2003), estresse hídrico por falta de água

(Miyashita et al., 2005; Souza et al., 2003b), metais pesados (Catriona et al., 2002),

herbicidas (Ralph, 2000), vírus (Guo et al., 2005), fungos (Lorenzini et al., 1997),

tratamento químico com ácido abscísico (Jia & Lu, 2003), ferimento mecânico

(Quilliam et al., 2006; Herde et al.,1999). A grande vantagem de analisar

fluorescência é que pode ser feito em folhas intactas e de maneira não destrutiva,

além de ser um método muito sensível, sendo possível identificar injúria nas folhas

mesmo quando os sintomas não são visíveis (Krause & Weis, 1991).

2.8- Plantas Tratadas com Jasmonatos e a Fotossíntese

Os jasmonatos atuam como componentes na sinalização de reações de

resposta de defesa em plantas (Farmer & Ryan, 1990), uma das conseqüências da

ação dos jasmonatos é a indução de sintomas de senescência (Ueda & Kato, 1980;

Chou & Kao 1992; He et al., 2002). Entre os efeitos da senescência destaca-se, a

redução na quantidade de Rubisco, declínio na fotossíntese (Noodén, 1988) e o

decréscimo no conteúdo de pigmentos, caracterizado pelo amarelecimento das

folhas (Feller & Fischer, 1994). Alguns trabalhos têm sido publicados abordando

tratamento com jasmonatos e sua relação com o rendimento fotossintético. Jung

(2004) ao analisar os efeitos da redução dos teores de clorofila causados por

jasmonatos em plantas de Arabidopsis thaliana, encontrou além de perda da clorofila

e carotenóides, decréscimo na atividade fotossintética evidenciado por queda no

rendimento quântico (Fv/Fm) e na taxa de transporte de elétrons (ETR), alterações

16

nos “quenchings” também foram observadas. Em plantas de Brassica napus L., o

tratamento com metil jasmonato interferiu no crescimento e desenvolvimento da

planta, provocando queda na taxa fotossintética e no conteúdo de clorofila (Rossato

et al., 2002). O rendimento quântico máximo foi uma das ferramentas utilizada para

avaliar os efeitos do tratamento por metil jasmonato em folhas de plantas de cevada,

o rendimento apresentou brusco decréscimo quando o tratamento foi realizado sob

alta incidência de luz (Wierstra & Kloppstech, 2000).

17

3-OBJETIVO

3.1- Objetivo Geral Analisar a resposta da planta Ricinus communis, quando exposta aos vapores

de metil jasmonato, através do perfil de proteínas e rendimento fotossintético.

3.2 - Objetivos Específicos 1 – Acompanhar, por meio de eletroforese unidimensional e bidimensional

modificações no perfil protéico das folhas das plantas tratadas por metil jasmonato.

2 - Caracterizar as proteínas de interesse, ou seja, as que são induzidas ou

reprimidas pelo tratamento, obtendo algumas características como dados de massa

molecular e ponto isoelétrico.

3 - Verificar a ação do MeJa na degradação e consumo da Rubisco utilizando

análise eletroforética e imunodetecção.

4- Verificar possíveis danos causados no aparelho fotossintético por meio das

variáveis da fluorescência da clorofila a e atividade fotossintética.

18

4- MATERIAIS

O trabalho foi desenvolvido no laboratório de Química e Função de Proteínas

e Peptídeos e no laboratório de Fisiologia Vegetal, nos Centros de Biociências e

Biotecnologia (CBB) e de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA).

4.1.- Equipamentos Tabela 1- Relação dos equipamentos utilizados para realização do trabalho.

Equipamentos Marca

Analisador de gás no IV Licor LI-6200

Espectrofotômetro Shimadzu

Espectrômetro de massas MALDI-TOF Micromass

Fluorímetro de luz modulada MINI-PAM

Medidor de área foliar Licor LI-3100

Sistema para eletroforese horizontal GE Healthcare

Sistema para eletroforese

unidimensional

GE Healthcare

Sistema para IEF GE Healthcare

4.2- Reagentes Todos os reagentes utilizados neste trabalho foram de grau analítico e obtidos

comercialmente.

Os géis utilizados nas análises por eletroforese bidimensional foram

fabricados pela empresa GE Healthcare.

4.3- Sementes As sementes de Ricinus communis, cultivar IAC 80 foram adquiridos no

Instituto Agronômico de Campinas.

19

4.4- Anticorpo

Os anticorpos policlonais contra a proteína cadeia pesada da Rubisco de

Ricinus communis, foram desenvolvidos e obtidos em camundongos pelo Dr. Milton

Masahiko Kanashiro do Laboratório de Biologia do Reconhecer desta universidade.

20

5- METODOLOGIA

5.1- Cultivo das Plantas As sementes foram semeadas em potes plásticos contendo o substrato

orgânico Plantmax® em casa de vegetação. As plantas foram irrigadas diariamente

até atingir capacidade de campo, durante todo o período de germinação e

crescimento.

Após o período de aproximadamente quinze dias (estágio trifoliar), os potes

foram levados para o laboratório e as plantas foram submetidas aos tratamentos. As

folhas alvo em todos os ensaios foram os primeiros unifoliatos formados logo após a

formação das folhas cotiledonárias.

5.2- Indução de Estresse por Metil Jasmonato Para indução do estresse, um grupo de plantas foi acondicionado em uma

câmara fechada a aproximadamente 28 ºC, sob um fotoperiodo de 14 horas e uma

irradiação de 200 μmol m-2s-1.

O metil jasmonato na concentração de 1 mM (125 μL dissolvido em 1 ml de

etanol e diluído em quantidade suficiente para 500 mL de solução 0,1% de triton X-

100) foi aplicado sobre as folhas por pulverização. Duas formas diferentes de

tratamento foram realizadas como descritas a seguir.

Um outro grupo de plantas controles (sem MeJa) foi mantido nas mesmas

condições e analisadas nos mesmos períodos de tempo das plantas tratadas.

5.2.1- Primeiro Tratamento (T1)

O metil jasmonato foi borrifado uma vez sobre as folhas até ficarem

completamente molhadas (gotejando) e após períodos de tempo (1, 6, 14, 24 e 48

horas) as análises foram realizadas. Este tratamento foi realizado segundo

Cavalcante et al. (1999) com modificações.

21

5.2.2- Segundo tratamento (T2) O metil jasmonato foi borrifado sobre as folhas por seis vezes uma vez a cada

duas horas, até ficarem completamente molhadas (gotejando), após períodos de

tempos (24, 48, 72, 96 e 144 horas), as análises foram realizadas. Este tratamento

foi realizado segundo Jung (2004) com modificações.

5.3- Obtenção dos Extratos Protéicos

Duas metodologias diferentes de extração de proteínas foram realizadas para

aperfeiçoar as análises e alcançar objetivos diferentes.

5.3.1- Primeiro Método de Extração (E1)

Os extratos foram obtidos seguindo as etapas descritas abaixo, segundo

Souza, 2003 com modificações.

• As folhas cortadas foram pesadas, maceradas e reduzidas a pó com auxilio

de grau e pistilo na presença de nitrogênio líquido.

• O pó obtido foi ressuspenso em 5 volumes de uma solução de tris-HCl 100

mM pH 8,0, EDTA 10mM, PMSF 10 mM , benzamidina 4 mM, PVPP

(polivinilpolipirrolidona) 5%. A suspensão foi mantida por 1 hora a 4ºC e

centrifugada por 30 minutos a 15000 g a uma temperatura de 4ºC. A

suspensão foi descartada e o sobrenadante foi reservado para análises

posteriores.

5.3.2- Segundo Método de Extração (E2)

Os extratos foram obtidos seguindo as etapas descritas abaixo, segundo

Tsugita et al, (1996) com modificações.

• As folhas cortadas foram pesadas, maceradas e reduzidas a pó com auxilio

de grau e pistilo na presença de nitrogênio líquido.

• O pó obtido foi ressuspenso em 10 volumes de uma solução de TCA 10% em

acetona e β-mercaptoetanol 0,07%, e mantido por 45 minutos a -20º C. Após

22

este período, a suspensão foi centrifugada a 35000 g por 15 minutos a 4º C.

O sobrenadante foi descartado.

