Francisco Diogo Carvalho Guerra Liberal

Avaliao e Caraterizao por

Mtodos Computacionais de

Diferentes Radioistopos no

Contexto da Terapia Paliativa de

Metstases sseas

Julho 2013

Avaliao e Caracterizao por Mtodos

Computacionais de Diferentes Radioistopos no

Contexto da Terapia Paliativa de Metstases

Monografia do Curso de Mestrado em Engenharia Biomdica da

Universidade do Porto

Francisco Diogo Carvalho Guerra Liberal

Licenciado em Engenharia Biomdica pela Universidade

de Trs-os-Montes e Alto Douro (2013)

Orientador:

Joo Manuel R. S. Tavares

Professor Associado do Departamento de Engenharia

Mecnica da Faculdade de Engenharia da

Universidade do Porto

Coorientador:

Adriana Alexandre S. Tavares

Investigadora da Molecular Neurolmaging (MNI), LLC New

Haven, Connecticut, USA

Agradecimentos

Ao Professor Joo Manuel R. S. Tavares pela orientao e disponibilidade fornecidos ao

longo deste trabalho, fundamentais para a correta elaborao do mesmo.

A Dr.. Adriana Alexandre S. Tavares pelo apoio prestado a este trabalho, bem como,

pelo auxlio e ajuda fornecida para a realizao do mesmo.

E a todos aqueles de que forma direta e indireta contriburam de forma positiva para o

desenvolvimento deste trabalho.

Sumrio

O objectivo principal do presente trabalho (Avaliao e Caraterizao por Mtodos

Computacionais de Diferentes Radioistopos no Contexto da Terapia Paliativa de

Metstases sseas) determinar o eventual impacto de alguns radiofrmacos

utilizados atualmente em terapias paliativas ou em testes clnicos, atravs do recurso a

mtodos computacionais de forma a realizar uma anlise comparativa entre os

diferentes radioistopos disponveis.

Sabe-se que um agente ideal para radioterapia tumoral dirigida deve apresentar, entre

outras caractersticas, semi-vida fsica entre 30 minutos e 10 dias, nucldeos filhos

estveis (semi-vida superior a 60 dias) e qumica adequada a captao pelo tecido

sseo.

A radioterapia interna com utilizao de radioistopos tem sido amplamente utilizada

para terapia paliativa das metstases sseas, encontrando-se mltiplos radioistopos

em utilizao como, Samrio-153, o Estrncio-89, o Rnio-186 e 188, o Fsforo-32, o

Tectnio-99m, o Hlmio-166, o Estanho-117m, o Lutcio-177, o Samrio-153 e o

Rdio-223.

Para a realizao da Dissertao final de Mestrado necessrio proceder a uma

recolha e pesquisa bibliogrfica de estudos cientficos desenvolvidos nesta rea de

interesse, bem como, da informao sobre algumas tcnicas a utilizar para a execuo

prtica do trabalho envolvido, dais quais se destaca os simuladores radiobiolgicos

desenvolvidos pelo Prof. Robert Stewart da Universidade de Washington, sendo eles,

Monte Carlo Damage Simulaton (MCDS), Monte Carlo Excision Repair (MCER) e o

Virtual Cell (VC), que em conjunto realizam uma simulao detalhada dos efeitos

biolgicos da radiao a nvel celular e molecular.

Uma vez finalizada essa pesquisa, realiza-se a definio do projeto a desenvolver,

nomeadamente pela abordagem ao protocolo a utilizar, os dados mais importantes

para a realizao das simulaes. Serve o presente documento como planificao dos

Trabalhos Prticos a realizar no mbito desta Dissertao

ndice

1.1. INTRODUO ......................................................................................................................... 14

1.2. PRINCIPAIS OBJETIVOS ........................................................................................................... 15

1.3. ESTRUTURA ORGANIZATIVA .................................................................................................. 16

1.4. CONTRIBUIES PRINCIPAIS .................................................................................................. 17

2.1. INTRODUO ......................................................................................................................... 21

2.2. PRINCPIOS DO CICLO CELULAR .............................................................................................. 22

2.3. CINTICA CELULAR ................................................................................................................. 24

2.4. APOPTOSE E NECROSE ........................................................................................................... 26

2.5. SUMRIO ............................................................................................................................... 28

3.1 INTRODUO ............................................................................................................................. 32

3.2 EFEITOS CELULARES DA RADIAO ............................................................................................. 33

3.3 EFEITOS DIRETOS E INDIRETOS DA RADIAO ............................................................................ 34

3.4 TIPO DE DANOS E DESTINO DAS CLULAS RADIOINDUZIDOS ...................................................... 36

3.4.1. MTODO DE CLASSIFICAO DAS LESES AO ADN .................................................................................. 37

3.5 MECANISMOS DE REPARAO DO ADN ..................................................................................... 38

3.6 CURVAS DE SOBREVIDA .............................................................................................................. 41

3.7 SUMRIO .................................................................................................................................... 43

4.1 INTRODUO ............................................................................................................................. 47

4.2 PRINCIPAIS CARACTERSTICAS DOS RADIOISTOPOS ................................................................. 48

4.2.1 FSFORO-32 ................................................................................................................................... 49

4.2.2 ESTRNCIO-89 ................................................................................................................................. 49

4.2.3 TRIO-90 ......................................................................................................................................... 50

4.2.4 ESTANHO-117M ............................................................................................................................... 50

4.2.5 SAMRIO-153 ................................................................................................................................. 51

4.2.6 HLMIO-166 ................................................................................................................................... 52

4.2.7 TLIO-170 ...................................................................................................................................... 52

4.2.8 LUTCIO-177 ................................................................................................................................... 53

4.2.9 RNIO-186 ...................................................................................................................................... 53

4.2.10 RNIO-188 ............................................................................................................................ 54

4.2.11 RDIO-223 ............................................................................................................................ 54

4.3 SUMRIO .................................................................................................................................... 55

5.1 INTRODUO ............................................................................................................................. 59

5.2 SIMULADORES ............................................................................................................................ 59

5.3 VANTAGENS E DESVANTAGENS .................................................................................................. 61

5.4 MONTE CARLO DAMAGE SIMULATION MCDS .......................................................................... 62

5.4.1 INFORMAO DE ENTRADA E SADA ...................................................................................................... 66

5.5 MONTE CARLO EXCISION REPAIR MCER ................................................................................... 68

5.5.1 INFORMAO DE ENTRADA E SADA ...................................................................................................... 72

5.6 VIRTUAL CELL - VC....................................................................................................................... 73

5.6.1 INFORMAO DE ENTRADA E SADA ...................................................................................................... 75

5.7 SUMRIO .................................................................................................................................... 79

6.1 INTRODUO ............................................................................................................................. 84

6.2 PROCEDIMENTOS ....................................................................................................................... 84

6.3 SUMRIO .................................................................................................................................... 93

7.1 CONCLUSES FINAIS ................................................................................................................... 97

7.2 PERSPETIVAS FUTURAS ............................................................................................................... 98

Captulo 1

Introduo ao Trabalho e Estrutura

da Monografia

1.1. Introduo

As metstases sseas so uma das mais importantes complicaes associada ao

desenvolvimento e proliferao de clulas malignas. Estas so tambm um dos

maiores problemas que um doente com cancro pode experienciar, sendo que cerca de

80-100% dos doentes que morrem de cancro da prstata, mama e pulmo possuem

metstases sseas. De entre esses doentes, mais de 75% experienciam significativas

dores sseas e 50 % dos mesmos reportam analgia inadequada [13].

O alvio dos sintomas induzidos pelas metstases sseas pode ser conseguido por via

de um tratamento de corpo inteiro ou meio corpo com feixes de radiao externo de 8

Gy, com uma taxa de sucesso a rondar os 80%. Contudo com o uso desta modalidade

de irradiao corporal externa, todos os tecidos do corpo esto expostos a elevados

nveis de radiao de forma semelhante, o que pode causar efeitos secundrios

considerveis, em particular para os tecidos saudveis que se encontram volta do

tecido tumoral maligno [8].

A terapia com radiofrmacos menos invasiva, tipicamente melhor tolerada e produz

resultados no alvio da dor ssea, com a vantagem de limitar a exposio da radiao

aos tecidos alvos [15]. Contudo, estudos so necessrios para investigar,

nomeadamente, quais as melhores vias de administrao, dose, frequncia de

administrao e radioistopos que resultaro numa melhor captao do radiofrmaco

por parte do tecido alvo [8, 13].

Atualmente vrios estudos tm vindo a apresentar dados favorveis ao tratamento

paliativo de metstases sseas quando este aplicado em estados menos avanados

da doena oncolgica e muitos radiofrmacos novos tm sido apontados como tendo

elevado potencial teraputico [13]. Outros estudos tm demonstrado que os

radioistopos que decaem por emisso de partculas - e por captura eletrnica so os

que apresentam maior potencial teraputico, bem como, alguns radioistopos com

decaimento , como o caso do rdio-223, onde a sua elevada energia depositada

num volume muito reduzido [10, 17].

Irradiao de clulas tumorais com recurso a partculas radioativas como as acima

mencionadas, por via de uso de radiofrmacos, pode induzir leses na estrutura do

ADN da clula alvo, as quais podem subsequentemente levar morte da mesma por

um processo de morte celular programada designado de apoptose [13]. Tal resultaria

numa destruio seletiva de clulas tumorais por um processo de morte celular

controlado. Uma variedade de fatores contribui para a eficincia dos radiofrmacos,

dado que os efeitos da radiao nas clulas um processo complexo e vrios esforos

tm vindo a ser realizados para melhor compreender todo este processo atravs de

estudos in vitro e in vivo, bem como avanos cientficos na rea da radiobiologia. Para

alm disso, nos ltimos anos tm vindo a ser desenvolvidos, com sucesso, vrios

simuladores computacionais que tm vindo a acelerar a obteno de resultados in

silico e melhorar o conhecimento cientfico atual na rea de radiobiologia celular,

nomeadamente na rea de efeitos da radiao ionizante em clulas.

1.2. Principais Objetivos

Estudos e publicaes recentes documentam o interesse da terapia com recurso a

radiao, com mltiplas aplicaes na rea oncolgica, constituindo assim um tema

em voga nos dias de hoje. Neste sentido, os estudos radiobiolgicos, como os que se

pretendem realizar, so absolutamente pertinentes e necessrios para de uma forma

simples e barata melhor caraterizar a natureza dos efeitos produzidos pelos diferentes

radioistopos em diferentes cenrios de oncologia, bem como o seu potencial como

agente teraputico.

