AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES GENOTÓXICA, ANTIGENOTÓXICA ... · Cumarinas e chalconas são...

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

LABORATÓRIO DE RADIOBIOLOGIA E MUTAGÊNESE

AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES GENOTÓXICA, ANTIGENOTÓXICA,

MUTAGÊNICA, ANTIMUTAGÊNICA E RECOMBINOGÊNICA DO

HÍBRIDO CUMARINA-CHALCONA (7-METOXI-3-(E)-3-(3,4,5-

TRIMETOXIFENIL)ACRILOIL)-2H-CROMEN-2-ONA) EM BACTÉRIAS,

CAMUNDONGOS E DROSOPHILA MELANOGASTER

CAMILA REGINA DO VALE

GOIÂNIA-GO

2017

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GOIÂNIA-GO

2017

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências Biológicas do Instituto de Ciências Biológicas

da Universidade Federal de Goiás, como requisito

parcial para obtenção do título de Doutor em Ciências

Biológicas.

Área de Concentração: Bioquímica e Genética.

Orientadora Profa. Dra. Lee Chen Chen

Co-Orientador Prof. Dr. Guilherme Roberto de Oliveira

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BANCA EXAMINADORA

_____________________________________________ Profa. Dra. Lee Chen Chen

Universidade Federal de Goiás

_____________________________________________ Profa. Dra. Carolina Ribeiro e Silva


_____________________________________________ Profa. Dra. Cristiene Costa Carneiro

Pontifícia Universidade Católica de Goiás

_____________________________________________ Prof. Dr. Paulo Roberto de Melo Reis

Pontifícia Universidade Católica de Goiás

_____________________________________________ Prof. Dra. Wanderlene Blanco Nunes


Aprovada em: ____/____/_____

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente meu agradecimento é para Deus por tudo que tens feito em minha

vida.

À minha orientadora Prof.ª Dr.ª Lee Chen Chen, pela oportunidade e por me orientar

desde o mestrado. Agradeço pela confiança depositada, pelo conhecimento

compartilhado, pela paciência e carinho dispensado.

Ao Prof. Dr. Guilherme Oliveira, meu co-orientador, pelas contribuições para a

realização deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Salvador de Carvalho pela amizade, carinho e todos os ensinamentos.

Aos professores da banca por dedicarem um pouco do seu tempo na análise desta

tese, contribuindo com preciosas sugestões para o seu engrandecimento.

Às minhas mães Maria Aparecida do Vale (in memoriam) e Florentina Santos do Vale

principais responsáveis pela minha formação, oferecendo todas as condições, seja

financeira ou moral, que me permitiram alcançar esse objetivo.

Às minhas tias Maria Madalena do Vale Pereira e Zélia Maria do Vale por todo carinho,

apoio e orações.

Ao meu querido e amado esposo Rafael Guimarães Dias por ser tudo que eu sempre

precisei e meu companheiro de todas as horas a qual quero viver junto o resto da

minha vida.

À amiga-irmã Débora Cristina da Silva Lima, companheira de vida, pois nossa

amizade vai muito além da vida acadêmica, obrigada pelo carinho, apoio em tudo.

Ao mestre Murilo Machado dos Anjos pela ajuda na síntese do composto.

Ao Jefferson Hollanda Véras pelo apoio e por contribuir muito com a realização do

trabalho.

Aos amigos do Laboratório de Radiobiologia de Microorganismos e Mutagênse Aroldo

Vieira de Moraes Filho, Carolina Ribeiro e Silva, Cristiene Costa Carneiro, Rangel

Moreira Silva pela ajuda com os experimentos e pelo companheirismo.

À todos os demais amigos e colegas do laboratório, por toda colaboração com as

atividades e por tornarem o cotidiano tão agradável.

À toda equipe de profissionais do Colégio Cruzeiro do Sul e em especial à diretora

Vilma Lemes e às coordenadoras Eduvirgens Maria dos Santos Neves e Márcia Alves

Almeida por todo apoio e incentivo.

À FAPEG pelo auxílio financeiro concedido.

À Universidade Federal de Goiás pela formação acadêmica.

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Sumário

Resumo ..................................................................................................................... 10 Abstract........ ........ ............ ........ ........ ....... ..... ........ ........ ... ......... .....12

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 14 1.1. Cumarinas e Chalconas ..................................................................................... 14 1.2. Mutagenicidade e Genotoxicidade ..................................................................... 17 1.3. Antimutagenicidade/ Antigenotoxicidade ............................................................ 19 1.4. Ensaios de Genética Toxicológica para Avaliação dos Efeitos Mutagênicos e Antimutagênicos de Composto...................................................................................20 1.4.1. Teste de mutagenicidade com Salmonella typhimurium (Teste de Ames) ...... 21 1.4.2. Teste do Micronúcleo em Medula Óssea de Camundongos ........................... 24 1.4.3. Ensaio Cometa ou Single Cell Gel Electrophoresis (SGE) .............................. 27 1.4.4. Teste para Detecção de Mutação e Recombinação Somática (Somatic Mutation and Recombination Test- SMART). ........................................................................... 30 2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 34 2.1. Objetivo Geral .................................................................................................... 34 2.2. Objetivos Específicos ......................................................................................... 34 3. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 35 3.1. Experimento Químico ......................................................................................... 35 3.1.1. Síntese de 4-MET ........................................................................................... 35 3.1.2. Híbrido cumarina-chalcona (4-MET) ............................................................... 35 3.1.3. Síntese do híbrido cumarina-chalcona (4-MET) .............................................. 35 3.1.3.1. Preparação do 3-acetil-7-metoxi-2H-chromen-2-ona ................................... 36 3.1.3.2. Preparação do híbrido de cumarina-chalcona (4-MET) ................................ 36 3.2. Experimentos Biológicos .................................................................................... 37 3.2.1. Teste de Mutagenicidade de Ames em cepas de S. typhimurium ................... 37 3.2.1.1. Cepas bacterianas........................................................................................ 37 3.2.1.2. Meios de cultura, reagentes e soluções ....................................................... 37 3.2.1.3. Controles ...................................................................................................... 39 3.2.1.4. Procedimento experimental .......................................................................... 39 3.2.1.5. Análise estatística ........................................................................................ 40 3.2.2. Teste em Camundongos ................................................................................. 41 3.2.2.1. Protocolos de Tratamento dos Animais ........................................................ 41 3.2.2.2. Teste do Micronúcleo em Medula Óssea ..................................................... 42 3.2.2.3. Ensaio Cometa ............................................................................................. 43 3.2.2.4. Análise Estatística dos Testes Micronúcleo e Cometa ................................. 45 3.2.4. Teste SMART .................................................................................................. 45 3.2.4.1. Linhagens de Drosophila melanogaster ....................................................... 45 3.2.4.2. Agentes Químicos ........................................................................................ 46 3.2.4.2. 1. Controles .................................................................................................. 46 3.2.4.2.2. Meios de Cultura e Condições de Cultivo .................................................. 46 3.2.4.3. Cruzamentos ................................................................................................ 46 3.2.4.4. Procedimento Experimental - Tratamento Crônico ....................................... 47 3.2.4.5. Análise citogenética...................................................................................... 48 3.2.4.6. Análise Estatística ........................................................................................ 48 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 50 8. PRODUÇÃO CIENTÍFICA ..................................................................................... 63 8.1. Manuscrito submetido à revista Plos One (ISSN: 1099-1263): Teste de Ames, Micronúcleo e Cometa .............................................................................................. 63

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8.2. Manuscrito a ser submetido à revista Científica: SMART/asa. ........................... 88 9. CONCLUSÃO GERAL......................................................................................... 112 ANEXO 1: Parecer Favorável do Comitê de Ética......................................................................................................................... 113

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AS Azida sódica

ANOVA Análise de variância

CIF Ciclofosfamida

DMSO Dimetilsulfóxido

DP Desvio padrão

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

ENC Eritrócitos normocromáticos

EPC Eritrócitos policromáticos

EPCMN Eritrócitos policromáticos micronucleados

FDA Food and Drug Administration

i.p. Intraperitoneal

IM Índice de mutagenicidade

MN Micronúcleo

MMC: Mitomicina C

4NQO 4-nitroquinolina 1-óxido

OTM Momento da cauda de Olive

PBS Tampão salina fosfato

p.c. Peso corpóreo

PI Porcentagem de inibição da mutagenicidade

RM Razão de mutagenicidade

SCGE Eletroforese em gel de célula única alcalina

SMART Somatic Mutation and Recombination Test

TRIS Tris-hidroximetilaminometano

4-MET- Híbrido Cumarina-Chalcona (7-metoxi-3-(E)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil-2H-

cromen-2-ona)

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LISTA DE FIGURAS Figura 1: Núcleo fundamental das cumarinas ...................................................... 14 Figura 2: Núcleo fundamental das chalconas ....................................................... 15 Figura 3: Estrutura Química do of (E)-7-metoxi-3-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil-2H-cromen-2-ona ou 4-MET ....................................................................................... 16 Figura 4: Esquema do teste de mutagenicidade de Ames. Colônias de revertentes são contadas após exposição a substâncias tratadas (Zanoni, 2010) .................. 22 Figura 5: Processo de maturação das células da linhagem eritrocitária (Ribeiro, 2003) .............................................................................................................................. 26 Figura 6: Formação de micronúcleos em eritrócitos da medula óssea (Ribeiro, 2003) .............................................................................................................................. 26 Figura 7: Fotomicrografia de eritrócitos da medula óssea de camundongos. ...... 29 Figura 8: Imagens de cometas células do fígado após tratamento com mutágenos26 Figura 9: Fenótipos dos pelos de D. melanogaster (microscopia eletrônica) ....... 32 Figura 10: Linhagens teste de D. melanogaster ................................................... 33 Figura 11: Fotomicrografia mostrando pelos múltiplos, flare (seta A) e mancha gêmea .............................................................................................................................. 33 Figura 12: Estrutura Química do (E)-7-metoxi-3-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil-2H-cromen-2-ona ou 4-MET 1 .................................................................................... 35 Figura 13: Síntese de 4-MET 1 de 1 from 3-acetil-7-metoxi-2H-cromen-2-ona 2. Reagentes e condições ......................................................................................... 36 Figura 14: Representação dos Experimentos Realizados em Camundongos ...... 42 Figura 15: Tela de captura do software Open Comet, versão 13 ......................... 44

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LISTA DE TABELAS Tabela 1: Means ± standard deviation (SD) of histidine revertant colonies (obtained from three independent experiments carried out in triplicate.....................................74 Tabela 2: Effects of treatments with different doses of the coumarin-chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-chromen-2-one (4-MET) on the frequency of micronucleated polychromatic erythrocytes (MNPCE) and polychromatic/normochromatic erythrocytes ratio (PCE/NCE) in bone marrow cells of mice ................................... ....................................................................................77 Tabela 1: Frequency of mutant spots observed in somatic cells of marker-heterozygous (mwh/flr3) Drosophila melanogaster descendants of standard cross (ST) and high bioactivation cross (HB) treated with four different concentrations (5, 50, 100, and 400 µg /mL) of the coumarin–chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-cromen-2-one (4-MET) ........................................... 96 Tabela 2: Frequency of mutant spots observed in marker-heterozygous (mwh/flr3) and balancer-heterozygous (mwh/TM3) Drosophila melanogaster descendants of standard cross (ST) co-treated with four different concentrations (5, 50, 100, and 400 µg /mL) of the coumarin–chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-cromen-2-one (4-MET) and mitomycin C (MMC)……………………………………98 Tabela 3: Frequency of mutant spots observed in marker-heterozygous (MH) and balancer-heterozygous (BH) Drosophila melanogaster descendants of high bioactivation cross (HB) co-treated with four different concentrations (5, 50, 100, and 400 µg /mL) of the coumarin–chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-cromen-2-one (4-MET) and mitomycin C (MMC)........99

10

RESUMO

Cumarinas e chalconas são moléculas derivadas de compostos fenólicos e que

podem ser sintetizadas por fungos, bactérias e plantas. Além disso, também podem

ser sintetizadas em laboratório. Esses compostos exercem diversas atividades

biológicas, tais como: antioxidante, anti-inflamatória, antiviral e antitumoral. Com base

na relevância das cumarinas e chalconas, o objetivo do presente estudo consistiu em

avaliar as atividades genotóxica, antigenotóxica, mutagênica e antimutagênica de um

híbrido sintético de cumarina-chalcona, 7-metoxi-3-(E)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil-

2H-cromen-2-ona (4-MET), utilizando o método in vitro teste de Ames e três métodos

in vivo: teste do micronúcleo e ensaio cometa em medula óssea de camundongos

utilizando três tratamentos (pré, co e pós-tratamento) e teste SMART/asa em

Drosophila melanogaster. No teste de mutagenicidade de Ames não foi observado um

aumento significativo no número de revertentes prototróficas em cepas de Salmonella

typhimurium TA98 e TA100 (p > 0,05), desta forma demonstrando ausência de ação

mutagênica. Na avaliação antimutagênica pelo teste de Ames, 4-MET apresentou

atividade antimutagênica em todas as doses e nas duas cepas testadas (p < 0,05). Os

resultados do teste do micronúcleo mostraram que a concentração de 50 mg/kg de 4-

MET não aumentou a frequência de eritrócitos policromáticos micronucleados

(EPCMN) nos dois tempos (24 h e 120 h) testados, evidenciando ausência de efeito

mutagênico deste composto. Não houve diminuição na razão de eritrócitos

policromáticos/normocromáticos (EPC/ENC) no tempo de 24 h, indicando ausência

de ação citotóxica de 4-MET. No entanto, para o tempo de 120 h houve diminuição na

razão EPC/ENC, mostrando atividade citotóxica. Na avaliação da antimutagenicidade

pelo teste do micronúcleo, 4-MET diminuiu significativamente a frequência de EPCMN

em ambas as doses testadas (25 e 50 mg/kg) nos três tipos de tratamento (pré, co e

pós-tratamento), demonstrando ação antimutagênica (p < 0,05). Além disso, 4-MET

aumentou a razão de EPC/ENC na dose de 50 mg/kg em co e pós-tratamento,

evidenciando seu efeito anticitotóxico. No ensaio cometa, 4-MET não aumentou

significativamente o número de danos no DNA na concentração de 50 mg/kg (p >

0,05), demonstrando ausência de atividade genotóxica. Entretanto, na avaliação da

antigenotoxicidade de 4-MET, em todos os tratamentos houve diminuição no número

de danos no DNA (p < 0,05) em ambas as doses utilizadas (25 e 50 mg/kg), indicando

atividade antigenotóxica. Na avaliação das atividades mutagênica e recombinogênica

pelo SMART, em nenhuma das concentrações utilizadas (5, 50, 100 e 400 μg/mL)

11

houve efeito mutagênico e/ou recombinogênico nos cruzamentos padrão (ST) e

aprimorado (HB). Atividades antimutagênica e anti-recombinogênica foram

observadas em todas as doses para ambos os cruzamentos (p < 0,05). Com base nos

resultados obtidos, bem como em estudos descritos na literatura acerca das

atividades de cumarinas e chalconas, podemos inferir que as atividades

antigenotóxica, antimutagênica e antirecombinogênica observadas no presente

estudo podem ser atribuídas, pelos menos parcialmente, à estrutura química do

híbrido cumarina-chalcona 4-MET, que possibilita sua interação com moléculas

bioativas e sua atividade antioxidante.

Palavras-chave: Antigenotoxicidade. Antimutagenicidade. Anti-

recombinogenicidade. Genotoxicidade. Mutagenicidade. Quimioprevenção.

12

ABSTRACT

Coumarins and chalcones are molecules derived from phenolic compounds that can

be synthesized by fungi, bacteria, and plants. In addition to this, these molecules can

also be synthesized in laboratory. These compounds are known to have multiple

biological activities such as antioxidant, anti-inflammatory, antiviral and anti-tumoral

activities. Based on the relevance of coumarins and chalcones, the aim of the present

study was to evaluate the genotoxic, antigenotoxic, mutagenic, and antimutagenic

activities of a coumarin-chalcone synthetic hybrid, 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-

trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-cromen-2-one (4-MET), using the in vitro Ames

Mutagenicity test and three in vivo methods: the micronucleus test and the comet

assay in mice bone marrow using three treatments (pre-, co-, and post-treatment) and

the SMART/wing test in Drosophila melanogaster. In the Ames mutagenicity test, at

none of the doses of 4-MET tested (1, 10, 50, 100, and 500 μg/plate) did not showed

an increase in the number of His+ revertants in Salmonella typhimurium tester strains

TA98 and TA100 (p > 0.05), thus demonstrating lack of mutagenic action. In the

antimutagenic evaluation of the Ames test, 4-MET presented antimutagenic activity at

all doses and both strains tested (p < 0.05). The results of the micronucleus test

showed that the dose of 50 mg/kg of 4-MET did not increase the frequency of

micronucleated polychromatic erythrocytes (MNPCE) at both times tested (24 h and

120 h), evidencing lack of mutagenic effect of this compound. The

polychromatic/normochromatic erythrocyte ratio (PCE/NCE) did not decrease at 24 h,

indicating lack of cytotoxic action of 4-MET. However, at 120 h, PCE/NCE ratio

decreased, showing cytotoxic effect. In the assessment of antimutagenicity using the

micronucleus test, 4-MET significantly decreased the frequency of MNPCE at both

doses tested (25 and 50 mg/kg) and in the three treatments (pre-, co- and post-

treatment), demonstrating antimutagenic action (p < 0.05). Moreover, 4-MET

increased PCE/NCE ratio at the dose of 50 mg/kg in co- and post-treatment,

evidencing its anticytotoxic effect. In the comet assay, 4-MET did not significantly

increase DNA damage at the dose of 50 mg/kg (p > 0.05), demonstrating lack of

genotoxic activity. Nonetheless, in the antigenotoxicity assessment of 4-MET in all

treatments a significant decrease in DNA damage (p < 0.05) was observed at both

doses tested (25 and 50 mg/kg), indicating antigenotoxic activity. In the evaluation of

the mutagenic and recombinogenic activities using SMART, at none of the

concentrations used (5, 50, 100, and 400 μg/mL) mutagenic and/or recombinogenic

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effects were found in the standard (ST) and bioactivation (HB) crosses. Antimutagenic

and antirecombinogenic activities were observed at all doses in both crosses (p >

0.05). Based on the results obtained and also studies carried out in the literature about

coumarins and chalcone, it was possible to infer that the antigenotoxic, antimutagenic,

and antirecombinogenic activities observed in the present study may be, at least

partially, attributed to the chemical structure of the coumarin-chalcone hybrid 4-MET,

which allows its interaction with bioactive molecules and its antioxidant activity.

Keywords: Antigenotoxicity. Antimutagenicity. Antirecombinogenicity,

Chemoprevention. Genotoxicity. Mutagenicity.

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1. INTRODUÇÃO

1.1. Cumarinas e Chalconas

O conhecimento sobre as plantas e a descoberta de suas possíveis

propriedades curativas acompanhou a evolução do homem por meio dos tempos e

têm revelado amplo potencial no tratamento de numerosas doenças (Gaspi, 2011;

Kaur et al., 2012). Diversos produtos derivados de plantas têm sido empregados como

matéria-prima para a síntese de substâncias bioativas e contribuído para a obtenção

de novos agentes terapêuticos. Esses agentes podem, muitas vezes, ser obtidos mais

facilmente e a custos menores (Chiaradia, 2006, Silva, 2015). Dentre essas

substâncias extraídas de plantas, podem-se inserir as cumarinas e as chalconas.