• O sedimento foi ressuspenso em 10 volumes de uma solução de acetona

com PMSF 1mM, EDTA 2mM e β-mercaptoetanol 0,07%. A suspensão foi

mantida a -20º C por 1 hora e centrifugada 35000 g por 15 minutos a 4º C. O

sobrenadante foi descartado.

• O sedimento foi novamente ressuspenso na mesma solução anterior e

centrifugado imediatamente a 35000 g por 15 minutos a 4º C. O sobrenadante

foi descartado.

• O sedimento foi seco em centrifuga à vácuo (Speed Vac).

• Para as análises por eletroforese o sedimento obtido foi ressuspenso para

dissolução das proteínas, na proporção de 5 mg para 200 μL de tampão

contendo: uréia 8M, DTT 100 mM, CHAPS 2%, mantido a 37º C por 1 hora

sob agitação e então centrifugado a 9000 g por 10 minutos a 4º C. O

sobrenadante foi reservado para análises posteriores.

5.4- Quantificação de Proteínas

As determinações de proteínas obtidas pelo método E2, foram feitas pelo

método descrito por Bradford (1976). As amostras foram diluídas 20 vezes em

tampão tris. Em paralelo uma curva-padrão foi feita utilizando-se ovalbumina (OVA).

As leituras foram realizadas utilizando espectrofotrômetro a um comprimento de

onda de 595 nm.

5.5- Avaliação do Perfil Protéico Através de Eletroforese

5.5.1- Eletroforese Unidimensional

As proteínas extraídas pelos métodos E2, foram analisadas por eletroforese

em gel de poliacrilamida 15% sob condições desnaturantes, segundo método

23

desenvolvido por Laemmili (1970) e Hochstrasser et al., (1988), utilizando o sistema

“miniVE” de eletroforese vertical GE Healthcare.

O gel de separação (15% em acrilamida) foi preparado pela mistura de água,

3,5 mL; acrilamida/bis-acrilamida (30% T; 2,67% C), 7,5 mL; tampão tris/HCL 1,5 M

pH 8,8, 3,8 mL; SDS 10% 150 μL, persulfato de amônio 10%, 150 μL e TEMED 6 μL.

Perfazendo um volume final de 15 mL. O gel de concentração “stacking” (4% em

acrilamida) foi preparado pela mistura de água, 2,7 mL; acrilamida/bis-acrilamida

(30% T; 2,67% C), 0,67 mL; tampão tris/Hcl 1M pH 6,8, 0,5 mL; SDS 10%, 40 μL;

persulfato de amônio 10%, 40 μL e TEMED, 4 μL, para um volume final de 4 mL.

As amostras foram dissolvidas na proporção 1/3 em tampão contendo água,

3,8 mL; tris/HCl 1M pH 6,8, 1,0 mL; glicerol, 0,8 mL; SDS 10%, 1,6; β-

mercaptoetanol 0,4 mL e azul de bromofenol 1%, para um volume final de 8 mL. A

corrida eletroforética foi realizada com uma voltagem constante de 50 V por

aproximadamente 30 minutos e 100 V até o final da corrida (aproximadamente 2

horas). Foi utilizado tampão de corrida pH 8,3 contendo tris 0,1 M, glicina 1 M e SDS

0,5%.

5.5.2- Eletroforese Bidimensional (2D-PAGE)

O perfil protéico dos extratos foi avaliado po eletroforese bidimensional

empregando os aparelhos IPGphor e MULTIphor II (GE Healthcare) de acordo com

instruções do fabricante e segundo Laemmili, (1970), O’Farrel, (1975), Bjellqvist et

al, (1982) e Görg et al., (1985 e 1988).

5.5.2.1- Focalização Isoéletrica (IEF)

• Uma alíquota do extrato (E2) foi dissolvida em de tampão de re-hidratação

(uréia 8M; CHAPS 2%; anfólitos 0,5% e DTT 0,2 -0,4%, azul de bromo fenol

0,0002%) quantidade suficiente para 200 μl.

• A solução resultante foi colocada no centro do “strip holder” de 11 cm.

24

• O “strip”, (tira de gel) de 11 cm com gradiente de pH imobilizado na faixa de 3

a 10, foi colocado sobre a amostra e então coberto com um óleo mineral.

• O “strip holder” foi colocado sobre a plataforma do aparelho de focalização

IPG Phor o qual foi programado para temperatura de 20º C, 50 mA por “strip”,

12 de re-hidratação e etapas crescentes de voltagem até atingir

aproximadamente 50.000 Vhs.

5.5.2.2- SDS-PAGE

• O “strip” com as proteínas já focalizadas foi colocado por 15 minutos em

tampão de equilíbrio (tris-HCl pH 8,8 0,05 M; uréia 6 M; glicerol 30%; SDS

2%; azul de bromo fenol 0,0002% e DTT 1,0 %), e mais 15 minutos no

mesmo tampão porém sem DTT e com iodoacetamida 2,5%.

• O gel SDS 12,5% pré-fabricado, suportado por um filme plástico foi colocado

sobre a plataforma do Mult Phor II selado por fluído de cobertura.

• Os “strips” de tampão anodo e catodo foram posicionados de acordo com os

pólos positivo e negativo da plataforma do aparelho.

• O “strip” já equilibrado foi colocado sobre o gel de segunda dimensão, e

submetido a eletroforese nas condições de 600 V e 20 mA por 45 minutos;

600V e 40 mA até o final da corrida.

A eletroforese bidimensional realizada com propósito de análise de

imunodetecção foi realizada com algumas modificações do protocolo descrito nos

itens 4.5.2.1 e 4.5.2.2. Na IEF, o “strip” utilizado foi de 7,0 cm com gradiente de pH

imobilizado na faixa de 4 a 7, as etapas crescentes de voltagem ocorreram até

atingir 20.000 Vhs. A segunda dimensão foi realizada como descrito no item 4.5.1, o

“strip” já equilibrado foi colocado no topo do gel SDS, sem o gel de concentração. O

“strip” foi selado utilizando uma solução de agarose 0,5 % em tampão de corrida.

25

5.6- Visualização das Proteínas

5.6.1- Coloração por Azul de Coomassie

O gel obtido da eletroforese unidimensional foi colocado por 30 minutos em

uma solução corante (Coomassie Blue 0,1%; metanol 40% e ácido acético 10%). A

visualização das proteínas coradas foi feita utilizando uma solução descorante

(metanol 40% e ácido acético 10%) com muitas trocas pelo tempo de 1 a 3 horas.

5.6.2- Revelação com Nitrato de Prata

Foi seguido o protocolo compatível para espectrofotometria de massas,

segundo (Shevchenco et al, 1996). As etapas foram seguidas conforme tabela

abaixo.

Tabela 2- Protocolo para revelação das proteínas por nitrato de prata.

Etapa Reagente Duração

Fixação metanol 50%, ácido acético

5%

20 minutos

Lavagem metanol 50% 10 minutos

Lavagem água grau milli-Q Mínimo 2 horas

Sensibilização tiossulfato de sódio penta

hidratado 0.02

1 minuto

Lavagem água grau milli-Q 1 minuto


Prata nitrato de prata 0,1% 20 minutos a 4 º C


Revelação carbonato de sódio2% e

formaldeído 0,04%

Tempo suficiente para aparecer os

spots de interesse

Parada ácido acético 5% 5 minutos

Preservação ácido acético1% Algumas semanas

26

5.7- Análise do Gel

A imagem dos géis foi obtida utilizando scanner especializado de alta

resolução no modo transmissivo. A análise das imagens obtidas dos géis da 2D-

PAGE foi feita através do software Phoretix 2D.

5.8 - Digestão das Proteínas e Extração dos Peptídeos

Os “spots” e bandas de interesse foram retirados do gel com auxílio de um

pipetador automático com ponteiras adaptadas ou de uma lâmina de bisturi. Os

spots e bandas foram descorados, as proteínas digeridas por tripsina e os peptídeos

foram extraídos de acordo com Gharahdaghi e colaboradores, (1999) nas condições

descritas abaixo.

• Os “spots” retirados dos géis corados por prata foram colocados em uma

solução 1/1 de ferricianeto de potássio 30 mM e tiossulfato de sódio 100 mM,

por 10 minutos e lavados com água grau milli-Q por 3 vezes.

