Avaliação e Caraterização por Métodos Computacionais de...

Francisco Diogo Carvalho Guerra Liberal

Avaliação e Caraterização por

Métodos Computacionais de

Diferentes Radioisótopos no

Contexto da Terapia Paliativa de

Metástases Ósseas

Julho 2013

Avaliação e Caracterização por Métodos

Computacionais de Diferentes Radioisótopos no

Contexto da Terapia Paliativa de Metástases

Monografia do Curso de Mestrado em Engenharia Biomédica da

Universidade do Porto

Francisco Diogo Carvalho Guerra Liberal

Licenciado em Engenharia Biomédica pela Universidade

de Trás-os-Montes e Alto Douro (2013)

Orientador:

João Manuel R. S. Tavares

Professor Associado do Departamento de Engenharia

Mecânica da Faculdade de Engenharia da

Universidade do Porto

Coorientador:

Adriana Alexandre S. Tavares

Investigadora da Molecular Neurolmaging (MNI), LLC New

Haven, Connecticut, USA

Agradecimentos

Ao Professor João Manuel R. S. Tavares pela orientação e disponibilidade fornecidos ao

longo deste trabalho, fundamentais para a correta elaboração do mesmo.

A Dr.ª. Adriana Alexandre S. Tavares pelo apoio prestado a este trabalho, bem como,

pelo auxílio e ajuda fornecida para a realização do mesmo.

E a todos aqueles de que forma direta e indireta contribuíram de forma positiva para o

desenvolvimento deste trabalho.

Sumário

O objectivo principal do presente trabalho (Avaliação e Caraterização por Métodos

Computacionais de Diferentes Radioisótopos no Contexto da Terapia Paliativa de

Metástases Ósseas) é determinar o eventual impacto de alguns radiofármacos

utilizados atualmente em terapias paliativas ou em testes clínicos, através do recurso a

métodos computacionais de forma a realizar uma análise comparativa entre os

diferentes radioisótopos disponíveis.

Sabe-se que um agente ideal para radioterapia tumoral dirigida deve apresentar, entre

outras características, semi-vida física entre 30 minutos e 10 dias, nuclídeos filhos

estáveis (semi-vida superior a 60 dias) e química adequada a captação pelo tecido

ósseo.

A radioterapia interna com utilização de radioisótopos tem sido amplamente utilizada

para terapia paliativa das metástases ósseas, encontrando-se múltiplos radioisótopos

em utilização como, Samário-153, o Estrôncio-89, o Rénio-186 e 188, o Fósforo-32, o

Tecténio-99m, o Hólmio-166, o Estanho-117m, o Lutécio-177, o Samário-153 e o

Rádio-223.

Para a realização da Dissertação final de Mestrado é necessário proceder a uma

recolha e pesquisa bibliográfica de estudos científicos desenvolvidos nesta área de

interesse, bem como, da informação sobre algumas técnicas a utilizar para a execução

prática do trabalho envolvido, dais quais se destaca os simuladores radiobiológicos

desenvolvidos pelo Prof. Robert Stewart da Universidade de Washington, sendo eles,

Monte Carlo Damage Simulaton (MCDS), Monte Carlo Excision Repair (MCER) e o

Virtual Cell (VC), que em conjunto realizam uma simulação detalhada dos efeitos

biológicos da radiação a nível celular e molecular.

Uma vez finalizada essa pesquisa, realiza-se a definição do projeto a desenvolver,

nomeadamente pela abordagem ao protocolo a utilizar, os dados mais importantes

para a realização das simulações. Serve o presente documento como planificação dos

Trabalhos Práticos a realizar no âmbito desta Dissertação

Índice

1.1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 14

1.2. PRINCIPAIS OBJETIVOS ........................................................................................................... 15

1.3. ESTRUTURA ORGANIZATIVA .................................................................................................. 16

1.4. CONTRIBUIÇÕES PRINCIPAIS .................................................................................................. 17

2.1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 21

2.2. PRINCÍPIOS DO CICLO CELULAR .............................................................................................. 22

2.3. CINÉTICA CELULAR ................................................................................................................. 24

2.4. APOPTOSE E NECROSE ........................................................................................................... 26

2.5. SUMÁRIO ............................................................................................................................... 28

3.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 32

3.2 EFEITOS CELULARES DA RADIAÇÃO ............................................................................................. 33

3.3 EFEITOS DIRETOS E INDIRETOS DA RADIAÇÃO ............................................................................ 34

3.4 TIPO DE DANOS E DESTINO DAS CÉLULAS RADIOINDUZIDOS ...................................................... 36

3.4.1. MÉTODO DE CLASSIFICAÇÃO DAS LESÕES AO ADN .................................................................................. 37

3.5 MECANISMOS DE REPARAÇÃO DO ADN ..................................................................................... 38

3.6 CURVAS DE SOBREVIDA .............................................................................................................. 41

3.7 SUMÁRIO .................................................................................................................................... 43

4.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 47

4.2 PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS DOS RADIOISÓTOPOS ................................................................. 48

4.2.1 FÓSFORO-32 ................................................................................................................................... 49

4.2.2 ESTRÔNCIO-89 ................................................................................................................................. 49

4.2.3 ÍTRIO-90 ......................................................................................................................................... 50

4.2.4 ESTANHO-117M ............................................................................................................................... 50

4.2.5 SAMÁRIO-153 ................................................................................................................................. 51

4.2.6 HÓLMIO-166 ................................................................................................................................... 52

4.2.7 TÚLIO-170 ...................................................................................................................................... 52

4.2.8 LUTÉCIO-177 ................................................................................................................................... 53

4.2.9 RÉNIO-186 ...................................................................................................................................... 53

4.2.10 RÉNIO-188 ............................................................................................................................ 54

4.2.11 RÁDIO-223 ............................................................................................................................ 54

4.3 SUMÁRIO .................................................................................................................................... 55

5.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 59

5.2 SIMULADORES ............................................................................................................................ 59

5.3 VANTAGENS E DESVANTAGENS .................................................................................................. 61

5.4 MONTE CARLO DAMAGE SIMULATION – MCDS .......................................................................... 62

5.4.1 INFORMAÇÃO DE ENTRADA E SAÍDA ...................................................................................................... 66

5.5 MONTE CARLO EXCISION REPAIR – MCER ................................................................................... 68


5.6 VIRTUAL CELL - VC....................................................................................................................... 73


5.7 SUMÁRIO .................................................................................................................................... 79

6.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 84

6.2 PROCEDIMENTOS ....................................................................................................................... 84

6.3 SUMÁRIO .................................................................................................................................... 93

7.1 CONCLUSÕES FINAIS ................................................................................................................... 97

7.2 PERSPETIVAS FUTURAS ............................................................................................................... 98

Capítulo 1

Introdução ao Trabalho e Estrutura

da Monografia

1.1. Introdução

As metástases ósseas são uma das mais importantes complicações associada ao

desenvolvimento e proliferação de células malignas. Estas são também um dos

maiores problemas que um doente com cancro pode experienciar, sendo que cerca de

80-100% dos doentes que morrem de cancro da próstata, mama e pulmão possuem

metástases ósseas. De entre esses doentes, mais de 75% experienciam significativas

dores ósseas e 50 % dos mesmos reportam analgia inadequada [13].

O alívio dos sintomas induzidos pelas metástases ósseas pode ser conseguido por via

de um tratamento de corpo inteiro ou meio corpo com feixes de radiação externo de 8

Gy, com uma taxa de sucesso a rondar os 80%. Contudo com o uso desta modalidade

de irradiação corporal externa, todos os tecidos do corpo estão expostos a elevados

níveis de radiação de forma semelhante, o que pode causar efeitos secundários

consideráveis, em particular para os tecidos saudáveis que se encontram à volta do

tecido tumoral maligno [8].

A terapia com radiofármacos é menos invasiva, tipicamente melhor tolerada e produz

resultados no alívio da dor óssea, com a vantagem de limitar a exposição da radiação

aos tecidos alvos [15]. Contudo, estudos são necessários para investigar,

nomeadamente, quais as melhores vias de administração, dose, frequência de

administração e radioisótopos que resultarão numa melhor captação do radiofármaco

por parte do tecido alvo [8, 13].

Atualmente vários estudos têm vindo a apresentar dados favoráveis ao tratamento

paliativo de metástases ósseas quando este é aplicado em estados menos avançados

da doença oncológica e muitos radiofármacos novos têm sido apontados como tendo

elevado potencial terapêutico [13]. Outros estudos têm demonstrado que os

radioisótopos que decaem por emissão de partículas β- e por captura eletrónica são os

que apresentam maior potencial terapêutico, bem como, alguns radioisótopos com

decaimento α, como o caso do rádio-223, onde a sua elevada energia é depositada

num volume muito reduzido [10, 17].

Irradiação de células tumorais com recurso a partículas radioativas como as acima

mencionadas, por via de uso de radiofármacos, pode induzir lesões na estrutura do

ADN da célula alvo, as quais podem subsequentemente levar à morte da mesma por

um processo de morte celular programada designado de apoptose [13]. Tal resultaria

numa destruição seletiva de células tumorais por um processo de morte celular

controlado. Uma variedade de fatores contribui para a eficiência dos radiofármacos,

dado que os efeitos da radiação nas células é um processo complexo e vários esforços

têm vindo a ser realizados para melhor compreender todo este processo através de

estudos in vitro e in vivo, bem como avanços científicos na área da radiobiologia. Para

além disso, nos últimos anos têm vindo a ser desenvolvidos, com sucesso, vários

simuladores computacionais que têm vindo a acelerar a obtenção de resultados in

silico e melhorar o conhecimento científico atual na área de radiobiologia celular,

nomeadamente na área de efeitos da radiação ionizante em células.