As cumarinas representam uma grande classe de compostos fenólicos naturais

encontrados principalmente em plantas, mas também com ocorrência em fungos e

bactérias. Nas plantas, são encontradas, predominantemente, em angiospermas. As

cumarinas são lactonas do ácido o-hidroxi-cinâmico, e o principal representante é a

1,2-benzopirona, denominada simplesmente de cumarina (Figura 1). Esses

constituintes vegetais são derivados do metabolismo da fenilalanina, tendo como

precursores iniciais os ácidos cinâmico e o p-hidroxi-cinâmico, a partir dos quais as

cumarinas e seus derivados são biossintetizados por diferentes vias (Witaicenis et al.,

2014).

Figura 1: Núcleo fundamental das cumarinas

Esse composto vem se tornando alvo atrativo para síntese orgânica e também

para indústria farmacêutica, principalmente devido à baixa toxicidade, valor nutricional

e relativa facilidade de síntese e baixo custo (Al-Amiery et al., 2012).

Atualmente, as cumarinas têm estado em destaque devido à ampla gama de

atividades biológicas deste composto, tais como, anti-inflamatória (Lee et al., 2011;

Witaicenis et al., 2014), antitumoral (Huang et al., 2011; Musa et al., 2011; Gacch e

15

Jadhav, 2012; Bubols et al., 2013), hepatoprotetora, antialérgica, anti HIV-1 (Musa et

al., 2011; Bubols et al., 2013; Slapsyte et al., 2013), antiviral, antifúngica,

antimicrobiana, antiasmática, antioxidante (Kaur et al., 2012; Anand et al., 2012;

Slapsyte et al., 2013), antinociceptiva (Barros et al., 2010), antidiabética,

antidepressiva (Sashidhara et al., 2011), antigenotóxica e anticoagulante (Musa et al.,

2011).

Outra importante classe de compostos naturais bioativos são as chalconas

(Kandaswamy e Raveendiran, 2014). Quimicamente, as chalconas podem ser

definidas como cetonas aromáticas α-β-insaturadas com dois anéis aromáticos, um

ligado diretamente à função cetona e outro à dupla ligação, conectados por uma

cadeia aberta de três átomos de carbono, ficando conjugados uma porção olefínica e

um grupamento carbonílico (Figura 2) (Sakirolla et al., 2012).

Figura 2: Núcleo fundamental das chalconas

As chalconas são amplamente distribuídas em frutas, legumes, especiarias,

chá e soja (Sakirolla et al., 2012). Esses compostos têm recebido grande atenção

devido à abundância em plantas e facilidade de obtenção (Sashidhara et al., 2010).

As chalconas apresentam diversas atividades biológicas, tais como: atividade

antimutagênica (Silva et al., 2015), anti-inflamatória (Reddy et al., 2011), antifibrótica

(Lee et al., 2011), antibacteriana (Mascarello et al., 2010), antiprotozoária (Aponte et

al., 2010) e antioxidante (Xue et al., 2012; Kandaswamy e Raveendiran, 2014).

Derivados de chalconas apresentaram atividade citotóxica e antimitótica. Esses

compostos são capazes de se ligar ao sítio da colchicina na β-tubulina, inibindo,

assim, a sua polimerização. Consequentemente, os microtúbulos, elementos

celulares essenciais ao processo de mitose, não são formados (Dyrager et al., 2011;

Ruan et al., 2011).

16

As atividades biológicas de cumarinas e chalconas estão relacionadas,

principalmente, à atividade antioxidante e interação com várias enzimas, tais como

glutationas e peroxidases (Bubols et al., 2013; Kandaswamy e Raveendiran, 2014;

Sandhu et al., 2014). Cumarinas são potentes agentes sequestradores de espécies

reativas de oxigênio (EROS) e são agentes quelantes de metais (Marques et al.,

2015). Chalconas mostram atividade antioxidante contra os radicais tanto hidroxila e

peroxila (Kandaswamy e Raveendiran, 2014).

Em virtude da importância considerável desses dois compostos naturais,

cumarinas e chalconas, e das propriedades biológicas destas moléculas, um conjunto

de híbridos de cumarina-chalcona recentemente estão sendo sintetizados e

estudados (Datta et al, 2011; Zhang et al., 2011; Xue et al., 2012 Kandaswamy e

Raveendiran, 2014; Witaicenis et al., 2014; Arsenyan et al., 2015; Marques et al.,

2015; Xi e Liu, 2015). Na concepção de novos agentes bioativos, o desenvolvimento

de moléculas híbridas por meio da combinação de diferentes compostos pode

conduzir perfis biológicos interessantes (Sashidhara et al., 2010; Pingaew et al., 2014;

Sandhu et al., 2014). Essas moléculas combinadas, provavelmente, oferecem

algumas vantagens, tais como: superação da resistência a medicamentos e melhoria

da eficiência biológica, podendo ser utilizado no tratamento de numerosas doenças

(Pingaew et al., 2014; Sandhu et al., 2014). Ressalta-se, assim, a importância do

estudo realizado nesta tese, onde foi sintetizado e avaliado as atividades biológicas

de um novo híbrido de chalcona-cumarina, 4-MET (Figura 3).

Figura 3: Estrutura Química de (E)-7-metoxi-3-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil-2H-

cromen-2-ona ou 4-MET.

Apesar das diversas atividades biológicas e do uso generalizado de cumarinas

e/ou chalconas, pesquisas sobre a sua genotoxicidade ou efeitos protetores são

parcialmente contraditórios e escassos (Fedato e Maistro, 2012), demonstrando

17

assim, a necessidade e importância de avaliações precisas os efeitos biológicos

desses compostos.

1.2. Mutagenicidade e Genotoxicidade

A informação genética dos organismos vivos está armazenada em moléculas

de DNA e RNA. Essa informação é conservada e transmitida para cada célula por

sucessivas gerações por meio de um processo de replicação fiel e preciso (Snustad e

Simmons, 2013). A fidelidade desse processo é assegurada por várias respostas

celulares aos danos genéticos que podem ocorrer, como paralisação do ciclo celular,

indução de mecanismos de reparo e apoptose. Ainda assim, algumas alterações

presentes no DNA podem não ser reparadas e serão fixadas como mutações (Levitt

et al., 2007).

Mutações são alterações súbitas e hereditárias no material genético de um

organismo (Nelson e Cox, 2014). Tais alterações podem ser decorrentes de processos

celulares normais (espontâneas) ou podem ser induzidas pela exposição a agentes

físicos, químicos biológicos e também pelo estresse oxidativo (Olinsk et al., 2002,

Wogan et al., 2004).

Os organismos vivos estão, frequentemente, expostos a diversos agentes

físicos, químicos e biológicos que podem causar danos celulares. Os danos podem

afetar processos vitais como a duplicação e a transcrição gênica, podendo levar a

processos neoplásicos ou à morte celular. Pelo fato de causarem lesões no material

genético, essas substâncias são conhecidas como substâncias mutagênicas e/ou

genotóxicas (Kovacica e Somanathana, 2014).

Os agentes que causam mutações podem ser basicamente classificados em

autobióticos ou xenobióticos. Os autobióticos são mutágenos endógenos, a exemplo

das espécies reativas de oxigênio (EROs) produzidas in vivo. Os xenobióticos são

mutágenos existentes no ambiente externo, sendo, portanto, estranhos ao sistema

biológico, tais como contaminantes (poluentes do ar e da água), alimentares (aminas

heterocíclicas, aditivos e concervantes) e os relacionados com o estilo de vida

(nitrosaminas, tabaco e álcool) (Kryston et al., 2011).

Um agente mutagênico pode desencadear diversas respostas de acordo com

o organismo afetado (Gatehouse, 1990). Isso ocorre devido a uma série de fatores,

como ativação metabólica (pró-mutágenos), processo de detoxificação de compostos

18

químicos, variedade de sistemas de reparo e efeito do mutágeno na célula (Klaassen

e Watkins,1999). Os agentes mutagênicos podem induzir mudanças genômicas por

interagir diretamente com o DNA ou por interagir com proteínas envolvidas na

manutenção da integridade do genoma (Zaha, 2014).

Alguns agentes mutagênicos podem exercer mais de um mecanismo de ação,

que depende de vários fatores, incluindo a natureza das alterações no DNA

(modificações de base, de resíduos de açúcar, de fosfato ou quebras nos filamentos

de DNA), e os subsequentes efeitos secundários causados pela resposta do

organismo a essas modificações. Esses efeitos secundários podem incluir a ação de

várias formas de reparo do material genético e a duplicação de cromossomos sobre

moldes modificados (Nias, 1998; Dowd e Tilson, 1999; Zaha, 2014).

Existem dois tipos de mutações, quanto a estrutura do material genético, as

mutações gênicas e as cromossômicas (Frank, 2010). As mutações gênicas são

ocasionadas por substituição de bases (transições e transversões), frameshifts,

inserções, deleções e translocações. As alterações cromossômicas podem estar

relacionadas à estrutura do cromossomo em consequência de deleções, duplicações,

inversões e translocações ou ao número de cromossomos em decorrência de falhas

na citocinese, por não disjunção mitótica. (Olivier et al., 2010)

As mutações também podem ser classificadas de acordo com o tipo de célula

afetada em germinativas ou somáticas. As mutações nas células germinativas são

responsáveis por produzir mudanças na hereditariedade, acarretando o

desenvolvimento de efeitos teratogênicos e de desordens hereditárias. As mutações

em células somáticas podem estar envolvidas na patogênese de algumas doenças

crônico-degenerativas, tais como as cardiovasculares (arteriosclerose) e

neurodegenerativas (Alzheimer). Além disso, as mutações somáticas estão

intrinsecamente relacionadas com o processo de carcinogênese (Carter et al., 2012;

Khalil, 2014).

Mutações atuam em diversas etapas do processo de carcinogênese (Yong et

al., 2014) A mutação pode ser o primeiro estágio no processo de formação de um

tumor (O’Connor, 2015). Dessa forma, ensaios que detectam componentes

genotóxicos permitem identificar substâncias com risco potencial para

desenvolvimento de neoplasias nos seres humanos. Isso revela a importância de

trabalhos de avaliação da genotoxicidade de diferentes compostos.

19

Estudos epidemiológicos têm mostrado que há relação entre o

desenvolvimento de neoplasias e hábitos alimentares, pois a dieta é uma das

principais vias de exposição do organismo a diferentes componentes mutagênicos

e/ou carcinogênicos (Ahmed et al., 2013). Acredita-se que um terço de todos os

cânceres humanos possa estar relacionado ao hábito alimentar (Ferrini et al., 2015).

Diante desse cenário, várias pesquisas científicas ressaltam a necessidade de

mudanças nos hábitos alimentares da população na tentativa de minimizar os riscos

de desenvolvimento de câncer. Para tanto, observa-se uma tendência geral de se

investigar o efeito genotóxico, carcinogênico, embriotóxico e/ou teratogênico de

substâncias químicas, especialmente os presentes em alimentos (Hussain et al.,

2001).

1.3. Antimutagenicidade/ Antigenotoxicidade

Fatores da dieta têm grande importância na metabolização e detoxificação de

compostos químicos genotóxicos, podendo diminuir assim a taxa de danos

acumulados no DNA e ser utilizados na prevenção de doenças (Bárta et al., 2006). Já

se conhecem que diversos componentes utilizados na dieta oriundos de produtos

naturais e/ou sintéticos podem proteger o DNA de um dano ou modularem a ação de

agentes genotóxicos. Essas substâncias são denominadas agentes antigenotóxicos

ou antimutagênicos (Rigo, 2009).

O termo “antimutagênico” foi usado, originalmente, em 1952 para descrever os

agentes que reduzem a frequência de mutações espontâneas ou induzidas,

independentemente do mecanismo envolvido (Von Borstel et al., 1996, Carneiro,

2016). Os estudos com agentes antimutagênicos se iniciaram na década de 1950,

porém somente a partir da década de 1990 o interesse se concentrou na identificação

de agentes antimutagênicos de origem natural (Wargovich, 1997).

Antimutágenos têm sido descritos, principalmente, em frutas e legumes (Vieira

et al., 2015). Diversos metabólitos presentes em plantas impedem ou atenuam a

ocorrência de processos mutagênicos. Dentre esses estão o ácido ascórbico (vitamina

C), ácidos graxos, ácidos linoleicos conjugados, o ácido p-aminobenzóico (PABA), as

clorofilas e seus derivados, cumarinas, flavonoides, fibras dietéticas, fitoestrógenos,

as glutationas, os isotiocianetos aromáticos, a N-acetil-I-cisteína, taninos, tocoferóis

(vitaminas E) e outros (Hiramatsu et al., 2004).

20

As plantas possuem metabólitos secundários com inúmeras funções, dentre

elas a captura de radicais livres, proteção contra radiação Ultravioleta (UV) e contra o

ataque de patógenos. Esses metabólitos podem ser antioxidantes naturais que

previnem os danos oxidativos ao DNA e, portanto, podem ser considerados agentes

antimutagênicos (Kris-etherton et al., 2002; Malins et al., 2002; Khan et al., 2005).

Atualmente, diversos metabolitos extraídos de plantas estão sendo utilizados

para a quimioprevenção. A quimioprevenção consiste na suplementação da dieta com

alimentos, medicamentos e compostos naturais para reverter ou suprimir o processo

de formação do câncer. As estratégias de quimioprevenção almejam prevenir ou

interromper cada uma das etapas da carcinogênese. A estratégia anti-iniciação

consiste em inibir alterações e induzir reparos na molécula de DNA. A estratégia de

anti-promoção consiste em realizar a detoxificação, como por exemplo, o sequestro

de radicais livres e de metabólitos carcinogênicos. A estratégia de anti-progressão

consiste em suprimir a proliferação, aumentar a imunidade, reduzir o processo

inflamatório e aumentar a apoptose (Namasivayam, 2011).

A quimioproteção, por meio dos componentes da dieta, requer não apenas

avaliação da segurança e eficácia dos possíveis agentes quimiopreventivos em

modelos animais e em humanos, mas também maior conhecimento dos possíveis

mecanismos de ação (De Flora e Ferguson, 2005). Para isso, diversos sistemas testes

estão disponíveis permitindo assim identificar estes agentes protetores (Antunes e

Araújo, 2000).

As metodologias clássicas para avaliar a genotoxicidade de agentes químicos

e físicos podem ser empregadas para avaliação e identificação de agentes

antigenotóxicos. Assim, ensaios com células de microrganismos ou de mamíferos têm

sido amplamente utilizados tanto nos estudos de genotoxicidade como nos de

antigenotoxicidade (Luiz, 2002).

1.3. Ensaios para a Avaliação dos Efeitos Mutagênicos e Antimutagênicos de

Compostos

Existem diversos ensaios que detectam compostos genotóxicos e/ou

antigenotóxicos (Umbuzeiro e Vagas, 2003). Esses ensaios detectam mutações

gênicas e danos cromossômicos. Essa possibilidade de avaliar diversos tipos de

lesões tem fortalecido a importância dos testes de genotoxicidade (Ribeiro e Marques,

21

2003). Esses ensaios podem avaliar o aumento e/ou diminuição da frequência de

lesões e/ou mutações induzidas em relação à frequência basal (Westman, 2006).

Muitos dos testes de detecção de atividades genotóxicas têm sido propostos

para identificação de possíveis agentes carcinógenos (Zeiger, 1998), visto que os

testes de mutagenicidade são referenciais para carcinogenicidade (Erdtmann, 2003).

Além disso, o conhecimento de substâncias capazes de modular os efeitos

genotóxicos de agentes químicos e físicos também é de grande importância, porque

podem auxiliar no entendimento dos mecanismos de ação desses agentes

genotóxicos e contribuir na diminuição das alterações gênicas que possivelmente

resultam no aparecimento de doenças, tais como câncer (Takahashi et al., 2001).

No presente estudo, foram realizados testes de genética toxicológica, in vitro e

in vivo, visando investigar o efeito de 4-MET sobre os principais tipos de danos ao

DNA. Foram realizados um ensaio bacteriano: o Teste de mutagenicidade de Ames,

um teste em D. melanogaster o teste para a detecção de mutação e recombinação

somática (SMART/asa) em D. melanogaster (SMART/asa) e dois ensaios em

camundongos: o teste do micronúcleo e o ensaio do cometa. Os ensaios como o teste

de Ames, teste SMART/asa, teste do micronúcleo e o ensaio cometa são amplamente

utilizados e adequados para a avaliação de diferentes eventos genotóxicos e

antigenotóxicos de diversas substâncias.

1.4.1. Teste de mutagenicidade com Salmonella typhimurium (Teste de Ames)

O teste de mutagenicidade de Ames foi desenvolvido por Bruce Ames e

colaboradores na década de 1970 (Ames, 1971; Ames et al., 1973) e foi

posteriormente revisado ao longo dos anos para melhorar a sensibilidade para muitos

tipos de agentes mutagênicos (Maron e Ames, 1983; Wilcox et al., 1990; OECD,

1997). Este ensaio é utilizado para detectar a ação mutagênica e antimutagênica de

agentes indutores que atuam ao nível do DNA bacteriano (Maron e Ames, 1983; Aiub

e Felzenszwalb, 2011). O teste de Ames é considerado um ensaio que apresenta

grande sensibilidade, reprodutibilidade e versatilidade (Moreira et al., 2002;

Umbuzeiro e Vargas, 2003).

Esse ensaio é utilizado em todo o mundo e reconhecido pela comunidade

científica e agências governamentais como um ensaio inicial para determinar o

potencial mutagênico de novos produtos químicos e medicamentos. Diversos agentes

22

mutagênicos detectados, pelo teste de Ames muitas vezes são apresentados,

posteriormente, como agentes carcinogênicos em testes que utilizam animais

(Mortelmans e Zeiger, 2000). Isso faz com que esse teste seja um dos principais

ensaios empregados na determinação da mutagenicidade de um grande número de

compostos químicos (Umbuzeiro e Vargas, 2003).

O teste de Ames emprega linhagens de S. typhimurium derivadas da linhagem

parental LT2, auxotróficas para histidina (his-), apresentando diferentes mutações no

operon desse aminoácido, sendo construídas para detectar mutações do tipo

deslocamento do quadro de leitura ou substituição de pares de base no DNA. Essas

linhagens são incapazes de crescer em meio de cultura mínimo, sem histidina, a

menos que ocorram mutações que restaurem a sua capacidade de síntese

(Umbuzeiro e Vargas, 2003). O número de revertentes é facilmente medido pela

contagem de colônias que crescem em meio mínimo, após a exposição de uma

população de células à substância a ser testada (Ames et al., 1973; Maron e Ames,

1983; Umbuzeiro e Vargas, 2003; Aiub e Felzenszwalb, 2011).O composto-teste é

considerado mutagênico, se o aumento no número de colônias revertentes excede 2

vezes o número de colônias revertentes do controle negativo, e/ou se o aumento é

estatisticamente significativo (Escobar et al., 2013) (Figura 4).

Figura 4: Esquema do teste de mutagenicidade de Ames. Colônias de revertentes

são contadas após exposição a substâncias tratadas (Zanoni, 2010).

23

O teste de Ames permite o conhecimento dos mecanismos de interação de

mutágenos com o DNA, fornecendo informações sobre o tipo de mutação induzida,

podendo ser do tipo substituição de pares de bases ou deslocamento no quadro de

leitura do DNA (frameshift) (Mortelmans e Zeiger, 2000; Claxton et al., 2010; Escobar

et al., 2013). As linhagens de S. typhimurium possuem diversas mutações que

auxiliam no processo de identificação de substâncias que lesam o DNA, como a

mutação rfa que está presente em todas as linhagens e causa perda parcial da

barreira de lipopolissacarídeos da parede bacteriana, tornando a bactéria mais

permeável a moléculas grandes, como as aminas aromáticas e hidrocarbonetos

(Mortelmans e Zeiger, 2000; Tejs, 2008; Escobar et al. 2013). A maioria das cepas

apresentam uma deleção do gene uvrB, o que causa a perda da capacidade de reparo

por excisão de nucleotídeos, permitindo que mais lesões no DNA sejam reparadas

por mecanismos sujeitos a erros, aumentando assim a possibilidade de ocorrência de

mutações, elevando a sensibilidade do teste na detecção do mutágeno. A deleção do

gene uvrB é estendida até o gene responsável pela síntese da biotina, tornando as

linhagens dependentes dessa vitamina (Villela, 2003; Tejs, 2008).