• Os “spots” descorados e bandas retiradas dos géis unidimensionais foram

lavados 3 vezes por 15 minutos com uma solução contendo acetonitrila 50%

e bicarbonato de amônio 10 mM pH 8,0 50%; após colocado na presença de

acetonitrila 100% por 5 minutos e em seguida secos em Speed-Vac por 20 a

30 minutos.

• O géis secos foram re-hidratados com a solução de tripsina na concentração

de (10 a 15 μg/mL de tampão bicarbonato 25mM pH 8,0), em seguida os géis

foram incubados a 37ºC por 16 a 24 horas.

• Para extração dos peptídeos adicionou-se sobre os géis um volume

apropriado de uma solução de TFA 0,1%, e mantido sob agitação por 60

minutos, o sobrenadante foi coletado. Este procedimento foi realizado por

duas vezes.

• Os extratos obtidos foram concentrados a 5 μL utilizando Speed-Vac.

27

5.9- Caracterização por Espectrometria de Massas

Esta etapa foi realizada utilizando o Espectrômetro de Massas MALDI-TOF

TOF 4700 Applied Biosystems do Departamento de Fisiologia e Farmacodinâmica da Fundação Osvaldo Cruz (Fiocruz). Sob orientação do Dr. Jonas Perales.

5.10- Eletrotransferência

Após a eletroforese as proteínas foram transferidas para membrana de

nitrocelulose, utilizando um sistema de transferência semi-seco, tampão de

transferência (Tris 25mM, Glicina 192 mM, Metanol 20%, pH 8,3) e aplicado 0,8 mA

por cm2. Após a eletrotransferência a membrana foi corada com vermelho de

Ponceau, para verificar a transferência das proteínas do gel para a membrana.

5.11- “Western Blotting” A análise de imunodetecção foi realizada segundo Towbin e colaboradores,

(1979), seguindo etapas descritas abaixo.

• A membrana de nitrocelulose com as proteínas transferidas teve seus sítios

livres bloqueados com tampão bloqueador PBS pH 7,6 (Fosfato de sódio

monobásico 0,1 M e cloreto de sódio 0, 5 M ) com leite em pó desnatado 2%,

por duas horas.

• Em seguida a membrana foi incubada com IgG de camundongo produzido

contra cadeia pesada da Rubisco de Ricinus communis em tampão

bloqueador na proporção de 1:2000 por aproximadamente 18 horas a 4º C.

• A membrana foi lavada por 1 hora com tampão PBS com trocas a cada 10

minutos.

• Na seqüência, a membrana foi incubada por duas horas com anticorpo

secundário (anti IgG de camundongo), acoplado a peroxidase.

• Após as duas horas de incubação, a membrana foi lavada novamente, como

descrito anteriormente.

28

• A visualização da reação imunológica foi revelação por marcação com DAB

(diaminobenzidina), utilizando uma solução contendo Tris-HCl 40 mM, DAB

0,1%, Imidazol 6 mM, Peróxido de Hidrogênio 0,1%.

5.12- Medidas Fotossintéticas 5.12.1- Taxa Fotossintética

Para medidas da taxa fotossintética, foi utilizado um Analisador de Gás no

Infra Vermelho (IRGA) LI-6200 e um sistema de fotodiodo (LED) acoplado à

superfície da câmara, que possibilitou um fluxo de fótons fotossintéticos de

aproximadamente 600 μmol m-2 s-1, suficientes para a saturação do aparelho

fotossintético, sem aquecimento do tecido foliar (Delieu & Walker, 1981). As folhas

foram adaptadas em uma câmara do aparelho, onde o CO2 foi injetado, e o consumo

do gás foi medido, a temperatura ambiente era de 25º C. As leituras também

forneceram dados de concentração interna de CO2 (Ci), eficiência instantânea de

carboxilação (Φc) e condutância estomática (gs).

5.12.2- Características da Fluorescência da Clorofila a

As características da fluorescência da clorofila a foram monitoradas à

temperatura ambiente por meio de um fluorímetro de luz modulada MINI-PAM. O

aparelho foi ajustado para traçar uma curva de luz o que possibilitou a obtenção dos

“quenchings”. Para isto, as folhas foram adaptadas ao escuro por 30 minutos com

pinças apropriadas (DLC-8) ao sensor do aparelho. Variáveis da clorofila F /Fv m,

F /F ’, qN, qP e ETR, foram analisadas (Schreiber et al., 1988). v m

5.13- Pigmentos Fotossintéticos

A determinação do conteúdo de pigmentos foi realizada segundo Wellburn, (1994), utilizando DMSO (dimetilsulfóxido) como solvente na proporção de 0,030 g

de folha para 3,0 mL de DMSO. Folha e solvente foram colocados em um tubo de

ensaio que foi completamente vedado com papel alumínio e aquecido a 70º C por 20

29

minutos, em seguida foram feitas leituras no espectrofotômetro nos comprimentos

de onda 480, 649 e 665 nm.

Cálculos:

Para a determinação da clorofila a

(12,19*A665) – (3,45*A649)= μg/ml

Para a determinação da clorofila b

(21,99*A649) – (5,32*A665) = μg/ml

Para a determinação da clorofila total

(clorofila a+ clorofila b)= clorofila T μg/ml

Para a determinação da carotenóides

{(1000*A480) – (2,14*(clorofila a)) – (70,16*(clorofila b))} /220= μg/ml

Para transformar em μg/g de matéria fresca aplicar a fórmula:

(X μg/ml) *(volume do extrato) = Y μg/g de matéria fresca

5.14- Determinação da Massa e Área Foliar Para se obter a massa seca, as folhas frescas foram pesadas e mantidas em

estufa a 70 ºC até ficarem secas, e então novamente pesadas. A área foliar (cm2) foi

medida utilizando o aparelho Licor LI-3100.

30

6- RESULTADOS 6.1- Análise do Perfil de Proteínas Por Eletroforese Unidimensional A eletroforese em SDS-PAGE das proteínas extraídas, conforme método E1 e

descrito nos itens 4.3.1 de plantas controles e tratadas com MeJa, conforme método

T1 (uma aplicação) descrito nos itens 4.2.1 são mostradas nas figuras abaixo.

A C1 T1 C6 T6 C14 T14 M C24 T24 C48 T48 C72 T72 M

kDa 250 160 105 75 50 35 30 25 15 10

Fig. 5- Gel de eletroforese SDS-PAGE 15% de proteínas extraídas pelo método E1

de folhas de plantas controles e tratadas pelo método (T1) após 1, 6, 14, 24, 48, 72

horas (C1, C6, C14, C24, C48, C72 e T1, T6, T14, T24, T48, T72) respectivamente.

(M) marcador de peso molecular. As proteínas foram coradas por azul de

Coomassie. As setas pretas indicam reduções e vermelhas, aumentos dos níveis de

proteínas.

Pode-se observar na figura 5A duas bandas majoritárias (indicadas por setas

largas) com massas estimadas em torno de 50 e 15 kDa. Estas bandas estão

destacadas em todas as figuras dos géis unidimensionais. Nota-se uma redução

nestas bandas em 14 horas após o tratamento (fig. 5A).

kDa 250 160 105 75 50 35 30 25 15 10

B

31

Nos tempos a partir de 24 horas, estas reduções são mais evidentes,

parecendo ocorrer uma redução gradativa com o tempo de tratamento (fig. 5B). Nos

tempos de 24 a 72 horas aparece uma banda com massa estimada em 21 kDa não

vista no controle. Nos tempos de 48 e 72 horas, surge uma outra banda protéica

com massa estimada em 32 kDa. Com o objetivo de avaliar o efeito do metil jasmonato (MeJa) na senescência

das plantas de mamona, um protocolo de tratamento (T2) em que se fazem várias

aplicações de MeJa foi utilizado. No tempo de 24 horas, o gel das proteínas não

mostra nenhuma indução aparente (fig. 6A), somente são vistas as reduções das

bandas de 50 e 15 kDa, a partir de 48 horas de tratamento estas reduções se

repetem (fig. 6B), porém são visíveis as proteínas de 21, 24 e 32 kDa, não

encontradas nos controles e já vistas anteriormente para o tratamento T1.

250

M controle tratadaA

10

Fig. 6- Gel de eletroforese SDS-PAGE 15%, de proteínas extraídas pelo método E1

de folhas de plantas controles e tratadas método (T2) após 24 horas (A) e 48 horas

(B), (M) marcador de peso molecular. As proteínas foram coradas por azul de

Coomassie. As setas pretas indicam principais reduções e vermelhas, aumentos dos

níveis de proteínas.