1.2. Principais Objetivos

Estudos e publicações recentes documentam o interesse da terapia com recurso a

radiação, com múltiplas aplicações na área oncológica, constituindo assim um tema

em voga nos dias de hoje. Neste sentido, os estudos radiobiológicos, como os que se

pretendem realizar, são absolutamente pertinentes e necessários para de uma forma

simples e barata melhor caraterizar a natureza dos efeitos produzidos pelos diferentes

radioisótopos em diferentes cenários de oncologia, bem como o seu potencial como

agente terapêutico.

Assim, uma vez concluída esta Dissertação com o tema “Avaliação e Caraterização por

Métodos Computacionais de Diferentes Radioisótopos no Contexto da Terapia

Paliativa de Metástases Ósseas”, espera-se contribuir para um maior conhecimento

cientifico sobre:

• O eventual potencial terapêutico de cada radioisótopo estudado,

nomeadamente através da análise dos efeitos radiobiológicos produzidos

pelas principais emissões de cada radioisótopo;

• A avaliação dos efeitos radiobiológicos das principais emissões de cada

radioisótopo em vários cenários de simulação.

Por seu lado, após a conclusão dos Trabalhos Práticos, espera-se conseguir abordar de

forma correta e global o plano de trabalhos a desenvolver, no que toca ao uso dos

diferentes simuladores e parâmetros de simulação para os diferentes cenários, pela

recolha de informação cientifica que funciona como explicação introdutória de alguns

dos métodos utilizados, seguida de uma breve explicação dos procedimentos a

desenvolver para realizar a Dissertação.

1.3. Estrutura Organizativa

Pretende-se organizar o presente documento de uma forma autónoma e

independente para facilitar o acesso as diversas áreas estruturas em 7 capítulos.

Assim, descreve-se sumariamente de seguida o que será abordado em cada capítulo:

• Capítulo 2. Biologia Celular

Neste capítulo realiza-se uma descrição global, dos principais conceitos do ciclo

celular, com acessória relação deste com a morte celular programada, isto é, apoptose.

Este capítulo reveste-se de capital importância pois para o desenvolvimento desta

Dissertação é fundamental o conhecimento da cinética celular, em particular, as suas

relações com o processo apoptótico.

• Capítulo 3. Radiobiologia Celular

Neste terceiro capítulo são explicados os conceitos básicos associados ao uso de

radiação em células e os efeitos que esta provoca nas mesmas, esclarecendo-se

conceitos como curvas de sobrevida, e principais mecanismos de reparação celular.

• Capítulo 4. Radioisótopos para Terapia Paliativa

Neste quarto capítulo são enumeradas as principais características de cada

radioisótopo com potencial terapêutico, bem como as características das suas

principais emissões radioativas.

• Capítulo 5. Simuladores em Radiobiologia

Neste quinto capítulo são enumerados e descritos os simuladores que se prevê utilizar

para a realização da Dissertação, bem como todos os parâmetros necessários para o

controlo de cada cenário. Realizando também de uma forma sucinta uma comparação

da utilização dos simuladores em relação a uma cultura celular.

• Capítulo 6. Introdução a Simulação

Neste penúltimo capítulo são expostas algumas simulações simples utilizadas para

melhor compreender o funcionamento dos simuladores anteriormente descritos,

explicando-se também como se pretende realizar os futuros cenários de irradiação.

• Capitulo 7. Conclusões Finais e Perspetivas Futuras

Neste último capítulo são apresentas algumas conclusões finais sobre o trabalho

desenvolvido, indicando igualmente quais as perspetivas futuras da continuação do

desenvolvimento deste trabalho para posterior apresentação como Dissertação.

1.4. Contribuições Principais

Como principais contribuições dos Trabalhos Práticos, enquanto trabalho guia para a

execução prática dos procedimentos para o desenvolvimento correto desta

Dissertação, salientam-se o estudo dos diferentes simuladores, processo apoptótico e

ciclo celular, a revisão bibliográfica, bem como, a descrição algo detalhada dos

radioisótopos e funcionamento dos simuladores que se pretendem utilizar durante um

projeto desta natureza.

No que diz respeito à Dissertação espera-se que esta contribua para melhorar o

conhecimento científico neste tema em particular, pois é um campo de intensa

pesquiza e interesse crescente.

Capítulo 2

Biologia Celular

2.1. Introdução

De um modo geral, as células crescem, aumentam o seu conteúdo e por fim dividem-

se. Cada célula origina duas células-filhas que, se tudo ocorrer dentro da normalidade,

serão geneticamente idênticas á célula-mãe. Por sua vez, estas células-filhas podem

tornar-se células-mães da geração seguinte. Assim, a vida de uma célula começa

quando esta surge a partir da célula-mãe e acaba, quando ela própria se divide para

originar duas células-filhas.

O conjunto de transformações e processos que decorrem desde a formação da célula

até ao momento em que ela própria se divide constitui um processo dinâmico e

continuo, denominado ciclo celular.

Durante a divisão celular, os organelos, enzimas e outros constituintes da célula são

distribuídos pelas células-filhas. O ADN é exatamente auto-duplicado e as copias

rigorosamente divididas. É esta fidelidade na duplicação e na distribuição do material

genético pelas células-filhas que assegura a continuidade genética.

Todo o procedimento do ciclo celular e controlado por diversas proteínas e enzimas

que além de garantirem a ausência de erros, transmitem a cinética do ciclo, isto é, a

duração de cada fase especifica do processo e o tempo total necessário para que todo

o processo ocorra. Uma pequena mutação numa proteína ou enzima de controlo, pode

ter consequências dramáticas na cinética celular, como no caso das células

carcinogénicas, em geral o período do ciclo celular é muito inferior as celular normais.

Um destino final das células, muito característico e importante do ponto de vista

terapêutico é a morte celular por apoptose, isto é, morte celular programada que tem

um efeito mínimo ou mesmo ausente sobre as células vizinhas.

A apoptose é um mecanismo de segurança presente nas células que é desencadeado

sempre que as células são danificadas de forma irreversível, garantindo assim mais

uma vez a continuidade genética.

Mais uma vez, o processo apoptótico é controlado por um vasto número de enzimas e

proteínas específicas, que iniciam todo o processo assim que algum recetor é ativado.

2.2. Princípios do Ciclo Celular

As células crescem e dividem-se de acordo com o seu ciclo celular. Este ciclo é o

processo através do qual uma célula somática duplica o seu material genético e o

reparte igualmente às suas células-filhas, e é dividido em interfase e fase mitótica. A

interfase corresponde ao período entre o fim de uma divisão celular e o início da

divisão seguinte, enquanto, a fase mitótica enquadra o período durante o qual ocorre

a divisão celular propriamente dita.

São conhecidas aproximadamente 50 proteínas que atuam como fatores de

crescimento. As células que possuem o recetor específico para um determinado fator

de crescimento serão iniciadas no ciclo, enquanto as que não expressarem esse

recetor permanecerão inativas.

A interfase, que antecede a fase mitótica divide-se em três subfases: G1, S e G2. O

intervalo G1, ou pós-mitótico, inicia-se quando a célula é estimulada a multiplicar. Este

intervalo corresponde ao período entre o fim da mitose e o início da síntese de ADN

(fase S), e caracteriza-se por um amento do volume celular e intensa síntese de

proteínas e enzimas. Na fase S, ocorre a autorreplicação de cada uma das moléculas de

ADN, a fim de que cada cromossoma seja formado por dois cromatídeos ligados por

um centrómero. O intervalo G2, ou pré-mitótico, ocorre após a síntese de ADN (fase S)

e antes do início da mitose. Neste período ocorre sobretudo a síntese de biomoléculas

e ARN necessários à divisão celular, consultar figura 1.

Ilustração 1: Progressão do ciclo celular depende de uma sequência de ativação e desativação de diversos

complexos CDKs e CDKIs (Stewart e Kleihues, 2003)

Durante o ciclo celular existem etapas de avaliação interna relativamente ao

prosseguimento do ciclo celular, designados por Checkpoint 1, que ocorre no final do

intervalo G1 e Checkpoint 2, que ocorre no final do intervalo G2. Se o resultado da

avaliação for negativo as células param o seu processo de divisão e permanecem no

estádio denominado G0 por tempo indeterminado ou até à sua morte. Se pelo

contrário, a avaliação efetuada for positiva, estas processem para a fase seguinte do

ciclo celular, a fase mitótica.

Relativamente à fase mitótica esta é comummente dividida em duas etapas principais:

a mitose, que corresponde à divisão do núcleo, e a citocinese, que corresponde à

divisão do citoplasma. A mitose, embora seja um processo continuo, é dividido

didaticamente em: prófase, metáfase, anáfase e telófase. A prófase é, de um modo

geral, a etapa mais longa da mitose. Nesta fase, sucede a condensação dos

cromossomas, tornando-se mais espessos e curtos, e os dois centríolos começam a

afastar-se em sentidos opostos, formando-se o fuso acromático. Na metáfase os

cromossomas atingem o máximo de encurtamento, o fuso acromático fica completo e

os centríolos atingem os pólos da célula. Para além disso, os cromossomas orientam-se

com os centrómeros no plano equatorial, voltados com as terminações para fora.

Durante a anáfase surge a clivagem dos centrómeros, separando-se os dois

cromatídeos que passam a constituir dois cromossomas independentes. Durante nesta

fase ocorre a ascensão dos cromossomas filhos. Por ultimo, na telófase, a membrana

nuclear reorganiza-se em torno dos cromossomas de cada célula-filha o fuso mitótico é

degradado e os cromossomas descondensam, terminado assim a mitose.

A citocinese carateriza-se pela divisão do citoplasma e consequente individualização

de cada célula-filha. Estre processo começa a ser preparado durante a mitose com a

formação do anel contrátil de filamentos proteicos. Estes durante a citocinese

contraem-se e puxam a membrana celular para dentro, causando um sulco de

clivagem, que vai lentamente estrangulando o citoplasma até separar as células-filhas.