Em algumas linhagens de S. typhimurium, foi introduzido o plasmídio pKM101,

que, além de conferir resistência à ampicilina (Valent, 1990), possui o gene muc, cuja

expressão causa estímulo no sistema de reparo suscetível ao erro (“error prone”),

aumentando tanto a mutagênese espontânea como a induzida, pois o produto desse

gene interfere na fidelidade da DNA polimerase (Bhamre et al., 2001; Villela, 2003).

As linhagens TA98 e TA100, selecionadas para o presente estudo, são

comumente utilizadas para estudos de triagem, mostrando eficiência na detecção de

grande número de agentes mutagênicos (Umbuzeiro e Vargas, 2003). A mutação

existente na cepa TA100, denominada hisG46, resulta da substituição de uma leucina

(GAG/CTC) por uma prolina (GGG/CCC), e pode ser revertida para o estado selvagem

por um composto mutagênico que cause uma substituição de pares de bases num

dos pares GC. A mutação que ocorre na cepa TA98, denominada hisD3052,

consequência de um frameshift, que afeta a leitura correta de uma sequência próxima,

constituída de oito resíduos GC – C-G-C- G-C-G-C-G- repetitivos. Nessa cepa, a

reversão para o fenótipo his+ ocorre pela deleção de um ou dois pares de bases ou

pela adição de um par. Essa mutação é revertida por agentes mutagênicos como 2-

nitrofluoreno e derivados nitro aromáticos (Maron e Ames, 1983). Assim, a aplicação

24

das duas cepas acima mencionadas permite a identificação de mutágenos ou

antimutágenos com diferentes mecanismos de ação.

1.4.2. Teste do Micronúcleo em Medula Óssea de Camundongos

O teste do micronúcleo foi proposto inicialmente por Heddle (1973) como uma

alternativa simples para avaliar danos cromossômicos. Esse ensaio avalia danos no

DNA ao nível cromossômico. É um teste de mutagenicidade utilizado para detecção

de agentes clastogênicos (que quebram cromossomos), e de agentes aneugênicos

(que induzem aneuploidia ou segregação cromossômica anormal) (Kirsch-Volders et

al., 2011).

Esse ensaio é internacionalmente aceito como parte da bateria de testes

recomendada na avaliação do potencial mutagênico para o registro de novos produtos

químicos que entram no mercado mundial e como um método de triagem no

desenvolvimento de novos fármacos. A alta confiabilidade e o baixo custo da técnica

contribuem para o sucesso mundial e adoção desse biomarcador para estudos de

danos genéticos in vivo (Bonassi et al., 2007). Além disso, a maioria dos protocolos

internacionais indica, pelo menos, um teste citogenético em células hematopoiéticas

de roedores para avaliação de danos genéticos in vivo, sendo o teste do micronúcleo

o mais recomendado (Rothfuss et al., 2011).

Esse teste pode ser executado praticamente em qualquer população de células

que estejam constantemente em divisão, sendo a medula óssea de mamíferos uma

das regiões mais adequadas, visto que suas células levam de 22 a 24 horas para

completar um ciclo de divisão (Heddle, 1973) (Figura 5), sendo, portanto, um período

adequado para administração e absorção de um composto.

Na medula óssea, um agente clastogênico pode induzir a ocorrência de

quebras cromossômicas, gerando fragmentos acêntricos que se atrasam em relação

aos elementos com centrômero, ou causar distúrbios no aparato mitótico, de modo

que algumas cromátides podem também se atrasar em relação às demais. Assim, um

cromossomo inteiro ou fragmentos acêntricos não conseguem se migrar para os polos

da célula durante a anáfase e podem não ser incluídos nos núcleos das células-filhas

após a divisão celular, formando, assim, os chamados micronúcleos (MN), observados

no citoplasma dos eritrócitos policromáticos (EPC) (Kirsch-Volders et al., 2011)

(Figura 6).

25

Os EPC, quando sofrem maturação, se transformam em eritrócitos

normocromáticos (ENC), os quais são lançados na corrente sanguínea. O teste do

MN se caracteriza pela observação do efeito do agente testado em EPC anucleados,

que têm vida curta e qualquer micronúcleo encontrado representa dano cromossômico

recente (Salvadori et al., 2003). Se contarmos os MN apenas em EPC, saberemos

que eles se formaram na mitose anterior, na presença do agente mutagênico (Rabelo‐

Gay, 1991).

Na técnica do MN em medula óssea de roedores, a avaliação do número de

células micronucleadas é obtida por meio da contagem de 2000 EPC por animal, onde

são utilizados 5 animais para cada grupo tratado e respectivos controles. Também é

feita a avaliação da relação EPC/ENC em total de 1000 EPC registrando,

simultaneamente, a frequência de ENC, para avaliar a citotoxicidade de um composto

(Heddle e Salamone, 1981). Uma diminuição na proporção de EPC reflete em uma

diminuição na relação EPC/ENC, de modo que a diminuição dessa relação é um

parâmetro para a ação tóxica medular e depressão celular. Dessa forma, essa relação

constitui parâmetro de citotoxicidade ou depressão celular (Shahrim et al., 2006).

Os MN aparecem nas células filhas em decorrência de danos induzidos nas

células parentais (Ribeiro, 2003). São considerados MN clássicos estruturas

circulares, delimitadas por membrana, de mesma refringência que o núcleo, porém

não ligadas a esse e com um tamanho que corresponda de 1/5 a 1/20 do tamanho do

núcleo principal (Heddle, 1973; Schmid, 1975; Rabello-Gay, 1991) (Figura 7).

26

Figura 5: Processo de maturação das células da linhagem eritrocitária (Ribeiro,

2003).

Figura 6: Formação de micronúcleos em eritrócitos da medula óssea (Ribeiro,

2003).

27

Figura 7: Fotomicrografia de eritrócitos da medula óssea de camundongos. (A-

eritrócitos normocromáticos -ENC; B- eritrócitos policromáticos - EPC; C- eritrócitos

policromáticos micronucleados - EPCMN). Fonte: Laboratório de Radiobiologia e

Mutagênese/ ICB – UFG

Os eventos que levam à formação do MN podem ser induzidos pelo estresse

oxidativo, exposição a agentes clastogênicos ou aneugênicos, defeitos genéticos nos

checkpoints do ciclo celular e nos genes de reparo do DNA (Rajagopalan et al., 2004;

Fenech et al., 2005; Bonassi et al., 2007). Todos esses eventos que causam a

formação do MN, como rearranjos cromossômicos, expressão gênica alterada, ou

aneuploidia são efeitos associados com a instabilidade cromossômica geralmente

observada no câncer (Fenech, 2002; Rajagopalan et al., 2004).

É importante também ressaltar que o potencial de muitos compostos naturais

de modular os efeitos genotóxicos de xenobióticos tem sido identificado utilizando-se

o teste do MN como parâmetro de análise (Azevedo et al., 2003). Ensaios com animais

in vivo se tornam importantes para a avaliação da genotoxicidade e/ou

antigenotoxicidade, por melhor se aproximarem das condições do organismo humano

e levarem em consideração elementos como distribuição, metabolismo, detoxificação,

mecanismos de reparo do DNA, conjugação e excreção (Butterworth, 2006). Por essa

razão, no estudo proposto nesta tese, foram também realizados diferentes testes in

vivo, tais como o teste do Micronúcleo e o ensaio cometa.

1.4.3. Ensaio Cometa ou Single Cell Gel Electrophoresis (SGE)

O ensaio cometa, também chamado Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE), é

amplamente aceito como um método padrão para avaliar danos no DNA (McKenna et

28

al., 2008). Esta é uma técnica utilizada para detectar lesões genômicas, que, após

serem processadas, podem resultar em mutação. Diferentemente das mutações, as

lesões detectadas com o ensaio cometa são passíveis de correção (Gontijo e Tice,

2003), constituindo, portanto, lesões pré-mutagênicas (Kammann et al., 2001).

O ensaio cometa foi primeiramente descrito por Ostling e Johanson (1984) e foi

denominado como “estudo microeletroforético” de danos no DNA em células

individuais. Essa técnica tem sido modificada e extensivamente validada ao longo dos

anos, e é agora comumente referida como ensaio cometa (Wong et al., 2005). O

ensaio cometa pode ser aplicado em qualquer tecido in vivo, desde que uma

suspensão de células individuais nucleadas possam ser obtidas (Hartmann et al.,

2003).

As vantagens do ensaio cometa incluem a simplicidade, rápida performance e

alta sensibilidade para vários tipos de danos no DNA (Gonçalves et al., 2013; Wong

et al. 2005). Essa metodologia apresenta algumas vantagens sobre os testes

bioquímicos e citogenéticos, entre as quais a utilização de um pequeno número de

células que não necessariamente estejam em divisão (Gonçalves et al., 2013).

Devido às numerosas vantagens do ensaio cometa, essa técnica tem sido

amplamente utilizada na avaliação da genotoxicidade de medicamentos, aditivos

alimentares, agroquímicos, em sistemas in vitro e/ou in vivo, bem como nos estudos

de reparo do DNA, estudos de ecotoxicologia, biomonitoramento humano e ambiental

(Wong et al., 2005; Piperakis, 2009; Liao et al., 2009).

Esse teste detecta quebras de fita simples e duplas, ligações cruzadas, sítios

de reparo por excisão e/ou lesões alcali-lábeis. Nesse ensaio, as células são

englobadas em gel, espalhadas sobre uma lâmina e o genoma nuclear é desenrolado

e submetido a uma corrente elétrica que proporciona a migração de segmentos de

DNA livres para fora do núcleo. Quebras no DNA causam um relaxamento local do

material genético superenrolado, permitindo que alças de DNA sejam arrastadas

durante a eletroforese. As células que apresentam um núcleo redondo são

identificadas como normais, sem dano detectável no DNA. Por outro lado, as células

lesadas são identificadas visualmente por uma espécie de cauda, similar a um

cometa, formada pelos fragmentos de DNA (Tice et al., 2000; Azqueta et al., 2009;

Oliveira et al., 2009).

A partir do núcleo, fragmentos de DNA migram no sentido do ânodo. Quanto

mais intensa for a indução de quebras, menores serão os fragmentos e maior a

29

extensão de migração. Após coloração específica, o DNA da célula que não

apresentar dano migrará de forma homogênea formando um círculo. Em

contrapartida, o DNA danificado formará fragmentos de diversos tamanhos,

originando forma similar à de um cometa, com a cauda correspondendo aos

fragmentos que migraram. O dano pode ser quantificado em células individuais. Para

interpretação dos resultados, o cometa é dividido entre cabeça e cauda. Assim células

sem ou com pouco dano no DNA não apresentam cauda, enquanto células com mais

danos apresentam caudas maiores (Perez-Cerezales et al. 2009).

Há duas versões do Ensaio Cometa: a neutra, que é considerada menos

sensível porque detecta apenas lesão de fita dupla de DNA (Ostling e Johanson,

1984); e a alcalina, descrita por Singh et al. (1988) a qual é adotada pela maioria dos

laboratórios por detectar maior variedade de lesões de DNA, como quebra de fita

simples, lesões de sítios alcalinos lábeis, locais de reparos incompletos e crosslinks.

Os cometas resultantes da corrida eletroforética do DNA necessitam passar por um

processo de coloração, que pode ser feito alternativamente por técnicas de

fluorescência, usando brometo de etídio, iodeto de propídio e cyber Green; ou por

histotécnica convencional com sal de prata (Dusinska e Collins, 2008; Brianezi et al.,

2009).

Para a visualização do dano no DNA, em geral, são analisadas 100 células por

indivíduo (Figura 8). As lâminas são feitas em duplicata, sendo contadas 50 células

de cada lâmina, para que se tenha um total de 100 células para cada indivíduo. As

lâminas são analisadas em aumento de 40x com microscópio óptico. (Vilella et al.,

2003).

Figura 8: Imagens de nucleóides do pós-tratamento da medula óssea de

camundongos tratados com o composto 4-MET. Figura 4-A, nucleóide com danos no

DNA e figura 4-B nucleóide sem danos no DNA (Laboratório de Radiobiologia e

Mutagênese, 2015).

A B

30

O uso de ensaio cometa associado ao teste de micronúcleo é recomendado.

Enquanto o ensaio do cometa detecta lesões reversíveis, o teste de micronúcleo

detecta lesões mais persistentes no DNA ou efeitos aneugênicos que não podem ser

reparados (Hartmann et al., 2003; Rothfuss et al., 2011). Os danos mensurados pelo

ensaio cometa aparecem mais cedo do que os micronúcleos, que requerem uma

divisão celular para serem visualizados (Dusinska e Collins, 2008). Diante disso,

destaca-se a importância de avaliar o potencial genotóxico e mutagênico de 4-MET

no presente estudo por meio dois ensaios, micronúcleo e cometa.

1.4.4. Teste para Detecção de Mutação e Recombinação Somática (Somatic

Mutation and Recombination Test- SMART)

O teste SMART é um ensaio que permite a quantificação simultânea de

recombinação mitótica e mutação usando D. melanogaster. O SMART constitui um

ensaio de curto prazo, caracterizado por ser rápido, barato, produzir resultados

confiáveis e facilmente reproduzíveis. Esse ensaio é amplamente utilizado na

detecção de efeitos mutagênicos e antimutagênicos de agentes químicos e misturas

complexas (Spanó et al., 2001; Thomé et al., 2012; Franchi et al., 2013; Andrade et

al., 2014).

A D. melanogaster, um organismo eucarioto conhecida popularmente como

mosca da fruta, tem sido utilizada há mais de 90 anos em pesquisa genética, em

diversos testes para o monitoramento de agentes genotóxicos (Rand, 2010). Segundo

Akmoutsou et al. (2011) e Perkhulyn et al. (2015), o extensivo conhecimento acerca

do genoma da D. melanogaster tem feito desse organismo um modelo para estudos

genéticos em eucariontes, bem como na avaliação dos efeitos tóxicos, genotóxicos e

antigenotóxicos.

A comparação do genoma humano com o da Drosophila aponta para a alta

conservação evolutiva, não apenas em nível da sequência do DNA, mas,

principalmente, em relação às funções gênicas. São também relevantes os dados

obtidos com base em análises proteômicas, uma vez que 60% dos 289 genes

relacionados a doenças humanas apresentam homologia em Drosophila, dos quais,

31

75% portam sequências proteicas similares nesses dois organismos (Tickoo e Russel,

2002).

O teste SMART/asa foi desenvolvido para detectar a perda de heterozigose de

genes marcadores específicos que determinam a expressão de fenótipos detectáveis

nas asas da mosca adulta. Esse teste baseia-se na identificação de pelos ou tricomas

com fenótipos mutantes que representam a expressão fenotípica da ocorrência de

lesões em nível de DNA (Graf et al., 1984; Dias, 2008).

As lesões são primordialmente induzidas nas células dos discos imaginais que,

por diversas divisões mitóticas, darão origem a estruturas do corpo da mosca adulta,

como as asas. Caso ocorra alguma alteração genética em uma das células do disco

imaginal, tal alteração estará presente em todas as células descendentes, formando

clone de células mutantes detectadas como mancha de pelos diferentes na asa da

mosca adulta. Essas manchas, com fenótipos característicos indicam a ocorrência de

eventos genéticos relacionados com mutações pontuais, aberrações cromossômicas

e rearranjos estruturais devidos à recombinação mitótica (Graf et al., 1984; 1989;

1996).

Diversos trabalhos apontam que a recombinação homóloga (RH) consiste em

um dos mecanismos responsáveis pela perda de heterozigose de genes que estão

envolvidos na regulação do ciclo celular. A RH também pode induzir eventos como a

conversão gênica, deleção de segmentos cromossômicos e translocações e é

considerada como um dos principais processos de alterações genéticas envolvidos

na gênese e progressão de processos carcinogênicos (Bishope e Schiestl, 2001;

Lehmann, 2003; Andrade et al., 2014; Koksal e Gurbuzel, 2015). Revelando assim a

importância do uso do teste SMART/asa juntamente com outros bioensaios na

avaliação de agentes genotóxicos e antigenotóxicos.

Para a realização do teste SMART são utilizadas 3 linhagens mutantes de D.

melanogaster:

1) Linhagem multiple wing hairs (mwh): os indivíduos dessa linhagem possuem um

gene marcador no braço esquerdo do cromossomo 3 e é caracterizado por expressar

três ou mais pelos por célula (pelos múltiplos) (Figura 9b), diferentemente da

linhagem selvagem em que há a expressão de apenas um pelo por célula (Figura 9a)

(Dias, 2008);

2) Linhagem flare3 (flr3): os indivíduos dessa linhagem possuem o gene marcador

flr3 localizado também no braço esquerdo do cromossomo 3, em uma região mais

32

proximal do centrômero, e é caracterizado por expressar um pelo modificado na

célula, com a base alargada e semelhante a uma “chama de vela” (Figura 9c). Esse

gene marcador é letal em homozigose recessiva e as moscas não se desenvolvem

até a fase adulta (Graf et al., 1984; Guzmán-Rincon e Graf, 1995). Em virtude dessa

letalidade, foi desenvolvido cromossomo balanceador TM3, Bds (Third Multiple 3,

beaded-serrate), que mantém a heterozigose da linhagem. O balanceador impede

eventos de recombinação (Lindsley e Zimm, 1992);

3) Linhagem Oregon R, flare3 (ORR): essa linhagem é caracterizada por ser capaz

de ativar promutágenos, de forma mais eficiente, que dependem da ativação

metabólica por enzimas citocromo P450, também conhecidas como CYP6A2. A

linhagem ORR possui alta capacidade de bioativação devido a altos níveis de

expressão de enzimas citocromo P450 (Hallstrom e Blanck, 1985).

A partir dessas três linhagens, são realizados dois tipos de cruzamentos para

o teste SMART/asa:

a) Cruzamento padrão (ST) fêmeas virgens flr3 são cruzadas com machos mwh

(Graf et al., 1989);

b) Cruzamento de alta bioativação metabólica (HB) fêmeas virgens ORR são

cruzadas com machos mwh (Graf e Van Schaik, 1992).

De ambos os cruzamentos, é possível a obtenção de dois tipos de

descendentes: trans-heterozigotos para os marcados recessivos mwh e flr3 (MH-

mwh+/+flr3) que possuem asas arredondadas e os heterozigotos para o cromossomo

balanceador TM3 (BH- mwh+/TM3Bds) que possuem asas serrilhadas (Figura 10)

(Dias, 2008).

A B C

Figura 9: Fenótipos dos pelos de D. melanogaster (microscopia eletrônica): a) pelos

normais; b) pelos mwh e c) pelos flr3 (Dias, 2008).

33

Figura 10: Linhagens teste de D. melanogaster: (A) flr³, (B) mwh.

Os pelos mutantes são classificados em manchas: simples quando

expressam apenas um dos marcadores mwh ou flr3 originadas por mutação, deleção

ou recombinação distal; e gêmeas quando expressam os dois marcadores mwh e

flr3 na mesma mancha e são originadas exclusivamente por eventos recombinacionais

(Graf et al., 1984) (Figura 11).