5160

75

50

35

30

25

15

10

M controle tratadaB250

105160

75

50

35

30

25

15

10

32

O gel de eletroforese das proteínas extraídas das plantas tratadas (T2) no

tempo de 72 e 144 horas são mostrados abaixo. O perfil de proteínas nestes tempos

se mostra semelhantes ao de 48 horas, porém os fenômenos de reduções e

induções se tornam mais acentuados.

M controle tratadaB250

105160

75

50

3530

25

1510

A M controle tratada250

105160

75

50

35

30

25

15

10

Fig.7 - Gel de eletroforese SDS-PAGE 15%, de proteínas extraídas pelo método E1

de folhas de plantas controles e tratadas método (T2) após 72 horas (A) e 144 horas

(B), (M) marcador de peso molecular. As proteínas foram coradas por azul de

Coomassie. As setas pretas indicam principais reduções e vermelhas, aumentos dos

níveis de proteínas.

As bandas protéicas com características similares e que apresentaram

reduções ou induções foram retiradas do gel e hidrolisadas. As proteínas extraídas e

os fragmentos triptícos foram levados ao espectrômetro de massas para serem

seqüenciados, e as seqüências encontradas foram comparadas com outras

seqüências encontradas em bancos de dados. Obteve-se a identificação de duas

proteínas (tabela 3), as que foram destacadas nos géis mostrados anteriormente por

faixas largas que apresentavam massa estimada em torno de 50 e 15 kDa.

33

Tabela 3- Seqüências das proteínas identificadas por espectrometria de massas.

Massa do

peptídeo

Seqüência Proteína pI MM kDa

Espécie

1021,7 DTDILAAFR LSU 6,13 52,07 Kunhardtia radiata 1021,7 DTDILAAFR

1407,9 LTYYTPEYETK 1451,8 SFQGPPHGIQVER 1465,9 TFQGPPHGIQVER 2170,2 GGLDFTKDDENVNSQPFMR 2410,4 LTYYTPEYETKDTDILAAFR 9142,5 SPGYYDGR SSU 8,87 19,94 Glycine

tomentella 9332,6 IIGFDNVR 20,05 2802,3 KGWIPCLEFELEHGFVYR 19,99 Glycine

tabacina Glycine max

6.2- Análise do Perfil de Proteínas Por Eletroforese Bidimensional A eletroforese bidimensional é uma ferramenta de alta resolução para analisar

o perfil de proteínas, por isso foi utilizada para melhor avaliar o efeito do metil

jasmonato, quando aplicado de maneira mais sutil, uma vez que em 1D SDS-PAGE

não revelou grandes alterações nos primeiros tempos de tratamento. Foi utilizado

um método de extração próprio para 2D-PAGE, o qual mostrou ser bastante efetivo

na preparação de amostras para este tipo de análise.

As eletroforeses bidimensionais mostram os perfis protéicos das plantas

controles e tratadas com metil jasmonato (MeJa) conforme método T1 (uma

aplicação) descrito no item 4.2.1 e extraídas conforme método E2 item 4.3.2 em

diferentes tempos. Após revelação das proteínas por prata, os géis foram

digitalizados, editados e analisados conforme item 4.7 e são mostrados nas figuras;

8 (1 hora após tratamento), 9 (6 horas), 10 (14 horas), 11 (24 horas), 12 (48 horas).

34

250 160 105 75 50 35 30 25

15

M (kDa) 3 10

250 160 105 75 50 35 30 25

15

T

C

C

T

T

C

C

Fig. 8: Eletroforese bidimensional dos extratos protéicos de folhas de mamona

controle (C) e tratadas com MeJa (T) após 1 hora. Os quadrantes mostram as

regiões de principais alterações ampliadas para melhor visualização.

35

Tabela 4- Número total de “spots” detectados nos géis nos vários tempos.

Tempo 1 hora 6 horas 14 horas 24 horas 48 horas N° de spots plantas controle 170 123 155 83 144 N° de spots plantas tratadas 168 90 101 87 111

Em todos os géis apresentados nas figuras 15 a 19 as proteínas foram

reveladas por nitrato de prata. Podem-se observar proteínas cujos níveis foram

aumentados ou reduzidos em relação aos controles. A indução de novas proteínas

nas plantas tratadas, não vistas nos controles, também foi observada. Os principais

“spots” protéicos de interesse foram destacados, numerados e tiveram seus ponto

isoelétricos (pI) e massa moleculares (MM) em kDa aparente determinados.

Inicialmente estes valores foram tabelados para cada tempo de experimentação. As

tabelas 5 a 9 apresentam portanto as principais alterações observadas para os

tempos de 1, 6, 14, 24, 48 horas, respectivamente.

Tabela 5- Características dos “spots” protéicos que sofreram alteração após 1 hora

de tratamento com MeJa. A tabela apresenta respectivos valores de pI, MM e a

porcentagem de alteração de volume em relação aos controles.

Spot n0 pI . MM kDa % de redução % de aumento1 6,16 50,33 16,92 2 7,30 35,21 58,04 3 6,74 33,66 68,75 4 6,35 31,23 71,28 5 6,47 31,17 184,76 6 6,18 30,08 60,84 7 6,45 28,28 17,64

36

T

C

C

T

C

T

C

T 250 160 105 75 50 35 30 25 15

10

M (kDa) 3 10

C

250 160 105 75 50 35 30 25 15

10

T




37

Tabela 6- Características dos “spots” protéicos que sofreram alteração após 6 horas

de tratamento com MeJa. A tabela apresenta respectivos valores de pI, MM e a

porcentagem de alteração de volume em relação aos controles. Em destaque estão

os “spots” protéicos não encontrados nos controles.

Spot n0 pI . MM kDa % de redução % de aumento1 6,37 50,75 42,7 2 6,80 31,43 133,34 3 6,65 31,20 281,49 4 6,51 29,83 50,68 5 6,79 28,67 67,60 6 4,71 22,22 - - 7 6,58 14,59 - - 8 4,44 14,38 245,31 9 4,51 13,50 208,95 10 4,97 13,19 22,57

- - 11 4,90 11,75 12 4,50 10,83 26,76

- - 13 5,22 10,25 - - 14 5,10 10,08 - - 15 4,74 9,77

38

T

T

T

T

C

C

C

C

M (kDa) 3 10

160 105 75 50 35 30 25 15 10

C

160 105 75 50 35 30 25 15 10

T




39

Tabela 7- Características dos “spots” protéicos que sofreram alteração após 14

horas de tratamento com MeJa. A tabela apresenta respectivos valores de pI, MM e

a porcentagem de alteração de volume em relação aos controles. Em destaque

estão os “spots” protéicos não encontrados nos controles.

Spot n0 pI . MM kDa % de redução % de aumento1 5,81 49,77 76,25 2 4,16 17,31 - - 3 4,27 17,16 22,02 4 4,10 17,03 167,68 5 4,32 16,56 49,18 6 4,45 16,38 138,32 7 4,56 16,38 282,29 8 4,30 15,99 90,29 9 4,17 14,01 640,42 10 7,31 17,03 25,94

40

T

T

T

T

C

C

C

C

M (kDa) 3 10

250 160 105 75 50 35 30 25 15

10

C

250 160 105 75 50 35 30 25 15

10

T




41



a porcentagem de alteração de volume em relação aos controles.

Spot n0 pI . MM kDa % de redução % de aumento1 6,27 50,68 88,47 2 6,45 30,93 146,31 3 6,03 29,55 47,01 4 6,60 28,00 4,60 5 5,47 22,13 1163,73 6 7,60 14,72 36,38 7 4,97 30,25 689,23

42

M (kDa) 3 10

250 160 105 75 50 35 30 25 15

10

C

T

T

T

C

C

T

C

C

250 160 105 75 50 35 30 25 15

10

T




43



a porcentagem de alteração de volume em relação aos controles.