A duração das subfases do ciclo celular varia com as espécies, tipo de tecido e com o

estado de desenvolvimento do organismo. Tipicamente o tempo de duplicação celular

varia entre 10 a 40 horas com a fase G1 a durar 30%, fase S 50%, fase G2 15% e a

mitose 5% do tempo do ciclo celular. A radiossensibilidade celular também varia ao

longo do ciclo celular, em geral, a fase final do estádio S é a mais radiorresistente, a

fase G2 e M são as mais radiossensíveis.

2.3. Cinética celular

Todo o ciclo celular de cada tipo de célula é controlado por diversos marcadores,

enzimas e proteínas que lhes proporciona uma cinética particular, que pode ser

alterada se ocorrer alguma alteração genética, como no caso das células

carcinogénicas da próstata e mama.

As células carcinogénicas metastáticas da próstata, tal como as células normais que as

originam, são sensíveis a estimulação por hormonas de crescimento. Estas células são

dependentes de hormonas, uma vez que, na presença de certas hormonas a sua

percentagem de proliferação (Kp) é estimulada, enquanto na ausência aumenta a sua

taxa de morte celular (Kd). Na presença das hormonas corretas, ocorre o contínuo

crescimento destas células, uma vez que, a taxa de proliferação supera a taxa de morte

celular [22].

Estudos realizados por Carter e colaboradores concluíram que o tempo necessário de

duplicação de células da próstata é de 2.4±0.6 anos enquanto para células

metastáticas era de 1.8±0.2 anos. Por seu lado os estudos realizados por Schmid e

colaboradores obtiveram 5.8 e 3.6 anos respectivamente.

O Kp, expressa em percentagem a taxa de proliferação diária de um tipo particular de

células, é calculado dividindo o valor GF para esse tipo de célula pelo período

intermitótico Tc, expresso em dias, e posteriormente multiplicado o resultado por 100.

O GF é determinado por análises imunocitoquimicas para detetar células em ciclo

celular, através da deteção do antigene Ki67 presente em células em proliferação (G1,

S, G2) e ausente em células fora de ciclo (G0). O GF é então a porção de células da

amostra marcadas positivamente para o antigene Ki67.

O Tc é determinado usando culturas de células da próstata saudáveis e carcinogénicas

(DU-145, PC-3 e LNCaP), observando o tempo entre mitoses sucessivas através do

recurso a vídeo, conclui-se pelo estudo de Berges e colaboradores que para ambas as

amostras o Tc é de 48±5 horas.

O Kd expressa em percentagem a taxa de morte celular diária, é calculado dividindo a

fração de células que a extremidade do ADN é marcada com TTF (terminal transferase)

exógena purifica pela meia vida das células marcadas, geralmente 12 horas, e depois

multiplicado por 100.

Mais propriamente um valor de meia vida de 12±2 horas para células normais, 12±3

para células metastáticas da próstata.

Por fim conclui-se então que a taxa de crescimento é dada pela subtração de Kd a Kp

para cada tipo particular de célula. Quando Kd < Kp o tempo de duplicação é dado pela

formula:

𝐷𝑇 =𝑙𝑛2

[𝑘𝑝 − 𝑘𝑑]

Quando Kd = Kp, o tempo de renovação de todo o tecido é calculado por:

𝑇𝑡 = 1 𝑘𝑝�

A percentagem de proliferação das células normais da próstata é baixa, contudo, é

elevada o suficiente para equilibrar a baixa percentagem de morte celular espontânea.

Demonstrando assim que as células da próstata estão em equilíbrio, tendo um Tt de

500±79 dias. Quando as células da próstata entram numa fase inicial de carcinogénese,

ocorre um aumento de 6.9 vezes o valor normal de Kp, e com um aumento de 4 vezes o

valor de Kd. Levando assim a acumulação diária de 0.45±0.11% de celulas. Ficando

assim um tempo de duplicação de 154±22 dias para estas células.

Os resultados demostraram também que o valor Kp das células metastáticas é 10.7

vezes superior comparado com as células normais e o valor de Kd é unicamente 3.8

vezes superior ao das células normais. Levando assim a uma taxa de crescimento

celular no osso das células metastáticas de 1.28±0.23%, traduzindo-se assim num

tempo de duplicação de 54±5 dias, consultar tabela 1.

Tabela 1: Parâmetros da cinética das células da próstata (adaptado Berges 1995)

Tipo celular Kp (%) Kd (%) Tempo de

duplicação (dias) Células epiteliais da

próstata 0.19±0.03 0.20±0.03 500±79

Células de elevado valor neoplástico 1.25±0.30 0.80±0.24 154±22

Células metastáticas da próstata no osso 2.04±0.29 0.79±0.16 54±5

2.4. Apoptose e Necrose

Apoptose, ou morte celular programada, carateriza-se por ocorrer de forma individual,

não infligindo, por isso, morte às células vizinhas. A morte celular por apoptose

participa em múltiplas situações fisiológicas. A combinação da apoptose com a

proliferação celular é responsável pelo delineamento de tecidos e órgãos nos

embriões. Por exemplo, a apoptose regula a separação dos dedos nos fetos. Problemas

na regulação da apoptose podem conduzir ao aparecimento de inúmeras patológicas,

nomeadamente cancro, (Tavares 2009).

O processo apoptótico tem o seu início após a captação de um sinal ou estimulo pelas

células para entrarem em apoptose, realizando um vasto conjunto de alterações.

Uma família de proteínas denominada caspase, é tipicamente ativada nas fases iniciais

do processo, sendo responsáveis pela degradação de componentes celulares

fundamentais para o funcionamento celular normal, incluindo enzimas responsáveis

pela reparação do ADN. Por outro lado, as caspases podem ativar enzimas

destruidoras, tais como, ADNases, que iniciam a quebra do ADN.

A célula em apoptose apresenta uma morfologia distinta e caraterística, que tem início

com o encurtamento celular devido a destruição dos filamentos de actina e lâminas do

citoesqueleto. Posteriormente o núcleo celular apresenta uma aparência em ferradura

devido a quebra da cromatina e condensação nuclear e um contínuo encurtamento

celular é observado de forma a permitir a posterior remoção dos restos celulares pelos

macrófagos. Na fase final da apoptose surgem pequenas bolsas membranares, que

formam vesículas, denominados corpos apoptóticos. Estas alterações morfológicas são

comuns a todas as células em apoptose explícita, independentemente do agente

indutor do processo. Quer isto dizer que a ação das caspases representa uma via

comum, que opera em todas as células programadas para morrer, (Anazetti e Melo

2007).

A sensibilidade da célula face a um estímulo apoptótico depende de um número de

fatores como a expressão de proteínas indutoras e anti-apoptóticas, a intensidade do

estímulo e o estádio do ciclo celular. Existe um extenso número de mecanismos que

induzem apoptose. A apoptose pode ser desencadeada por estímulos extrínsecos, tais

como, a ligação de indutores de apoptose a recetores da membrana celular,

denominados recetores de morte celular. Para além dos processos referidos, a

apoptose pode ser induzida por sinais intrínsecos que produzem stresse celular, devido

à exposição à radiação, a químicos ou vírus. Pode igualmente resultar de uma privação

de fatores de crescimento ou stresse oxidativo induzido pela formação de radicais

livres.

Existe uma grande correlação entre o ciclo celular e a apoptose, reconhecida pelos

genes que codificam as proteínas c-Myc, p53, Rb, ras, PKA, PKC, Bcl-2, NF-kB, CDK,

ciclinas e CKI. Após estimulação, estas proteínas podem induzir proliferação celular,

interrupção do ciclo celular ou morte celular programada. A resposta celular é

fortemente influenciada pela informação genética existente, o microambiente, a

extensão de dano no ADN e a concentração de diferentes proteínas.

Por outro lado, a morte celular por necrose ocorre, geralmente, em resposta a danos

severos nas células e é caraterizada, morfologicamente, por um aumento do volume

citoplasmático e mitocondrial, seguido da rutura da membrana plasmática e

extravasamento do conteúdo celular, induzindo deste modo uma resposta

inflamatória, que pode causar dano e, por vezes até morte às células vizinhas. Deste

modo, quando a morte celular ocorre por via da necrose, um grande número de

células é afetado e lesado durante o processo inflamatório. Contrariamente ao

processo de retração celular observada aquando do processo apoptótico, na necrose

observa-se um edema celular devido as lesões no citoesqueleto e inibição das bombas

de Na+/K+, o que origina a perda da permeabilidade seletiva da membrana.

Em síntese, na apoptose, ou morte celular programada, as células morrem como

resultado de uma grande variedade de estímulos, contudo, o processo é controlado e

regulado. Contrariamente a necrose, corresponde à morte celular descontrolada, que

conduz ao aparecimento de lise celular e consequente resposta inflamatória, consultar

imagem 2.

Ilustração 2: Apoptose e a necrose são distinguidas por alterações morfológicas características

(Stewart e Kleihues, 2003)

2.5. Sumário

Deste capítulo conclui-se que a célula começa a sua vida quando se origina a partir da

divisão da célula-mãe e termina quando ela própria se divide em duas células-filhas,

dai se denomina esta existência cíclica das células por ciclo celular. O ciclo celular, bem

como toda a cinética associada desempenham um papel fundamental na resposta

celular à irradiação pois aquando de um dano pode repara-lo, pode ordenar a morte

celular, por apoptose, ou pode retirar essas células do ciclo celular, permanecendo

num estádio de paragem, designado G0. A apoptose é o processo de morte celular que

menos danos causa às células vizinhas, sendo o processo ideal de fim celular aquando

da irradiação.