Conforme o momento de indução do dano genético e do tempo de ação da

genotoxina durante a embriogênese, pode-se encontrar variações no número de

células mutantes presentes nas manchas. Quanto ao tamanho, as manchas se

classificam em simples pequenas, quando possuem um ou dois pelos mutantes por

célula, caracterizadas por se formarem durante o último e penúltimo ciclo de divisão

mitótica, que ocorrem na fase de pupa. Ou manchas simples grandes, se houver três

ou mais pelos mutantes, são alterações produzidas mais cedo, ou seja, são formadas

durante o desenvolvimento larval no início das divisões mitóticas. Como células

monossômicas ou portadoras de grandes deleções, dividem-se raramente, aumentos

restritos ao número de manchas simples pequenas podem ser indicativos de

Clastogênese ou Aneugênese (Graf et al., 1995).

Figura 11: Fotomicrografia mostrando pelos múltiplos, flare (seta A) e mancha

gêmea (B).

A B

34

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Avaliar a atividade genotóxica, antigenotóxica, mutagênica, antimutagênica,

recombinogênica e anti-recombinogênica de 4-MET em diversos níveis celulares e

organismos.

2.2. Objetivos Específicos

-Avaliar a atividade mutagênica e antimutagênica de 4-MET pelo teste de

mutagenicidade de Ames em linhagens de Salmonella typhimurium.

-Avaliar a atividade mutagênica e antimutagênica de 4-MET pelo teste do micronúcleo

em medula óssea de Camundongos in vivo.

-Avaliar a atividade genotóxica e antigenotóxica de 4-MET pelo ensaio cometa em

medula óssea de camundongos.

-Avaliar a atividade mutagênica, recombinogênica, antimutagênica e anti-

recombinogênica de 4-MET pelo teste SMART/asa com D. melanogaster.

35

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Experimento Químico

3.1.1. Síntese de 4-MET

Todos os reagents comerciais foram obtidos da Sigma-Aldrich (S. Luis, MO,

USA). cromatografia em camada delgada (CCD) foi realizada em de placas de gel de

silica 60 F254 (Merck KGaA). Espectros 1H NMR e 13C NMR foram registrados em um

espectofotometro Bruker Advance (Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Germany).

Espectros infravermelhos foram feitos com um espectometro Bomem M102 (Bomem

Inc., Vanier, Quebec, Canada).

3.1.2. Híbrido cumarina-chalcona (4-MET)

O Híbrido cumarina-chalcona 4-MET (Figura 12) foi sintetizado no Instituto de

Química, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil em parceria com o

Professor Dr. Guilherme Roberto de Oliveira. O composto foi ressuspendido em

dimetilsufoxido (DMSO) usado imediatamente nos tratamentos.

Figura 12: Estrutura Química do (E)-7-metoxi-3-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil-2H-

cromen-2-ona ou 4-MET.

3.1.3. Síntese do híbrido cumarina-chalcona (4-MET)

O composto foi preparado seguindo a condensação do 3-acetil-7-metoxi-2H-

cromen-2-ona previamente sintetizado. A Sintese do 4-MET está detalhada na Figura

13.

36

O

O

O

OMe

OMe

OMe

MeO

CH3

O

OHMeO

+ CH3 OCH3

O O

O O

CH3

O

MeO

A

B

A: dietilamina/etanol

B: 3,4,5-trimetoxi benzaldeído e

dietilamina/etanol anidro refluxo

Figura 13: Síntese de (E)-7-metoxi-3-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil-2H-cromen-2-

ona ou 4-MET.

3.1.3.1. Preparação do 3-acetil-7-metoxi-2H-chromen-2-ona

A cumarina 3-acetil foi sintetizada como descrito previamente por Bhatnagar et

al. (2012). Para a solução de 2-hidroxi-4-metoxibenzaldeido (2 mmol e acetoacetato

de metila e (2.2 mmol) em 3.0mL de etanol, uma quantidade de 0,2 mL de dietilamina

foi adicionada. Depois foi agitada por 6 horas a temperature ambiente, o sólido foi

filtrado, lavado com éter etílico gelado e recristalizado em etanol. ¹H NMR

(CDCl3) δ: 8.48 (s; 1H), 7.55 (d; 1H; J = 8.7 Hz), 6.90, 6,82(1H; J=2,4) (dd; 1H; J = 8.7

Hz e 2.4 Hz), 3.92 (s; 3H), 2.70 (s; 3H). ¹3C NMR (CDCl3) δ: 195.7; 165.5; 159.9; 147.9;

131.7; 120.9; 114.1; 112.3;100.6; 56.3; 30.7.

3.1.3.2. Preparação do híbrido de cumarina-chalcona (4-MET)

Para uma mistura de 3-acetil-7-metoxi-2H-cromen-2-ona (2 mmol) e 3,4,5-

trimetoxi benzaldeido (2 mmol) em 3.0 mL de etanol anidro, uma quantidade de 0,2

mL de piperidina foi adicionada, a mistura foi agitada por 10 minutos e depois colocada

em refluxo overnight. O sólido foi filtrado e recristalizado em etanol, resultando em 4-

MET. IR (KBr) max cm-1: 3040, 2980, 1737 e 1211. ¹H NMR (CDCl3) δ: 8,60 (s;

37

1H), 7,92 (d; 1H; J= 15,69 Hz), 7,79 (d; 1H; J= 15,69 Hz), 7,58 (d; 1H; J= 8,71), 6,93

(dd; 1H; J= 8,71 e 2,45 Hz), 6,91 (s; 2H), 6,86 (d; 1H; J= 2,45 Hz), 3,94 (s; 3H), 3,93

(s; 6H) e 3.91 (s; 3H).

3.2. Experimentos Biológicos

3.2.1. Teste de Mutagenicidade de Ames em cepas de S. typhimurium

3.2.1.1. Cepas bacterianas

Foram utilizadas as cepas bacterianas de S. typhimurium TA98 e TA100. As

linhagens utilizadas foram gentilmente cedidas pela Divisão de Toxicologia,

Genotoxicidade e Microbiologia Ambiental da Companhia de Tecnologia de

Saneamento Ambiental do Estado de São Paulo (CETESB, São Paulo, SP, Brasil).

3.2.1.2. Meios de cultura, reagentes e soluções

Foram utilizados Top-ágar; Solução de Cloreto de Sódio a 0,5%; Solução de

Histidina/Biotina (0,5 mM); Caldo Nutriente; Meio Mínimo Glicosado (MMG) contendo

solução de sais de Vogel-Bonner 50X (sulfato de magnésio heptahidratado, ácido

cítrico monohidratado, fosfato de potássio dibásico, fosfato de sódio e amônio) e

solução de dextrose (40%).

Antes de serem utilizadas, todas as soluções preparadas foram colocadas em

autoclave a 120ºC durante 20 minutos.

Solução de sais de Vogel-Bonner

Sulfato de magnésio hidratado...................................................................................1 g

Ácido cítrico monohidratado P.A..............................................................................10 g

Fosfato de potássio dibásico P. A............................................................................50 g

Fosfato de sódio e amônio P. A............................................................................17,5 g

Água morna destilada...........................................................................................65 mL

Solução de glicose 40%

Dextrose P. A...........................................................................................................40 g

Água destilada....................................................................................................100 mL

38

Ágar Mínimo Glicosado

Ágar..........................................................................................................................15g

Solução de sais de Vogel-Bonner.........................................................................20 mL

Solução de glicose 40%........................................................................................50 mL


Para a preparação do Meio Mínimo Glicosado (placa-teste) foram distribuídos

30 mL do meio de cultura em placas de Petri. Posteriormente as placas contendo o

ágar mínimo glicosado foram colocadas em repouso por 12 horas em estufa a 37ºC

para posterior utilização.

Solução de Biotina (0, 5 mM)

Biotina...................................................................................................................18 mg


Solução de Histidina (125 mL)

Histidina................................................................................................................50 mg

Água destilada .....................................................................................................10 mL

Placa Máster

Ágar........................................................................................................................7,5 g

Solução de sais de Vogel-Bonner.........................................................................10 mL

Solução de glicose 40%........................................................................................25 mL

Solução de biotina...................................................................................................3 mL

Solução de histidina................................................................................................5 mL


Caldo Nutritivo

Caldo nutritivo............................................................................................................5 g


39

Solução Histidina/Biotina 0,5 mM

D-Biotina...............................................................................................................62 mg

L-Hitidina...............................................................................................................48 mg


Ágar de superfície com traços de biotina/histidina (top-ágar)

Bacto ágar..................................................................................................................3 g

Cloreto de sódio (NaCl)...........................................................................................2,5 g

Solução de histidina/biotina..................................................................................50 mL


3.2.1.3. Controles

Nos experimentos realizados foram utilizados controles positivos: 4-

nitroquinolina (4NQO) para a cepa TA98 (0,5 µg), azida sódica para a cepa TA100

(1,5 µg). Como controle negativo utilizou-se dimetilsulfóxido (DMSO) diluído em água.

3.2.1.4. Procedimento experimental

As cepas de S. typhimurium TA98 e TA100 foram inoculadas em caldo

nutriente, a 37°C, com agitação constante por 12h até atingir a fase estacionária de

crescimento.

Para avaliação da atividade mutagênica, alíquotas de culturas das cepas

bacterianas (100 µL) foram incubadas em diferentes concentrações (1 µg, 10 µg, 50

µg 100 µg e 500 µg) de 4-MET em tubos de ensaio em triplicata com agitação e

aeração constantes, durante 25 minutos. Juntamente aos grupo tratados foram

incluídos os controles positivos específicos para cada cepa (0,5 µg de 4-NQO para

TA98 e 1,5 µg de azida sódica para TA100) e o controle negativo (DMSO diluído em

água). Após o período de incubação, foram adicionados 2 mL de ágar glicosado

liquefeito (top-ágar), contendo a solução de histidina/biotina 0,5 mM, mantido à

temperatura de 45ºC. A mistura foi homogeneizada e vertida em placa, contendo meio

mínimo glicosado, que foi incubada a 37ºC durante 48h. Em seguida, foi feita a

contagem do número de colônias revertentes por placa. Cada dose constou de três

repetições e foram realizados três experimentos para cada cepa.

Na avaliação da atividade antimutagênica, alíquotas de culturas das cepas

bacterianas (100 µL) foram incubadas em diferentes concentrações (1 µg, 10 µg, 50

40

µg 100 µg e 500 µg) de 4-MET concomitante aos controles positivos específicos para

cada cepa (0,5 µg de 4-NQO para TA98 e 1,5 µg de azida sódica para TA100) em

tubos de ensaio em triplicata com agitação e aeração constantes, durante 25 minutos.

Após o período de incubação, foram adicionados 2 mL de ágar glicosado liquefeito

(top-ágar), contendo a solução de histidina/biotina 0,5 mM, mantido à temperatura de

45ºC. A mistura foi homogeneizada e vertida em placas, contendo meio mínimo

glicosado, as quais foram incubadas a 37ºC durante 48h. Em seguida foi feita a

contagem do número de colônias revertentes por placa. Cada dose constou de três

repetições e foram realizados ao todo três experimentos para cada cepa.

3.2.1.5. Análise estatística

Na avaliação da mutagenicidade, após a contagem do número de colônias

revertentes foi calculada a razão de mutagenicidade (RM), dada pela seguinte

equação:

RM = (número de revertentes em placa teste (espontâneos + induzidos)

número de revertentes em placa do controle negativo (espontâneos))

O resultado é considerado positivo para mutagenicidade quando o

número de colônias revertentes nas placas for igual ou superior ao dobro do número

de colônias revertentes espontâneas do controle negativo (Maron e Ames, 1983).

Além disso todos os resultados também foram submetidos à Análise de Variância

(ANOVA), seguido do teste Tukey. Os valores de P < 0,05 foram considerados

significativos quando comparados com o controle negativo.

Para a avaliação da antimutagenicidade foi calculada a porcentagem de

inibição de mutagenicidade (PI) pela utilização da equação de Sghaier et al., 2011:

PI(%) = [1 − ( número de revertentes em placa teste − RE

número de revertentes em placa do controle positivo − RE )] X 100

RE: revertentes espontâneos

PI: porcentagem de inibição

Considera-se como resultado positivo quando a porcentagem de inibição é

relevante, pelo menos acima de 30 % e para verificar significância estatística os

resultados também foram submetidos a testes estatísticos, Análise de Variância

41

(ANOVA), seguido do teste Tukey. Os valores de P < 0,05 foram considerados

significativos quando comparados com o controle positivo.

3.2.2. Teste em Camundongos

O protocolo usado neste estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa

Animal da Universidade Federal de Goiás (CEP/UFG no. 014/2014- ANEXO 1). Este

experimento seguiu todas as normas de manejo e experimentação animal

preconizadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).

Foram utilizados 50 camundongos Mus musculus (Swiss Webster) out bred, do

sexo masculino, pesando entre 30 e 40g com idade variando de 7 a 12 semanas,

procedentes do Biotério Central da Universidade Federal de Goiás. Antes da

realização dos experimentos, os animais permaneceram por 7 dias no laboratório,

mantidos em gaiolas de polipropileno com dimensão de 40x30x16 cm com 5 animais

cada, forradas com maravalha trocada diariamente, e alimentados com ração

comercial e água filtrada, ambos oferecidos "ad libitum". Os animais foram mantidos

a temperatura ambiente de 25ºC, umidade 50% ± 20% e um ciclo de luz 12h claro/12h

escuro.

3.2.2.1. Protocolos de tratamento dos animais

No presente estudo foram utilizados os mesmos animais para o Teste do

Micronúcleo e Ensaio Cometa. Os animais foram divididos em 10 grupos com 5

animais cada e pesados antes da administração do composto. Em todos os

tratamentos duas doses de 4-MET (25 e 50 mg/Kg de peso corporal - pc) foram

administradas oralmente para os grupos de 5 animais. Cada animal do grupo 1

recebeu DMSO (0,15 mL) administrado oralmente, sendo o grupo 1 o controle

negativo, os animais do grupo 2 receberam ciclofosfamida (CIF) administrada

intraperitoneal (ip) em uma dose de 50 mg/Kg pc, sendo o grupo controle positivo. Os

grupos de 3 a 10 receberam diferentes tratamentos com 4-MET, conforme a seguir,

totalizando 10 grupos (Figura 14).

Genotoxicidade e citotoxicidade: Os animais do grupo 3 receberam uma dose

simples de 50 mg/Kg pc de 4-MET (24 h) e os animais do grupo 4 receberam 50 mg/kg

pc de 4-MET durante um período de 5 dias consecutivos (120 h).

Co-tratamento: animais do grupo 5 e 6 foram tratados, respectivamente, com 25 e 50

mg/Kg pc de 4-MET juntamente com a administração da CIF via ip.

42

Pre-tratamento: os animais do grupo 7 e 8 receberam, respectivamente 25 e 50

mg/Kg pc de 4-MET, durante 5 dias. No quinto dia duas horas depois da administração

de 4-MET foi administrado CIF ip.

Pós-tratamento: animais do grupo 9 e 10 foram tratados com CIF e depois de 6h e

12h de administração do agente inductor, esses animais receberam 4-MET em doses

de 25 e 50 mg/kg, respectivamente, totalizando 50 e 100 mg/kg.

Todos grupos de animais (tratados e controles) foram sacrificados por

deslocamento cervical 24 horas após a última administração deste agente alquilante

e os animais que receberam apenas 4-MET foram sacrificados 24 horas após a

adiministração deste composto. As células da médula óssea dos fêmures dos animais

foram lavadas em soro fetal bovino, e depois centrifugados (300 x g, 5 min), e

utilizadas para a confecção de lâminas para o Teste do Micronúcleo e Ensaio Cometa.

Figura 14: Representação dos experimentos realizados em camundongos.

3.2.2.2. Teste do Micronúcleo em Medula Óssea de Camundongo

O teste do micronúcleo foi realizado conforme os métodos descritos por Heddle

(1973) e Schmid (1975). Conforme mencionado anteriormente, as células da medula

óssea de camundongos foram utilizadas para a confecção de esfregaços celulares em

43

lâminas de vidro, que ao secarem foram fixadas em metanol absoluto durante 5

minutos, e posteriormente coradas em solução de Giemsa tamponada (fosfato de

sódio dibásico e fosfato de sódio monobásico) com pH 6,8. Para cada animal, três

lâminas foram preparadas, e um total de 2.000 eritrócitos policromáticos (EPC) foram

contados para determinar a frequência de eritrócitos policromáticos micronucleados

(EPCMN). A genotoxicidade e a antigenotoxicidade foram avaliadas pela frequência

de EPCMN, enquanto a citotoxicidade e a anticitotoxicidade foram avaliados pela

razão de EPC e eritrócitos normocromáticos (ENC).

A análise das lâminas foi realizada em microscopia óptica de luz, com a

finalidade de se detectar possíveis alterações e/ou perdas cromossômicas

(micronúcleos) nos eritrócitos da medula óssea dos animais submetidos aos

diferentes tratamentos. As células foram visualizadas utilizando objetiva de imersão

(100x), avaliando-se 2000 eritrócitos policromáticos (EPC) por animal e para cada

grupo foram utilizados 5 animais. Para avaliação da citotoxicidade, contou-se até

1000 EPC registrando simultaneamente a frequência de eritrócitos normocromáticos

(ENC), a razão EPC/ENC foi então determinada conforme modelo proposto por

Schmid (1975).

3.2.2.3. Ensaio Cometa

O ensaio cometa foi feito usando o método alcalino baseado nos métodos de

Sigh et al (1988) e Atia et al. (2013).

As células da medula óssea dos mesmos camundongos utilizadas para a

realização do Teste do Micronúcleo foram utilizadas para a realização do Ensaio

Cometa. Após a centrifugação dessas células, 10 µL da solução da medula óssea foi

homogeneizado com 120 µL de agarose low-melting (baixa fusão) e imediatamente

espalhado em lâminas de pré-cobertura, previamente preparadas e acrescido de

lamínula. Essas lâminas de pré-cobertura foram preparadas por imersão em solução

contendo 100 mL de PBS (tampão fosfato-salino) e 1,5 g de agarose e,

posteriormente, foram secas overnight na horizontal e em temperatura ambiente.

Essa lâmina foi mantida a 4°C por 5 minutos para solidificação. Após este

período, a lamínula foi retirada e as lâminas foram incubadas em uma solução de lise

(2,5M NaCl, 10mM Tris, 100mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 1% Triton X-

100 e 10% dimetilsulfóxido (DMSO), pH 10) e colocadas a 4°C por 24 horas para

remover proteínas e membranas. Posteriormente, as lâminas foram colocadas em

44

tampão de eletroforese (300mM NaOH, 1mM EDTA, pH > 13,0) por 30 minutos. Em

seguida, foi realizada a corrida de eletroforese por 25 minutos, a 0,9 V/cm e 300 mA

e a 4°C. Todo o procedimento foi feito no escuro para prevenir danos ao DNA. Após

a corrida eletroforética, as lâminas foram mergulhadas em solução de neutralização

(0,4M Tris, pH 7,5), lavadas com água destilada e secas a temperatura ambiente.

Para a captura das imagens, as lâminas foram coradas com 20 µL de Brometo

de Etídeo (0,02 mg/mL), 5 minutos antes da análise. As lâminas foram preparadas em

duplicatas e 100 nucleóides analisados (50 nucleóides para cada lâmina) utilizando

microscópio de fluorescência Axioplan - Imaging® usando o software Isis com um filtro

de excitação de 510-560 nm e um filtro barreira de 590 nm no aumento de 200 X.

Os nucleóides foram avaliados pelo software OpenComet, versão 1.3 (Figura

15). Para avaliação dos resultados foi selecionado o parâmetro Porcentagem de DNA

na cauda (% DNA in tail) que tem sido o parâmetro mais utilizado para quantificação

de danos no DNA (Collins, 2014).

Figura 15: Imagem analisado no software Open Comet, versão 1.3.