Spot n0 pI . MM kDa % de redução % de aumento1 5,98 50,64 93,87 2 4,42 45,93 86,88 3 4,57 41,00 58,21 4 8,13 14,17 51,91 5 4,70 31,74 492,43

Tabela 10- “Spots” protéicos com características similares encontrados em tempos

diferentes de tratamento com MeJa.

pI 1 6 14 24 48 Tempo (h) MM kDa 1 1 1 1 1 6,1 ± 0,18 50,43 ± 0,31 9 9 4,34 ± 0,17 13,76 ± 0,26

Nº do Spot

4 2 6,58 ± 0,26 31,33 ± 0,10 6 4 3 6,24 ± 0,08 29,15 ± 0,27 7 5 4 6,61 ± 0,12 28,25 ± 0,24 7 5 4,84 ± 0,14 31,00 ± 0,75 10 6 4 7,81 ± 0,30 15,31 ± 1,15

Duas proteínas mais abundantes com massa estimada em 50,43 e 15,31 kDa

e pI 6,10 e 7,81 (tabela 10), tiveram seus níveis diminuídos gradativamente com o

tempo. A de maior massa sofreu alteração a partir de uma hora após o tratamento e

a e a de menor, a partir de 14 horas. A redução dos níveis destas proteínas em

porcentagem de conteúdo em relação ao controle é mostrada na figura 13.

44

B

14 24 4840

50

60

70

80

Tempo tratamento (h)

% c

onte

údo

SSU

1 6 14 24 480

15

30

45

60

75

90


% c

onte

údo

LSU

A

Fig. 13: Redução da proteína de 50 (A) e 15 kDa (B), em porcentagem de conteúdo

nas plantas tratadas em relação às plantas controles.

6.3- Imunodetecção das Proteínas Separadas por 2D-PAGE As proteínas extraídas (método E2) para eletroforese bidimensional das

plantas controles e tratadas com MeJa pelo método T1, no tempo de 24 horas,

foram avaliadas por imunodetecção (ensaios por “western blotting”). Após reação

com o anti-soro produzido contra cadeia pesada da Rubisco, algumas proteínas

apresentaram reação positiva como pode ser visto na figura 14. Esta análise foi

utilizada com objetivo de identificar os “spots” protéicos correspondente a Rubisco e

seus possíveis produtos de degradação.

45

4 74 7 T C

Fig. 14- Imunodetecção após focalização isoelétrica na faixa de pH 4 a 7 e SDS-

PAGE 12% das proteínas extraídas das plantas controles (C) e tratadas com MeJa

(T), no tempo de 24 horas. A figura mostra a redução e presença de fragmentos da

LSU. A seta preta indica redução e as vermelhas, aumentos dos níveis de proteínas.

Como podemos observar na figura 14C na planta controle, uma mancha se

arrasta por toda a faixa de pI do gel. Este comportamento é devido à quantidade de

proteína aplicada, uma vez que a Rubisco é majoritária. Esta quantidade excessiva

foi utilizada para que pudessem visualizar proteínas minoritárias. Na figura 14T

podemos observar que ocorreu redução da cadeia pesada da proteína Rubisco com

o surgimento de diversos fragmentos deste polipeptídeo.

6.4- Atividade Fotossintética Comparando algumas variáveis da atividade fotossintética das plantas

controles e tratadas com MeJa pelo método T2, podem-se notar diferenças

proporcionadas pelo tratamento que são mostradas nos tabela 11 e 12.

46

Tabela 11- Taxa fotossintética (AN) e concentração interna de CO2 (Ci) de plantas

controles e tratadas com MeJa, após 144 horas. Cada valor corresponde a média de

8 repetições.

AN (μmol m-2 s-1 Ci (Pa) )

Controle 144 h 6,47 ± 0,88 297,77 ± 18,84

Tratada 144 h 2,04 ± 1,39 310,40 ± 25,28

Tabela 12- Eficiência instantânea de carboxilação (Φc = AN/Ci) e condutância

estomática (gs) de plantas controles e tratadas com MeJa após 144 horas. Cada

valor corresponde a média de 8 repetições. Φc (mol m-2 s-1 Pa-1) gs (mol m-2 s-1)

Controle 144 h 0,0217 ± 0,0019 0,241 ± 0,088

Tratada 144 h 0,0070 ± 0,0049 0,062 ± 0,018

Nas condições em que o experimento foi realizado, o tratamento com MeJa

demonstrou agir sobre o sistema fotossintético, promovendo uma redução na taxa

fotossintética em aproximadamente 68%, quando comparado com as plantas

controles; para Ci, não observamos mudanças significativas (tab. 11).

Uma redução também evidente ocorreu para os valores de eficiência

instantânea de carboxilação (68%) e condutância estomática (74%) para as plantas

tratadas (tab. 12). 6.5- Desenvolvimento da Planta Através de valores de matéria seca e área das folhas foi possível avaliar o

crescimento das plantas controles e submetidas ao tratamento com MeJa pelo

método T2. Uma quantidade de plantas foi retirada da casa de vegetação, levada

até ao laboratório e, um terço das plantas foram analisadas imediatamente (tempo

inicial). Do restante das plantas, metade foi tratada como descrito anteriormente, e a

47

outra parte foi mantida nas mesmas condições, porém sem tratamento com MeJa,

Ambas as plantas, controles e tratadas, foram analisadas no tempo de 144 horas.

Como pode ser visto na tabela 13, as plantas controles se desenvolveram

normalmente e as plantas tratadas tiveram o crescimento inibido. Enquanto para as

plantas controles, a massa e a área foram aumentadas em 106 e 246% em relação

ao tempo zero, os mesmos parâmetros das plantas tratadas aumentaram apenas 18

e 65%.

Tabela 13- Efeito do MeJa no crescimento da planta. Cada valor corresponde à

média de 10 plantas.

Massa seca (mg) Área (cm2)

Tempo inicial 251,39 ± 29,93 6,90 ± 0,52

Controle 144 horas 519,00 ± 77,97 23,90 ± 4,23

Tratada 144 horas 296,68 ± 51,74 11,39 ± 2,16

6.6- Características da Fluorescência da Clorofila a

O tratamento com MeJa resultou em mudanças nas características dos sinais

de fluorescência, os quais foram quantificados nas folhas. Algumas variáveis foram

analisadas e mostradas abaixo.

Tabela 14- Rendimento quântico máximo (F /Fv m) de plantas controle e tratadas com

MeJa pelo método T2 nos diversos tempos. Cada valor corresponde a média de 5

repetições.

48 h 72 h 96 h 144 h

Controle 0,850 ± 0,004 0,842 ± 0,006 0,842 ± 0,003 0,846 ± 0,004

Tratada 0,828 ± 0,006 0,833 ± 0,007 0,830 ± 0,005 0,836 ± 0,009

O rendimento quântico máximo (Fv/Fm), não apresentou nenhuma alteração

significativa, porém observa-se um decréscimo na atividade fotoquímica para

48

rendimento quântico efetivo, isto é, sob luz (fig 15). A redução parece evoluir com o

tempo de tratamento nos níveis de luz de 350 e 1150 μmol m-2 s-1, nas plantas

tratadas.

0 48 72 96 1440.00

0.07

0.14

0.21

0.28

0.35C 350 T 350 C 1150 T 1150


F v/F

m'

Fig. 15: Rendimento Quântico Máximo Efetivo (F /Fv m’) em função de níveis


MeJa pelo método T2. As barras indicam desvio padrão da média de 5 repetições.

A figura 16 demonstra decréscimo na taxa de transporte de elétrons nas

plantas tratadas quando comparadas aos controles. Para o nível mais intenso de luz

(1150 μmol m-2 s-1) os valores foram menores em todos os tempos. Para 350 μmol

m-2 s-1, esta redução é vista somente a partir de 72 horas e se mantém assim até o

final do tratamento.

49

0 48 72 96 1440

10

20

30

40

50

60

70C 350 T350 C1150 T 1150


ETR

Fig. 16: Taxa de transporte de elétrons (ETR) em função de níveis diferentes de luz

(350 e 1150 μmol m-2 s-1) de plantas controles e submetidas ao MeJa pelo método

T2. As barras indicam desvio padrão da média de 5 repetições.

Para a variável qP, os valores foram comparativamente menores para as

plantas tratadas. Para o nível de luz de 350 μmol m-2 s-1, no tempo de 48 horas os

valores não apresentam diferença significativa. A partir do tempo de 72 horas os

valores permanecem estáveis, porém sempre menores que os encontrados nos

controles. Para o nível de luz 1150 μmol m-2 s-1, observa-se decréscimo em relação

aos controles já a partir do tempo de 48 horas, se acentuando em 72 horas e

permanecendo constante até 144 horas (fig 17).