Assim, uma vez concluda esta Dissertao com o tema Avaliao e Caraterizao por

Mtodos Computacionais de Diferentes Radioistopos no Contexto da Terapia

Paliativa de Metstases sseas, espera-se contribuir para um maior conhecimento

cientifico sobre:

O eventual potencial teraputico de cada radioistopo estudado,

nomeadamente atravs da anlise dos efeitos radiobiolgicos produzidos

pelas principais emisses de cada radioistopo;

A avaliao dos efeitos radiobiolgicos das principais emisses de cada

radioistopo em vrios cenrios de simulao.

Por seu lado, aps a concluso dos Trabalhos Prticos, espera-se conseguir abordar de

forma correta e global o plano de trabalhos a desenvolver, no que toca ao uso dos

diferentes simuladores e parmetros de simulao para os diferentes cenrios, pela

recolha de informao cientifica que funciona como explicao introdutria de alguns

dos mtodos utilizados, seguida de uma breve explicao dos procedimentos a

desenvolver para realizar a Dissertao.

1.3. Estrutura Organizativa

Pretende-se organizar o presente documento de uma forma autnoma e

independente para facilitar o acesso as diversas reas estruturas em 7 captulos.

Assim, descreve-se sumariamente de seguida o que ser abordado em cada captulo:

Captulo 2. Biologia Celular

Neste captulo realiza-se uma descrio global, dos principais conceitos do ciclo

celular, com acessria relao deste com a morte celular programada, isto , apoptose.

Este captulo reveste-se de capital importncia pois para o desenvolvimento desta

Dissertao fundamental o conhecimento da cintica celular, em particular, as suas

relaes com o processo apopttico.

Captulo 3. Radiobiologia Celular

Neste terceiro captulo so explicados os conceitos bsicos associados ao uso de

radiao em clulas e os efeitos que esta provoca nas mesmas, esclarecendo-se

conceitos como curvas de sobrevida, e principais mecanismos de reparao celular.

Captulo 4. Radioistopos para Terapia Paliativa

Neste quarto captulo so enumeradas as principais caractersticas de cada

radioistopo com potencial teraputico, bem como as caractersticas das suas

principais emisses radioativas.

Captulo 5. Simuladores em Radiobiologia

Neste quinto captulo so enumerados e descritos os simuladores que se prev utilizar

para a realizao da Dissertao, bem como todos os parmetros necessrios para o

controlo de cada cenrio. Realizando tambm de uma forma sucinta uma comparao

da utilizao dos simuladores em relao a uma cultura celular.

Captulo 6. Introduo a Simulao

Neste penltimo captulo so expostas algumas simulaes simples utilizadas para

melhor compreender o funcionamento dos simuladores anteriormente descritos,

explicando-se tambm como se pretende realizar os futuros cenrios de irradiao.

Capitulo 7. Concluses Finais e Perspetivas Futuras

Neste ltimo captulo so apresentas algumas concluses finais sobre o trabalho

desenvolvido, indicando igualmente quais as perspetivas futuras da continuao do

desenvolvimento deste trabalho para posterior apresentao como Dissertao.

1.4. Contribuies Principais

Como principais contribuies dos Trabalhos Prticos, enquanto trabalho guia para a

execuo prtica dos procedimentos para o desenvolvimento correto desta

Dissertao, salientam-se o estudo dos diferentes simuladores, processo apopttico e

ciclo celular, a reviso bibliogrfica, bem como, a descrio algo detalhada dos

radioistopos e funcionamento dos simuladores que se pretendem utilizar durante um

projeto desta natureza.

No que diz respeito Dissertao espera-se que esta contribua para melhorar o

conhecimento cientfico neste tema em particular, pois um campo de intensa

pesquiza e interesse crescente.

Captulo 2

Biologia Celular

2.1. Introduo

De um modo geral, as clulas crescem, aumentam o seu contedo e por fim dividem-

se. Cada clula origina duas clulas-filhas que, se tudo ocorrer dentro da normalidade,

sero geneticamente idnticas clula-me. Por sua vez, estas clulas-filhas podem

tornar-se clulas-mes da gerao seguinte. Assim, a vida de uma clula comea

quando esta surge a partir da clula-me e acaba, quando ela prpria se divide para

originar duas clulas-filhas.

O conjunto de transformaes e processos que decorrem desde a formao da clula

at ao momento em que ela prpria se divide constitui um processo dinmico e

continuo, denominado ciclo celular.

Durante a diviso celular, os organelos, enzimas e outros constituintes da clula so

distribudos pelas clulas-filhas. O ADN exatamente auto-duplicado e as copias

rigorosamente divididas. esta fidelidade na duplicao e na distribuio do material

gentico pelas clulas-filhas que assegura a continuidade gentica.

Todo o procedimento do ciclo celular e controlado por diversas protenas e enzimas

que alm de garantirem a ausncia de erros, transmitem a cintica do ciclo, isto , a

durao de cada fase especifica do processo e o tempo total necessrio para que todo

o processo ocorra. Uma pequena mutao numa protena ou enzima de controlo, pode

ter consequncias dramticas na cintica celular, como no caso das clulas

carcinognicas, em geral o perodo do ciclo celular muito inferior as celular normais.

Um destino final das clulas, muito caracterstico e importante do ponto de vista

teraputico a morte celular por apoptose, isto , morte celular programada que tem

um efeito mnimo ou mesmo ausente sobre as clulas vizinhas.

A apoptose um mecanismo de segurana presente nas clulas que desencadeado

sempre que as clulas so danificadas de forma irreversvel, garantindo assim mais

uma vez a continuidade gentica.

Mais uma vez, o processo apopttico controlado por um vasto nmero de enzimas e

protenas especficas, que iniciam todo o processo assim que algum recetor ativado.

2.2. Princpios do Ciclo Celular

As clulas crescem e dividem-se de acordo com o seu ciclo celular. Este ciclo o

processo atravs do qual uma clula somtica duplica o seu material gentico e o

reparte igualmente s suas clulas-filhas, e dividido em interfase e fase mittica. A

interfase corresponde ao perodo entre o fim de uma diviso celular e o incio da

diviso seguinte, enquanto, a fase mittica enquadra o perodo durante o qual ocorre

a diviso celular propriamente dita.

So conhecidas aproximadamente 50 protenas que atuam como fatores de

crescimento. As clulas que possuem o recetor especfico para um determinado fator

de crescimento sero iniciadas no ciclo, enquanto as que no expressarem esse

recetor permanecero inativas.

A interfase, que antecede a fase mittica divide-se em trs subfases: G1, S e G2. O

intervalo G1, ou ps-mittico, inicia-se quando a clula estimulada a multiplicar. Este

intervalo corresponde ao perodo entre o fim da mitose e o incio da sntese de ADN

(fase S), e caracteriza-se por um amento do volume celular e intensa sntese de

protenas e enzimas. Na fase S, ocorre a autorreplicao de cada uma das molculas de

ADN, a fim de que cada cromossoma seja formado por dois cromatdeos ligados por

um centrmero. O intervalo G2, ou pr-mittico, ocorre aps a sntese de ADN (fase S)

e antes do incio da mitose. Neste perodo ocorre sobretudo a sntese de biomolculas

e ARN necessrios diviso celular, consultar figura 1.

Ilustrao 1: Progresso do ciclo celular depende de uma sequncia de ativao e desativao de diversos

complexos CDKs e CDKIs (Stewart e Kleihues, 2003)

Durante o ciclo celular existem etapas de avaliao interna relativamente ao

prosseguimento do ciclo celular, designados por Checkpoint 1, que ocorre no final do

intervalo G1 e Checkpoint 2, que ocorre no final do intervalo G2. Se o resultado da

avaliao for negativo as clulas param o seu processo de diviso e permanecem no

estdio denominado G0 por tempo indeterminado ou at sua morte. Se pelo

contrrio, a avaliao efetuada for positiva, estas processem para a fase seguinte do

ciclo celular, a fase mittica.

Relativamente fase mittica esta comummente dividida em duas etapas principais:

a mitose, que corresponde diviso do ncleo, e a citocinese, que corresponde

diviso do citoplasma. A mitose, embora seja um processo continuo, dividido

didaticamente em: prfase, metfase, anfase e telfase. A prfase , de um modo

geral, a etapa mais longa da mitose. Nesta fase, sucede a condensao dos

cromossomas, tornando-se mais espessos e curtos, e os dois centrolos comeam a

afastar-se em sentidos opostos, formando-se o fuso acromtico. Na metfase os

cromossomas atingem o mximo de encurtamento, o fuso acromtico fica completo e

os centrolos atingem os plos da clula. Para alm disso, os cromossomas orientam-se

com os centrmeros no plano equatorial, voltados com as terminaes para fora.

Durante a anfase surge a clivagem dos centrmeros, separando-se os dois

cromatdeos que passam a constituir dois cromossomas independentes. Durante nesta

fase ocorre a ascenso dos cromossomas filhos. Por ultimo, na telfase, a membrana

nuclear reorganiza-se em torno dos cromossomas de cada clula-filha o fuso mittico

degradado e os cromossomas descondensam, terminado assim a mitose.

A citocinese carateriza-se pela diviso do citoplasma e consequente individualizao

de cada clula-filha. Estre processo comea a ser preparado durante a mitose com a

formao do anel contrtil de filamentos proteicos. Estes durante a citocinese

contraem-se e puxam a membrana celular para dentro, causando um sulco de

clivagem, que vai lentamente estrangulando o citoplasma at separar as clulas-filhas.

A durao das subfases do ciclo celular varia com as espcies, tipo de tecido e com o

estado de desenvolvimento do organismo. Tipicamente o tempo de duplicao celular

varia entre 10 a 40 horas com a fase G1 a durar 30%, fase S 50%, fase G2 15% e a

mitose 5% do tempo do ciclo celular. A radiossensibilidade celular tambm varia ao

longo do ciclo celular, em geral, a fase final do estdio S a mais radiorresistente, a

fase G2 e M so as mais radiossensveis.

2.3. Cintica celular

Todo o ciclo celular de cada tipo de clula controlado por diversos marcadores,

enzimas e protenas que lhes proporciona uma cintica particular, que pode ser

alterada se ocorrer alguma alterao gentica, como no caso das clulas

carcinognicas da prstata e mama.