Capítulo 3

Radiobiologia Celular

3.1 Introdução

Quando a radiação ionizante interage com células ou tecidos, ocorrem interacções e

deposição de energia nos diversos componentes da célula, principalmente no ADN, por

este ser o componente mais sensível.

Os efeitos da radiação podem ser diversos dependendo do grau de maturação e tipo

celular em causa, bem como da qualidade da radiação. Podendo ser provocados de

uma forma direta, isto é, a própria radiação interage diretamente com o alvo, neste

caso o ADN ou outro qualquer constituinte da célula, ou podem ser provocados de

forma indireta, nesta, a radiação atua sobre moléculas de água, produzindo radicais

livres altamente reativos, que por sua vez interagem e provocam lesões nos

constituintes celulares.

A irradiação de uma célula pode resultar em nove destinos finais:

• Ausência de efeito;

• Atraso na divisão: a célula atrasa a entrada no processo de divisão;

• Apoptose: a célula morre antes de se dividir ou após divisão por fragmentação

em pequenos corpos;

• Falha reprodutiva: a célula morre na tentativa de executar mitose;

• Instabilidade genómica: carateriza-se por um atraso da falha reprodutiva

como resultado da introdução de instabilidade genómica;

• Mutação: a célula sobrevive, mas esta mutada;

• Transformação: a célula sobrevive, mas a mutação leva a alterações de

fenótipo e possibilidade de carcinogénese;

• Efeito bystander: uma célula irradiada envia sinais às células vizinhas não

irradiadas, induzindo nestas danos genéticos;

• Reposta adaptativa: a célula irradiada é estimulada a reagir e torna-se mais

resistente a radiação, (Suntharalingam 2002).

Dos destinos finais, enumerados anteriormente, aquele que é mais interessante do

ponto de vista da radioterapia metabólica dirigida, é a apoptose, pois este destino

induz menos danos nas células vizinhas e, adicionalmente, impede a propagação de

aberrações cromossómicas radioinduzidas.

As células têm mecanismos intrínsecos de resposta as diversas lesões que a radiação

ionizante pode provocar no ADN. Estes mecanismos de uma forma geral após a

detecção do local lesado procedem a uma substituição das bases incorrectas ou

mesmo de um segmento da cadeia de ADN, de forma a tentar corrigir a lesão e

assegurar a integridade genética.

Dos mecanismos conhecidos, tem especial destaque os mecanismos de reparação mais

simples que são utilizados principalmente nas quebras simples como o caso da

reparação por excisão de bases (Base Excision Repair, BER) que permite corrigir

problemas em bases individuais, reparação por excisão de nuclídeos (Nucleotide

Excision Repair, NER) que corrige através da remoção e substituição de oligonuclídeos,

com comprimentos entre 24 e 32 nucleótidos. Este processo é a via primaria de

remoção de espécies reativas do oxigénio.

Quando existem ou ocorrem danos irreparáveis no ADN, geralmente o próximo passo

é a apoptose, ou more celular programada, de forma a evitar, as consequências de

reparações altamente mutagénicas.

3.2 Efeitos Celulares da Radiação

Pelas leis de Bergonie e Tribondeau (1906), conclui-se que quanto mais diferenciada é

a célula, maior é a sua radiorresistência e quanto maior é a taxa de proliferação, de

crescimento e atividade metabólica da célula, maior é a radiossensibilidade. Assim,

tecidos ou órgãos em desenvolvimento e proliferação ativa são mais radiossensível

que tecidos ou órgãos totalmente desenvolvidos e diferenciados, ilustração 4.

Em 1925, Ancel e Vitemberger modificam a lei de Bergonie e Tribondeau, introduzindo

a noção de tempo de latência, afirmando que a suscetibilidade das células à lesão por

radiação é o mesmo, mas o tempo de aparecimento das lesões produzidas pela

radiação vária de acordo com o tipo de célula, influenciadas pela quantidade de

stresse biológico que a célula está sujeita, necessidade de divisão, e às condições de

pré e pós-radiação da célula exposta.

Ilustração 3: Relação entre a radiossensibilidade das células e as suas características de divisão e diferenciação celulares.

Os efeitos celulares da radiação podem também ser classificados com base na sua

probabilidade de ocorrência, sendo divididos em dois tipos distintos:

• Efeitos estocásticos: Podem aparecer a partir da lesão de uma ou várias células,

não existe limiar, pelo que os efeitos são de natureza aleatória, isto é, assume-se

que existe sempre a probabilidade de ocorrerem, mesmo para pequenas doses

de radiação. Um aumento da dose implica um aumento da frequência do efeito e

não da sua gravidade.

• Efeitos determinísticos: estão associados a um limiar a partir do qual surgem, são

os efeitos cuja severidade aumenta com o aumento da dose.

3.3 Efeitos Diretos e Indiretos da Radiação

Quando as células são expostas a radiação ionizante, ocorrem primeiramente efeitos

físicos entre os átomos e moléculas da célula e a radiação, e só mais tarde se verificam

os danos biológicos. Os efeitos biológicos da radiação resultam sobretudo de lesões

• Vida curta • Indiferenciadas • Dividem-se regularmente

Muito Alta

• Dividem-se um número limitado de vezes • Algum grau de diferenciação Alta

• Dividem-se irregularmente • Esperança de vida muito variavel Média

• Vida longa • Não se dividem muitas vezes • Grau variavel de diferenciação

Baixo • Não se dividem • Altamente diferenciadas Muito Baixo

provocadas ao ADN, o qual é o componente mais sensível da célula no que toca a

radiação ionizante. Contudo, existem outros componentes da célula, que uma vez

danificados, podem produzir efeitos biológicos na célula como por exemplo enzimas,

lípidos estruturais, entre outros.

Quando a radiação incidente interage com o material biológico, transfere energia para

a célula, provocando danos que pode ser resultado de efeitos diretos ou indiretos da

radiação. No efeito direto, a radiação interage diretamente com a molécula alvo, ou

seja o ADN. Os átomos do ADN são ionizados ou excitados, conduzindo a uma cascata

de eventos físicos e químicos, que eventualmente produzem o dano biológico. O efeito

direto é o processo dominante em interações de radiação de alta LET.

No efeito indireto, a radiação interage com outas moléculas ou átomos,

principalmente moléculas de água, no interior da célula, produzindo radicais livres, os

quais posteriormente provocam a ionização da molécula alvo. As interações da

radiação com as moléculas de água no interior da célula produzem radicais livres de

curta vida, nomeadamente, o H2O+ e o OH·. Os radicais livres em causa podem induzir

danos no ADN, os quais conduzem a danos biológicos. Cerca de dois terços do dano

biológico provocado por radiação de baixa LET é devido ao efeito indireto da radiação,

consultar imagem 4 [2].

Ilustração 4: Efeitos Diretos versos Efeitos Indiretos (Hall e Giaccia, 2006)

3.4 Tipo de Danos e Destino das Células

Radioinduzidos

As células expressam os danos radioinduzidos aquando da sua divisão e multiplicação.

Lesões que provocam aberrações cromossómicas e mutações genéticas nas células,

podem levar à morte celular, inibição da divisão celular ou a transformações malignas.

Estas alterações celulares podem ter como consequências finais a alteração da função

tecidular, morte tecidular ou indução de cancro.

A interação de radiação ionizante com material biológico provoca uma cascata de

eventos nefastos para a estrutura e função do material em causa. Quando existe

interação entre radiação e o ADN, um dos seguintes efeitos biológicos na estrutura do

ADN podem ocorrer: 1) alteração das ligações entre as bases, devido a substituição de

bases, adição de novas bases ou remoção de bases existentes, substituição cruzada de

bases; 2) Single Strand Break (SSB), quebras simples da cadeia; ou 3) Double Strand

Break (DSB), quebras duplas da cadeia. Estes danos do ADN podem conduzir a

alterações na função do ADN levando uma das seguintes consequências: inibição

temporária ou permanente da síntese de ADN, síntese de ADN incorreto, inibição ou

prevenção da mitose ou mesmo síntese de proteínas incorretas. Por outro lado

quando a interação da radiação ocorre com enzimas, alterações da estrutura terciária

ou disrupção das ligações químicas das enzimas podem ocorrer, levando à inibição da

atividade enzimática ou a alterações do metabolismo celular. Se as interações ocorrem

nas membranas celulares, pode ocorrer um aumento da permeabilidade aos iões,

resultando em potenciais alterações da composição intracelular e extracelular da

célula.

Suntharalingam em 2002 classifica os danos provocados em células de mamíferos em

três grandes grupos:

• Danos letais: os quais são irreversíveis, conduzindo à morte da célula;

• Danos subletais: podem ser reparados em algumas horas exceto se outros

danos subletais forem adicionados durante a reparação celular, o que

conduzirá ao aparecimento de um dano letal;

• Danos potencialmente letais: podem ser manipulados pelos mecanismos de

reparação quando as células são retidas no estádio G0.

Como consequência dos danos provocados pela radiação a célula pode-se encaminhar

para um de nove possíveis destinos finais, (Suntharalingam 2002):

• Ausência de efeito;

• Atraso na divisão: célula fica retida no estádio G0;

• Apoptose: a célula morre por fragmentação;

• Falha reprodutiva: a célula morre na tentativa de executar mitose;

• Instabilidade genómica: carateriza-se por um atraso da falha reprodutiva como

resultado da introdução de instabilidade genómica;

• Mutação: a célula sobrevive, mas está mutada;

• Transformações: a célula sobrevive, mas a mutação leva a alterações de

fenótipo e possibilidade de carcinogénese;

• Efeito bystander: a célula irradiada envia sinais as células vizinhas não

irradiadas, induzindo danos genéticos nas mesmas;

• Resposta adaptativa: a célula irradiada é estimulada para reagir e tornar-se

mais resistentes à radiação.