45

3.2.2.4. Análise Estatística dos Testes Micronúcleo e Cometa

Para análise estatística do teste do micronúcleo a avaliação de genotoxicidade

e antigenotoxicidade foi realizada por meio da comparação das frequências de

eritrócitos policromáticos micronucleados (EPCMN) dos grupos tratados, em relação

ao grupo controle negativo (genotoxicidade) ou positivo (antigenotoxicidade) pelo

teste ANOVA. Em seguida, foi utilizado o teste de comparação múltipla (teste de

Tukey). Para a avaliação de citotoxidade as frequências de EPC/ENC de cada grupo

foram comparadas pelo teste Qui-quadrado. Foram considerados significativos

valores de p< 0,05.

A porcentagem (%) de redução da genotoxicidade induzida pela CIF foi

calculada pela média de EPCMN de cada tratamento, usando a seguinte fórmula

(Waters et al. 1990; Fedato e Maistro, 2012):

% Redução = (A − B

A − C) X 100

*Onde A corresponde a media de EPCMC observada nos tratamentos com CIF

(controle postitivo), B corresponde a média de EPCMC observada em tratamentos de

antigenotocxicidade (4-MT associado com CIF) e C corresponde a media de EPCMC

no controle negativo.

Para análise estatística do ensaio cometa, foi realizado o teste ANOVA, seguido

do teste de Tukey, utilizando o softwere estatístico SigmaStat, versão 3.5. Em todas

as situações foi considerado como significativo quando p < 0.05.

3.2.4. Teste para a Detecção de Mutação e Recombinação Somática

(SMART/asa)

3.2.4.1. Linhagens de Drosophila melanogaster

Para a realização desse ensaio foram utilizadas três linhagens de D.

melanogaster que são portadoras de diferentes marcadores genéticos em seus

cromossomos (Graf e Van Schaik, 1992). As linhagens apresentam a seguinte

constituição genética:

-multiple wing hairs (mwh): mwh/mwh, com constituição fenotípica apresentando

múltiplos pelos por célula;

-flare3(flr3): flr3/In(3LR)TM3, ri pp sep I(3)89Aa bx34e e BdS, com constituição

fenotípica apresentando pelos com a base alargada;

46

-ORR; flare3(ORR; flr3): ORR; flr3 /In(3LR)TM3, ri pp sep I(3)89Aa bx34e e BdS, com

constituição fenotípica apresentando altos níveis de enzimas de metabolização da

classe citocromo p450.

3.2.4.2. Agentes Químicos

3.2.4.2. 1. Controles

- Foi utilizado como controle positivo a mitomicina C (MMC) e como controle negativo

o Dimetilsulfóxido (DMSO).

3.2.4.2.2. Meios de Cultura e Condições de Cultivo

Para a manutenção das linhagens de D. melanogaster e para a realização dos

cruzamentos das moscas adultas foi utilizado o meio de cultura banana-ágar (Marques

et al., 1966), distribuído em garrafas estéreis de 250 mL (Graf et al., 1984). A coleta

de larvas de terceiro estágio provenientes dos cruzamentos ST e HB foi realizada a

partir do meio de ovoposição constituído por uma camada de fermento biológico

(Saccharomyces cerevisiae) e açúcar sobre uma base sólida (1 cm) de ágar a 3%

(Graf et al., 1984). Para o tratamento crônico das larvas foi utilizado, por tubo, 900mg

de purê de batata comercial (Yoki alimentos S.A), hidratados com 3 ml das diferentes

concentrações selecionadas da 4-MT (5, 50, 100, and 400 µg/mL) e os respectivos

controles positivo (MMC a 0, 05 mM) e negativo (DMSO a 0,05%).

As linhagens foram mantidas em uma câmara com temperatura constante a

25ºC e umidade relativa de aproximadamente 60%.

3.2.4.3. Cruzamentos

Foram utilizados nesse bioensaio, dois tipos de cruzamentos:

a- Cruzamento Padrão (ST)- fêmeas virgens da linhagem flr3 foram cruzadas com

machos mwh. Esse cruzamento apresenta níveis basais de expressão de enzimas de

metabolização, complexo citocromo P-450 (Graf et al., 1989).

b- Cruzamento de Alta Bioativação Metabólica (HB) - fêmeas da linhagem ORR;

flr3 foram cruzadas com machos mwh. Este cruzamento apresenta níveis elevados de

expressão de enzimas de metabolização, especialmente as do complexo citocromo

P-450 (Graf e Van Schaik, 1992).

47

Os cruzamentos tiveram a duração de 48 horas, realizados em garrafas

contendo uma proporção de 80 fêmeas para 40 machos, previamente preparadas com

meio de cultura banana-ágar. Posteriormente, os reprodutores dos cruzamentos ST e

HB foram transferidos para o meio de cultura de ovoposição por um período de 8

horas, para obtenção de larvas de terceiro estágio. De ambos os cruzamentos foram

obtidos dois tipos de descendentes: trans-heterozigotos para os marcadores mwh

e flr3 (MH)- apresentando asas arredondadas; e heterozigoto para o balanceador

TM3 (BH)- que possuem asas serrilhadas devido à presença do cromossomo

balanceador TM3 (Graf et al., 1996).

3.2.4.4. Procedimento Experimental - Tratamento Crônico

Os experimentos foram realizados de acordo com Graf e colaboradores (1984).

Após 72±4 horas do início da ovoposição as larvas de terceiro estágio de ambos os

cruzamentos foram coletadas por flotação em água corrente com auxílio de peneiras

de malha fina. Para a avaliação do efeito tóxico, foram utilizadas 100 larvas em tubos

de vidro (2,5 cm de diâmetro e 8,0 cm de altura) submetidas a tratamento crônico por

administração oral da 4-MET. Para cada tubo foram adicionados 0,9 g de meio de

cultura purê de batata instantâneo (Yoki Alimentos S.A.). Para cada um dos tubos foi

adicionado 3 mL das concentrações de 4-MET (tubo 1-1 µg/mL de 4-MET, tubo 2- 5

µg/mL de 4-MET, tubo 3- 20 µg/mL de 4-MET, tubo 4- 50 µg/mL de 4-MET, tubo 5-

100 µg/mL de 4-MET, tubo 6- 200 µg/mL de 4-MET e tubo 7- 400 µg/mL de 4-MET)

para gerar as curvas de sobrevivência das larvas em função da dose e também o

controle negativo (água destilada estéril) e positivo (MMC 0,05 mM).

Na avaliação da atividade genotóxica, seguindo os mesmos procedimentos

adotados para a curva de sobrevivência, foram usados 100 larvas/tubo provenientes

de ambos os cruzamentos selecionados (ST e HB). Cada tubo foi previamente

preparado com 0,9 g de purê de batata, que foram hidratados com 3 mL de 4

diferentes concentrações de 4-MET selecionadas a partir dos resultados da curva de

sobrevivência mencionada acima (5, 50, 100, and 400 µg/mL).

Para avaliação da antigenotoxicidade também foram colocadas 100 larvas/tubo

de ambos os cruzamentos. Os tubos contendo 0,9 g de purê de batata, foram

hidratados com 1,5 mL do controle positivo (solução de MMC a 0,05 mM) associadas

com 1,5 mL das mesmas concentrações da 4-MET utilizadas para avaliação da

genotoxicidade (5, 50, 100, and 400 µg/mL).

48

Os adultos emergentes de cada tubo foram fixados em etanol 70% e armazenados à

temperatura ambiente, até o momento da montagem das asas e posterior análise

microscópica.

3.2.4.5. Análise citogenética

As moscas, conservadas em etanol 70%, tiveram suas asas retiradas com o

auxílio de pinças de relojoeiro, distendidas e fixadas sobre a superfície de lâminas

secas e embebidas com solução de FAURE (30g de goma arábica, 20 mL de glicerol,

1,5g de hidrato cloral e 50 mL de água destilada). As lâminas foram mantidas a 40ºC,

em uma placa aquecedora, por um período mínimo de 24 horas. Posteriormente,

foram colocadas lamínulas (24 x 32 mm), contendo uma gota da solução de FAURE,

permanecendo por mais 24 horas a 40ºC (Graf et al., 1984). Cada lâmina foi composta

por 20 asas, sendo 10 asas de machos e 10 asas de fêmeas. Para cada dose foram

analisadas 80 asas.

As lâminas foram analisadas em microscópio óptico com 400X de ampliação.

A análise constitui-se no registro da frequência, tipo de manchas encontradas (simples

pequena, grandes ou gêmeas), bem como o tamanho das mesmas e a posição em

que se encontram na asa.

3.2.4.6. Análise Estatística

Para análise estatística de possíveis efeitos genotóxicos foi realizada uma

comparação entre a frequência de manchas mutantes dos grupos tratados com a 4-

MT e o controle negativo. Estas comparações foram realizadas utilizando-se o teste

binominal condicional de Kastenbaum e Bowman (1970), com nível de significância

de 5%. Esse procedimento utilizado baseou-se em duas hipóteses:

(I) Ho: não há diferença entre as frequências de mutações do grupo controle e dos

grupos tratados com a 4-MET.

(II) Ha: as frequências de mutação induzida nos grupos tratados são “m” vezes

maiores que a frequência de mutações espontâneas obtida no grupo controle

negativo.

Onde “m” é o fator de multiplicação inserido para minimizar os riscos de falso-

positivo: m=2 para manchas simples pequenas e total de manchas, pois elas

apresentam altas frequências espontâneas e m=5 para manchas simples grandes e

49

gêmeas, porque raramente surgem de forma espontânea (Graf et al., 1984; Frei e

Wurgler, 1988; Frei et al., 1992).

Com base nos resultados obtidos dessa análise estatística foi feito um procedimento

de múltiplas decisões de acordo com Frei e Wurgler (1988):

(I) Aceita-se ambas as hipóteses, como elas não podem ser verdadeiras

simultaneamente, nenhuma decisão pode ser tomada, tendo-se assim, resultados

inconclusivos.

(II) Aceita-se Ho e rejeita-se Ha, o resultado será negativo.

(III) Rejeita-se Ho e se aceita Ha, o resultado será positivo.

(IV) Rejeitam-se ambas as hipóteses e o resultado será fraco-positivo.

Para análise estatística da antigenotoxicidade, a frequência de manchas

mutantes dos grupos tratados com a 4-MET foram comparadas com o controle

positivo (agente genotóxico isolado (MMC) versus 4-MET + agente genotóxico-MMC),

por meio do teste-U não paramétrico de Mann-Whitney (Frei e Würgler,1995).

Devido a fraca expressão do marcador de flr3 em clones pequenos e sua

letalidade em clones grandes de células mutantes (Graf, 1995), apenas os clones mwh

(manchas mwh simples e gêmeas) foram utilizados para calcular as frequências

formação de clones por 105 células. Estes valores foram depois utilizadas para estimar

a contribuição de recombinação e mutação para a incidência do total de manchas

mutantes em moscas MH (Andrade et al., 2004). As percentagens de inibição (PI)

foram calculados usando o total de manchas por asa com a seguinte fórmula

(Abraham, 1994):

% PI = {MMC − (MMC + 4 MT)

MMC } × 100

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63

8. PRODUÇÃO CIENTÍFICA

8.1. Manuscrito submetido à revista Plos One

PONE-D-17-03247

Chemopreventive Effect and DNA Repair Induction of the Coumarin-Chalcone Hybrid

[7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one] (4-MET)

Against DNA Damage In Vitro and In Vivo

Dr. Lee Chen-Chen

Dear MsC Camila Vale,

You are receiving this e-mail because you have been listed as an author on a

manuscript recently submitted to PLOS ONE and entitled "Chemopreventive Effect and

DNA Repair Induction of the Coumarin-Chalcone Hybrid [7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5

trimethoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one] (4-MET) Against DNA Damage In Vitro

and

In Vivo".

The corresponding author for the submission process is: Dr. Lee Chen-Chen

The full author list for the submission is: Camila Regina do Vale; Débora Cristina da

Silva Lima; Murilo Machado dos Anjos; Jefferson Hollanda Véras; Guilherme Roberto

de Oliveira; Lee Chen-Chen, PhD

If you are not aware of this submission, or if you should not be listed as a co-author,

then please contact the journal office at [email protected].

Kind regards,

PLOS ONE- http://pone.edmgr.com/

mailto:[email protected]

http://pone.edmgr.com/

64

Chemopreventive Effect and DNA Repair Induction of the Coumarin-Chalcone

Hybrid [7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-chromen-2-one]

(4-MET) Against DNA Damage In Vitro and In Vivo

Running title: Chemopreventive effect of a coumarin-chalcone hybrid In Vitro and In

Vivo

Camila Regina do Vale1, Débora Cristina da Silva Lima1, Murilo Machado dos

Anjos2, Jefferson Hollanda Véras1, Guilherme Roberto de Oliveira2, and Lee

Chen-Chen1*

1 Department of Genetics, Institute of Biological Sciences, Federal University of Goiás,

Goiânia, GO, Brazil, 2 Institute of Chemistry, Federal University of Goiás, Goiânia, GO,

Brazil

* [email protected]

The authors contributed equally to this work.

Abstract

Chalcones and coumarins are natural and/or synthetic compounds which have been

associated with numerous biological activities such as antioxidant, anti-inflammatory

and anti-tumoral effects. Based on their biological activities, we synthesized a

coumarin-chalcone hybrid [7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-

chromen-2-one] (4-MET) and assessed its genotoxic, cytotoxic, antigenotoxic, and

anticytotoxic effects, as well as DNA repair action using different types of treatment

(co-, pre- and post-treatment) in in vitro and in vivo assays. The Ames test,

micronucleus test, and comet assay revealed that 4-MET did not exhibit genotoxic

effects. Regarding cytotoxicity, 4-MET exhibited moderate cytotoxicity in mouse bone

marrow cells by micronucleus test (120 h). Results from co-, pre- and post- treatments

with 4-MET clearly showed their protective action against cyclophosphamide -induced

micronuclei and DNA damage. The obtained results suggested that this compound

may act both preventing DNA damage induced by cyclophosphamide (CPA) and also

in subsequent steps of damage, as well as the cellular repair process. These findings

revealed that 4-MET triggers chemopreventive properties and induced DNA repair

systems and therefore is a potential chemopreventive and therapeutic agent.


65

Introduction

Chalcones and coumarins are natural or synthetic compounds of widespread

occurrence in plants and belong to flavonoid class. These compounds have been

reported to exhibit a wide range of biological activities [1][2], including antioxidant, anti-

inflammatory, anti-ulcerative, antiviral, antifungal, antimutagenic and anti-tumoral

properties [3] [4] [5]. They are also effective chemopreventive agents [6]. These

biological features of coumarins and chalcones are related their radical scavenging

effect and interaction with several enzymes [1][7][8] [9].

Due to the considerable importance of these two compounds and their antioxidant

properties, a series of coumarin-chalcone hybrids have recently been synthesized [10]

[11] [12] [13][14][15]. The synthesis of hybrids is an important strategy to develop novel

compounds with improved features, in order to overcome drug resistance, display

antioxidant properties [16], and even enhance their biological potency in the treatment

of numerous diseases [9] [17] [18].

It is well known that several hybrids molecules can present varied biological

activities as well as modified selectivity profile and improved modes of action [6].

Recently, coumarin-chalcone hybrids have received significant attention due to their

anticancer, antimicrobial, antioxidant and anti-inflammatory properties [9]. Considering

the importance of these cumarin-chalcone hybrids for further therapeutic development,

we synthesized the new coumarin-chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-

trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-chromen-2-one (4-MET) and evaluated the genotoxic

and antigenotoxic activities of this compound.

Among the numerous tests for the detection of genotoxic and antigenotoxic agents,

the Ames mutagenicity test, the micronucleus test, and the comet assay are widely

used and the results of these assays are considered hallmarks of carcinogenicity.

These assays detect compounds which are capable of causing base-pair substitution

and frameshift mutations (Ames test), clastogenesis and aneugenesis, i.e. DNA

damage at the chromosomal level (micronucleus test), DNA strand breaks, alkali-labile

sites, intercalation and oxidation sites (comet assay) [19][20][21][22][23].

Therefore, the aim of this study was to evaluate the genotoxic and antigenotoxic

effects of 4-MET using the Ames mutagenicity test in vitro, the micronucleus test and

the comet assay, in mice. In order to assess both protective effects of 4-MET against

DNA damage induced by CPA and its DNA repair capacity, we performed in vivo co-,

66

pre- and post-treatment using the micronucleus test and comet assay in mice bone

marrow cells.

Materials and Methods

Chemicals

All commercially available reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St.

Louis, MO, USA), unless stated otherwise. Thin-layer chromatography (TLC) was

conducted on silica gel 60 F254 plates (Merck KGaA, Darmstadt, Germany). 1H NMR

(Proton Nuclear Magnetic Resonance) and 13C NMR (Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance) spectra were recorded on a Bruker Advance III (500 MHz) spectrometer

(Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Germany). Infrared (IR) spectrum was performed on a

Bomem M102 spectrometer (Bomem Inc., Vanier, Quebec, Canada).

Synthesis of compounds

Preparation of 3-acetyl-7-methoxy-2H-chromen-2-one

The synthesis of 3-acetyl coumarin was carried out at the Institute of Chemistry,

Federal University of Goiás, Goiânia, GO, Brazil as described by Bhatnagar [24] with

few modifications. An aliquot of 0.2 mL diethylamine was added to a solution of 2-

hydroxy-4-methoxybenzaldehyde (2.0 mmol) and methyl acetoacetate (2.2 mmol) in

3.0 mL ethanol. After stirring for 6 h at room temperature, the solid was filtered, washed

with cold ethyl ether, and recrystallized in ethanol. ¹H NMR (CDCl3) δ: 8.48 (s; 1H),

7.55 (d; 1H; J = 8.7 Hz), 6.90, 6.82 (1H; J = 2.4 Hz) (dd; 1H; J = 8.7 Hz and 2.4 Hz),

3.92 (s; 3H), 2.70 (s; 3H). 13C NMR (CDCl3) δ: 195.7; 165.5; 159.9; 147.9; 131.7;

120.9; 114.1; 112.3; 100.6; 56.3; 30.7.

Synthesis of the coumarin-chalcone hybrid 4-MET

The coumarin-chalcone hybrid 4-MET was also synthesized at the Institute of

Chemistry through aldolic condensation of 3-acetyl-7-methoxy-2H-chromen-2-one

previously synthesized (as described above) and the appropriate aldehyde (Figure 1).

An aliquot of 0.2 mL piperidine was added to a solution of 3-acetyl-7-methoxy-2H-

chromen-2-one (2.0 mmol) and 3,4,5-trimethoxy benzaldehyde (2.0 mmol) in 3.0 mL

anhydrous ethanol. The mixture was stirred for 10 min and refluxed overnight. The

67

solid was filtered and recrystallized in ethanol, resulting in 4-MET. IR (KBr) max cm-1:

3040, 2980, 1737, and 1211. ¹H NMR (CDCl3) δ: 8.60 (s; 1H), 7.92 (d; 1H; J = 15.69

Hz), 7.79 (d; 1H; J = 15.69 Hz), 7.58 (d; 1H; J = 8.71), 6.93 (dd; 1H; J = 8.71 and 2.45

Hz), 6.91 (s; 2H), 6.86 (d; 1H; J = 2.45 Hz), 3.94 (s; 3H), 3.93 (s; 6H), and 3.91 (s; 3H).

The compound 4-MET was dissolved in 0.5% dimethyl sulfoxide (DMSO) immediately

before use in the treatments.

FIG 1. Synthesis of the coumarin-chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-

trimethoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one (4-MET) (1) from 3-acetyl-7-methoxy-

2H-chromen-2-one (2). Reagents and conditions: (a) 3,4,5-trimethoxy benzaldehyde

and piperidine/anhydrous ethanol (reflux).