50

0 48 72 96 1440.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5C 350 T 350 C 1150 T 1150


qP

Fig. 17: Coeficiente de extinção fotoquímico (qP) em função de níveis diferentes de

luz (350 e 1150 μmol m-2 s-1) de plantas controles e submetidas ao MeJa pelo

método T2. As barras indicam desvio padrão da média de 5 repetições.

Como esperado, os valores para o coeficiente de extinção não fotoquímico se

mostram maiores para nível de luz mais alto; 1150 μmol m-2 s-1, os quais também se

apresentam menores para as plantas tratadas quando comparados aos controles

sob o mesmo valor de intensidade luz. Estes decréscimos ocorrem a partir de 48

horas, e são sucessivos até o final do tratamento (fig. 18). Para o valor menor de luz

350 μmol m-2 s-1, a planta ainda consegue extinguir o excesso de luz recebida até o

tempo de 72 horas, porém a partir de 96 horas os valores de qN são menores para

as plantas tratadas até o tempo final de 144 horas.

51

0 48 72 96 1440.35

0.40

0.45

0.50

0.55

0.60

0.65C 350 T 350 C 1150 T 1150


qN Fig. 18: Coeficiente de extinção não fotoquímico (qN) em função de níveis diferentes

de luz (350 e 1150 μmol m-2 s-1) de plantas controles e submetidas ao MeJa pelo

método T2. As barras indicam desvio padrão da média de 5 repetições.

6.7- Pigmentos Fotossintéticos A observação inicial dos efeitos do MeJa nas plantas tratadas pelo método

T2, foi a presença de numerosas manchas de lesões de necroses e amarelecimento

das folhas (fig. 19). Estes sintomas não foram observados nas plantas tratadas pelo

método T1, por este motivo T2 foi o método mais investigado para avaliação da ação

do MeJa, sobre o sistema fotossintético. Neste caso o conteúdo de pigmentos

fotossintéticos (clorofila total e carotenóides), das plantas tratadas e sem tratamento

foi avaliado.

As plantas submetidas ao MeJa pelo método T2 sofreu redução em seus

conteúdos de clorofila total e carotenóides, os quais podem ser vistos na tabela 15.

52

A B

Fig. 19: Mudanças morfológicas ocorridas nas plantas tratadas com metil jasmonato

(A), comparadas com as plantas não tratadas (B) no tempo de 144 horas.

Tabela 15- Influência do metil jasmonato sobre o conteúdo de clorofila total e

carotenóides nos diversos tempos de tratamento. Cada valor corresponde a média

de 3 repetições.

Clorofila total (μg/g de

matéria fresca)

Carotenóides (μg/g de

matéria fresca)

Controle 2208,90 ± 209,92 63749,8 ± 4478,3

Tratada 48 h 1530,30 ± 96,11 55986,3 ± 2359,5

Controle 1919,54 ± 33,67 57814,7 ± 1054,7

Tratada 72 h 1182,50 ± 122,56 47038,1 ± 3047,3

Controle 1894,62 ± 66,44 60495,1 ± 3266,2

Tratada 96 h 1182,56 ± 49,00 47929,3 ± 2240,0

Controle 1919,36 ± 53,36 59277,5 ± 1233,2

Tratada 144 h 1094,60 ± 193,53 41082,3 ± 7184,0

A tabela 15 mostra os valores encontrados, e pode-se observar que para as

plantas tratadas, os valores são comparativamente menores a partir de 48 horas.

Este decréscimo no conteúdo de pigmentos é mais notável para clorofila total, que

apresenta valor 43% menor que para as plantas controles no tempo máximo de

53

tratamento, para o caso dos conteúdos de carotenóides no mesmo tempo a redução

foi de 30% em relação às plantas não tratadas (fig. 20).

54

48 72 96 14450

55

60

65

70

75


% C

loro

fila

tota

l

48 72 96 14460

70

80

90

100

Tempo tratamento (h)%

Car

oten

óide

s

Fig. 20: Os gráficos mostram a queda no conteúdo de clorofila total e carotenóides

em relação aos respectivos controles, nos diversos tempos de tratamento.

7- DISCUSSÃO

Neste trabalho, a aplicação exógena de metil jasmonato foi utilizada para

estudar alterações no perfil de proteínas nas folhas de plantas de mamona, uma vez

que o efeito dos jasmonatos tem sido bem caracterizado em outras plantas (Rossato

et al., 2002; Reinbothe et al., 1994; Farmer e Ryan, 1990; Weidhase et al., 1987).

Neste trabalho, pela análise do perfil de proteínas observamos algumas

mudanças marcantes, sendo que algumas proteínas tiveram seus níveis reduzidos,

enquanto que outras, aumentados em conseqüência do tratamento. Através dos

géis de eletroforese unidimensional, observamos a redução de uma proteína de 50

kDa a partir de 14 até 72 horas após tratamento com uma aplicação de metil

jasmonato. Reduções também foram vistas quando foi utilizado o tratamento mais

severo, com várias aplicações de MeJa, como descrito em materiais e métodos. Esta

proteína após ter sua seqüência analisada foi identificada como sendo a cadeia

pesada da Rubisco.

A Rubisco é a maior fonte de nitrogênio para mobilização e preenchimento de

proteínas de reserva da semente (Matile, 1992). A Rubisco é a principal proteína de

reserva, e, durante formação normal da folha representa 50% do total de conteúdo

de proteínas. Ela é sintetizada até a completa expansão da mesma, etapa em que

alcança a concentração máxima. Após esse período, a Rubisco é lentamente

degradada, e seus aminoácidos são exportados para outras partes da planta que

estão em formação. Sob condições de estresse, a concentração da Rubisco diminui

mais rapidamente do que em folhas de plantas que não estão estressadas (Enyedy

et al., 1992). O consumo desta proteína em folhas de mamona após o tratamento

com metil jasmonato, já foi observado nos tempos de 24 e 48 horas por Cavalcante

e colaboradores (1999), e uma proteína com massa de 15 kDa foi registrada com

sendo um possível fragmento da Rubisco. O decréscimo na atividade e na

quantidade da Rubisco já foi observado em muitas condições de estresse. O

decréscimo na quantidade e fragmentação da Rubisco foram observados em folhas

de arroz após tratamento com excesso de cobre (Hajduch et al., 2001). Um drástico

decréscimo da concentração de Rubisco foi observado por SDS-PAGE e

imunodetecção, em tecidos de plântulas de arroz após tratamento com ácido

jasmônico, as quais também apresentaram lesões de necrose (Rakwal & Komatsu,

2001), como foi observado também em folhas de mamona neste trabalho (figura 27).

55

Cicloheximida, um seqüestrador de radicais livres, 1,10-fenantrolina um metal

quelador e inibidores de proteinases e do fotossistema II inverteram

significantemente a ação do JA no decréscimo da Rubisco, e na indução de

polipeptídeos. Os autores deste trabalho sugerem que o principal agente causador

do decréscimo da Rubisco, após tratamento, é um aumento na atividade de certas

proteinases, provavelmente do tipo serínicas. Especula-se também que a atuação

do JA em plantas de arroz deve ser mediada pela inativação do aparelho

fotossintético, causada por sua habilidade em potencializar a geração de ROS no

cloroplasto, resultando em anormalidades no fluxo de transporte de elétrons e

promovendo necroses (Rakwal & Komatsu, 2001). A geração de ROS foi vista em

plantas de mamona, após tratamento com MeJa. O tratamento promoveu tanto uma

transiente redução nos níveis da enzima 2-Cis peroxiredoxina, como uma transiente

redução nos níveis de atividade da guaiacol peroxidase, enzima envolvida na

remoção de H O (Soares et al., 2004). 2 2

Folhas de cevada apresentaram considerável redução nas subunidades

pesada e leve Rubisco, após cinco dias de tratamento com excesso de cobre e na

subunidade pesada após o mesmo período de tratamento com excesso de

manganês. Ambos os tratamentos provocaram também redução nos níveis de RBP

(Proteínas Ligadoras de Rubisco) e RA (Rubisco Ativase) (Demirevska-Kepova et

al., 2004). O estresse foto-oxidativo mediado por dithiothreitol (DTT) em folhas de

ervilha promoveu uma rápida degradação da Rubisco. Dados deste trabalho também

sugerem que espécies reativas de oxigênio podem ser consideradas componentes

importantes do sistema proteolítico nos cloroplastos que são responsáveis pelo

consumo da Rubisco sob situações de estresses ou senescência de folhas (Roulin &

Feller, 1998).