A escala temporal associado à quebra de ligações químicas e subsequente dano

biológico, período de latência, situa-se entre algumas horas a anos, dependendo do

tipo de dano. Caso a morte celular seja o resultado da irradiação, esta pode ocorrer

dentro de algumas horas, isto é, efeitos precoces da radiação. Contudo, se o dano for

oncogénico, a sua expressão pode ser adiada durante anos, isto é, efeito tardio da

radiação.

3.4.1. Método de Classificação das Lesões ao ADN

Nikjoo e colaboradores, em 1997, definiram dois métodos alternativos de classificação

de quebras nas cadeias de ADN.

Esses esquemas de classificação consideravam 1) os padrões de quebras de acordo

com a complexidade do dano (simples, duplo e combinações) numa ou ambas as

cadeias de ADN, figura 5; e 2) classificação das quebras como resultado direto ou

indireto da radiação (devido a radicais livres). As classificações são apresentadas na

tabela 2, (Nikjoo 1997 e 2001).

Ilustração 5: Esquema de classificação de danos do ADN segundo (Nikjoo 1997 e 2001)

Classificação Descrição

Ausência de quebra Não ocorre deposição energética por efeito direto, nem a

deposição energética devido a radicais livres (efeito indireto) conduz à formação de quebras do ADN

SSB Quebra simples do ADN SSB+ Duas quebras simples na mesma cadeia ADN

2SSB Duas ou mais quebras simples em cadeias opostas separadas por >10 bp, mas não classificadas como quebras duplas DSB Duas quebras simples opostas e separadas por ≤10 bp

DSB+ Uma quebra dupla acompanhada por uma ou mais quebras simples separadas por menos de 10 bp

DSB++ Mais de uma quebra dupla no segmento de ADN separadas por 10 bp ou mais Tabela 2: lassificação das diferentes quebras do ADN, segundo (Nikjoo 1997, 2001)

3.5 Mecanismos de Reparação do ADN

Quando a radiação ionizante interage com material biológico, principalmente o ADN,

provoca alterações na sua estrutura num curto espaço de tempo, entre 10-3 e 10-5

segundos, estimulando a quebras de ligações químicas do ADN. Contudo, os efeitos

biológicos de tal lesão surgem tardiamente, após um período de latência quem pode

demorar desde algumas horas até vários anos. Como consequência dos danos no ADN

a célula pode sofrer uma mutação, entrar em apoptose ou tornar-se numa célula

carcinogénica.

Dependendo da energia depositada pela radiação ionizante na célula irradiada podem

ocorrer quebras de apenas uma cadeia de ADN ou quebras nas duas cadeias de ADN

(mencionadas anteriormente). Em termos biológicos as quebras simples são

tipicamente de fácil reparação, não apresentando assim grandes consequências

celulares, a não ser em caso de reparação incorreta a qual pode conduzir ao

aparecimento de uma mutação. Também as quebras duplas separadas por vários pares

de bases são frequentemente facilmente reparados pelos mecanismos celulares.

Porém as quebras duplas complexas, separadas por poucos pares de bases são uma

das lesões mais toxicas e mutagénicas nas células humanas, uma única DSB tem

potencial para remover mais de 100 milhões de pares de base de informação genética.

O número de lesões no ADN geradas pela radiação é elevado, mas o número de células

que morrem devido as lesões é substancialmente mais reduzido. O número de lesões

induzidas no ADN por uma radiação de 1-2 Gy é aproximadamente de 1000 SSB e 40

DSB. Dados experimentais demonstram que as DSB induzida por radiações de baixo

LET são tipicamente mais facilmente reparadas que as DSB provocadas por radiações

de alto LET. Conhecimento relativo à interação e trajeto da radiação (track structure)

com a matéria tem vindo a ser utilizado para explicar as variações e diferentes

distribuições das lesões no ADN.

Existem múltiplos mecanismos enzimáticos de reparação do DNA nas células que

atuam em diferentes tipos de lesões. Para as lesões DBS, os principais mecanismos de

reparação são a recombinação homóloga (Homologous Recombination) e a

recombinação não homóloga (Non-Homologous End Joining, NHEJ) [37].A

recombinação homóloga requer que parte do ADN não esteja danificado para servir

como molde para síntese de novo ADN, é um mecanismo raro, sem erros e que

acontece essencialmente após a replicação, na fase final do estádio S e G2 do ciclo

celular. Inicia-se com a ligação de um complexo proteico nos locais das lesões. Ocorre

a síntese dos nuclídeos em falta, criando assim um complexo cruzado entre as cadeias

de ADN lesadas e normais, designado de junção de Holliday. A quebra da junção

Holliday garante a recombinação homóloga no final do mecanismo de reparação. Por

seu lado, a recombinação não homóloga provoca lesões pré-mutagénicas, podendo ser

letais no caso de aberrações em anel, dicêntrico ou ponte de anáfase ou não-letais se

forem pequenas deleções ou translocações simétricas. Este mecanismo opera na

ponta do fragmento de ADN, após a identificação por parte da proteína Ku70/Ku80 do

local da lesão, de seguida a proteína de reparação é ligada a DNA-PK, que promove

uma religação dos fragmentos. Este mecanismo ocorre essencialmente na fase final do

estádio G1 e fase S do ciclo celular.

A radiossensibilidade difere dentro do ciclo celular, em geral, a fase final do estádio S é

a mais radiorresistente, a fase G2 e M são as mais radiossensíveis, tomando a fase G1

um valor intermedio. A proporção favorável da reparação por HR em vez da NHEJ na

fase final de S pode explicar a sua maior radiorresistência, ver imagem 6.

Ilustração 6: Fração de células que sobrevivem a uma dose de 6.6 Gy de raio-X em função do tempo, A

sobrevivência celular cresce até um máximo na fase final do estádio S (Wang, 2000)

Existem mecanismos de reparação mais simples que são utilizados principalmente nas

quebras simples como o caso da reparação por excisão de bases (Base Excision Repair,

BER) que permite corrigir problemas em bases individuais através da produção de um

local AP (local apurínico ou apirimidínico), reparação por excisão de nuclídeos

(Nucleotide Excision Repair, NER) que corrige dímeros de timina através da remoção e

substituição de oligonuclídeos, com comprimentos entre 24 e 32 nucleótidos, por

reparação enzimática distinta do ADN. Este processo é a via primaria de remoção de

espécies reativas do oxigénio capazes de induzir ciclopurinas em células de mamíferos.

Por último existe ainda a reparação de erros de emparelhamento (Mismatch Repair,

MMR).

Dois modos de reparação BER têm sido observados em células procarióticas e

eucarióticas: a excisão e substituição de um único nucleótido, denominado BER de

curta substituição (Short-Patch BER – SP-BER), que ocorre na maioria dos casos; e a

remoção de fragmentos de 2 a 13 nucleótidos, denominado BER de longa duração

(Long-Patch BER – LP-BER). Segundo Dianov e colaboradores (2000), em células

humanas, as vias de reparação LP-BER e NER têm um papel relativamente minoritário

na reparação dos danos, sendo estes na sua maioria removidos pela via SP-BER.

Quando existem ou ocorrem danos irreparáveis no ADN, geralmente o próximo passo

é a apoptose, ou more celular programada, de forma a evitar, as consequências de

reparações altamente mutagénicas.

3.6 Curvas de Sobrevida

O procedimento padrão para medir a radiossensibilidade de uma população celular é a

retenção da sua integridade reprodutiva, isto é referido como a sobrevida celular e

percentagem de sobrevida após irradiação, assumindo que existe uma relação clara

entre a apoptose e o crescimento e a sobrevivência celular para um grande intervalo

de doses e níveis de sobrevivência.

O tipo de radiação influencia a forma da curva, sendo que radiações densamente

ionizantes apresentam curvas de sobrevida quase exponenciais face à dose absorvida,

enquanto radiações pouco ionizantes apresentam uma pequena diminuição inicial,

seguida de uma região denominada em ombro, mantendo-se quase e decréscimo

constante para altas doses, consultar imagem 7.

Ilustração 7: Curvas de sobrevida celular típica para radiação de alta LET e baixa LET: (a) Primeiro modelo e

(b) modelo atual (Tavares, 2009)

As curvas de sobrevida são melhor expressas em gráficos semilogarítmicos de

sobrevivência por dose irradiada, geralmente com doses de 1 a 10 Gy por célula. O

modelo mais utilizado na atualidade é o modelo linear-quadrático, usando um

polinómio de segunda ordem, utilizando as constantes α que representa a inclinação

inicial da curva e β a componente quadrática de morte celular para descrever o declive

da sobrevida (S) com o aumento da dose (D).

𝑆 = 𝑒−(𝛼𝐷+𝛽𝐷2)

A razão α/β fornece a dose para a qual os componentes quadráticos e lineares da

morte celular são iguais.

A taxa de sobrevivência celular é maior quando uma dose é administrada de forma

fracionada num período superior a 2 horas, comparado com uma única dose. Esta

variação é atribuída às reparações das lesões subletais entre frações. Em geral o

período de reparação de metade das lesões subletais varia entre 0.5 a 1 hora para

células em cultura podendo ser maior em tecidos. E a reparação completa pode

demorar entre 6 a 8 horas, podendo também ser mais moroso em tecidos.

O sucesso da reparação do dano depende da dose absorvida e do tempo de exposição,

existindo uma velocidade máxima de reparação observada quando a lesão atinge

níveis de saturação, análogo à cinética enzimática. A reparação é menos bem-sucedida

para irradiações de altas taxas de doses, apresentado maior sucesso para baixas taxas

de doses. O sucesso crescente da sobrevivência celular a baixas doses ou com doses

muito espaçadas no tempo e consistente com a importância dada ao tempo de

reparação das lesões subletais.