As clulas carcinognicas metastticas da prstata, tal como as clulas normais que as

originam, so sensveis a estimulao por hormonas de crescimento. Estas clulas so

dependentes de hormonas, uma vez que, na presena de certas hormonas a sua

percentagem de proliferao (Kp) estimulada, enquanto na ausncia aumenta a sua

taxa de morte celular (Kd). Na presena das hormonas corretas, ocorre o contnuo

crescimento destas clulas, uma vez que, a taxa de proliferao supera a taxa de morte

celular [22].

Estudos realizados por Carter e colaboradores concluram que o tempo necessrio de

duplicao de clulas da prstata de 2.40.6 anos enquanto para clulas

metastticas era de 1.80.2 anos. Por seu lado os estudos realizados por Schmid e

colaboradores obtiveram 5.8 e 3.6 anos respectivamente.

O Kp, expressa em percentagem a taxa de proliferao diria de um tipo particular de

clulas, calculado dividindo o valor GF para esse tipo de clula pelo perodo

intermittico Tc, expresso em dias, e posteriormente multiplicado o resultado por 100.

O GF determinado por anlises imunocitoquimicas para detetar clulas em ciclo

celular, atravs da deteo do antigene Ki67 presente em clulas em proliferao (G1,

S, G2) e ausente em clulas fora de ciclo (G0). O GF ento a poro de clulas da

amostra marcadas positivamente para o antigene Ki67.

O Tc determinado usando culturas de clulas da prstata saudveis e carcinognicas

(DU-145, PC-3 e LNCaP), observando o tempo entre mitoses sucessivas atravs do

recurso a vdeo, conclui-se pelo estudo de Berges e colaboradores que para ambas as

amostras o Tc de 485 horas.

O Kd expressa em percentagem a taxa de morte celular diria, calculado dividindo a

frao de clulas que a extremidade do ADN marcada com TTF (terminal transferase)

exgena purifica pela meia vida das clulas marcadas, geralmente 12 horas, e depois

multiplicado por 100.

Mais propriamente um valor de meia vida de 122 horas para clulas normais, 123

para clulas metastticas da prstata.

Por fim conclui-se ento que a taxa de crescimento dada pela subtrao de Kd a Kp

para cada tipo particular de clula. Quando Kd < Kp o tempo de duplicao dado pela

formula:

=2

[ ]

Quando Kd = Kp, o tempo de renovao de todo o tecido calculado por:

= 1

A percentagem de proliferao das clulas normais da prstata baixa, contudo,

elevada o suficiente para equilibrar a baixa percentagem de morte celular espontnea.

Demonstrando assim que as clulas da prstata esto em equilbrio, tendo um Tt de

50079 dias. Quando as clulas da prstata entram numa fase inicial de carcinognese,

ocorre um aumento de 6.9 vezes o valor normal de Kp, e com um aumento de 4 vezes o

valor de Kd. Levando assim a acumulao diria de 0.450.11% de celulas. Ficando

assim um tempo de duplicao de 15422 dias para estas clulas.

Os resultados demostraram tambm que o valor Kp das clulas metastticas 10.7

vezes superior comparado com as clulas normais e o valor de Kd unicamente 3.8

vezes superior ao das clulas normais. Levando assim a uma taxa de crescimento

celular no osso das clulas metastticas de 1.280.23%, traduzindo-se assim num

tempo de duplicao de 545 dias, consultar tabela 1.

Tabela 1: Parmetros da cintica das clulas da prstata (adaptado Berges 1995)

Tipo celular Kp (%) Kd (%) Tempo de

duplicao (dias) Clulas epiteliais da

prstata 0.190.03 0.200.03 50079

Clulas de elevado valor neoplstico 1.250.30 0.800.24 15422

Clulas metastticas da prstata no osso 2.040.29 0.790.16 545

2.4. Apoptose e Necrose

Apoptose, ou morte celular programada, carateriza-se por ocorrer de forma individual,

no infligindo, por isso, morte s clulas vizinhas. A morte celular por apoptose

participa em mltiplas situaes fisiolgicas. A combinao da apoptose com a

proliferao celular responsvel pelo delineamento de tecidos e rgos nos

embries. Por exemplo, a apoptose regula a separao dos dedos nos fetos. Problemas

na regulao da apoptose podem conduzir ao aparecimento de inmeras patolgicas,

nomeadamente cancro, (Tavares 2009).

O processo apopttico tem o seu incio aps a captao de um sinal ou estimulo pelas

clulas para entrarem em apoptose, realizando um vasto conjunto de alteraes.

Uma famlia de protenas denominada caspase, tipicamente ativada nas fases iniciais

do processo, sendo responsveis pela degradao de componentes celulares

fundamentais para o funcionamento celular normal, incluindo enzimas responsveis

pela reparao do ADN. Por outro lado, as caspases podem ativar enzimas

destruidoras, tais como, ADNases, que iniciam a quebra do ADN.

A clula em apoptose apresenta uma morfologia distinta e caraterstica, que tem incio

com o encurtamento celular devido a destruio dos filamentos de actina e lminas do

citoesqueleto. Posteriormente o ncleo celular apresenta uma aparncia em ferradura

devido a quebra da cromatina e condensao nuclear e um contnuo encurtamento

celular observado de forma a permitir a posterior remoo dos restos celulares pelos

macrfagos. Na fase final da apoptose surgem pequenas bolsas membranares, que

formam vesculas, denominados corpos apoptticos. Estas alteraes morfolgicas so

comuns a todas as clulas em apoptose explcita, independentemente do agente

indutor do processo. Quer isto dizer que a ao das caspases representa uma via

comum, que opera em todas as clulas programadas para morrer, (Anazetti e Melo

2007).

A sensibilidade da clula face a um estmulo apopttico depende de um nmero de

fatores como a expresso de protenas indutoras e anti-apoptticas, a intensidade do

estmulo e o estdio do ciclo celular. Existe um extenso nmero de mecanismos que

induzem apoptose. A apoptose pode ser desencadeada por estmulos extrnsecos, tais

como, a ligao de indutores de apoptose a recetores da membrana celular,

denominados recetores de morte celular. Para alm dos processos referidos, a

apoptose pode ser induzida por sinais intrnsecos que produzem stresse celular, devido

exposio radiao, a qumicos ou vrus. Pode igualmente resultar de uma privao

de fatores de crescimento ou stresse oxidativo induzido pela formao de radicais

livres.

Existe uma grande correlao entre o ciclo celular e a apoptose, reconhecida pelos

genes que codificam as protenas c-Myc, p53, Rb, ras, PKA, PKC, Bcl-2, NF-kB, CDK,

ciclinas e CKI. Aps estimulao, estas protenas podem induzir proliferao celular,

interrupo do ciclo celular ou morte celular programada. A resposta celular

fortemente influenciada pela informao gentica existente, o microambiente, a

extenso de dano no ADN e a concentrao de diferentes protenas.

Por outro lado, a morte celular por necrose ocorre, geralmente, em resposta a danos

severos nas clulas e caraterizada, morfologicamente, por um aumento do volume

citoplasmtico e mitocondrial, seguido da rutura da membrana plasmtica e

extravasamento do contedo celular, induzindo deste modo uma resposta

inflamatria, que pode causar dano e, por vezes at morte s clulas vizinhas. Deste

modo, quando a morte celular ocorre por via da necrose, um grande nmero de

clulas afetado e lesado durante o processo inflamatrio. Contrariamente ao

processo de retrao celular observada aquando do processo apopttico, na necrose

observa-se um edema celular devido as leses no citoesqueleto e inibio das bombas

de Na+/K+, o que origina a perda da permeabilidade seletiva da membrana.

Em sntese, na apoptose, ou morte celular programada, as clulas morrem como

resultado de uma grande variedade de estmulos, contudo, o processo controlado e

regulado. Contrariamente a necrose, corresponde morte celular descontrolada, que

conduz ao aparecimento de lise celular e consequente resposta inflamatria, consultar

imagem 2.

Ilustrao 2: Apoptose e a necrose so distinguidas por alteraes morfolgicas caractersticas

(Stewart e Kleihues, 2003)

2.5. Sumrio

Deste captulo conclui-se que a clula comea a sua vida quando se origina a partir da

diviso da clula-me e termina quando ela prpria se divide em duas clulas-filhas,

dai se denomina esta existncia cclica das clulas por ciclo celular. O ciclo celular, bem

como toda a cintica associada desempenham um papel fundamental na resposta

celular irradiao pois aquando de um dano pode repara-lo, pode ordenar a morte

celular, por apoptose, ou pode retirar essas clulas do ciclo celular, permanecendo

num estdio de paragem, designado G0. A apoptose o processo de morte celular que

menos danos causa s clulas vizinhas, sendo o processo ideal de fim celular aquando

da irradiao.

Captulo 3

Radiobiologia Celular

3.1 Introduo

Quando a radiao ionizante interage com clulas ou tecidos, ocorrem interaces e

deposio de energia nos diversos componentes da clula, principalmente no ADN, por

este ser o componente mais sensvel.

Os efeitos da radiao podem ser diversos dependendo do grau de maturao e tipo

celular em causa, bem como da qualidade da radiao. Podendo ser provocados de

uma forma direta, isto , a prpria radiao interage diretamente com o alvo, neste

caso o ADN ou outro qualquer constituinte da clula, ou podem ser provocados de

forma indireta, nesta, a radiao atua sobre molculas de gua, produzindo radicais

livres altamente reativos, que por sua vez interagem e provocam leses nos

constituintes celulares.

A irradiao de uma clula pode resultar em nove destinos finais:

Ausncia de efeito;

Atraso na diviso: a clula atrasa a entrada no processo de diviso;

Apoptose: a clula morre antes de se dividir ou aps diviso por fragmentao

em pequenos corpos;

Falha reprodutiva: a clula morre na tentativa de executar mitose;

Instabilidade genmica: carateriza-se por um atraso da falha reprodutiva

como resultado da introduo de instabilidade genmica;

Mutao: a clula sobrevive, mas esta mutada;

Transformao: a clula sobrevive, mas a mutao leva a alteraes de

fentipo e possibilidade de carcinognese;

Efeito bystander: uma clula irradiada envia sinais s clulas vizinhas no

irradiadas, induzindo nestas danos genticos;

Reposta adaptativa: a clula irradiada estimulada a reagir e torna-se mais

resistente a radiao, (Suntharalingam 2002).

Dos destinos finais, enumerados anteriormente, aquele que mais interessante do

ponto de vista da radioterapia metablica dirigida, a apoptose, pois este destino

induz menos danos nas clulas vizinhas e, adicionalmente, impede a propagao de

aberraes cromossmicas radioinduzidas.