Quando plantas de Brassica napus foram tratadas com metil jasmonato,

desde o inicio de seu desenvolvimento, observou-se a redução de ambas as

subunidades da Rubisco, LSU e SSU, três dias após o tratamento. Observou-se o

máximo de redução 10 dias após o tratamento sendo que os níveis parecem retornar

ao níveis dos controles 17 dias depois da aplicação. Em nosso trabalho observamos

a redução mais efetiva da LSU a partir de 24 horas para ambos os tipos de

tratamento e se tornou mais intensa com o tempo de tratamento até 144 horas. Para

a cadeia pequena da Rubisco (SSU) as alterações foram mais notáveis no tempo de

56

48 horas e foi gradativa com o tempo até 144 horas, Hilditch e colaboradores, (1989)

fazem referência a produtos da degradação da SSU com massas de 2-3 kDa.

A atuação do metil jasmonato sobre a expressão de genes, pode levar a

acumulação não só de JPIs mas também de proteínas de reserva vegetativa (VSPs).

Estas proteínas induzidas tem a função de proteger e defender as plantas sob

determinadas condições de estresse. Proteínas de reserva induzidas por

jasmonatos, são glicoproteínas que se acumulam naturalmente durante períodos de

florescimento, senescência e dessecação (Sembdner & Parthier, 1993). Rossato e

colaboradores (2001) observaram acumulo de uma proteína glicoproteína de 23 kDa

durante o ciclo de florescimento em Brassica napus. O mesmo grupo em 2002

mostrou que outra proteína de Brassica napus imunologicamente relacionada à

anterior, sofreu acumulo 24 horas após o tratamento com metil jasmonato. Estas

proteínas aparecem nas folhas com 24 kDa e na raiz principal com massa 23 kDa, e

não foram vistas nos controles.

Nas folhas de mamona uma proteína com características semelhantes

(massa de 24 kDa) foi observada após várias aplicações, no tempo de 48 horas

(figura 6A). Este aumento persistiu mostrou aumento até o final do tratamento (figura

7B). Este fenômeno não foi visto para plantas tratadas utilizando a outra

metodologia, método T1.

Dados vistos em nossos resultados como, a degradação das subunidades da

Rubisco, redução dos níveis de pigmentos fotossintéticos (tabela 15), lesões de

necroses vistas nas folhas (figura 19), são alguns dos sinais que denotam sintomas

de senescência em folhas de mamona em função do tratamento mais “severo” com

metil jasmonato. A observação destes fenômenos, e a síntese da proteína de 24 kDa

corroboram com os fenômenos ocorridos em Brassica napus vistos por Rossato e

colaboradores (2002), e nos leva a crer que a proteína induzida de 24 kDa

encontrada na mamona possa ser a mesma VSP relatada acima.

Uma outra alteração no perfil de proteínas das plantas tratadas quando

comparado com o controle foi a indução de uma proteína com massa estimada em

32 kDa acumulada para ambos os tratamentos. Esta proteína não vista nos

controles é induzida no tempo de 48 horas e aumenta relativamente com o tempo de

tratamento até 144 horas (figuras 5B, 6 e 7). Uma indução vista nas plantas tratadas,

quando as proteínas foram extraídas método E1,com massa de aproximadamente

21 kDa mostrou acúmulo a partir do tempo de 24 horas (figura 5B) para plantas

57

tratadas pelo método T1 e a partir de 48 horas (figura 6B) para o método T2, e se

mantém até o final do tratamento (figura 7).

A eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida foi utilizada como uma

ferramenta analítica para estudar as mudanças no proteoma das plantas. 2-DE

revelou alterações consideráveis no perfil protéico das folhas tratadas com MeJa em

relação as plantas não tratadas, processo em que as plantas foram tratadas com

uma aplicação somente. A observação inicial mostrou uma mancha que sofre uma

redução gradativa (com o tempo de tratamento de 1 hora até 48 horas). Esta

redução se iniciou em cerca de 16% (1 hora) e chegou a 94% em relação ao

controle no tempo máximo de tratamento. Esta região do mapa protéico mostrou

características similares de massa molecular e pI (50 kDa e 6,1) à proteínas vistas

no mapa protéico de outras plantas, e foi imunologicamente detectada com anticorpo

contra LSU, ensaio que mostrou claramente a redução do “spot” e o aparecimento e

de componentes correspondentes a subprodutos da proteínas degradada devido ao

tratamento (figura 14). Estes eventos se mostraram similares aos ocorrido em uvas

quando realizados os mesmos ensaios, porém provocados por outro tipo de

estresse, luz (Carvalho et al., 2005). Neste trabalho Carvalho e colaboradores

identificaram a proteína SSU, correspondente a uma encontrada em nosso trabalho

após a separação por 2-DE com massa de 15,3 kDa e pI 7,8 (figuras 10-12, tabela

10). Nós observamos uma redução dessa proteína aproximadamente 26-58% nos

tempos de 14-48 horas de tratamento.

Rakwal e Komatsu (2000), utilizaram análises proteômicas para estudar

mudanças bioquímicas resultantes do MeJa em arroz, assim como visto em folhas

de mamona, o mapeamento protéico de tecidos da planta de arroz mostrou que as

subunidades da Rubisco são drasticamente reduzidas, e ensaios de imunodetecção

confirmaram tais resultados.

O mapeamento das proteínas de folhas de mamona utilizando, a alta

resolução da eletroforese bidimensional mostrou, não só supressão da síntese de

proteínas mais também induções abundantes nos vários tempos de tratamento

(figuras 15-19). Estas observações são consistentes com os dois principais efeitos

do MeJa já reportados, que são a expressão de genes para indução de novas

proteínas e supressão das existentes, antes do estresse (Reinbothe et al., 1994).

Entre as proteínas induzidas podemos destacar um grupo de “spots” protéicos não

encontrados nos controles que aparecem no perfil das plantas tratadas, nos tempos

58

de 6 horas “spots” 6, 7, 11, 13, 14 e 15 (tabela 6) e outro no tempo de 14 horas

“spot” 2 (tabela 7). Os “spots” que apresentam massa entre 9,7 e 22,2 kDa podem

estar relacionados a inibidores de proteinases do tipo Kunitz que possuem massa

entre 18-22 kDa, ou do tipo Bowman-Birk (com massa entre 8-10 kDa), classes

estas descritas por Haq & Khan, (2003). O “spot” 2 (tempo de 14 horas), apresenta

massa molecular de 17,3 kDa e pI 4,16, estas características são semelhantes a

uma proteína ácida PR (JIP 9) com massa molecular de 17 kDa encontrada através

de análises proteômicas em folhas de arroz após tratamento com MeJa (Rakwal &

Komatsu, 2000). O MeJa mostrou fazer parte do mecanismo de defesa de arroz

quando o mapeamento proteômico de plantas tratadas com 500 µM de MeJa

revelaram muitas proteínas que após seqüenciadas mostraram homologia a

proteínas relacionadas a patogênese (proteína tipo taumatina, PR5; um precursor de

beta-1,3-glucanase; PR intracelular, e uma proteína antifúngica) e outras

relacionadas a proteção celular (glutathiona transferase, e ascorbato peroxidase)

(Rakwal et al., 1999). As proteínas que tiveram seus níveis aumentados

comparativamente aos controles estavam distribuídas no vários tempos até 48

horas.

Por meio dos resultados obtidos nas eletroforeses bidimensionais podemos

notar que as principais induções ocorrem nos tempos intermediários, 6 e 14 horas,

as plantas pareceram diminuir a síntese de proteínas para os tempos mais longos de

tratamento, o que pode ser bem visualizado no tempo de 48 horas. As proteínas

com massa entre 30 e 40 kDa que se mostraram aumentadas após tratamento,

podem estar entre os fragmentos da LSU, destacando os “spots” protéicos 5 e 7 do

tempo de 24 horas e o “spot” número 5 no tempo de 48 horas, que pareceram

corresponder aos “spots” detectados após imunodetecção contra LSU e que

mostraram aumentos após tratamento (figura 14).