Doses of 4-MET used in in vitro and in vivo assays

In the Salmonella mutagenicity test (Ames test), the doses of 4-MET used were 1,

10, 50, 100, 500 µg/plate. These doses used in our study cover a range from 1 to 500

µg/plate in accordance to Mortelmans and Zeiger [33], which recommended a

minimum of five doses and a range of at least three logs.

The doses of 25 and 50 mg/kg of 4-MET used in the animal testing were based on

previous studies in mice that used coumarins and chalcones for biological activity

evaluations [2] [12] [17]. Dimethylsulfoxide (DMSO) was used to dissolve 4-MET and

it was used as negative control in all performed assays.

Ames test

Bacterial Strains

Salmonella typhimurium tester strains TA98 (hisD3052) (rfa) (uvrB) (AmpR) and TA100

(hisG46) (rfa) (uvrB) (AmpR), as described by Maron and Ames [22], were kindly

supplied by the Divisão de Toxicologia, Genotoxicidade e Microbiologia Ambiental

68

from the Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental do Estado de São

Paulo (CETESB, São Paulo, SP, Brazil).

Experimental procedure in vitro

The Salmonella mutagenicity assay proposed by Maron and Ames [22] was

followed. A 0.1-mL aliquot of bacterial suspension (1–2 × 109 cells/mL) of each strain

(TA98 and TA100) was incubated with 1, 10, 50, 100, and 500 µg/plate 4-MET diluted

in 20 μL DMSO (lot no. 0900221, Vetec, Duque de Caxias, RJ, Brazil) at 37ºC for 25

min. A 2.0-mL aliquot of top agar [0.6% Difco agar (lot no. 082613209, Kasvi, Curitiba,

PR, Brazil), 0.5% NaCl, 50 μM L-histidine, and 50 μΜ biotin, at 45ºC] was added to the

test tubes and poured onto Petri dishes containing minimal agar medium [1.5% agar

(lot no. 082613209, Kasvi, Curitiba, PR, Brazil), 2% glucose, and Vogel-Bonner

medium E (MgSO4H2O, lot no. 1109865; C6H8O.7H2O, lot no. 1100795; K2HPO2, lot

no. DCBB4100; Na2NH2PO4.H2O, lot no. 1208265, Vetec Química Fina Ltda., Duque

de Caxias, RJ, Brazil)]. Each assay was performed three times in triplicate. A negative

control (20 µL DMSO) and a positive control [0.5 μg 4-nitroquinoline 1-oxide (4-

NQO)/plate (lot no. SLBD6960V, Sigma-Aldrich, São Paulo, SP, Brazil) for TA98 and

3.0 μg sodium azide (lot no. 26628–22–8, Merck, Cotia, SP) for TA100] were included.

For the evaluation of antimutagenicity, the same doses of 4-MET used in the mutagenic

evaluation were incubated and combined with their respective positive controls (co-

treatment). After incubation at 37ºC for 48 h, His+ revertant colonies were counted.

Statistical analysis of the Ames test

The software Sigma Stat 3.5 was used in all analyses. The results were tabulated

and the experimental values were expressed as mean ± standard deviation (SD).

Mutagenicity data were evaluated using analysis of variance (ANOVA) and the Tukey’s

test for differences among the means. Mutagenicity induction was measured using the

mutagenic index (MI), calculated as the ratio between the number of colonies in the

test treatment and the number of colonies in the negative control treatment. The

inhibition percentage of mutagenicity (IP) induced by each mutagen was calculated in

relation to the number of revertant colonies obtained in the control group treated with

the mutagen alone, using the following formula [25]:

𝐼𝑃 (%) = [ 1 − ( 𝑇𝑃 − 𝑆𝑅

𝑃𝐶𝑃 − 𝑆𝑅 )] 𝑋 100

69

where:

TP: number of His+ revertants on test plates (plates incubated with mutagen and test

compound)

SR: spontaneous His+ revertants on negative control plates (tester strains incubated

in the absence of test compound and mutagen)

PCP: number of His+ revertants on positive control plates (plates incubated with the

mutagen alone)

Animal tests: micronucleus test and comet assay

This study was approved by the Animal Research Ethics Committee of the

Federal University of Goiás (CEUA/UFG no. 014/14) and followed all the rules of

animal management and experimentation from the Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal [26] and the Toxicology Society [27]. Healthy, young male

adult (8–12 weeks) outbred mice (Mus musculus, Swiss Webster), weighing 25–30g,

obtained from the animal facilities of the same university, were brought to the

laboratory five days before the experiments and housed in plastic cages (40 cm × 30

cm × 16 cm), at 24 ± 2ºC and 55 ± 10% humidity, with a light-dark natural cycle of 12

h. Standard food pellets (appropriate commercial rodent diet Labina, Ecibra Ltda.,

Santo Amaro, SP, Brazil) and water were provided ad libitum.

Experimental procedure in vivo

The animals were randomized into control and experimental groups, divided into

ten groups of five animals each and weighed before the administration of the

chemicals. The animals in Group 1 received 0.1 mL/10 g body weight (BW) DMSO

(negative control) administered orally, while the animals in Group 2 received 50 mg/kg

BW cyclophosphamide (CPA, lot no. 5L091, Baxter Hospitalar Ltda., São Paulo, SP,

Brazil) (positive control) in a single intraperitoneal (ip) administration.

Genotoxicity and cytotoxicity. The animals in Group 3 received a single dose of

50 mg/kg BW 4-MET (24 h), whereas the animals in Group 4 received 50 mg/kg BW

4-MET for five consecutive days (120 h).

Co-treatment. The animals in Groups 5 and 6 were respectively treated with 25

and 50 mg/kg BW 4-MET and concomitantly received a single dose of 50 mg/kg BW

CPA ip each.

70

Pre-treatment. The animals in Groups 7 and 8 received 25 and 50 mg/kg BW 4-

MET, respectively, for five consecutive days. On the last day, the animals in both

groups received a single dose of 50 mg/kg BW CPA ip 2 h after the administration of

4-MET.

Post-treatment. The animals in Groups 9 and 10 were treated with a single dose

of 50 mg/kg CPA. After 6 h and 12 h, the animals in Group 9 received 25 mg/kg 4-

MET, totalizing a final dose of 50 mg/kg, whereas the animals in Group 10 received 50

mg/kg 4-MET, totalizing a final dose of 100 mg/kg.

All animals were euthanized by cervical dislocation 24 h after the last

administration of all kind of treatments (control and treated groups). The bone marrow

cells from both femurs of the animals were flushed using fetal calf serum (lot no.

61005001, Laborclin, Pinhais, PR, Brazil) and, after centrifugation (300× g, 5 min),

were used for the preparation of micronucleus test slides and the comet assay.

Micronucleus test

The micronucleus test was performed according to von Ledebur and Schmid

[23] . Bone marrow cells prepared as described above were smeared on glass slides,

coded for blind analysis, air-dried, and fixed with absolute methanol (CH4O, lot no.

1207433COD: 000102.06, Vetec, Duque de Caxias, RJ, Brazil) at room temperature

for 5 min. The smears were stained with Giemsa (lot no. 21101108C, Newprov,

Pinhais, PR, Brazil), dibasic sodium phosphate (lot no. 982162, Vetec, Duque de

Caxias, RJ, Brazil), and monobasic sodium phosphate (lot no. 983831, Vetec, Duque

de Caxias, RJ, Brazil. In the micronucleus test we analyzed 2,000 polychromatic

erythrocytes (PCE) per animal. Five animals were analyzed for each dose, thus a total

of 10,000 PCE were analyzed per dose to determine the frequency of micronucleated

polychromatic erythrocytes (MNPCE) using light microscopy (Olympus BH-2 10 × 100,

Tokyo, Japan). Genotoxicity and antigenotoxicity were assessed by the frequency of

MNPCE, whereas cytotoxicity and anticytotoxicity were evaluated by the PCE and

normochromatic erythrocytes (NCE) ratio (PCE/NCE).

Comet assay

The comet assay was performed using the alkaline method [28]. Slides previously

coated with normal melting point agarose (1.5%) received a mixture that contains 15

71

μl of bone marrow cells and 120 μl of low melting point agarose (0.75%) at 37ºC. The

mixture was spread on the slides with coverslips and taken to a cold chamber. After

gelation, the coverslips were carefully removed. The slides were immersed in lysis

solution protected from light [1% triton X-100 (lot no. DCBB3232, Vetec Química Fina

Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brazil), 10% DMSO, 2.5 M NaCl (lot no. 73516, Dinâmica

Química Contemporânea Ltda., Diadema, SP, Brazil), 100 mM EDTA (lot no.

2965C504, Invitrogen by Life Technologies, Itapevi, SP, Brazil), and 10 mM Tris (lot

no. 0805008, Vetec Química Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brazil), pH 10.0] at 4ºC

for 12–24 h. Subsequently, the slides were incubated with freshly made alkaline

solution [300 mM NaOH (lot no. 19804, Neon Comercial Ltda., São Paulo, SP, Brazil),

1 mM EDTA, pH > 13] at 4ºC for 20 min for DNA unwinding. The electrophoresis was

performed in the same buffer at 300 mA and 25 V/cm at 4ºC for 30 min. After the

electrophoresis, the slides were placed in a staining tray, covered with a neutralizing

buffer (0.4 M Tris-HCl, pH 7.5), stained with ethidium bromide, and analyzed. For each

treated group 500 nucleoids were analyzed,100 nucleoids per animal, using an

epifluorescence Leica DM 2000 Citogen microscope (Leica Microsystems, Wetzlar,

Germany), equipped with a Jenoptik ProgRes® MF camera (Optronics, Goleta, CA,

USA), driven by Lucia CytogeneticsTM version 2.5 software (Laboratory Imaging Ltd,

Prague, Czech Republic), 200 x magnification.

For the assessment of the genomic damage using the comet assay, the

OpenCometTM software, version 1.3 (Cometbio-OpenComet, Singapore) was

employed. Using a novel and robust method for finding comets based on geometric

shape attributes, this open-source software tool provides automated analysis of comet

assay images segmenting the comet heads through image intensity profile analysis.

As a result of automation, it is more accurate, less prone to human bias, and faster

than manual analysis [29]. Since percentage of DNA in the tail (%DNA in tail) is

commonly used in several studies for quantification of DNA damage [30–32], this

parameter was also chosen in our study.

Statistical analysis for the micronucleus test and comet assay

The genotoxic and antigenotoxic activities in the micronucleus test and comet assay

were evaluated using one-way ANOVA followed by the Tukey’s test. The cytotoxicity

and anticytotoxicity were analyzed by chi-square (𝜒2) test. For genotoxicity and

cytotoxicity evaluation, groups 3 and 4 were compared to the negative control (group

72

1). In the evaluation of antigenotoxicity, groups 5 and 6 (co-treatment), groups 7 and

8 (pre-treatment), groups 9 and 10 (post-treatment) were compared with the positive

control (group 2) in order to evaluate 4-MET effects against damage induced by CPA.

The results were considered statistically significant when p < 0.05. In the micronucleus

test the percentage reduction in CPA-induced genotoxicity was calculated using the

following formula [18]:

% Reduction = (A − B

A − C) X 100

where:

A: MNPCE mean in CPA treatment (positive control)

B: MNPCE mean in antigenotoxic treatment (4-MET + CPA)

C: MNPCE mean in negative control

Results

Ames test

The results of the mutagenic evaluation are presented in Table 1. All results were

obtained from three independent experiments carried out in triplicate. The data

obtained for the positive and negative control are in accordance with Maron and Ames

[22] and Mortelmans and Zeiger [33].

In the evaluation of mutagenicity, the doses of 4-MET tested (1, 10, 50, 100, and

500 µg/plate) did not cause an increase in the number of His+ revertant colonies in

both tester strains, TA98 or TA100, since no significant difference was observed

between the negative control and any doses of the coumarin-chalcone hybrid (p >

0.05). Moreover, none of the treatments with 4-MET reached MI ≥ 2 or dose-response

effects, with the highest induction in the strain TA100, which reached MI = 1.07 at dose

of 100 mg/plate. Thus, based on the results of the Ames test, 4-MET did not exhibit

mutagenic effect.

The results of the antimutagenic assessment showed that all tested doses of 4-MET

caused a significant decrease in the number of His+ revertant colonies in tester strains

TA98 and TA100 compared to the respective positive controls (p < 0.05). At doses of

1, 10, 50, 100, and 500 µg/plate, these treatments resulted in IP of 26.00%, 35.50%,

63.00%, 72.63%, and 77.78% for strain TA98, and 17.64%, 17.05%, 34.12%, 58.24%,

73

and 61.58% for strain TA100, respectively. Therefore, at all tested doses, 4-MET was

able to significantly reduce the mutagenic effects of sodium azide and 4-NQO.

74

TABLE 1. Means ± standard deviation (SD) of histidine revertant colonies (obtained from three independent experiments carried

out in triplicate), mutagenic index (MI), and inhibition percentage of mutagenicity (IP) for two tester strains of Salmonella

typhimurium, TA98 and TA100, after treatment with different doses of the coumarin-chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-

trimethoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one (4-MET).

Treatment Mutagenicity Antimutagenicity

TA 98 TA 100 TA 98 TA 100

Mean ± SD MI Mean ± SD MI Mean ± SD IP (%) Mean ± SD IP (%)

Negative control1 21.10 ± 0.95 1.00 128.00 ± 6.00 1.00 24.67 ± 2.08 _ 178.00 ± 37.00 _

Positive control2 637.55 ± 41.66 30.21 2259.00 ±81.00 15.53 524.86 ± 21.27 _ 2269.33 ±205.89 _

4-MET 1 µg/plate 21.55 ± 3.97A 1.02 124.00 ± 22.00A 0.96 394.55 ± 27.60D 26.00 1900.46 ± 25.25D 17.64

4-MET 10 µg/plate 19.77 ± 1.70A 0.93 124.00 ± 16.00A 0.96 347.47 ± 22.36D 35.50 1912.96 ± 31.47D 17.05

4-MET 50 µg/plate 18.55 ± 0.19A 0.87 137.00 ± 3.00A 1.06 211.22 ± 16.32D 63.00 1555.82 ± 45.66D 34.12

4-MET 100 µg/plate 19.33 ± 0.33A 0.91 138.00 ± 14.00A 1.07 161.54 ± 8.08D 72.63 1051.45 ± 8.42D 58.24

4-MET 500 µg/plate 13.99 ± 1.45A 0.66 119.00 ± 2.00A 0.92 135.77 ± 12.40D 77.78 981.67 ± 22.55D 61.58

1 Negative control: 20 µL dimethylsulfoxide (DMSO).

2 Positive control: 0.5 μg 4-nitroquinoline-1-oxide (4NQO) per plate for TA98 and 3.0 μg of sodium azide for TA100.

All values are means ± SD of three independent experiments.

Mutagenicity: A No significant difference compared to the negative control (p > 0.05). B Significant difference compared to the

negative control (p < 0.05). Antimutagenicity: C No significant difference compared to the positive control (p > 0.05). D Significant

difference compared to the positive control (p < 0.05).

Analyzed using one-way ANOVA and Tukey’s test.

75

Micronucleus test

No clinical signs of toxicity were observed in any treated groups and all animals

survived the treatment. Table 2 shows the frequencies of MNPCE and PCE/NCE ratio

in groups co-, pre-, or post-treated with 4-MET and CPA.

In this study, the negative control group (Group 1) exhibited low MNPCE values, as

expected, and the positive control group (Group 2) had a significant increase in

MNPCE compared to the negative control group (p < 0.05), confirming the sensitivity

of the test.

Genotoxicity: group 3, which received a single dose of 50 mg/kg 4-MET (24 h),

and group 4, which received 50 mg/kg 4-MET for five consecutive days (120 h), were

not able to significantly increase the MNPCE frequencies compared to the negative

control (p > 0.05). These results demonstrated the absence of genotoxic effects of 4-

MET in both treated groups.

Cytotoxicity: in group 3, the PCE/NCE ratio was 1.22, while in the negative control

group it was 1.1. According to this result, 4-MET exhibited absence of cytotoxic effect

at this dose (p>0.05). On the other hand, in group 4, the PCE/NCE ratio was 0.87,

while in the negative control group it was 1.1. Thus, the treatment with 50 mg/kg 4-

MET for 120 h (Group 4) caused a significant decrease in PCE/NCE ratio compared to

the negative control group (p<0.05), evidencing a moderate cytotoxic effect in this

dose.

Co-treatment: groups 5 and 6, respectively treated with 25 and 50 mg/kg 4-MET

and concomitantly treated with a single dose of 50 mg/kg CPA, presented a significant

decrease in MNPCE frequencies compared to the positive control group (p < 0.05),

reducing CPA-induced genotoxicity to 41% and 81%, respectively. These results

indicated the antigenotoxic effect of 4-MET.

Regarding to the anticytotoxicity assessment, in groups 5 and 6 the PCE/NCE ratios

were 0.69 and 1.07, respectively, while in the positive control group it was 0.71. The

dose of 4-MET used in group 5 did not cause a significant increase in the PCE/NCE

ratio compared to the positive control group (p > 0.05), therefore showing absence of

anticytotoxic effects. The dose of 4-MET employed in group 6 caused a significant

increase in PCE/NCE ratio compared to the positive control group (p < 0.05), showing

an anticytotoxic effect, demonstrating a protective action against the cytotoxicity

induced by CPA.

76

Pre-treatment: groups 7 and 8 were able to significantly reduce (p < 0.05) the

genotoxic activity of CPA to 64% and 70%, respectively. Thus, both doses of 4-MET

presented antigenotoxic effects.

In the assessment of 4-MET anticytotoxicity, the PCE/NCE ratios in groups 7 and 8

were 0.69 and 0.74, respectively, whereas in the positive control group it was 0.71.

Both doses did not cause a significant increase in PCE/NCE ratio compared to the

positive control group (p > 0.05), demonstrating the absence of anticytotoxic effect.

Post-treatment: Animals treated with 4-MET in the groups 9 and 10 significantly

reduced the MNPCE frequencies compared to the positive control group (p < 0.05).

These findings showed that at both doses 4-MET reduced the genotoxic activity of

CPA, to 79% and 83%, respectively, exhibiting an antigenotoxic effect in post-

treatment.

In relation to 4-MET anticytotoxicity, in Groups 9 and 10 the PCE/NCE ratios were

0.64 and 1.09, respectively, whereas in the positive control group it was 0.71. Thus,

the treatment with 25 mg/kg of 4-MET (Group 9) did not cause a significant increase

in PCE/NCE ratio compared to the positive control group (p > 0.05), showing the

absence of anticytotoxic effect. On the other hand, the treatment with 50 mg/kg 4-MET

(Group 10) caused a significant increase in PCE/NCE ratio compared to the positive

control group (p < 0.05), evidencing an anticytotoxic effect and demonstrating a

protective action against the cytotoxicity induced by CPA.

77

TABLE 2. Effects of treatments with different doses of the coumarin-chalcone hybrid

7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one (4-MET) on

the frequency of micronucleated polychromatic erythrocytes (MNPCE) and

polychromatic/normochromatic erythrocytes ratio (PCE/NCE) in bone marrow cells of

mice.