As clulas tm mecanismos intrnsecos de resposta as diversas leses que a radiao

ionizante pode provocar no ADN. Estes mecanismos de uma forma geral aps a

deteco do local lesado procedem a uma substituio das bases incorrectas ou

mesmo de um segmento da cadeia de ADN, de forma a tentar corrigir a leso e

assegurar a integridade gentica.

Dos mecanismos conhecidos, tem especial destaque os mecanismos de reparao mais

simples que so utilizados principalmente nas quebras simples como o caso da

reparao por exciso de bases (Base Excision Repair, BER) que permite corrigir

problemas em bases individuais, reparao por exciso de nucldeos (Nucleotide

Excision Repair, NER) que corrige atravs da remoo e substituio de oligonucldeos,

com comprimentos entre 24 e 32 nucletidos. Este processo a via primaria de

remoo de espcies reativas do oxignio.

Quando existem ou ocorrem danos irreparveis no ADN, geralmente o prximo passo

a apoptose, ou more celular programada, de forma a evitar, as consequncias de

reparaes altamente mutagnicas.

3.2 Efeitos Celulares da Radiao

Pelas leis de Bergonie e Tribondeau (1906), conclui-se que quanto mais diferenciada

a clula, maior a sua radiorresistncia e quanto maior a taxa de proliferao, de

crescimento e atividade metablica da clula, maior a radiossensibilidade. Assim,

tecidos ou rgos em desenvolvimento e proliferao ativa so mais radiossensvel

que tecidos ou rgos totalmente desenvolvidos e diferenciados, ilustrao 4.

Em 1925, Ancel e Vitemberger modificam a lei de Bergonie e Tribondeau, introduzindo

a noo de tempo de latncia, afirmando que a suscetibilidade das clulas leso por

radiao o mesmo, mas o tempo de aparecimento das leses produzidas pela

radiao vria de acordo com o tipo de clula, influenciadas pela quantidade de

stresse biolgico que a clula est sujeita, necessidade de diviso, e s condies de

pr e ps-radiao da clula exposta.

Ilustrao 3: Relao entre a radiossensibilidade das clulas e as suas caractersticas de diviso e diferenciao celulares.

Os efeitos celulares da radiao podem tambm ser classificados com base na sua

probabilidade de ocorrncia, sendo divididos em dois tipos distintos:

Efeitos estocsticos: Podem aparecer a partir da leso de uma ou vrias clulas,

no existe limiar, pelo que os efeitos so de natureza aleatria, isto , assume-se

que existe sempre a probabilidade de ocorrerem, mesmo para pequenas doses

de radiao. Um aumento da dose implica um aumento da frequncia do efeito e

no da sua gravidade.

Efeitos determinsticos: esto associados a um limiar a partir do qual surgem, so

os efeitos cuja severidade aumenta com o aumento da dose.

3.3 Efeitos Diretos e Indiretos da Radiao

Quando as clulas so expostas a radiao ionizante, ocorrem primeiramente efeitos

fsicos entre os tomos e molculas da clula e a radiao, e s mais tarde se verificam

os danos biolgicos. Os efeitos biolgicos da radiao resultam sobretudo de leses

Vida curta Indiferenciadas Dividem-se regularmente

Muito Alta

Dividem-se um nmero limitado de vezes Algum grau de diferenciao Alta

Dividem-se irregularmente Esperana de vida muito variavel Mdia

Vida longa No se dividem muitas vezes Grau variavel de diferenciao

Baixo No se dividem Altamente diferenciadas Muito Baixo

provocadas ao ADN, o qual o componente mais sensvel da clula no que toca a

radiao ionizante. Contudo, existem outros componentes da clula, que uma vez

danificados, podem produzir efeitos biolgicos na clula como por exemplo enzimas,

lpidos estruturais, entre outros.

Quando a radiao incidente interage com o material biolgico, transfere energia para

a clula, provocando danos que pode ser resultado de efeitos diretos ou indiretos da

radiao. No efeito direto, a radiao interage diretamente com a molcula alvo, ou

seja o ADN. Os tomos do ADN so ionizados ou excitados, conduzindo a uma cascata

de eventos fsicos e qumicos, que eventualmente produzem o dano biolgico. O efeito

direto o processo dominante em interaes de radiao de alta LET.

No efeito indireto, a radiao interage com outas molculas ou tomos,

principalmente molculas de gua, no interior da clula, produzindo radicais livres, os

quais posteriormente provocam a ionizao da molcula alvo. As interaes da

radiao com as molculas de gua no interior da clula produzem radicais livres de

curta vida, nomeadamente, o H2O+ e o OH. Os radicais livres em causa podem induzir

danos no ADN, os quais conduzem a danos biolgicos. Cerca de dois teros do dano

biolgico provocado por radiao de baixa LET devido ao efeito indireto da radiao,

consultar imagem 4 [2].

Ilustrao 4: Efeitos Diretos versos Efeitos Indiretos (Hall e Giaccia, 2006)

3.4 Tipo de Danos e Destino das Clulas

Radioinduzidos

As clulas expressam os danos radioinduzidos aquando da sua diviso e multiplicao.

Leses que provocam aberraes cromossmicas e mutaes genticas nas clulas,

podem levar morte celular, inibio da diviso celular ou a transformaes malignas.

Estas alteraes celulares podem ter como consequncias finais a alterao da funo

tecidular, morte tecidular ou induo de cancro.

A interao de radiao ionizante com material biolgico provoca uma cascata de

eventos nefastos para a estrutura e funo do material em causa. Quando existe

interao entre radiao e o ADN, um dos seguintes efeitos biolgicos na estrutura do

ADN podem ocorrer: 1) alterao das ligaes entre as bases, devido a substituio de

bases, adio de novas bases ou remoo de bases existentes, substituio cruzada de

bases; 2) Single Strand Break (SSB), quebras simples da cadeia; ou 3) Double Strand

Break (DSB), quebras duplas da cadeia. Estes danos do ADN podem conduzir a

alteraes na funo do ADN levando uma das seguintes consequncias: inibio

temporria ou permanente da sntese de ADN, sntese de ADN incorreto, inibio ou

preveno da mitose ou mesmo sntese de protenas incorretas. Por outro lado

quando a interao da radiao ocorre com enzimas, alteraes da estrutura terciria

ou disrupo das ligaes qumicas das enzimas podem ocorrer, levando inibio da

atividade enzimtica ou a alteraes do metabolismo celular. Se as interaes ocorrem

nas membranas celulares, pode ocorrer um aumento da permeabilidade aos ies,

resultando em potenciais alteraes da composio intracelular e extracelular da

clula.

Suntharalingam em 2002 classifica os danos provocados em clulas de mamferos em

trs grandes grupos:

Danos letais: os quais so irreversveis, conduzindo morte da clula;

Danos subletais: podem ser reparados em algumas horas exceto se outros

danos subletais forem adicionados durante a reparao celular, o que

conduzir ao aparecimento de um dano letal;

Danos potencialmente letais: podem ser manipulados pelos mecanismos de

reparao quando as clulas so retidas no estdio G0.

Como consequncia dos danos provocados pela radiao a clula pode-se encaminhar

para um de nove possveis destinos finais, (Suntharalingam 2002):

Ausncia de efeito;

Atraso na diviso: clula fica retida no estdio G0;

Apoptose: a clula morre por fragmentao;

Falha reprodutiva: a clula morre na tentativa de executar mitose;

Instabilidade genmica: carateriza-se por um atraso da falha reprodutiva como

resultado da introduo de instabilidade genmica;

Mutao: a clula sobrevive, mas est mutada;

Transformaes: a clula sobrevive, mas a mutao leva a alteraes de

fentipo e possibilidade de carcinognese;

Efeito bystander: a clula irradiada envia sinais as clulas vizinhas no

irradiadas, induzindo danos genticos nas mesmas;

Resposta adaptativa: a clula irradiada estimulada para reagir e tornar-se

mais resistentes radiao.

A escala temporal associado quebra de ligaes qumicas e subsequente dano

biolgico, perodo de latncia, situa-se entre algumas horas a anos, dependendo do

tipo de dano. Caso a morte celular seja o resultado da irradiao, esta pode ocorrer

dentro de algumas horas, isto , efeitos precoces da radiao. Contudo, se o dano for

oncognico, a sua expresso pode ser adiada durante anos, isto , efeito tardio da

radiao.

3.4.1. Mtodo de Classificao das Leses ao ADN

Nikjoo e colaboradores, em 1997, definiram dois mtodos alternativos de classificao

de quebras nas cadeias de ADN.

Esses esquemas de classificao consideravam 1) os padres de quebras de acordo

com a complexidade do dano (simples, duplo e combinaes) numa ou ambas as

cadeias de ADN, figura 5; e 2) classificao das quebras como resultado direto ou

indireto da radiao (devido a radicais livres). As classificaes so apresentadas na

tabela 2, (Nikjoo 1997 e 2001).

Ilustrao 5: Esquema de classificao de danos do ADN segundo (Nikjoo 1997 e 2001)

Classificao Descrio

Ausncia de quebra No ocorre deposio energtica por efeito direto, nem a

deposio energtica devido a radicais livres (efeito indireto) conduz formao de quebras do ADN

SSB Quebra simples do ADN SSB+ Duas quebras simples na mesma cadeia ADN

2SSB Duas ou mais quebras simples em cadeias opostas separadas por >10 bp, mas no classificadas como quebras duplas DSB Duas quebras simples opostas e separadas por 10 bp

DSB+ Uma quebra dupla acompanhada por uma ou mais quebras simples separadas por menos de 10 bp

DSB++ Mais de uma quebra dupla no segmento de ADN separadas por 10 bp ou mais Tabela 2: lassificao das diferentes quebras do ADN, segundo (Nikjoo 1997, 2001)

3.5 Mecanismos de Reparao do ADN

Quando a radiao ionizante interage com material biolgico, principalmente o ADN,

provoca alteraes na sua estrutura num curto espao de tempo, entre 10-3 e 10-5

segundos, estimulando a quebras de ligaes qumicas do ADN. Contudo, os efeitos

biolgicos de tal leso surgem tardiamente, aps um perodo de latncia quem pode

demorar desde algumas horas at vrios anos. Como consequncia dos danos no ADN

a clula pode sofrer uma mutao, entrar em apoptose ou tornar-se numa clula

carcinognica.

Dependendo da energia depositada pela radiao ionizante na clula irradiada podem

ocorrer quebras de apenas uma cadeia de ADN ou quebras nas duas cadeias de ADN

(mencionadas anteriormente). Em termos biolgicos as quebras simples so

tipicamente de fcil reparao, no apresentando assim grandes consequncias

celulares, a no ser em caso de reparao incorreta a qual pode conduzir ao

aparecimento de uma mutao. Tambm as quebras duplas separadas por vrios pares

de bases so frequentemente facilmente reparados pelos mecanismos celulares.