Outro efeito importante na sobrevida celular é o chamado efeito bystander, em que as

células próximas das células irradiadas, mas que não foram atingidas diretamente pela

radiação, exibem lesões similares aquelas observadas em células diretamente

atingidas pela radiação.

3.7 Sumário

Pretende-se, uma vez finalizada a leitura deste capítulo, que se compreenda e retenha

os conceitos básicos dos efeitos das interacções da radiação com as células e material

biológico, com particular importância para os mecanismos de reparação presentes nas

células eucarióticas.

Do capítulo verificou-se que os efeitos finais da radiação dependem do tipo de célula

em causa, bem como a fase do ciclo celular em que se encontra, pois sabe-se que uma

célula em estádio G1 é mais radioresistente do que a mesma célula em estádio M.

Por outro lado, a qualidade da radiação utilizada, influencia de forma drástica o tipo de

danos provocados no ADN da célula, quanto maior o LET da radiação, mais complexo e

difíceis de reparar vão ser os danos, garantindo assim que a célula inicia o seu processo

apoptótico.

Capítulo 4

Radioisótopos

para Terapia Paliativa

4.1 Introdução

A radiação ionizante pode ser utilizada para destruição das celulares carcinogénicas,

por via de métodos de irradiação externa com raios-X ou partículas de elevada energia

ou métodos de irradiação interna com recurso a técnicas de braquiterapia ou uso de

radiofármacos.

A radiação transmitida internamente a uma área específica ou a um órgão lesado será

tendencialmente mais seletiva que feixes de radiação externos. Contudo é importante

definir qual a quantidade certa de radiação a fornecer às células cancerosas alvo e ao

mesmo tempo definir qual a estratégia de administração mais eficiente e que evitará

lesar as células normais que rodeiam o tumor.

O primeiro caso de sucesso de métodos de irradiação interna de tumores com recurso

ao uso de radioisótopo foi o tratamento do cancro da tiroide com uso de iodo

radioativo. O Iodo-131 (131I), produzido num reator nuclear, é instável devido ao

elevado número de neutrões e emite radiação β e γ para alcançar a estabilidade. Para

além disso, quando injetado por via endovenosa ou administrado por via oral, o 131Iodeto de sódio, concentra-se preferencialmente na tiroide, glândulas salivares e

mucosas. Dado que a radiação β libertada pelo 131I é capaz de destruir as células

cancerosas e o 131Iodeto de sódio se localiza preferencialmente na tiroide, este

método de irradiação interna de tumores com recurso a radioisótopos tem sido

utilizado para tratamento do cancro da tiroide com elevado sucesso.

Existem outros isótopos utilizados com fiz terapêuticos ou de diagnóstico são captados

por áreas especificas do corpo, por exemplo, o Fosfato-32 e o Estrôncio-89

amplamente usados na terapia óssea e o Rádio-223 é um promissor agente para

tratamento ósseo.

Contudo, uma grande parte dos radioisótopos utilizados para radioterapia dirigida

necessitam de ser incorporados num composto químico, o qual será captado especifica

e seletivamente por um determinado tipo de recetor, transportador ou enzima na

célula alvo. Uma vez atingido o alvo, a radiação emitida pelo radioisótopo presente no

radiofármaco pode conduzir à morte celular.

4.2 Principais Características dos Radioisótopos

Para fins terapêuticos, a seleção do radionuclídeo adequado para uma aplicação

específica tem em consideração uma vasta gama de fatores, que incluem as

características físicas do radionuclídeo, principalmente o tipo e a energia da radiação

emitida e a sua meia-vida. Para além disso, é importante considerar o local de

deposição da energia do radionuclídeo, a localização anatómica da área a tratar, custos

e disponibilidade do radionuclídeo. A estratégia dos radiofármacos é depositar a maior

quantidade de energia possível num curto espaço de tempo nas células malignas, em

particular no ADN das mesmas, poupando as células saudáveis da radiação indesejável.

Na prática, radionuclídeos com emissão de partículas β-, bem como aqueles com

capacidade de captura eletrónica e emissão de eletrões Auger, são os únicos que tem

vindo a ser usados amplamente na terapia paliativa de metástases ósseas com

radiofármacos. As partículas β têm um poder de penetração nos tecidos na ordem dos

milímetros até alguns centímetros, sendo apropriadas para a irradiação de pequenos

tumores até tumores de tamanho médio. Alguns dos radionuclídeos promissores que

emitem partículas β-, terem valores de meia-vida adequados à radioterapia de

metástases ósseas, variando de algumas horas até dias. Para além disso, estes

radionuclídeos frequentemente decaem originando num nuclídeo filho estável. Por

ultimo, muitos destes radionuclídeos são facilmente produzidos. Ver tabela 3.

Nuclídeo Semi-vida física (dias)

Tipo de decaimento

Energia média (MeV)

Energia emissão γ

(MeV)

Penetração no tecido

(mm) 90Y 2.67 β- 2.28 0 2.7

188Re 17.0 β- 2.12 0.155 (15%) 2.4 166Ho 26.8 β- 1.85 0.81 (6.33%) 8.6

32P 14.3 β- 1.71 0 8.0 89Sr 50.5 β- 1.49 0 6.7

186Re 3.77 β- 1.08 0.137 (9%) 4.7 153Sm 1.95 β- 0.81 0.103 (29%) 3.4

131I 8.04 β- 0.61 0.364 (81%) 0.8 67Cu 2.58 β- 0.57 0.184 (48%) 0.05-2.1 177Lu 6.7 β- 0.497 0.113 (6.4%) 0.04-1.8

170Tm 1.10 β- 0.96 0.027 (2.83%) 117mSn 13.6 β- 0.16 0.158 (87%) 0.3 223Ra 11.43 α 5.97 0.118 (1.97%) 0.1

125I 60.3 EC 0.4 (Auger e-) 3.98 (6.6%) 10 nm Tabela 3: Exemplos de radioisótopos com potencial aplicabilidade em radioterapia e as suas características.

Legenda: EC - Captura eletrónica, β- - emissão de partículas beta menos, α – emissão de partículas alfa (adaptado de Volkert (1999));

4.2.1 Fósforo-32

O Fósforo-32 (32P) decai por emissão β- para Enxofre-32 no estado fundamental, com

um tempo de semi-vida de 14.28 dias e uma energia total de 1710.66 KeV. Este

radioisótopo apresenta um poder de penetração medio de 3mm nos tecidos e de

1.7mm no osso, atingindo um máximo de 8.5m. È obtido através da irradiação do

Enxofre-32 com neutrinos de alta velocidade, apresentando assim um baixo custo de

produção, consultar tabela 4.

Emissão Energia Média (KeV) Intensidade (%) β0,0 695.5 100.0

Tabela 4: Tabela de decaimento do Fósforo-32

4.2.2 Estrôncio-89

O Estrôncio-89 (89Sr) decai principalmente por emissão β- para Ítrio-89 no estado

fundamental e uma pequena fração de 0.0096% decai para o Ítrio-89 isomérico com

subsequente decaimento para Ítrio-89 via raios γ de 909 KeV. O [89Sr] tem um valor de

semi-vida de 50.57 dias e uma energia de decaimento de 1495,1 KeV, com um poder

de penetração de 2.4mm nos tecidos moles e um poder efetivo de 5 a 6mm. Este

radioisótopo é preparado a partir do Estrôncio-82 num reator com alto fluxo de

neutrões, consultar tabela 5.

Emissão Energia Média (KeV) Intensidade (%) β0,0 584.6 99.9903 β0,1 189.1 0.0096 ɣ0,0 909.0 0.0095

Tabela 5: Tabela de decaimento do Estrôncio-89

4.2.3 Ítrio-90

O Ítrio-90 (90Y) decai maioritariamente por emissão β- para o estado fundamental do

Zircónio-90 e para um nível excitado a 1760 KeV com uma probabilidade de 0.017%. O

[90Y] tem um valor de semi-vida de 2.668 dias e uma energia total de decaimento β- de

2279.8 KeV. Com um poder de penetração de 4mm no tecido ósseo, fazem dele ideal

para aplicações terapêuticas, consultar tabela 6.

Emissão Energia Média (KeV) Intensidade (%) CE-K 768.7 0.003 β0,1 163.7 0.017 β0,0 926.7 99.98

Tabela 6: Tabela dos principais decaimentos do Ítrio-90

4.2.4 Estanho-117m

O Estanho-117m (117mSn) decai por transformação isomérica com emissão de fotões

gama para o Estanho-117 estável. Tendo um tempo de semi-vida 13,6 dias e uma

energia de fotões gama de 158,6 KeV e emite eletrões de baixa energia, com

penetração efetiva medida em micrómetros, consultar tabela 7.

Os eletrões de baixa energia são emitidos através de conversão eletrónica entre

camadas, com especial interesse os produzidos pela camada K e L.

Emissão Energia Média (KeV) Intensidade (%) Auger-L 3.0 91.0 Auger-K 21.0 10.8

CE-K1 126.8 64.8 CE-K2 129.4 11.7 CE-L1 151.9 26.1 CE-L2 154.1 1.5 CE-M1 155.1 5.6

Fotões Gama 158.6 86.4 Tabela 7: Tabela dos principais decaimentos do Estanho-117

4.2.5 Samário-153

O Samário-153 (153Sm) desintegra-se via 3 ramos principais e pelo menos mais 10

ramos fracos de emissões β- para Európio-153. O [153Sm] tem um tempo de semi-vida

de 1.92849 dias e uma energia de 808,2 KeV.

A emissão β- média do Samário-153 é de 0.233 MeV, com penetração média no tecido

mole de 0.5mm e uma penetração efetiva de 2 a 3 mm. O (153Sm) também liberta

radiação γ, 29% da sua energia total com um valor de 0.1 MeV, permitindo assim a

realização de uma cintilografia do radionuclídeo administrado. O Samário-153 é

produzido num reator nuclear através do bombardeamento com neutrinos do

Samário-152.