Group Treatment MNPCE/2000 PCE

(mean ± SD)

MNPCE Reduction

(%)

PCE/NCE

(mean ± SD)

1 Negative control (DMSO)1 4.2 ± 0.45 1.1 ± 0.05

2 Positive control (CPA)2 27.2 ± 1.3 0.71 ± 0.02

Genotoxicity and Cytotoxicity

3 4-MET 50 mg/kg BW (24 h) 5.2 ± 1.1 1.22 ± 0.06

4 4-MET 50 mg/kg BW (120 h) 5.5 ± 1.3 0.87 ± 0.03§

Co-treatment

5 4-MET 25 mg/kg BW (24 h) + CPA 17.8 ± 1.13* 41 0.69 ± 0.12

6 4-MET 50 mg/kg BW (24 h) + CPA 8.6 ± 1.1* 81 1.07 ± 0.08*

Pre-treatment

7 4-MET 25 mg/kg BW (120 h) + CPA 12.4 ± 2.2* 64 0.69 ± 0.06

8 4-MET 50 mg/kg BW (120 h) + CPA 11.6 ± 1.1* 70 0.74 ± 0.02

Post-treatment

9 CPA + 4-MET 25 mg/kg BW 9.2 ± 1.6* 79 0.64 ± 0.11

10 CPA + 4-MET 50 mg/kg BW 8.2 ± 4.9* 83 1.09 ± 0.02*

1 Negative control: Dimethylsulfoxide (DMSO) administered orally.

2 Positive control: 50 mg/kg BW cyclophosphamide (CPA) diluted in saline and

administered ip.

Groups 3 and 4, treated only with 4-MET, were compared to the negative control group.

Groups 5, 6, 7, 8, 9, and 10, co-, pre-, or post-treated with CPA, were compared to the

positive control group.

§ Significant compared to the negative control (p < 0.05).

*Significant compared to the positive control (p < 0.05).

Analysis using one-way ANOVA, Tukey’s test, and chi-square test.

78

Comet assay

The results of the comet assay, which was applied to evaluate the primary level

of DNA damage in bone marrow cells of mice treated with 4-MET are shown in Figure

2. 4-MET did not significantly induce DNA damage at dose 50 mg/kg (Groups 3 and 4)

compared to the negative control group (p > 0.05), demonstrating absence of genotoxic

effect at 24 h and 120 h.

FIG 2. Assessment of the genotoxic activity of the coumarin-chalcone hybrid 7-

methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one (4-MET) in

mouse bone marrow cells using the comet assay estimated by the parameter

percentage of DNA in tail. DMSO, dimethylsulfoxide (negative control); CPA,

cyclophosphamide (50 mg/kg) (positive control). ANOVA and the Tukey’s test.

Figure 3 shows the percentage of DNA damage in mice bone marrow cells exposed

to 4-MET and CPA. The doses of 25 and 50 mg/kg, in co-, pre- and post-treatments,

showed a significant reduction of DNA damage compared to the group treated with

CPA alone (p < 0.05). The highest reductions of DNA damage were 41% (co-

treatment), 42% (pre-treatment) and 50% (post-treatment). Thus, 4-MET exhibited

antigenotoxic effects in all treatment.

79

FIG 3. Assessment of the antigenotoxic activity of the coumarin-chalcone hybrid 7-

methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one (4-MET) in

mouse bone marrow cells using the comet assay estimated by the parameter

percentage of DNA in the tail. DMSO, dimethylsulfoxide (negative control); CPA,

cyclophosphamide (50 mg/kg BW) (positive control). ANOVA and the Tukey’s test. *

Difference in comparison with the positive control (p < 0.05).

Discussion

Based on the features of coumarins and chalcones, we designed and synthesized

the coumarin-chalcone hybrid 4-MET. In order to evaluate the genotoxic, cytotoxic,

and protective effects of this compound, we used in vitro and in vivo assays. The

results of the mutagenic assessment of 4-MET revealed that it did not exhibit

mutagenic effects on S. typhimurium tester strains TA98 and TA100 at any doses

tested. Similarly, previous studies reported the absence of mutagenic effects of

coumarins and/or chalcones on S. typhimurium strains TA98, TA1535, TA1537, and

TA1538 using the Ames test [34] [35][36] [37].

In the antimutagenicity evaluation using the Ames test, 4-MET showed significant

antimutagenic activity at all tested doses against both mutagens, 4-NQO and sodium

azide. Sodium azide and 4-NQO induce intracellular oxidative stress, generating

reactive oxygen species (ROS) and metabolic products that can interact with cellular

enzymes and DNA, causing point mutations [38] [39]. This significant antimutagenic

effect of 4-MET could be attributed to an antioxidant action already described in many

chalcone derivatives, which present α,β-unsaturated ketones [17][40]. This

unsaturation creates a nucleophilic center at β-carbon that may have interacted with

4NQO and sodium azide metabolites, reducing their mutagenic effects and oxidative

80

stress on DNA [12][4]. Therefore, 4-MET was able to protect DNA against frameshift

and base pair substitution mutations.

The use of the in vitro Ames mutagenicity test in combination with the in vivo

micronucleus test has been recommended in several international guidelines to

evaluate the genotoxic/antigenotoxic activity of substances [40]. Furthermore, a variety

of methods have been used to assess DNA damage, including the comet assay [41],

and the micronucleus test [42].

In the present study, 4-MET did not present genotoxic and cytotoxic effects (24 h)

by micronucleus test, and did not promote a significant increase in DNA damage by

comet assay. Similar results were found for other chalcones and coumarin, which did

not display cytotoxic and genotoxic effects by in vivo micronucleus test in mice, or in

vitro chromosome aberration assay [43] [44]. In the other hand, 4-MET in pre-treatment

caused a decrease in PCE/NCE ratio, evidencing a moderate cytotoxic effect. This

cytotoxicity could be due to a cumulative effect that 4-MET provoked by a long-term

treatment (120 h).

In the antigenotoxicity evaluation of 4-MET by micronucleus test and comet assay,

this compound caused significant reduction in MNPCE frequencies and DNA breaks

in all treatments. This antigenotoxic effect of 4-MET may suggest a relevant protective

action of this compound against the harmful effects induced by CPA. The alkylating

agent CPA is converted by cytochrome P450 enzymes to multiple active metabolites

that cause crosslink in DNA. Moreover, CPA induces the generation of oxidative stress

mediated by the disruption of the redox balance, resulting in increased ROS and lipid

peroxidation [45].

The obtained results in comet assay and micronucleus test indicate that this

compound was able to act in DNA damage prevention (co- and pre-treatment). The

significant antigenotoxic and anticytotoxic activities of 4-MET may have been resulted

from an antioxidant effect of this compound, along with the interaction with enzymes,

such as gutatione [1][7][9][46]. Previous studies related the antioxidant properties of

coumarins with the aromatic ring (ring B) presented in their structures. This ring

induces a resonance in the structure and creates an electrostatic potential, which might

lead this molecule to interact with ROS and enzymes [47][48]. Thus, this protective

effect of 4-MET might be due to a ROS scavenging activity and its interaction with

detoxifying enzymes, that decreased the CPA-damage action.

81

The post-treatment showed a decreasing in the number of DNA breaks and

reduction of MNPCE, suggesting the induction of DNA-repair systems. The reduction

in DNA damage observed in comet assay indicates that 4-MET might have avoided

the formation of chromosome mutations (micronuclei), confirmed by the reduction of

MNPCE induced by CPA observed in the micronucleus test. These findings are in

accordance with other reports which showed that coumarins can enhance DNA repair,

resulting in potential chemopreventive and antimutagenic effects [18][42].

Computational modelling studies predict that the two oxygen atoms in the lactone ring

(ring B) of coumarins may interact via hydrogen bonding with several amino acid

residues in different classes of enzymes and receptors [47][48]. The significant

antigenotoxic and anticytotoxic effects of 4-MET in the post-treatment could indicate a

possible interaction of this molecule with DNA-repair enzymes, which made 4-MET

capable to recover the DNA integrity without decreasing the cell viability. However,

further studies are required to better understand the mechanism of action of 4-MET in

the DNA repair process.

Therefore, this study showed that the new coumarin-chalcone hybrid 4-MET

demonstrated a protective effect against cell damage and mutations, and also a

possible role in DNA repair system. Also, this molecule could be used for future

development of chemopreventive and anticancer agents.

Conclusion

The results of the present study showed that the new hybrid molecule 4-MET,

composed of coumarin and chalcone, exhibited antimutagenic, antigenotoxic, and

anticytotoxic activities. Although 4-MET did not exhibit mutagenic/genotoxic effect at

the tested doses, this compound displayed relevant antimutagenic and antigenotoxic

actions in co-, pre-, and post-treatment and presented a moderate cytotoxic effect in

mouse bone marrow cells. This compound action is possible related to damage

prevention or to DNA-repair induction. Our findings indicate that 4-MET is a probable

candidate for the development of chemopreventive therapies. Further investigation

using different long-term tests in animals and research on molecular biology are

necessary to clarify the beneficial properties of this compound.

82

Acknowledgments

This study was financially supported by the Brazilian agency Fundação de Amparo à

Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG) under the auspices of the Federal University

of Goiás (UFG).

Author Contributions

Conceived and designed the experiments: CRV GRO LCC. Performed the

experiments: CRV DCSL MMA. Analyzed the data: CRV JHV LCC. Contributed

reagents/materials/analysis tools CRV GRO LCC. Wrote the paper: CRV DCSL JHV

MMA GRO LCC.

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88

8.2. Manuscrito a ser submetido à revista científica.

Modulating effect of a novel coumarin–chalcone hybrid [7-methoxy-3-(E)-3-

(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-cromen-2-one] against mitomycin-induced

genotoxicity in somatic cells of Drosophila melanogaster

Camila Regina do Vale1, Débora Cristina da Silva Lima1, Aroldo Vieira de Moraes

Filho1, Murilo Machado dos Anjos2, Guilherme Roberto de Oliveira2, Salvador de

Carvalho1 and Lee Chen-Chen1*

1Departamento de Genética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal

de Goiás, Goiânia, GO, Brazil, 2Instituto de Química, Universidade Federal de Goiás,

Goiânia, GO, Brazil

*To whom correspondence should be addressed. Tel.: +55 62 3521-1483; Email:

[email protected]

Abstract

Coumarins comprise a large class of molecules derived from phenolic compounds

found mainly in plants, and exhibit multiple biological activities such as antioxidant,

anti-inflammatory, and anti-tumoral properties. Chalcones are one of the major classes

of natural compounds widespread in fruits and vegetables and display many biological

properties, including antibacterial, antiviral, and anti-inflammatory activities. Based on

the biological activities of these two types of natural compounds, we synthesized a new

coumarin–chalcone hybrid [7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-

cromen-2-one] (4-MET) aiming to evaluate its recombinogenic/anti-recombinogenic

and mutagenic/antimutagenic activities using the somatic mutation and recombination

test (SMART) in Drosophila melanogaster. To assess the mutagenic and

recombinogenic activities, 3-day-old larvae derived from standard cross (ST) and high

bioactivation cross (HB) were treated with different concentrations of 4-MET for 48 h.

The anti-recombinogenic and antimutagenic activities were assessed using larvae

derived from both crosses co-treated with the same concentrations of 4-MET and

mitomycin C. SMART revealed no mutagenic or recombinogenic effects, but

antimutagenic and anti-recombinogenic activities were observed in somatic cells of D.


89

melanogaster from both crosses. We suggest that the antimutagenic and anti-

recombinogenic activities observed in the present study may have been a result of the

antioxidant activity of 4-MET.

Introduction

Coumarins, also known as benzopyrones, comprise a large class of cinnamic

acids derived from phenolic compounds. They are found in fungi, bacteria, and plants,

particularly in edible plants from different families. Exposure to coumarins in human

diet is quite significant, since they have a wide distribution in plant based foods and

beverages (1), mainly vegetables, fruits, seeds, nuts, coffee, tea, and wine (2).

Coumarins have attracted intense interest in recent years, and they have

already been proven to display a large variety of biological activities, including

prevention of cancer and anti-HIV effect (3–5). These compounds are known to exert

antitumoral effects (2,4,6), and they can cause significant changes in cell growth and

differentiation (7). Coumarins exhibit various other properties, including antithrombotic,

antiviral, immunomodulatory (8), anti-inflammatory (1), and antioxidant activities (5).

Chalcones constitute another important class of natural products and belong to

the flavonoid family (9–11). Chemically, they can be considered open-chain flavonoids

with two aromatic rings joined by a three-carbon α,β-unsaturated carbonyl system.

Chalcones are widely distributed in fruits, vegetables, spices, tea, and soybean (12).

Since they are abundant in plants and easily synthesized, these compounds have

attracted great interest due to possible therapeutic uses (9).

Chalcones have been reported to possess many beneficial biological activities,

including anti-inflammatory, antibacterial, antioxidant, antimalarial, antiviral, anti-

diabetic, anti-ulcer, and anticancer properties (11,13). They are also effective as cell

proliferating inhibitors and chemopreventive agents (9).

Coumarins and chalcones exhibit biological properties related to radical

scavenging effect, due to their antioxidant activities, along with other possible

mechanisms such as anti-inflammatory effects and interaction with several enzymes

(4,11,14). Coumarins can be potent reactive oxygen species (ROS) scavengers and

metal chelating agents (15), whereas chalcones show antioxidant activity against both

hydroxyl and peroxyl radicals (11).

90

A series of coumarin–chalcone hybrids have recently been designed and

synthesized (1,11,13,15–19). The development of hybrid molecules through the

combination of different pharmacophores in order to design new bioactive agents may

lead to the synthesis of compounds with interesting biological profiles (9,10,14). These

combined pharmacophores probably offer some advantages such as overcoming drug

resistance (20), improving biological potency of therapeutic drugs, and treating

numerous diseases (10,14).

Despite the various biological activities of coumarins and/or chalcones, their

widespread use, and the numerous derivatives of these compounds already

synthesized for potential use in humans, the results of researches about their

genotoxicity or protective effects are partially conflicting (4). Moreover, studies on their

possible mutagenic/antimutagenic effects are lacking (21).

Due to the biological activities and wide distribution of coumarins and chalcones

in plant based foods and beverages used in the human diet, and in view of the

considerable importance of both compounds and their antioxidant properties, we

synthesized the new coumarin–chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-

trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-chromen-2-one (4-MET) and assessed its effect on DNA

damage. The aim of the present study was to evaluate the recombinogenic/anti-

recombinogenic and mutagenic/antimutagenic activities using the somatic mutation

and recombination test (SMART) in Drosophila melanogaster (22).

SMART uses wings of D. melanogaster and is a flexible and sensitive short-

term test for the detection of genotoxicity of inductor agents (23–25). This test is based

on loss of heterozygosity (LOH), which occurs through several mechanisms such as

chromosome loss and deletion, half-translocation, mitotic recombination, mutation,

and non-disjunction. Genetic alterations in somatic cells of wing imaginal discs result

in mutant clones in wing blades (26). SMART exploits the increased rate of mutant

spots in the presence of a genotoxic compound to detect genotoxicity (27), this assay

also identifies antigenotoxicity of several compounds (28), and allows the simultaneous

detection and quantification of mutations and mitotic recombinations, the main factors

related to carcinogenesis (28,29).

91

Materials and methods

Synthesis of compounds

All commercially available reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St.

Louis, MO, USA), unless stated otherwise. Thin-layer chromatography (TLC) was

conducted on silica gel 60 F254 plates (Merck KGaA, Darmstadt, Germany). 1H NMR

and 13C NMR spectra were recorded on a Bruker Advance III (500 MHz) spectrometer

(Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Germany). Infrared (IR) spectrum was performed on a

Bomem M102 spectrometer (Bomem Inc., Vanier, Quebec, Canada).

Preparation of 3-acetyl-7-methoxy-2H-chromen-2-one

The synthesis of 3-acetyl coumarin was carried out at the Institute of Chemistry,

Universidade Federal de Goiás, Goiânia, GO, Brazil, following Bhatnagar et al. (30)

with slight modifications. An aliquot of 0.2 mL diethylamine was added to a 2-hydroxy-

4-methoxybenzaldehyde (2.0 mmol) and methyl acetoacetate (2.2 mmol) solution in

3.0 mL ethanol. After stirring the mixture for 6 h at room temperature, the solid was

filtered, washed with cold ethyl ether, and recrystallized in ethanol. ¹H NMR

(CDCl3) δ: 8.48 (s; 1H), 7.55 (d; 1H; J = 8.7 Hz), 6.90, 6.82 (1H; J = 2.4 Hz) (dd; 1H; J

= 8.7 Hz and 2.4 Hz), 3.92 (s; 3H), 2.70 (s; 3H). 13C NMR (CDCl3) δ: 195.7; 165.5;

159.9; 147.9; 131.7; 120.9; 114.1; 112.3; 100.6; 56.3; 30.7.

Synthesis of the coumarin–chalcone hybrid 4-MET

The coumarin–chalcone hybrid 4-MET (1) was synthesized at the same

laboratory through aldolic condensation of 3-acetyl-7-methoxy-2H-chromen-2-one (2)

previously synthesized (as described above) and the appropriate aldehyde (Figure 1).

An aliquot of 0.2 mL piperidine was added to a solution of 3-acetyl-7-methoxy-2H-

chromen-2-one (2.0 mmol) and 3,4,5-trimethoxy benzaldehyde (2.0 mmol) in 3.0 mL

anhydrous ethanol. The mixture was stirred for 10 min and refluxed overnight. The

solid was filtered and recrystallized in ethanol, resulting in 4-MET. IR (KBr) max cm-1:

3040, 2980, 1737, and 1211. ¹H NMR (CDCl3) δ: 8.60 (s; 1H), 7.92 (d; 1H; J = 15.69

Hz), 7.79 (d; 1H; J = 15.69 Hz), 7.58 (d; 1H; J = 8.71), 6.93 (dd; 1H; J = 8.71 and 2.45

Hz), 6.91 (s; 2H), 6.86 (d; 1H; J = 2.45 Hz), 3.94 (s; 3H), 3.93 (s; 6H), and 3.91 (s; 3H).

92

The compound 4-MET was suspended in 0.5% dimethyl sulfoxide (DMSO)

immediately before use in the treatments.

FIG. 1. Synthesis of the coumarin-chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-

trimethoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one (4-MET) (1) from 3-acetyl-7-methoxy-

2H-chromen-2-one (2). Reagents and conditions: (a) 3,4,5-trimethoxy benzaldehyde

and piperidine/anhydrous ethanol (reflux).

Somatic Mutation and Recombination Test (SMART) in Drosophila melanogaster

In the SMART wing assay, three strains of D. melanogaster were used: 1.

multiple wing hairs (mwh): y;mwh j (mwh, 3-0.3); 2. flare3 (flr3, 3-38.8) [flr3/In(3LR)TM3,

ri pp sep I(3)89Aabx34e and BdS]; 3. ORR/ORR; flr3/In(3LR)TM3, ri pp sep I(3)89Aabx34e

and BdS. To produce the standard cross (ST), stocks of flare3 virgin females were

crossed with stocks of mwh males (31,32). To produce the high bioactivation cross

(HB), stocks of ORR;flare3 virgin females were crossed with stocks of mwh males (23).

HB has high sensitivity to promutagens and procarcinogens since the ORR;flr3/

TM3,BdS strain carries chromosomes 1 and 2 from a DDT-resistant Oregon R (R) line,

with an increased level of cytochrome P-450 (33).

Both crosses produce two types of progeny phenotypically distinguished by the BdS

marker, i.e. marker-heterozygous (MH) flies (mwh +/+ flr3), with phenotypically wild-

type wings, and balancer-heterozygous (BH) flies (mwh/TM3, BdS), with phenotypically

serrate wings. For a detailed analysis of genetic markers, consult Lindsley and Zimm

(34).

Experimental procedure

The experiments were carried out following Graf et al. (22). Eggs from both

crosses were collected over an 8-hour period and kept in culture bottles containing a

solid agar base (3%, w/v) covered with a layer of live Saccharomyces cerevisiae

93

supplemented with sucrose. Third instar (72 ± 4 h) larvae were removed from the

culture bottles, washed in tap water, and collected with a fine mesh stainless steel

sieve.