Porm as quebras duplas complexas, separadas por poucos pares de bases so uma

das leses mais toxicas e mutagnicas nas clulas humanas, uma nica DSB tem

potencial para remover mais de 100 milhes de pares de base de informao gentica.

O nmero de leses no ADN geradas pela radiao elevado, mas o nmero de clulas

que morrem devido as leses substancialmente mais reduzido. O nmero de leses

induzidas no ADN por uma radiao de 1-2 Gy aproximadamente de 1000 SSB e 40

DSB. Dados experimentais demonstram que as DSB induzida por radiaes de baixo

LET so tipicamente mais facilmente reparadas que as DSB provocadas por radiaes

de alto LET. Conhecimento relativo interao e trajeto da radiao (track structure)

com a matria tem vindo a ser utilizado para explicar as variaes e diferentes

distribuies das leses no ADN.

Existem mltiplos mecanismos enzimticos de reparao do DNA nas clulas que

atuam em diferentes tipos de leses. Para as leses DBS, os principais mecanismos de

reparao so a recombinao homloga (Homologous Recombination) e a

recombinao no homloga (Non-Homologous End Joining, NHEJ) [37].A

recombinao homloga requer que parte do ADN no esteja danificado para servir

como molde para sntese de novo ADN, um mecanismo raro, sem erros e que

acontece essencialmente aps a replicao, na fase final do estdio S e G2 do ciclo

celular. Inicia-se com a ligao de um complexo proteico nos locais das leses. Ocorre

a sntese dos nucldeos em falta, criando assim um complexo cruzado entre as cadeias

de ADN lesadas e normais, designado de juno de Holliday. A quebra da juno

Holliday garante a recombinao homloga no final do mecanismo de reparao. Por

seu lado, a recombinao no homloga provoca leses pr-mutagnicas, podendo ser

letais no caso de aberraes em anel, dicntrico ou ponte de anfase ou no-letais se

forem pequenas delees ou translocaes simtricas. Este mecanismo opera na

ponta do fragmento de ADN, aps a identificao por parte da protena Ku70/Ku80 do

local da leso, de seguida a protena de reparao ligada a DNA-PK, que promove

uma religao dos fragmentos. Este mecanismo ocorre essencialmente na fase final do

estdio G1 e fase S do ciclo celular.

A radiossensibilidade difere dentro do ciclo celular, em geral, a fase final do estdio S

a mais radiorresistente, a fase G2 e M so as mais radiossensveis, tomando a fase G1

um valor intermedio. A proporo favorvel da reparao por HR em vez da NHEJ na

fase final de S pode explicar a sua maior radiorresistncia, ver imagem 6.

Ilustrao 6: Frao de clulas que sobrevivem a uma dose de 6.6 Gy de raio-X em funo do tempo, A

sobrevivncia celular cresce at um mximo na fase final do estdio S (Wang, 2000)

Existem mecanismos de reparao mais simples que so utilizados principalmente nas

quebras simples como o caso da reparao por exciso de bases (Base Excision Repair,

BER) que permite corrigir problemas em bases individuais atravs da produo de um

local AP (local apurnico ou apirimidnico), reparao por exciso de nucldeos

(Nucleotide Excision Repair, NER) que corrige dmeros de timina atravs da remoo e

substituio de oligonucldeos, com comprimentos entre 24 e 32 nucletidos, por

reparao enzimtica distinta do ADN. Este processo a via primaria de remoo de

espcies reativas do oxignio capazes de induzir ciclopurinas em clulas de mamferos.

Por ltimo existe ainda a reparao de erros de emparelhamento (Mismatch Repair,

MMR).

Dois modos de reparao BER tm sido observados em clulas procariticas e

eucariticas: a exciso e substituio de um nico nucletido, denominado BER de

curta substituio (Short-Patch BER SP-BER), que ocorre na maioria dos casos; e a

remoo de fragmentos de 2 a 13 nucletidos, denominado BER de longa durao

(Long-Patch BER LP-BER). Segundo Dianov e colaboradores (2000), em clulas

humanas, as vias de reparao LP-BER e NER tm um papel relativamente minoritrio

na reparao dos danos, sendo estes na sua maioria removidos pela via SP-BER.

Quando existem ou ocorrem danos irreparveis no ADN, geralmente o prximo passo

a apoptose, ou more celular programada, de forma a evitar, as consequncias de

reparaes altamente mutagnicas.

3.6 Curvas de Sobrevida

O procedimento padro para medir a radiossensibilidade de uma populao celular a

reteno da sua integridade reprodutiva, isto referido como a sobrevida celular e

percentagem de sobrevida aps irradiao, assumindo que existe uma relao clara

entre a apoptose e o crescimento e a sobrevivncia celular para um grande intervalo

de doses e nveis de sobrevivncia.

O tipo de radiao influencia a forma da curva, sendo que radiaes densamente

ionizantes apresentam curvas de sobrevida quase exponenciais face dose absorvida,

enquanto radiaes pouco ionizantes apresentam uma pequena diminuio inicial,

seguida de uma regio denominada em ombro, mantendo-se quase e decrscimo

constante para altas doses, consultar imagem 7.

Ilustrao 7: Curvas de sobrevida celular tpica para radiao de alta LET e baixa LET: (a) Primeiro modelo e

(b) modelo atual (Tavares, 2009)

As curvas de sobrevida so melhor expressas em grficos semilogartmicos de

sobrevivncia por dose irradiada, geralmente com doses de 1 a 10 Gy por clula. O

modelo mais utilizado na atualidade o modelo linear-quadrtico, usando um

polinmio de segunda ordem, utilizando as constantes que representa a inclinao

inicial da curva e a componente quadrtica de morte celular para descrever o declive

da sobrevida (S) com o aumento da dose (D).

= (+2)

A razo / fornece a dose para a qual os componentes quadrticos e lineares da

morte celular so iguais.

A taxa de sobrevivncia celular maior quando uma dose administrada de forma

fracionada num perodo superior a 2 horas, comparado com uma nica dose. Esta

variao atribuda s reparaes das leses subletais entre fraes. Em geral o

perodo de reparao de metade das leses subletais varia entre 0.5 a 1 hora para

clulas em cultura podendo ser maior em tecidos. E a reparao completa pode

demorar entre 6 a 8 horas, podendo tambm ser mais moroso em tecidos.

O sucesso da reparao do dano depende da dose absorvida e do tempo de exposio,

existindo uma velocidade mxima de reparao observada quando a leso atinge

nveis de saturao, anlogo cintica enzimtica. A reparao menos bem-sucedida

para irradiaes de altas taxas de doses, apresentado maior sucesso para baixas taxas

de doses. O sucesso crescente da sobrevivncia celular a baixas doses ou com doses

muito espaadas no tempo e consistente com a importncia dada ao tempo de

reparao das leses subletais.

Outro efeito importante na sobrevida celular o chamado efeito bystander, em que as

clulas prximas das clulas irradiadas, mas que no foram atingidas diretamente pela

radiao, exibem leses similares aquelas observadas em clulas diretamente

atingidas pela radiao.

3.7 Sumrio

Pretende-se, uma vez finalizada a leitura deste captulo, que se compreenda e retenha

os conceitos bsicos dos efeitos das interaces da radiao com as clulas e material

biolgico, com particular importncia para os mecanismos de reparao presentes nas

clulas eucariticas.

Do captulo verificou-se que os efeitos finais da radiao dependem do tipo de clula

em causa, bem como a fase do ciclo celular em que se encontra, pois sabe-se que uma

clula em estdio G1 mais radioresistente do que a mesma clula em estdio M.

Por outro lado, a qualidade da radiao utilizada, influencia de forma drstica o tipo de

danos provocados no ADN da clula, quanto maior o LET da radiao, mais complexo e

difceis de reparar vo ser os danos, garantindo assim que a clula inicia o seu processo

apopttico.

Captulo 4

Radioistopos

para Terapia Paliativa

4.1 Introduo

A radiao ionizante pode ser utilizada para destruio das celulares carcinognicas,

por via de mtodos de irradiao externa com raios-X ou partculas de elevada energia

ou mtodos de irradiao interna com recurso a tcnicas de braquiterapia ou uso de

radiofrmacos.

A radiao transmitida internamente a uma rea especfica ou a um rgo lesado ser

tendencialmente mais seletiva que feixes de radiao externos. Contudo importante

definir qual a quantidade certa de radiao a fornecer s clulas cancerosas alvo e ao

mesmo tempo definir qual a estratgia de administrao mais eficiente e que evitar

lesar as clulas normais que rodeiam o tumor.

O primeiro caso de sucesso de mtodos de irradiao interna de tumores com recurso

ao uso de radioistopo foi o tratamento do cancro da tiroide com uso de iodo

radioativo. O Iodo-131 (131I), produzido num reator nuclear, instvel devido ao

elevado nmero de neutres e emite radiao e para alcanar a estabilidade. Para

alm disso, quando injetado por via endovenosa ou administrado por via oral, o 131Iodeto de sdio, concentra-se preferencialmente na tiroide, glndulas salivares e

mucosas. Dado que a radiao libertada pelo 131I capaz de destruir as clulas

cancerosas e o 131Iodeto de sdio se localiza preferencialmente na tiroide, este

mtodo de irradiao interna de tumores com recurso a radioistopos tem sido

utilizado para tratamento do cancro da tiroide com elevado sucesso.

Existem outros istopos utilizados com fiz teraputicos ou de diagnstico so captados

por reas especificas do corpo, por exemplo, o Fosfato-32 e o Estrncio-89

amplamente usados na terapia ssea e o Rdio-223 um promissor agente para

tratamento sseo.

Contudo, uma grande parte dos radioistopos utilizados para radioterapia dirigida

necessitam de ser incorporados num composto qumico, o qual ser captado especifica

e seletivamente por um determinado tipo de recetor, transportador ou enzima na

clula alvo. Uma vez atingido o alvo, a radiao emitida pelo radioistopo presente no

radiofrmaco pode conduzir morte celular.

4.2 Principais Caractersticas dos Radioistopos

Para fins teraputicos, a seleo do radionucldeo adequado para uma aplicao

especfica tem em considerao uma vasta gama de fatores, que incluem as

caractersticas fsicas do radionucldeo, principalmente o tipo e a energia da radiao

emitida e a sua meia-vida. Para alm disso, importante considerar o local de

deposio da energia do radionucldeo, a localizao anatmica da rea a tratar, custos

e disponibilidade do radionucldeo. A estratgia dos radiofrmacos depositar a maior

quantidade de energia possvel num curto espao de tempo nas clulas malignas, em

particular no ADN das mesmas, poupando as clulas saudveis da radiao indesejvel.