Este radioisótopo tem uma a tabela de decaimentos extremamente complexa,

podendo decair por emissão de eletrões Auger, captura eletrónica, emissão β-, fotões

gama, de diversos níveis de energia, dos quais se destacam os presentes na tabela 8.

Emissão Energia Média (KeV) Intensidade (%) Auger-L 3.4 – 7.8 53.0 CE-K5,3 21.154 20.5 CE-K3,0 54.66 41.4

β0,5 199.7 30.4 β0,3 225.3 49.2 β0,0 264.3 19.5 ɣ3,0 103.2 29.2

Tabela 8: Tabela dos principais decaimentos do Samário-153

4.2.6 Hólmio-166

O Hólmio-166 (166Ho) decai por emissão β- para níveis excitados do Érbio-166, com um

valor de energia de decaimento total de 1854.5 KeV e um tempo de semi-vida de

26.795 dias. Apresenta um elevado poder de penetração na ordem dos 8 mm. O

Hólmio tal como o Samário decai com emissão de um largo espectro de partículas, os

principais decaimentos do Hólmio podem ser consultados na tabela 9.

Emissão Energia Média (KeV) Intensidade (%) Auger-L 3.9 – 7.6 28.0 CE-L1,0 70.82 – 72,2 20.5

β0,1 651.1 50.5 β0,0 693.8 48.2

Tabela 9: Tabela dos principais decaimentos do Hólmio-166

4.2.7 Túlio-170

O Túlio-170 (170Tm) desintegra-se tanto por decaimento β-, para um nível excitado

intermédio de 84.25 KeV (18.3%) com subsequente decaimento para o estado

fundamental do elemento Itérbio-170 (Yb-170), como por decaimento β- diretamente

para o estado fundamental do elemento Yb-170 (81%). Para além disso, o 170Tm pode

também decair por captura eletrónica para um nível excitado intermédio de 78.6 KeV

(0.03%) com subsequente decaimento para o estado fundamental do Érbio-170 (Er-

170) ou diretamente para o estado fundamental (0.12%) do Er-170.Com um tempo de

semi-vida de 127.8 dias e uma energia total de emissão β- de 968 Kev e de captura

eletrónica de 314,4 KeV e emissão γ suficiente para imagiologia, ver tabela 10.

Emissão Energia Média (KeV) Intensidade (%) CE-L1,0 73.77 – 75.31 9.4

β0,1 290.5 18.3 β0,0 323.1 81.6

Tabela 10: Tabela dos principais decaimentos do Túlio-170

4.2.8 Lutécio-177

O Lutécio-177 (177Lu) desintegra-se por emissão β- para o estado fundamental e três

estados excitados do Háfnio-177 (Hf-177), com um valor de meia-vida de 6.647 dias e

energia de emissão de 498.3 KeV, também tem emissão γ suficiente para a produção

de imagem médica, ver tabela 11.

Emissão Energia Média (KeV) Intensidade (%) Auger-L 4.3 – 11.2 8.75 CE-L1,0 101.67 6.84

β0,3 47.66 11.64 β0,1 111.7 9.1 β0,0 149.4 79.3 ɣ3,1 208.36 10.38

Tabela 11: Tabela dos principais decaimentos do Lutécio-177

4.2.9 Rénio-186

O Rénio-186 (186Re) decai por emissão β- principalmente para o estado fundamental e

excitado a 137 KeV do Ósmio-186 e por captura eletrónica para o Tungsténio-186. O

(186Re) tem uma semi-vida de 3,7186 dias e uma energia de decaimento β- de 1069.5

KeV e de captura eletrónica de 581,6 KeV [38]. Sendo um emissor β com energia média

de 0.349 MeV e uma penetração média nos tecidos moles de 1.1mm e um máximo de

4.5mm. Também emite uma pequena componente de radiação γ (9%, 0.137 MeV),

permitindo assim uma imagem da pós-administração da biodistribuição, consultar

tabela 12.

Emissão Energia Média (KeV) Intensidade (%) Auger-L 4.7 – 12.9 6.43 CE-T1,0 63.3 – 137.11 12.15

β0,1 306.7 21.5 β0,0 359.6 70.9

Tabela 12: Tabela dos principais decaimentos do Rénio-186

4.2.10 Rénio-188

O Rénio-188 (188Re) decai por emissão β- para diferentes estados do Ósmio-188, dos

quais 71.1% decai diretamente para o estado fundamental. O (188Re) tem uma semi-

vida de 17,005 dias e uma energia de 2120,4 KeV [38]. Este radioisótopo apresenta

uma penetração média de 3 mm nos tecidos moles e máxima de 10 mm. O valor

elevado de energia de emissão β tem potencial para provocar danos letais nas células

tumorais na região de decaimento, ver tabela 13.

Emissão Energia Máxima (KeV) Intensidade (%) β0,0 2120.4 71.1% β0,1 1965.4 25.6%

Fotões Gama 155 15% Tabela 13: Tabela dos principais decaimentos do Rénio-188

4.2.11 Rádio-223

O Rádio-223 (223Ra) decai por emissão de partículas α para níveis excitados do Radão-

219. O (223Ra) apresenta uma semi-vida de 11,43 dias e uma energia de emissão α de

5978,99 KeV. Apresenta um poder de penetração inferior a 0.1mm nos tecidos, e

fotões gama que possibilitam a realização de imagem médica. Os principais

decaimentos do Rádio-223 podem ser consultados na tabela 14.

Emissão Energia Média (KeV) Intensidade (%) α0,6 5539.43 10.6 α0,5 5606.95 25.8 α0,4 5715.81 45.6 α0,3 5747.14 10.0

Auger-L 5.66 – 17.95 30.1 CE-T4,2 51.5 – 54.9 15.42 CE-K4,1 55.81 18.0 CE-T4,1 55.811 – 154.165 22.4 CE-T5,0 171.066 – 269.420 11.23

Tabela 14: Tabela dos principais decaimentos do Radio-223

4.3 Sumário

Neste quarto capítulo foram explicados os conceitos básicos associados ao uso de

radioisótopos na área terapêutica, sendo de salientar as características físicas de cada

candidato.

Sabendo que um radioisótopo emissor de partículas β, partículas α ou eletrões Auger

apresentam elevado potencial terapêutico, quando a ele esta associado um período de

semi-vida física adequado e um nuclídeo-filho estável, com possibilidade de ser

captado pelo tecido ósseo de uma forma direta ou através da ligação a outro agente

químico.

Capítulo 5

Simuladores em Radiobiologia

5.1 Introdução

Um passo essencial sobre a eficiência da terapia com radioisótopos é a análise dos

efeitos provocados por este no material biológico em estudo. Uma forma muito

apetecível de realizar estudos e ensaios na área é através do recurso a simuladores,

onde se utilizam código Monte Carlo para descrever o transporte e interacção de

energia com um meio descrito por diversos parâmetros extrapolados de ensaios in

vitro e in vivo.

A principal vantagem da utilização destes simuladores é a sua versatilidade e a

capacidade de em intervalos reduzidos de tempo, obter informação, que de outro

qualquer modo demoraria largos meses ou mesmo anos.

Para o desenvolvimento destes ensaios foram escolhidos os seguintes simuladores

Monte Carlo Damage Simutaion, que simula as lesões provocadas pela radiação, o

Monte Carlo Excision Repair, que simula os mecanismos de reparação e por último o

Virtual Cell, que simula todo o processo de interacção entre a radiação e o tecido alvo.

5.2 Simuladores

Os simuladores computacionais de radiobiologia celular são desde há algum tempo

uma fonte útil de informação sobre o potencial efeito terapêutico de diferentes

agentes irradiantes, entre eles, os radiofármacos utilizados em metástases ósseas,

sendo de crucial importância no campo da radioterapia molecular e projeção de

tratamentos.

Um dos primeiros simuladores dos efeitos da radiação desenvolvido foi o simulador

Monte Carlo. Segundo a história, decorria o ano de 1945 quando apareceu um modelo

matemático notável e que ainda hoje é amplamente aplicado em diversas áreas da

ciência.

O método Monte Carlo é um conjunto de técnicas estocásticas baseadas em números

aleatórios e probabilidades estatísticas para investigar problemas científicos, ode o seu

uso possibilita analisar sistemas complexos, como o caso da radiobiologia celular, que

de outro modo não seriam possíveis de estudar, pois descrever a interação de um par

de átomos é relativamente elementar, contudo, resolver as mesmas equações para

centenas ou milhares de átomos é impensável. Com o método Monte Carlo um

sistema complexo pode ser amostrado em números de configurações aleatórias e a

informação recolhida pode ser utilizada para descrever o sistema como um todo,

(Woller 1996).

Como já foi referido, atualmente os métodos Monte Carlos aplicados nos simuladores

dos efeitos da radiação possibilitam o planeamento, o estudo das interações entre a

radiação e a matéria, entre outros.

Porém, algumas desvantagens têm sido apontadas a este simulador, entre as quais a

sua exigência computacional. Assim, comparativamente ao algoritmo Monte Carlo,

computacionalmente mais complexo e detalhado, o algoritmo de Monte Carlo rápido

(MCDS) utilizado como ferramenta base para esta Dissertação, apresenta uma boa

correlação para a maioria dos espectros de danos radioinduzidos do ADN, o que sugere

que a distribuição espacial de danos elementares do ADN é determinada

primariamente por eventos independentes estocásticos.

A sua rapidez face ao Monte Carlo, em termos de processamento de informação,

possibilita a simulação de um cenário de 100000 células a 1 Gy de radiação em 1.5

minutos num Intel Pentium III Xeon a 2.4 GHz, necessitando de uma memoria de 1.3

megabytes, (Semenenko e Stewart 2004).