Os jasmonatos foram descritos inicialmente como uma substância que inibe o

crescimento da planta, e quando aplicado exogenamente nas plantas promove

senescência (Parthier, 1991). A ação inibitória no desenvolvimento da planta foi

notória em plantas de mamona após tratamento com metil jasmonato, afirmação

esta que pode ser evidenciada através dos dados de massa seca e área, mostrados

na tabela 13. Este evento de inibição puderam ser correlacionados a alguns

parâmetros da fotossíntese analisados e que mostraram alteração, entre eles

eficiência instantânea de carboxilação (Φc), condutância estomática (gs),

59

concentração interna de CO2 (Ci). Enquanto Φc e gs diminuíram, Ci aumentou

devido a redução de gs, a taxa fotossintética (AN) diminuiu substancialmente 68%

(tabelas 11 e 12). Este último resultado se mostrou semelhante ao encontrado em

Brassica napus após tratamento com metil jasmonato, que após 8 dias de

tratamento, folhas e raízes mostram redução no crescimento de 69 e 63%

respectivamente e a taxa fotossintética caiu aproximadamente 70%. A diminuição

na taxa fotossintética em folhas e tecidos verdes é um sintoma claro de declínio

fisiológico (senescência). Trocas de gases calculadas (fixação de carbono e emissão

de O2) mostram que a capacidade fotossintética diminui em paralelo com a

diminuição de outros índices como, clorofila e conteúdo de proteínas. Este declínio

na capacidade fotossintética envolve entre outros, componentes o fotossistema II, o

complexo citocromo b6f e reações de fixação de carbono catalisada pela Rubisco

(Buchanan et al., 2000).

A fotossíntese é afetada por muitas condições ambientais e o declínio na

atividade fotossintética tem sido relacionada a muitos tipos de estresses, tratamento

com alumínio, onde vários cultivares de café mostraram reduções dos valores de Φc,

gs, AN e aumento de Ci (Konrad et al, 2005). Resultados semelhantes foram vistos

em Vigna unguiculata após excesso de luz (Andersson et al., 1992), estresse hídrico

(Souza et al., 2003b). A redução da assimilação fotossintética de CO2 pode ser

atribuída ao decréscimo na eficiência do fotossistema II (Fv/Fm), à redução na

eficiência de carboxilação, ou à redução na quantidade da Rubisco (He & Lee,

2001). Nos experimentos com mamona, relacionada com a redução da atividade

fotossintética foi notável também a diminuição no conteúdo de pigmentos (tabela 15

e figura 20), bem como o amarelecimento das folhas e o aparecimento de manchas

de necrose (figura 19), com conseqüente inibição do crescimento da planta (tabela

13). Estes resultados são consistentes com os já relatados para Brassica napus

(Rossato et al., 2002), arroz (Rakwal & Komatsu, 2001) e cevada (Wierstra &

Kloppstech, 2000) após tratamento com MeJa, e juntamente com a redução da

síntese de proteínas entre outras a proteína fixadora de carbono a Rubisco, pôde-se

notar claramente um dos efeitos da aplicação exógena do MeJa em mamona, típica

senescência.

Plantas submetidas a algum tipo de estresse biótico ou abiótico com

alterações no estado funcional dos tilacóides dos cloroplastos provocam mudanças

nas características dos sinais de fluorescência (Baker & Rosenqvst, 2004). Os

60

sintomas de estresse induzidos por MeJa em folhas de mamona foram avaliados

pelas das variáveis da clorofila a. O valor da taxa F /Fv m para plantas tratadas

mostrou estar dentro da faixa apresentadas por plantas “saudáveis” (0,75 - 0,85)

como visto nos controles, demonstrando alguma tolerância do aparelho

fotossintético, porém o rendimento quântico efetivo (F /Fv m’) decresceu com o

excesso relativo de radiação e tempo de tratamento. A razão F /Fv m’ indica qual a

proporção de luz que foi absorvida pela clorofila associada ao PSII utilizada na

atividade fotoquímica, como tal, informa a quantidade de elétrons transportados

sendo um indicativo da fotossíntese (Baker & Rosenqvst, 2004). Desta forma a

queda da eficiência está diretamente associada à queda da taxa fotossintética e

eficiência instantânea de carboxilação, o que afeta o consumo de ATP e NADPH.

O rendimento quântico efetivo do PSII pode ser usado para estimar a taxa de

transporte de elétrons no tecido fotossintetizante. Em plantas de mamona tratadas o

MeJa provocou alteração no transporte de elétrons, fato este evidenciado pela

redução da taxa de transporte de elétrons (ETR) visto na figura 16, principalmente

para o nível de maior radiação que se mostrou sempre menor comparativamente

aos controle. Os dados encontrados para ETR denotam danos dos carreadores de

elétrons do aparelho fotossintético e fotoinibição, o que representa queda no fluxo de

elétrons para fixação de CO refletida nas reduções nos dados de trocas gasosas. 2

Os dados das variáveis da fluorescência da clorofila a revelaram o nível de

excitação de energia dos pigmentos e são dependentes do balanço entre o fluxo de

fótons fotossintéticos (FFF) e a soma da taxa de transporte de elétrons (ETR)

fotossintético e da dissipação térmica, o que pôde ser estimado pelos “quenchings”,

extinção fotoquímica (qP), causada pela utilização da energia para redução do

NADP+ e não-fotoquímica (qN) que representa outras formas de dissipação, como

calor. O aumento do FFF promove declínio no qP e aumento no qN. O decréscimo

do qP revelou o estado reduzido do primeiro aceptor de elétrons estável do PSII, a

QA, fornecendo uma estimativa da capacidade do PSII em utilizar a energia

luminosa para redução do NADP+, fundamental para à assimilação de CO2. Por sua

vez, o qN indicou a eficiência da dissipação de calor, em razão do aumento no

gradiente de prótons entre o lúmen e o estroma do cloroplasto (Maxwell & Johnson,

2000; Genty et al., 1989).

Alguns danos no aparelho fotossintético só são visíveis quando aplicado

análise dos “quenchings”. Para plantas de mamona submetidas ao estresse por

61

metil jasmonato foi verificado variações quando comparadas aos controles, para os

diferentes fluxos de fótons qP (figura 17) se mostrou superior para as plantas

controles e a diferença pareceu ser proporcional ao tempo de tratamento. As

reduções de qP para plantas estressadas indica ineficiência do PSII na utilização da

energia captada para redução de NADP+ necessário para assimilação de CO2,

indicando algum dano nas proteínas do complexo fotossintético. Variáveis de

fluorescência em Arabidopsis thaliana mostraram ser alteradas após tratamento com

metil jasmonato, tratamento este utilizando método de várias aplicações semelhante

ao utilizado em nosso estudo. A planta Arabidopsis thaliana evidenciou sintomas de

senescência, após 7 dias notando-se redução do teor de clorofila e do rendimento

quântico máximo. O fluxo de elétrons também decresceu em paralelo com o

aumento de qN (Jung, 2004). Em nosso estudo plantas de mamonas mostraram por

meio de mais um parâmetro que MeJa causa danos no aparelho fotossintético,

afirmação esta evidenciada pelos resultados de qN (figura 18), que mostraram a

ineficiência do aparelho na extinção do excesso de energia captada, valores

menores de qN foram provavelmente porque o aparelho estava muito danificado.

62

8-CONCLUSÃO

• De acordo com resultados encontrados podemos concluir que a molécula de

metil jasmonato deve fazer parte da sinalização em Ricinus communis, ao

induzir proteínas não encontradas nas plantas não tratadas.

• As reduções dos níveis das subunidades da Rubisco, mostra ser um dos

primeiros eventos de resposta da planta à ação do metil jasmonato.

• O metil jasmonato altera drasticamente a fotossíntese, o que pode ser

evidenciado pelos parâmetros de atividade fotossintética.

• A análise das variáveis da fluorescência da clorofila a foi uma ferramenta

importante para diagnosticar estresse em resposta ao metil jasmonato, uma

vez que as mesmas mostraram alterações bastante contundentes.

• A senescência associada ao metil jasmonato já descrita em outras plantas

pôde ser evidenciada em Ricinus communis, pela inibição no crescimento das

plantas, redução nos conteúdos de pigmentos, redução da fotossíntese,

redução da síntese de proteínas, entra elas as subunidades da Rubisco.

63

9-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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