Na prtica, radionucldeos com emisso de partculas -, bem como aqueles com

capacidade de captura eletrnica e emisso de eletres Auger, so os nicos que tem

vindo a ser usados amplamente na terapia paliativa de metstases sseas com

radiofrmacos. As partculas tm um poder de penetrao nos tecidos na ordem dos

milmetros at alguns centmetros, sendo apropriadas para a irradiao de pequenos

tumores at tumores de tamanho mdio. Alguns dos radionucldeos promissores que

emitem partculas -, terem valores de meia-vida adequados radioterapia de

metstases sseas, variando de algumas horas at dias. Para alm disso, estes

radionucldeos frequentemente decaem originando num nucldeo filho estvel. Por

ultimo, muitos destes radionucldeos so facilmente produzidos. Ver tabela 3.

Nucldeo Semi-vida fsica (dias)

Tipo de decaimento

Energia mdia (MeV)

Energia emisso

(MeV)

Penetrao no tecido

(mm) 90Y 2.67 - 2.28 0 2.7

188Re 17.0 - 2.12 0.155 (15%) 2.4 166Ho 26.8 - 1.85 0.81 (6.33%) 8.6

32P 14.3 - 1.71 0 8.0 89Sr 50.5 - 1.49 0 6.7

186Re 3.77 - 1.08 0.137 (9%) 4.7 153Sm 1.95 - 0.81 0.103 (29%) 3.4

131I 8.04 - 0.61 0.364 (81%) 0.8 67Cu 2.58 - 0.57 0.184 (48%) 0.05-2.1 177Lu 6.7 - 0.497 0.113 (6.4%) 0.04-1.8

170Tm 1.10 - 0.96 0.027 (2.83%) 117mSn 13.6 - 0.16 0.158 (87%) 0.3 223Ra 11.43 5.97 0.118 (1.97%) 0.1

125I 60.3 EC 0.4 (Auger e-) 3.98 (6.6%) 10 nm Tabela 3: Exemplos de radioistopos com potencial aplicabilidade em radioterapia e as suas caractersticas.

Legenda: EC - Captura eletrnica, - - emisso de partculas beta menos, emisso de partculas alfa (adaptado de Volkert (1999));

4.2.1 Fsforo-32

O Fsforo-32 (32P) decai por emisso - para Enxofre-32 no estado fundamental, com

um tempo de semi-vida de 14.28 dias e uma energia total de 1710.66 KeV. Este

radioistopo apresenta um poder de penetrao medio de 3mm nos tecidos e de

1.7mm no osso, atingindo um mximo de 8.5m. obtido atravs da irradiao do

Enxofre-32 com neutrinos de alta velocidade, apresentando assim um baixo custo de

produo, consultar tabela 4.

Emisso Energia Mdia (KeV) Intensidade (%) 0,0 695.5 100.0

Tabela 4: Tabela de decaimento do Fsforo-32

4.2.2 Estrncio-89

O Estrncio-89 (89Sr) decai principalmente por emisso - para trio-89 no estado

fundamental e uma pequena frao de 0.0096% decai para o trio-89 isomrico com

subsequente decaimento para trio-89 via raios de 909 KeV. O [89Sr] tem um valor de

semi-vida de 50.57 dias e uma energia de decaimento de 1495,1 KeV, com um poder

de penetrao de 2.4mm nos tecidos moles e um poder efetivo de 5 a 6mm. Este

radioistopo preparado a partir do Estrncio-82 num reator com alto fluxo de

neutres, consultar tabela 5.

Emisso Energia Mdia (KeV) Intensidade (%) 0,0 584.6 99.9903 0,1 189.1 0.0096 0,0 909.0 0.0095

Tabela 5: Tabela de decaimento do Estrncio-89

4.2.3 trio-90

O trio-90 (90Y) decai maioritariamente por emisso - para o estado fundamental do

Zircnio-90 e para um nvel excitado a 1760 KeV com uma probabilidade de 0.017%. O

[90Y] tem um valor de semi-vida de 2.668 dias e uma energia total de decaimento - de

2279.8 KeV. Com um poder de penetrao de 4mm no tecido sseo, fazem dele ideal

para aplicaes teraputicas, consultar tabela 6.

Emisso Energia Mdia (KeV) Intensidade (%) CE-K 768.7 0.003 0,1 163.7 0.017 0,0 926.7 99.98

Tabela 6: Tabela dos principais decaimentos do trio-90

4.2.4 Estanho-117m

O Estanho-117m (117mSn) decai por transformao isomrica com emisso de fotes

gama para o Estanho-117 estvel. Tendo um tempo de semi-vida 13,6 dias e uma

energia de fotes gama de 158,6 KeV e emite eletres de baixa energia, com

penetrao efetiva medida em micrmetros, consultar tabela 7.

Os eletres de baixa energia so emitidos atravs de converso eletrnica entre

camadas, com especial interesse os produzidos pela camada K e L.

Emisso Energia Mdia (KeV) Intensidade (%) Auger-L 3.0 91.0 Auger-K 21.0 10.8

CE-K1 126.8 64.8 CE-K2 129.4 11.7 CE-L1 151.9 26.1 CE-L2 154.1 1.5 CE-M1 155.1 5.6

Fotes Gama 158.6 86.4 Tabela 7: Tabela dos principais decaimentos do Estanho-117

4.2.5 Samrio-153

O Samrio-153 (153Sm) desintegra-se via 3 ramos principais e pelo menos mais 10

ramos fracos de emisses - para Eurpio-153. O [153Sm] tem um tempo de semi-vida

de 1.92849 dias e uma energia de 808,2 KeV.

A emisso - mdia do Samrio-153 de 0.233 MeV, com penetrao mdia no tecido

mole de 0.5mm e uma penetrao efetiva de 2 a 3 mm. O (153Sm) tambm liberta

radiao , 29% da sua energia total com um valor de 0.1 MeV, permitindo assim a

realizao de uma cintilografia do radionucldeo administrado. O Samrio-153

produzido num reator nuclear atravs do bombardeamento com neutrinos do

Samrio-152.

Este radioistopo tem uma a tabela de decaimentos extremamente complexa,

podendo decair por emisso de eletres Auger, captura eletrnica, emisso -, fotes

gama, de diversos nveis de energia, dos quais se destacam os presentes na tabela 8.

Emisso Energia Mdia (KeV) Intensidade (%) Auger-L 3.4 7.8 53.0 CE-K5,3 21.154 20.5 CE-K3,0 54.66 41.4

0,5 199.7 30.4 0,3 225.3 49.2 0,0 264.3 19.5 3,0 103.2 29.2

Tabela 8: Tabela dos principais decaimentos do Samrio-153

4.2.6 Hlmio-166

O Hlmio-166 (166Ho) decai por emisso - para nveis excitados do rbio-166, com um

valor de energia de decaimento total de 1854.5 KeV e um tempo de semi-vida de

26.795 dias. Apresenta um elevado poder de penetrao na ordem dos 8 mm. O

Hlmio tal como o Samrio decai com emisso de um largo espectro de partculas, os

principais decaimentos do Hlmio podem ser consultados na tabela 9.

Emisso Energia Mdia (KeV) Intensidade (%) Auger-L 3.9 7.6 28.0 CE-L1,0 70.82 72,2 20.5

0,1 651.1 50.5 0,0 693.8 48.2

Tabela 9: Tabela dos principais decaimentos do Hlmio-166

4.2.7 Tlio-170

O Tlio-170 (170Tm) desintegra-se tanto por decaimento -, para um nvel excitado

intermdio de 84.25 KeV (18.3%) com subsequente decaimento para o estado

fundamental do elemento Itrbio-170 (Yb-170), como por decaimento - diretamente

para o estado fundamental do elemento Yb-170 (81%). Para alm disso, o 170Tm pode

tambm decair por captura eletrnica para um nvel excitado intermdio de 78.6 KeV

(0.03%) com subsequente decaimento para o estado fundamental do rbio-170 (Er-

170) ou diretamente para o estado fundamental (0.12%) do Er-170.Com um tempo de

semi-vida de 127.8 dias e uma energia total de emisso - de 968 Kev e de captura

eletrnica de 314,4 KeV e emisso suficiente para imagiologia, ver tabela 10.

Emisso Energia Mdia (KeV) Intensidade (%) CE-L1,0 73.77 75.31 9.4

0,1 290.5 18.3 0,0 323.1 81.6

Tabela 10: Tabela dos principais decaimentos do Tlio-170

4.2.8 Lutcio-177

O Lutcio-177 (177Lu) desintegra-se por emisso - para o estado fundamental e trs

estados excitados do Hfnio-177 (Hf-177), com um valor de meia-vida de 6.647 dias e

energia de emisso de 498.3 KeV, tambm tem emisso suficiente para a produo

de imagem mdica, ver tabela 11.

Emisso Energia Mdia (KeV) Intensidade (%) Auger-L 4.3 11.2 8.75 CE-L1,0 101.67 6.84

0,3 47.66 11.64 0,1 111.7 9.1 0,0 149.4 79.3 3,1 208.36 10.38

Tabela 11: Tabela dos principais decaimentos do Lutcio-177

4.2.9 Rnio-186

O Rnio-186 (186Re) decai por emisso - principalmente para o estado fundamental e

excitado a 137 KeV do smio-186 e por captura eletrnica para o Tungstnio-186. O

(186Re) tem uma semi-vida de 3,7186 dias e uma energia de decaimento - de 1069.5

KeV e de captura eletrnica de 581,6 KeV [38]. Sendo um emissor com energia mdia

de 0.349 MeV e uma penetrao mdia nos tecidos moles de 1.1mm e um mximo de

4.5mm. Tambm emite uma pequena componente de radiao (9%, 0.137 MeV),

permitindo assim uma imagem da ps-administrao da biodistribuio, consultar

tabela 12.

Emisso Energia Mdia (KeV) Intensidade (%) Auger-L 4.7 12.9 6.43 CE-T1,0 63.3 137.11 12.15

0,1 306.7 21.5 0,0 359.6 70.9

Tabela 12: Tabela dos principais decaimentos do Rnio-186

4.2.10 Rnio-188

O Rnio-188 (188Re) decai por emisso - para diferentes estados do smio-188, dos

quais 71.1% decai diretamente para o estado fundamental. O (188Re) tem uma semi-

vida de 17,005 dias e uma energia de 2120,4 KeV [38]. Este radioistopo apresenta

uma penetrao mdia de 3 mm nos tecidos moles e mxima de 10 mm. O valor

elevado de energia de emisso tem potencial para provocar danos letais nas clulas

tumorais na regio de decaimento, ver tabela 13.