Contrariamente a este simulador MCDS, o algoritmo CELLDOSE Monte Carlo para

avaliar os efeitos da radiação em esferas de agua isoladas, necessita de algumas horas

num Pentium 4-EM64T a 3 GHz com 1 Gb de memoria RAM, (Champion 2008).

Em contraste o simulador de radiobiologia a usar (VC – Virtual Cell) fornece

informações sobre sobrevida celular, probabilidade de controlo tumoral, indução a

mutagénese entre outros em apenas alguns minutos.

Existem outros códigos baseados em código Monte Carlo para o estudo dos efeitos da

radiação no ADN, como o GEANT4-DNA, PENELOPE (PENetration and Energy LOss os

Positrons and Electrons), consultar tabela X.

5.3 Vantagens e Desvantagens

Uma das principais vantagens destes simuladores é a sua versatilidade e a capacidade

de em intervalos de tempo reduzidos, por vezes de poucos minutos, obter informação,

de que qualquer outro modo demoraria longos períodos de tempo e exigiriam grande

disponibilidade de recursos e capacidades. Por exemplo, as culturas de células, de

grande utilidade, possibilitam o conhecimento do comportamento e função de uma

população isolada de células, bem como, o estudo de fenómenos impossíveis de

produzir em tecidos intatos, possuem várias características desvantajosas e limitantes,

entre as quais se realçam: gastos elevados em material; dependência das condições de

crescimento da cultura; instabilidade da cultura celular e perda de características de

fenótipo; entre outras.

Em relação às culturas de células, os simuladores computacionais possuem algumas

vantagens; nomeadamente, o facto de permitirem obter informação de uma forma

mais rápida e flexível, possibilitando assim a cobertura de múltiplos parâmetros do

cenário de irradiação em causa num curto ciclo de tempo; não existem as limitações

impostas pela cinética das culturas, isto é, instabilidade, risco de contaminação que

inviabiliza a utilização dos resultados e força os investigadores a repetir todo o

processo; e o custo associado a simulação do processo é largamente inferior, existindo

mesmo simuladores para investigação na área de domínio publico.

Por outro lado, os simuladores também possuem desvantagens, tais como avaliações

estimadas em resultados experimentais prévios e conhecimentos atuais o por

interpolação destes dados, que pode não ser efetivamente verdadeiro no organismo

vivo; e a modelização da cinética celular de forma mecanista, que pode subvalorizar ou

sobrevalorizar certos parâmetros e resultados, por último os simuladores são limitados

a uma gama de entradas de cada parâmetro que nem sempre cobre todos os valores

necessários para os diversos estudos bem como a exigência computacional de alguns

simuladores mais detalhados.

5.4 Monte Carlo Damage Simulation – MCDS

Como referido nos modelos de trilhos estruturais, radiações de baixa LET conduzem à

formação de aproximadamente 1000 quebras simples (SSB) e 40 quebras duplas (DSB)

por gray (GY) numa célula de mamífero típica. O nível de danos provocados e bases é

estimado em 2500 para 25000/Gy/célula e, para além dos danos isolados, a radiação

ionizante tem a capacidade de produzir também múltiplos locais de danos (Multiply

Damage Sites - MDS), que consistem em dois ou mais danos elementares num curto

espaço de hélices enroladas em torno do ADN. As quebras isoladas ou múltiplas em

cada cadeia de ADN são detetadas como SSB na maioria dos ensaios. Por outro lado,

DSB são formadas quando pelo menos duas quebras do ADN se formam em

proximidade nas cadeias opostas do ADN. As DSB e outras classes de MDS são,

geralmente, as causas primárias de indução de apoptose por radiação ou mutagénese.

Informação detalhada sobre o espectro de possíveis configurações de danos induzidos

pela radiação ionizante é frequentemente obtida pelo uso de simuladores de trilos

estruturais Monte Carlo em combinação com modelos geométricos do ADN e da

Cromatina.

O simulador de danos Monte Carlo (MCDS), é um método simplitas e rápido para a

produção do espectro de danos no ADN que apresenta apenas quatro parâmetros

ajustáveis, dois dos quais podem ser restringidos a um intervalo de valores razoáveis

com base em resultados experimentais, (Semenenko e Stewart 2004).

Sendo estes parâmetros: número de quebras/Gy/célula (σSb), número de danos a bases

do ADN/Gy/célula (σBd), comprimento do segmento de ADN medido em pares de bases

(bp)/Gy/célula (nseg) e comprimento mínimo de ADN não danificado entre danos

elementares entre segmentos vizinhos medido em pares de bases (Nmin). O algoritmo

do simulador processa-se em duas fases: 1) distribuição aleatória no segmento de ADN

(parâmetro nseg) do número esperado de danos elementares produzidos numa célula

por uma determinada quantidade e qualidade de radiação e 2) subdivisão da

distribuição de danos elementares no segmento em lesões, sendo aqui determinante o

parâmetro Nmin, consultar figura 8.

Ilustração 8: Representação esquemática do simulador MCDS

O algoritmo do simulador MCDS pode ser descrito pelos seguintes passos:

A primeira fase, distribuição aleatória dos danos do ADN é composta por 5 passos:

1. Computação dos parâmetros para uma específica dose absorvida D (Gy). O

comprimento do segmento por célula é dado por:

𝑁𝑠𝑒𝑔 = 𝑔𝑛𝑠𝑒𝑔𝐷;

Já o número total de quebras por célula é dado por:

𝑆𝑏 = 𝑔𝜎𝑆𝑏𝐷;

Sendo g um fator de escala adimensional que pode ser utilizado para ajustar o

rendimento absoluto das lesões de ADN para melhor mimetizar as

observações experimentais para cada tipo de célula. Quando o tipo de célula é

desconhecido, o valor de g deve ser unitário. Este valor para células

eucarióticas pode ser aproximado a razão entre o conteúdo de ADN da célula

em estudo com o conteúdo da célula de mamíferos (6x109 bp).

O número de danos de base/célula pode ser calculado através do número de

quebras por célula pela equação:

𝐵𝑑 = 𝑓 𝑆𝑏.

•Número de quebras/Gy/célula (σSb)

•Número de danos debases/Gy/célula (σBd)

• Comprimento do segmento de ADN (nseg)

•Comprimento mínimo do segmento não danificado (Nmin)

Parâmetros Inicias

•Distribuição aleatoria dos danos no ADN

1ª Fase

•Subdivisão dos danos em lesões

2ª Fase

2. Seleção aleatória de um par de nucleótidos a partir do segmento de ADN, ou

seja, seleção de um integral distribuído de forma uniforme no intervalo [1,

Nseg].

3. Seleção aleatória da cadeia de ADN (cadeia 1 ou 2). Caso o nucleótido

selecionado não seja danificado, procede-se ao registo da quebra na

localização, caso contrário retorna-se ao passo 2.

4. Criação de um relógio

𝑆𝑏 = 𝑆𝑏 − 1;

𝑆𝑒 𝑆𝑏 > 0 , 𝑟𝑒𝑡𝑜𝑟𝑛𝑎𝑟 𝑎𝑜 𝑝𝑎𝑠𝑠𝑜 2.

5. Repetição dos passos 2 a 5 para os danos nas bases.

Na segunda fase do algoritmo, subdivisão dos danos em lesões, Nmin é o parâmero que

determina a forma de agrupamento dos danos elementares em lesões, segundo a

propriedade de que danos separados por pelo menos Nmin pares de bases são tratados

como lesões diferentes, consultar figura 9.

Ilustração 9: Representação esquemática do processo de agrupamento de danos em lesões (Semenenko e

Stewart 2004)

O algoritmo da segunda fase é descrito nos seguintes quatro passos:

1. Iniciar a contagem no fim o segmento de ADN e localizar o primeiro dano

elementar em cada uma das cadeias de ADN o em ambas. Iniciar a lesão do

ADN aquando da localização do dano elementar ou dos diversos danos

elementares.

2. Começando no par de base apos o ultimo dano elementar identificado,

proceder à movimentação ao longo do segmento de ADN, na mesma direção e

contar o número de pares de bases não danificadas antes do próximo dano

elementar detetado. Caso o fim do segmento seja atingido antes de se

encontrar outro dano elementar, considerar a lesão do ADN na localização do

último dano detetado e finalizar o processo.

3. Caso o número de pares de base não danificadas for ≥Nmin registar o fim da

poção da lesão na última localização de dano elementar detetado. De seguida

registar a posição de início da próxima lesão na localização do ultimo dano

elementar desta.

4. Retornar o passo 2.

Uma vez concluído o processo de agrupamento dos danos elementares do ADN em

lesões, estas podem ser analisadas em termos de natureza de distribuição espacial dos

danos elementares que as formam, (Semenenko e Stewart 2004).

O estudo realizado por Semenko e Stewart em 2004 onde comparam o desempenho

deste simulador com outros aceites pela comunidade cientifica mostram resultados

muito semelhantes em todas as gamas de radiações utilizadas, tornando este

simulador muito útil devido a sua simplicidade e rapidez a juntar a sua eficiência nos

resultados, consultar imagem 10.

Ilustração 10: Comparação do espectro de danos obtido com o método de Monte Carlo rápido e detalhado

(Semenenko e Stewart 2004)

5.4.1 Informação de Entrada e Saída

O simulador MCDS consiste num algoritmo simplificado do código Monte Carlo re-

parametrizado de forma a fornecer informação (outputs) sobre o rendimento das

lesões no ADN (DSB, SSB e locais de múltiplos danos de bases) após simulação com

eletrões, protões e partículas alfa de diferentes radioisótopos. Os ficheiros de saída

fornecem informação sobre as características de várias classes de danos do ADN,

incluindo o número médio de lesões por conjunto de danos do ADN e comprimento

medio do conjunto de danos em pares de bases (bp).

Para a realização da simulação basta intro

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