Emisso Energia Mxima (KeV) Intensidade (%) 0,0 2120.4 71.1% 0,1 1965.4 25.6%

Fotes Gama 155 15% Tabela 13: Tabela dos principais decaimentos do Rnio-188

4.2.11 Rdio-223

O Rdio-223 (223Ra) decai por emisso de partculas para nveis excitados do Rado-

219. O (223Ra) apresenta uma semi-vida de 11,43 dias e uma energia de emisso de

5978,99 KeV. Apresenta um poder de penetrao inferior a 0.1mm nos tecidos, e

fotes gama que possibilitam a realizao de imagem mdica. Os principais

decaimentos do Rdio-223 podem ser consultados na tabela 14.

Emisso Energia Mdia (KeV) Intensidade (%) 0,6 5539.43 10.6 0,5 5606.95 25.8 0,4 5715.81 45.6 0,3 5747.14 10.0

Auger-L 5.66 17.95 30.1 CE-T4,2 51.5 54.9 15.42 CE-K4,1 55.81 18.0 CE-T4,1 55.811 154.165 22.4 CE-T5,0 171.066 269.420 11.23

Tabela 14: Tabela dos principais decaimentos do Radio-223

4.3 Sumrio

Neste quarto captulo foram explicados os conceitos bsicos associados ao uso de

radioistopos na rea teraputica, sendo de salientar as caractersticas fsicas de cada

candidato.

Sabendo que um radioistopo emissor de partculas , partculas ou eletres Auger

apresentam elevado potencial teraputico, quando a ele esta associado um perodo de

semi-vida fsica adequado e um nucldeo-filho estvel, com possibilidade de ser

captado pelo tecido sseo de uma forma direta ou atravs da ligao a outro agente

qumico.

Captulo 5

Simuladores em Radiobiologia

5.1 Introduo

Um passo essencial sobre a eficincia da terapia com radioistopos a anlise dos

efeitos provocados por este no material biolgico em estudo. Uma forma muito

apetecvel de realizar estudos e ensaios na rea atravs do recurso a simuladores,

onde se utilizam cdigo Monte Carlo para descrever o transporte e interaco de

energia com um meio descrito por diversos parmetros extrapolados de ensaios in

vitro e in vivo.

A principal vantagem da utilizao destes simuladores a sua versatilidade e a

capacidade de em intervalos reduzidos de tempo, obter informao, que de outro

qualquer modo demoraria largos meses ou mesmo anos.

Para o desenvolvimento destes ensaios foram escolhidos os seguintes simuladores

Monte Carlo Damage Simutaion, que simula as leses provocadas pela radiao, o

Monte Carlo Excision Repair, que simula os mecanismos de reparao e por ltimo o

Virtual Cell, que simula todo o processo de interaco entre a radiao e o tecido alvo.

5.2 Simuladores

Os simuladores computacionais de radiobiologia celular so desde h algum tempo

uma fonte til de informao sobre o potencial efeito teraputico de diferentes

agentes irradiantes, entre eles, os radiofrmacos utilizados em metstases sseas,

sendo de crucial importncia no campo da radioterapia molecular e projeo de

tratamentos.

Um dos primeiros simuladores dos efeitos da radiao desenvolvido foi o simulador

Monte Carlo. Segundo a histria, decorria o ano de 1945 quando apareceu um modelo

matemtico notvel e que ainda hoje amplamente aplicado em diversas reas da

cincia.

O mtodo Monte Carlo um conjunto de tcnicas estocsticas baseadas em nmeros

aleatrios e probabilidades estatsticas para investigar problemas cientficos, ode o seu

uso possibilita analisar sistemas complexos, como o caso da radiobiologia celular, que

de outro modo no seriam possveis de estudar, pois descrever a interao de um par

de tomos relativamente elementar, contudo, resolver as mesmas equaes para

centenas ou milhares de tomos impensvel. Com o mtodo Monte Carlo um

sistema complexo pode ser amostrado em nmeros de configuraes aleatrias e a

informao recolhida pode ser utilizada para descrever o sistema como um todo,

(Woller 1996).

Como j foi referido, atualmente os mtodos Monte Carlos aplicados nos simuladores

dos efeitos da radiao possibilitam o planeamento, o estudo das interaes entre a

radiao e a matria, entre outros.

Porm, algumas desvantagens tm sido apontadas a este simulador, entre as quais a

sua exigncia computacional. Assim, comparativamente ao algoritmo Monte Carlo,

computacionalmente mais complexo e detalhado, o algoritmo de Monte Carlo rpido

(MCDS) utilizado como ferramenta base para esta Dissertao, apresenta uma boa

correlao para a maioria dos espectros de danos radioinduzidos do ADN, o que sugere

que a distribuio espacial de danos elementares do ADN determinada

primariamente por eventos independentes estocsticos.

A sua rapidez face ao Monte Carlo, em termos de processamento de informao,

possibilita a simulao de um cenrio de 100000 clulas a 1 Gy de radiao em 1.5

minutos num Intel Pentium III Xeon a 2.4 GHz, necessitando de uma memoria de 1.3

megabytes, (Semenenko e Stewart 2004).

Contrariamente a este simulador MCDS, o algoritmo CELLDOSE Monte Carlo para

avaliar os efeitos da radiao em esferas de agua isoladas, necessita de algumas horas

num Pentium 4-EM64T a 3 GHz com 1 Gb de memoria RAM, (Champion 2008).

Em contraste o simulador de radiobiologia a usar (VC Virtual Cell) fornece

informaes sobre sobrevida celular, probabilidade de controlo tumoral, induo a

mutagnese entre outros em apenas alguns minutos.

Existem outros cdigos baseados em cdigo Monte Carlo para o estudo dos efeitos da

radiao no ADN, como o GEANT4-DNA, PENELOPE (PENetration and Energy LOss os

Positrons and Electrons), consultar tabela X.

5.3 Vantagens e Desvantagens

Uma das principais vantagens destes simuladores a sua versatilidade e a capacidade

de em intervalos de tempo reduzidos, por vezes de poucos minutos, obter informao,

de que qualquer outro modo demoraria longos perodos de tempo e exigiriam grande

disponibilidade de recursos e capacidades. Por exemplo, as culturas de clulas, de

grande utilidade, possibilitam o conhecimento do comportamento e funo de uma

populao isolada de clulas, bem como, o estudo de fenmenos impossveis de

produzir em tecidos intatos, possuem vrias caractersticas desvantajosas e limitantes,

entre as quais se realam: gastos elevados em material; dependncia das condies de

crescimento da cultura; instabilidade da cultura celular e perda de caractersticas de

fentipo; entre outras.

Em relao s culturas de clulas, os simuladores computacionais possuem algumas

vantagens; nomeadamente, o facto de permitirem obter informao de uma forma

mais rpida e flexvel, possibilitando assim a cobertura de mltiplos parmetros do

cenrio de irradiao em causa num curto ciclo de tempo; no existem as limitaes

impostas pela cintica das culturas, isto , instabilidade, risco de contaminao que

inviabiliza a utilizao dos resultados e fora os investigadores a repetir todo o

processo; e o custo associado a simulao do processo largamente inferior, existindo

mesmo simuladores para investigao na rea de domnio publico.

Por outro lado, os simuladores tambm possuem desvantagens, tais como avaliaes

estimadas em resultados experimentais prvios e conhecimentos atuais o por

interpolao destes dados, que pode no ser efetivamente verdadeiro no organismo

vivo; e a modelizao da cintica celular de forma mecanista, que pode subvalorizar ou

sobrevalorizar certos parmetros e resultados, por ltimo os simuladores so limitados

a uma gama de entradas de cada parmetro que nem sempre cobre todos os valores

necessrios para os diversos estudos bem como a exigncia computacional de alguns

simuladores mais detalhados.

5.4 Monte Carlo Damage Simulation MCDS

Como referido nos modelos de trilhos estruturais, radiaes de baixa LET conduzem

formao de aproximadamente 1000 quebras simples (SSB) e 40 quebras duplas (DSB)

por gray (GY) numa clula de mamfero tpica. O nvel de danos provocados e bases

estimado em 2500 para 25000/Gy/clula e, para alm dos danos isolados, a radiao

ionizante tem a capacidade de produzir tambm mltiplos locais de danos (Multiply

Damage Sites - MDS), que consistem em dois ou mais danos elementares num curto

espao de hlices enroladas em torno do ADN. As quebras isoladas ou mltiplas em

cada cadeia de ADN so detetadas como SSB na maioria dos ensaios. Por outro lado,

DSB so formadas quando pelo menos duas quebras do ADN se formam em

proximidade nas cadeias opostas do ADN. As DSB e outras classes de MDS so,

geralmente, as causas primrias de induo de apoptose por radiao ou mutagnese.

Informao detalhada sobre o espectro de possveis configuraes de danos induzidos

pela radiao ionizante frequentemente obtida pelo uso de simuladores de trilos

estruturais Monte Carlo em combinao com modelos geomtricos do ADN e da

Cromatina.

O simulador de danos Monte Carlo (MCDS), um mtodo simplitas e rpido para a

produo do espectro de danos no ADN que apresenta apenas quatro parmetros

ajustveis, dois dos quais podem ser restringidos a um intervalo de valores razoveis

com base em resultados experimentais, (Semenenko e Stewart 2004).

Sendo estes parmetros: nmero de quebras/Gy/clula (Sb), nmero de danos a bases

do ADN/Gy/clula (Bd), comprimento do segmento de ADN medido em pares de bases

(bp)/Gy/clula (nseg) e comprimento mnimo de ADN no danificado entre danos

elementares entre segmentos vizinhos medido em pares de bases (Nmin). O algoritmo

do simulador processa-se em duas fases: 1) distribuio aleatria no segmento de ADN

(parmetro nseg) do nmero esperado de danos elementares produzidos numa clula

por uma determinada quantidade e qualidade de radiao e 2) subdiviso da

distribuio de danos elementares no segmento em leses, sendo aqui determinante o

parmetro Nmin, consultar figura 8.

Ilustrao 8: Representao esquemtica do simulador MCDS

O algoritmo do simulador MCDS pode ser descrito pelos seguintes passos:

A primeira fase, distribuio aleatria dos danos do ADN composta por 5 passos:

1. Computao dos parmetros para uma especfica dose absorvida D (Gy). O

comprimento do segmento por clula dado por:

= ;

J o nmero total de quebras por clula dado por:

= ;

Sendo g um fator de escala adimensional que pode ser utilizado para ajustar o

rendimento absoluto das leses de ADN para melhor mimetizar as

observaes experimentais para cada tipo de clula. Quando o tipo de clula

desconhecido, o valor de g deve ser unitrio. Este valor para clulas

eucariticas pode ser aproximado a razo entre o contedo de ADN da clula

em estudo com o contedo da clula de mamferos (6x109 bp).

O nmero de danos de base/clula pode ser calculado atravs do nmero de

quebras por clula pela equao:

= .

Nmero de quebras/Gy/clula (Sb)

Nmero de danos debases/Gy/clula (Bd)

Comprimento do segmento de ADN (nseg)

Comprimento mnimo do segmento no danificado (Nmin)

Parmetros Inicias

Distribuio aleatoria dos danos no ADN

1 Fase

Subdiviso dos danos em leses

2 Fase

2. Seleo aleatria de um par de nucletidos a partir do segmento de ADN, ou

seja, seleo de um integral distribudo de forma uniforme no intervalo [1,

Nseg].

3. Seleo aleatria da cadeia de ADN (cadeia 1 ou 2). Caso o nucletido

selecionado no seja danificado, procede-se ao registo da quebra na

localizao, caso contrrio retorna-se ao passo 2.

4. Criao de um relgio

= 1;

> 0 , 2.

5. Repetio dos passos 2 a 5 para os danos nas bases.

Na segunda fase do algoritmo, subdiviso dos danos em leses, Nmin o parmero que

determina a forma de agrupamento dos danos elementares em leses, segundo a

propriedade de que danos separados por pelo menos Nmin pares de bases so tratados

como leses diferentes, consultar figura 9.

Ilustrao 9: Representao esquemtica do processo de agrupamento de danos em leses (Semenenko e

Stewart 2004)

O algoritmo da segunda fase descrito nos seguintes quatro passos:

1. Iniciar a contagem no fim o segmento de ADN e localizar o primeiro dano

elementar em cada uma das cadeias de ADN o em ambas. Iniciar a leso do

ADN aquando da localizao do dano elementar ou dos diversos danos

elementares.

2. Comeando no par de base apos o ultimo dano elementar identificado,

proceder movimentao ao longo do segmento de ADN, na mesma direo e

contar o nmero de pares de bases no danificadas antes do prximo dano

elementar detetado. Caso o fim do segmento seja atingido antes de se

encontrar outro dano elementar, considerar a leso do ADN na localizao do

ltimo dano detetado e finalizar o processo.

3. Caso o nmero de pares de base no danificadas for Nmin registar o fim da

poo da leso na ltima localizao de dano elementar detetado. De seguida

registar a posio de incio da prxima leso na localizao do ultimo dano

elementar desta.

4. Retornar o passo 2.

Uma vez concludo o processo de agrupamento dos danos elementares do ADN em

leses, estas podem ser analisadas em termos de natureza de distribuio espacial dos

danos elementares que as formam, (Semenenko e Stewart 2004).

O estudo realizado por Semenko e Stewart em 2004 onde comparam o desempenho

deste simulador com outros aceites pela comunidade cientifica mostram resultados

muito semelhantes em todas as gamas de radiaes utilizadas, tornando este

simulador muito til devido a sua simplicidade e rapidez a juntar a sua eficincia nos

resultados, consultar imagem 10.

Ilustrao 10: Comparao do espectro de danos obtido com o mtodo de Monte Carlo rpido e detalhado

(Semenenko e Stewart 2004)

5.4.1 Informao de Entrada e Sada

O simulador MCDS consiste num algoritmo simplificado do cdigo Monte Carlo re-

parametrizado de forma a fornecer informao (outputs) sobre o rendimento das

leses no ADN (DSB, SSB e locais de mltiplos danos de bases) aps simulao com

eletres, protes e partculas alfa de diferentes radioistopos. Os ficheiros de sada

fornecem informao sobre as caractersticas de vrias classes de danos do ADN,

incluindo o nmero mdio de leses por conjunto de danos do ADN e comprimento

medio do conjunto de danos em pares de bases (bp).

Para a realizao da simulao basta introduzir na linha de comando: MCDS {nome do

ficheiro de input}.inp. Esta linha inicia de imediato o simulador e cria o ficheiro de

output, que semelhana do ficheiro de input um ficheiro de texto em formato

ASCII.

O ficheiro de input do simulador inclui os seguintes parmetros:

SEED: gerador aleatrio de nmeros, integral entre 1 e 2147483646.

Quando um valor negativo ou nulo atribudo neste parmetro, a

semente ser determinada pelo sistema relgio.

NUMBER OF CELLS: Todos os resultados produzidos pelo simulador sero

reportados como valores mdios e desvio padro, pelo que, este

parmetro especifica o nmero de ensaios corridos pelo simulador para o

clculo dos valores.

PARTICLE: Smbolo de partculas radioativas carregadas, exemplo, e para

eletres, 1H para protes e 4H para partculas alfa.

PARTICLE ENERGY: Energia da partcula expressa em MeV. O valor mnimo

para a simulao de 0.00008 MeV para eletres, 0.105 MeV para

protes e 2 MeV para partculas alfa.

FRACTION BL/BD: Este parmetro especifica a frao de locais de perda

de pares de bases no nmero total de bases danificadas. Na ausncia

desta informao, o valor por defeito 0.

DMSO SIMULATION PARAMETERS: O simulador tem como modelo

extraordinrio a simulao na presena de molculas endgenas

capturadoras de radicais livres (scaenger), pela especificao da

quantidade de DMSO. Para simular um ambiente celular normal, este

parmetro deve tomar o valor 0, fazendo com que os outros dois valores

deste parmetro no apresentem impacto sobre os resultados da

simulao.

Por seu lado, o ficheiro de output fornece informaes sobre:

Tempo de execuo: Tempo necessrio para terminar a simulao em

minutos.

Resumo da informao de input:

o Tipo de radiao, energia cintica da radiao em estudo versus

energia cintica mnima para simulao, energia da massa da

partcula em repouso em MeV e velocidade da partcula em estudo

em relao velocidade da luz;

o Parmetros de informao de danos e conjuntos de danos usados

pelo simulador MCDS, inclui: nseg (este parmetro aumenta com o

aumento da energia das partculas), St, Bd, f, Nmin (geralmente

atribui-se o valor 9, sendo o mximo de distancia entre duas

quebras para que sejam consideradas quebras duplas (DSB) de 10

pares de bases).

o Cpia dos dados de input para simulao com DMSO.

Resultados da simulao:

o Rendimento de danos agrupados de acordo com o esquema de

classificao de Nikjoo e colaboradores (ver seco 3.4.1), expresso

em percentagem, (Nikjoo 1997 e 2001).

o Rendimento das diferentes classes de danos (DSB, SSB e mltiplos

locais de danos de bases) por Gy por clula.

o Composio do conjunto de leses, isto , percentagem de quebras

das hlices do ADN ou danos a bases.

o Comprimento da leso em bp para diferentes classes de danos.

o Nmero de leses por comprimento de leses.

5.5 Monte Carlo Excision Repair MCER

Grupos de vrios nucldeos danificados numa ou em ambas as hlices de ADN,

frequentemente denominadas danos mltiplos (clustered damage) so caractersticos

da radiao ionizante. Por outro lado, os processos endgenos produzem leses

isoladas, retirando as clulas com processos de reparao de ADN deficientes, nas

quias danos mltiplos podem ser observados. Os danos mltiplos so potencialmente

mais difceis de reparar, pois as enzimas de reparao podem nem sempre possuir o

molde correto para a reparao dos nucldeos danificados (ver seco 3.5).

O modelo de reparao por exciso Monte Carlo, MCER, simula os passos essenciais no

processo de reparao por exciso de todas as classes de leses simples e mltiplas

que no DSB. O diagrama da figura 11 representa de forma esquemtica o modo de

funcionamento do modelo MCER.

Ilustrao 11: Representao esquemtica d modo de funcionamento do modelo MCER (Tavares 2007). (NS=

nmero de danos simples ou mltiplos no segmento; NL= nmero de leses; NM= nmero de mutaes (substituies de bases) durante o processo de reparao; DSBR= DSB radioinduzidas).

Os doze passos essenciais do modelo MCER incluem, (Semenenko 2005):

I. Criao de um segmento danificado: realizado pelo simulador MCDS.

II. Seleo do dano mltiplo: por forma a selecionar o dano mltiplo para

reparao, o simulador MCER percorre todo o segmento de ADN at encontrar

um dano simples ou mltiplo usando a metodologia descrita no simulador

MCDS.

III. DSB radioinduzidas: estas DSB, ao contrrio das DSB enzimticas, que so

formadas durante os processos de reparao do ADN, so induzidas

diretamente pela radiao. A contagem destas DSB segue o mesmo processo

do algoritmo MCDS, contudo, quando um dano mltiplo destetado no

classificado como DSB o processo de reparao por exciso iniciado.

IV. Seleo da leso de entre as leses mltiplas: o processo de reparao por

exciso inicia-se pela seleo da leso alvo para remoo. O processo de

seleo decorre em duas etapas, 1) um das cadeias de ADN selecionada e 2)

uma leso selecionada dentro da cadeia em estudo. A seleo da cadeia de

ADN ditada pela probabilidade P1, sendo que, P1=0.5 ambas as cadeias tm a

mesma probabilidade de serem selecionadas e quando este valor se aproxima

do 0 ou 1, todas as leses na cadeia selecionada so preferencialmente

removidas antes das leses na cadeia oposta serem reparadas. Esta escola

preferencial relaciona-se com informaes obtidas em estudos prvios. A

seleo da leso dentro da cadeia, quando leses mltiplas esto e estudo

feita de forma aleatria.

V. Seleo do processo de reparao: uma vez selecionado o nucletido para

remoo, a via responsvel pela remoo da leso e determinada. A

contribuio relativa de cada via de reparao para o processo global de

remoo de danos determinada por 3 probabilidades: PSP, PLP, PNER, cuja soma

1.

VI. Seleo do tipo de substituio: a substituio SP-BER caracterizada pela

substituio de um nico nucletido danificado. Para o tipo LP-BER e NER, os

quais envolvem a remoo de mais do que um nucletido, a simulao da

exciso d