Batches of equal numbers of larvae (100 larvae/concentration) were collected

from both crosses and transferred to glass vials containing 0.9 g mashed potato flakes

hydrated with 4-MET. To verify the toxic potential of the test coumarin–chalcone hybrid,

we employed different concentrations of 4-MET (1, 5, 20, 50, 100, 200, and 400 µg/mL)

and generated larval survival curves. To assess mutagenicity and antimutagenicity of

the test compound, four concentrations of 4-MET (5, 50, 100, and 400 µ/mL) were

administered to the larvae, and for the latter, the larvae were simultaneously treated

with MMC (0.05 mM). Treatments with DMSO (0.5%) and MMC (0.05 mM) were

included in the experiments as negative and positive controls, respectively. Larvae

were reared on the medium for the remainder of their larval life (~48 h) until hatching.

The experiments were carried out at 25°C and 60% relative humidity.

After hatching, flies were killed and stored in 70% ethanol until used for analysis.

Wings of MH flies were removed, mounted on glass slides with Faure’s solution (30 g

gum arabic, 20 mL glycerol, 50 g chloral hydrate, and 50 mL water), and examined for

spots using a compound microscope at 400X magnification. Wings of BH flies were

mounted and analyzed following the same procedure described above whenever a

positive response was obtained for MH progeny. During the analysis, the positions of

the spots were recorded per wing section (22).

Single spots result from point mutations, chromosomal aberrations, or recombination

events, whereas twin spots (flare and mwh) result from mitotic recombination between

the proximal flare marker and the centromere of chromosome 3 (35,36). Therefore, the

results obtained for MH and BH flies were compared to quantify the recombinogenic

potential (24,37,38).

Statistical analysis

The frequencies of spots per fly were compared with the concurrent control

series (38,39). The conditional binomial test (40) was used to make statistical

comparisons followed by a multiple-decision procedure (39), in which three potential

diagnoses were possible: positive, negative, or inconclusive. The results were

considered statistically significant when p < 0.05.

94

The treatment is considered effective if the frequency of mutant clones in the

treated series is at least m (multiplication factor) times greater than in the control series.

Since small single spots and total spots have a comparatively high spontaneous

frequency, m is fixed at a value of 2 (testing for a doubling of the spontaneous

frequency). For large single spots and twin spots, with a low spontaneous frequency,

m is fixed at a value of 5 (41).

Only mwh clones (mwh single and mwh twin spots) were used to calculate the

clone formation frequencies per 105 cells because of the weak expression of the flr3

marker in small clones and its lethality in large clones of mutant cells (42). The

calculated values were used to estimate the contribution of recombination and

mutation to the incidence of total mutant spots per fly in trans-heterozygous flies (43).

The inhibition percentages (IP) were calculated using the total number of spots per

wing with the following formula (44,45):

% IP = {MMC alone − (MMC + 4 − MET)

MMC alone} × 100

Results

Based on the results of the survival curves generated (Figure 2), none of the

concentrations of 4-MET used (1, 5, 20, 50, 100, 200, and 400 µg/mL) had significant

effects on the number of survivors and, therefore, the doses tested were not toxic to

D. melanogaster larvae.

95

Fig. 2: Survival curves of descendants of Drosophila melanogaster from standard

(ST) and high bioactivation (HB) crosses fed different concentrations (1, 5, 20, 50,

100, 200 and 400 µ/mL) of 4-MET.

The choice of the final concentrations of 4-MET was based on two main criteria:

reduction of percentage of survival of larvae, which is a clear indication that the

compounds affect the larvae, and number of emerging adults, which must be

sufficiently high to allow the implementation of the treatments (32,46,47).

Table 1 shows the frequencies of mutant spots observed in MH descendants from ST

and HB individuals treated with 4-MET alone. In the mutagenicity evaluation, none of

the four doses of 4-MET employed (5, 50, 100, and 400 µg/mL) significantly increased

the frequency of any categories of spots or total spots (p > 0.05). Hence, it is possible

to infer that 4-MET is not mutagenic to ST and HB at these concentrations.

96

Table 1. Frequency of mutant spots observed in somatic cells of marker-heterozygous (mwh/flr3) Drosophila melanogaster descendants of standard cross (ST) and high bioactivation cross (HB) treated with four different concentrations (5, 50, 100, and 400 µg /mL) of the coumarin–chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-cromen-2-one (4-MET)

Treatment 4-MET

Individuals (no.)

Frequency of mutant spots per individual (no. of spots)a

SSS (1–2 cells)b, m = 2

LSS (>2 cells)b, m = 5

TWS, m = 5 TOS, m = 2

ST mwh/flr3

Negative controlc 40 0.68 (27) 0.15 (6) 0.05 (2) 0.88 (35) Positive controld 40 11.25 (450)+ 6.65 (266)+ 2.45 (98)+ 20.35 (814)+ 5 µg/mL 40 0.35 (14)– 0.08 (3)– 0.00 (0)i 0.43 (17)– 50 µg/mL 40 0.15 (6)– 0.03 (1)– 0.00 (0)i 0.18 (7)– 100 µg/mL 40 0.50 (20)– 0.03 (1)– 0.00 (0)i 0.52 (21)– 400 µg/mL 40 0.60 (24)– 0.08 (3)– 0.05 (2)i 0.73 (29)–

HB mwh/flr3

Negative control 40 0.88 (35)– 0.20 (8)– 0.00 (0) 1.08 (43)– Positive control 40 11.65 (466)+ 5.40 (216)+ 1.20 (48)+ 18.25 (730)+ 5 µg/mL 40 0.18 (7)– 0.05 (2)– 0.00 (0)i 0.23 (9)– 50 µg/mL 40 0.10 (4)– 0.08 (3)– 0.03 (1)i 0.20 (8)– 100 µg/mL 40 0.18 (7)– 0.05 (2)– 0.00 (0)i 0.23 (9)– 400 µg/mL 40 0.23 (9)– 0.08 (3)– 0.03 (1)i 0.33 (13)–

aStatistical diagnosis following Frei and Würgler (38): –, negative; +, positive; i, inconclusive. bIncluding rare f lr3 single spots. cNegative control: 0.5% dimethylsulfoxide (DMSO). dPositive control: 0.05 mM mitomycin C (MMC). SSS, small simple spots; LSS, large simple spots; TWS, twin spots; TOS, total spots; m, multiplication factor.

97

The frequencies of mutant spots observed in MH and BH descendants from ST

individuals treated with 4-MET and co-treated with MMCGIKLUPO are in Table 2. In

the antimutagenicity assessment of ST, 4-MET reduced the genotoxicity induced by

MMC in all mutant spot categories in MH and BH descendants. In ST, MH descendants

inhibition ranged from 42% to 64%.

Table 3 shows the frequencies of mutant spots observed in MH and BH

descendants of HB individuals treated with 4-MET and co-treated with MMC. In the

antimutagenicity evaluation of HB, 4-MET reduced the mutagenicity induced by MMC

in all mutant spot categories in MH and BH descendants. The inhibition in MH

descendants of HB ranged from 32% to 59%. Based on these findings, 4-MET

modulated the genotoxic activity of MMC, which demonstrates its antimutagenic

activity.

In the present study, the treatment with MMC alone produced a positive

response in both MH and BH descendants of ST and HB, showing that the coumarin–

chalcone hybrid was mutagenic under these experimental conditions (Tables 2 and 3).

This result agrees with the expected value and confirms the sensitivity of the test to

produce mutant spots.

Considering the clone induction frequency per 105 cells, we compared the

number of observed spots in MH flies to those of BH flies and quantified the relative

contribution (%) of mutation and recombination to the total number of spots (37,44,49).

Clone induction frequency of a treatment with MMC alone was compared between

genotypes, and we found that 30% of the mutant clones produced in ST flies occurred

due to mutation, whereas 70% of them occurred due to recombination. Similarly, 35%

of the spots induced in HB flies resulted from mutation and 65% from recombination.

The recombination rates resulting from treatments with 5, 50, 100, and 400 µg/mL 4-

MET co-treated with MMC in ST descendants were 70%, 71%, 80%, and 86%,

respectively. Furthermore, in HB cross descendants, the frequencies of recombination

produced by MMC combined with 5, 50, 100, and 400 µg/mL 4-MET were 64%, 66%,

54%, and 49%, respectively. These results demonstrate that induced spots occurred

mostly due to recombination (Tables 2 and 3).

98

Table 2. Frequency of mutant spots observed in marker-heterozygous (mwh/flr3) and balancer-heterozygous (mwh/TM3) Drosophila melanogaster descendants of standard cross (ST) co-treated with four different concentrations (5, 50, 100, and 400 µg /mL) of the coumarin–chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-cromen-2-one (4-MET) and mitomycin C (MMC)

Treatment Individuals (no.)

Frequency of mutant spots per individual (no. of spots)a Total mwh

clonesc (no.)

Frequency of clone induction per 105 cellsd

(n/NC)e

Recombination

(%)f

Inhibition (%) SSS

(1–2 cells)b

m = 2

LSS (>2 cells)b

m = 5

TWS m = 5

TOS m = 2

4-MET (µg/mL)

MMC (mM)

ST mwh/flr3

0 0 40 0.60 (24) 0.10 (4) 0.05 (2) 0.75 (30) 29 1.54 0 0.05 40 11.25(450)+ 6.65 (266)+ 2.45 (98)+ 20.35(814)+ 765 41.70(40.1) 76 5 0.05 40 6.83 (273)* 4.03 (161)* 1.20 (48)* 12.05 (482)* 458 24.69(23.1) 70 42 50 0.05 40 5.65 (226)* 3.95 (158)* 0.45 (18)* 10.05 (402)* 393 20.59(19.0) 71 52 100 0.05 40 4.55 (182)* 3.18 (127)* 0.13 (5)* 7.85 (314)* 311 16.09(14.5) 80 64 400 0.05 40 4.08 (163)* 3.90 (156)* 0.55 (22)* 8.53 (341)* 330 17.47(15.9) 86 60

ST mwh/TM3

0 0 40 0.40 (16) 0.05 (2) 1.30 (52)+ 0.90 (36)* 1.18 (47)* g 0.58 (23)* 0.65 (26)*

0.45 (18) 18 0.92

0 0.05 40 3.78 (151)+ 5.08 (203)+ 203 10.40 (9.48)

5 0.05 40 2.95 (118)* 3.85 (154)* 154 7.89 (6.97) 26

50 0.05 40 1.95 (78)* 3.13 (125)* 125 6.40 (5.48) 42

100 0.05 40 1.38 (55)* 1.95 (78)* 78 4.00 (3.07) 67

400 0.05 40 0.90 (36)* 1.55 (62)* 62 3.18 (2.25) 76 aStat ist ical diagnosis following Frei and Würgler (38): +, posit ive; *, signif icant difference compared with the posit ive control group (p < 0.05). b Including rare f lr3 s ingle spots. cConsidering clones mwh for single spots mwh and twin spots. dFrequency of clone formation: clones/wings/24,400 cells (48). en, number of spots mwh; NC, number of cells. fPercentage of recombination calculated according to the formula: R = 1 – [(n/NC in mwh/TM3 flies)/(n/NC in mwh/flr3 flies)] ×100 (34). Control corrected frequencies were used for these calculations. gOnly single spots mwh can be observed in balancer-heterozygous individuals. SSS, small simple spots; LSS, large simple spots; TWS, twin spots; TOS, total spots; m, multiplication factor; m, multiplication factor.

99

Table 3. Frequency of mutant spots observed in marker-heterozygous (MH) and balancer-heterozygous (BH) Drosophila melanogaster descendants of high bioactivation cross (HB) co-treated with four different concentrations (5, 50, 100, and 400 µg /mL) of the coumarin–chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-cromen-2-one (4-MET) and mitomycin C (MMC)

Treatment Individuals (no.)

Frequency of mutant spots per individual (no. of spots)a Total mwh

clonesc (no.)

Frequency of clone induction per 105 cellsd

(n/NC)e

Recombination

(%)f

Inhibition (%) SSS

(1–2 cells)b

m = 2

LSS (>2 cells)b

m = 5

TWS m = 5

TOS m = 2

4-MET (µg/mL)

MMC (mM)

HB mwh/flr3

0 0 40 0.88 (35) 0.20 (8) 0.00 (00) 1.08 (43) 43 2.20 0 0.05 40 11.65(466)+ 5.40 (216)+ 1.20 (48)+ 18.25(730)+ 706 37.30(35.0) 65 5 0.05 40 8.28 (331)* 4.15 (166)* 0.30 (12)* 12.73 (509)* 503 26.08(23.8) 64 32 50 0.05 40 8.60 (344)* 3.50 (140)* 0.93 (37)* 13.03 (521)* 502 26.69(24.4) 66 30 100 0.05 40 8.28 (331)* 2.73 (109)* 0.33 (13)* 11.33 (453)* 446 23.21(21.0) 54 41 400 0.05 40 4.60 (184)* 2.90 (116)* 0.55 (22)* 8.05 (322)* 311 16.50(14.2) 49 59

HB mwh/TM3

0 0 40 0.15 (6) 0.13 (5) 1.33 (53)+ 0.88 (35)* g 1.25 (50)* 0.63 (25)* 0.55 (22)*

0.28 (11) 11 0.56

0

0.05

40

4.85 (194)+

6.18 (247)+

247

12.65(2.09)

5 0.05 40 3.43 (137)* 4.30 (172)* 172 8.81 (8.25) 32

50 0.05 40 2.93 (117)* 4.18 (167)* 167 8.56 (7.99) 31

100 0.05 40 4.38 (175)* 5.00 (200)* 200 10.25(9.68) 20

400 0.05 40 3.25 (130)* 3.89 (152)* 152 7.79 (7.22) 40 aStat ist ical diagnosis following Frei and Würgler (38): +, posit ive; *, signif icant difference compared with the posit ive control group (p < 0.05). b Including rare f lr3 s ingle spots. cConsidering clones mwh for single spots mwh and twin spots. dFrequency of clone formation: clones/wings/24,400 cells (48). en, number of spots mwh; NC, number of cells. fPercentage of recombination calculated according the formula: R = 1 – [(n/NC in mwh/TM3 flies)/(n/NC in mwh/flr3 flies)] ×100 (34). Control corrected frequencies were used for these calculations. gOnly single spots mwh can be observed in balancer-heterozygous individuals. SSS, small simple spots; LSS, large simple spots; TWS, twin spots; TOS, total spots; m, multiplication factor; m, multiplication factor

100

Discussion

The aim of the present study was to evaluate the mutagenic/antimutagenic and

recombinogenic/anti-recombinogenic activities of the novel coumarin–chalcone hybrid

4-MET using the SMART test in D. melanogaster. SMART was developed to detect

LOH of suitable genetic markers that have detectable phenotypes expressed on D.

melanogaster wings. This assay is an efficient and quick method for quantifying the

recombinogenic and mutagenic potential of chemical and physical agents (24,29,50).

The results of the mutagenic assessment using SMART showed that 4-MET did

not significantly increase the frequency of any classes of spots in ST or HB. These

findings indicated that 4-MET did not induce somatic mutation or recombination in D.

melanogaster. Similarly, previous studies reported the absence of mutagenic effects

of coumarins and/or chalcones on in vivo assays (51). Moreover, two chalcones,

namely 4-hydroxyderricin and xanthoangelol, were not genotoxic to bone marrow

erythrocytes of mice using the chromosome aberration assay and the micronucleus

test (52). Similar results were described in other in vivo study using the coumarin 4-

methylesculetin, no genotoxic effects were found (21). Various tests (Ames

mutagenicity test, comet assay, micronucleus test in mice, and SMART) have shown

that coumarins and chalcones are not genotoxic (2,5,15,21, 53–56). Our results

corroborate these findings, since 4-MET did not induce somatic mutation or

recombination in D. melanogaster.

In the evaluation of antimutagenicity, the chronic co-treatment of ST and HB

larvae with MMC and different concentrations of 4-MET led to significant reductions in

all three categories of spots in flies. Therefore, 4-MET acted as an antimutagenic agent

on MMC-induced DNA lesions. This result is consistent with the literature, since

coumarins and chalcones have been described as compounds that reduce induced

mutagenicity (54), inhibit carcinogenesis in rodents (57), and possess potential

chemopreventive and antimutagenic properties (21,56,58,59,60,61,62,63,64,65).

In the present study, 4-MET revealed antimutagenic effect against damage

induced by MMC in somatic cells of D. melanogaster. The mutagenic action of MMC

is related to its ability to produce reactive free radicals (66). Free radicals generated

by exogenous chemicals, such as MMC, or endogenous metabolites may cause

oxidative damage, resulting in cell death and tissue damage (67). Oxidative damage

involves single- or double-strand DNA breaks, purine and pyrimidine modifications,

DNA intrastrand adducts, and DNA cross links (68–71). Data from numerous

101

experiments suggest that oxidative damage to DNA contributes to aging and the

etiology of many human diseases, including atherosclerosis, neurodegenerative

diseases, and even cancers (72–74).

The antimutagenic effect of 4-MET observed in our study might be attributed to

its antioxidant activity, since the genotoxic action of MMC is related to its ability to

produce reactive free radicals (66). Thus, the primary action of 4-MET might be

associated with the protection of nucleophilic sites in DNA. These results show

similarity to literature reports. The antigenotoxic potential of coumarin in the bone

marrow cells of golden Syrian hamsters was probably due to its antioxidant potential

and modulating effect on phases I and II of the detoxification cascade (75). Vazquez-

Rodriguez et al. (65) demonstrated the antioxidant activity of several coumarin–

chalcone hybrids. Several others research groups, also have proved the antioxidant

activities of these compounds (9,10).

This antioxidant activity relies on the chalcone and/or coumarin nucleus, which

serves as nucleophiles to scavenge the reactive metabolites (76). Chalcones presents

α,β-unsaturated ketones (77,78, 79). This unsaturation creates a nucleophilic center

at β-carbon that may have interacted with MMC metabolites, reducing their mutagenic

effects and oxidative stress on DNA. Furthermore , previous studies related the

antioxidant properties of coumarins with the aromatic ring (ring B) presented in their

structures. This ring induces a resonance in the structure and creates an electrostatic

potential, which might lead this molecule to interact with ROS (77,78). Therefore, the

antimutagenic effect of 4-MET observed in our study may be attributed, at least

partially, to its molecular structure, composed of both a coumarin and a chalcone,

which facilitates radical scavenging activity and prevents DNA damage.

Previous studies have demonstrated the importance the SMART, since it is

suitable for the detection of recombinogenic activity of several chemicals (24). Mitotic

recombination is related to the development of several types of tumor (29,81).

Therefore, highlight the importance of defining the recombinogenic profile of 4-MET.

We observed that 4-MET displays both antimutagenic and anti-recombinogenic

activity. Thus, from the overall results of this study, it can be concluded that 4-MET is

a potential chemopreventive compound.

Therefore, all the results of this study demonstrate that the novel coumarin–

chalcone hybrid 4-MET exhibits antimutagenic and anti-recombinogenic activities.

102

These properties may have been the result of its antioxidant activity, and support the

use of this compound as a chemopreventive agent.

Conclusion

In conclusion, the present results indicate that 4-MET was not mutagenic and/or

recombinogenic at the doses tested. Additionally, it protected D. melanogaster somatic

cells against the mutagenic and/or recombinogenic effects of MMC. The assay used

in this study clearly showed that 4-MET is an efficient modulator of mutagenic action.

This property may be attributed to the antioxidant activity of this compound, already

described in the literature. By decreasing the formation of free radicals, this novel

coumarin–chalcone hybrid inhibits oxidative genetic damage and therefore can be

used in primary health care. Our results indicate that 4-MET is a probable candidate

to the development of chemopreventive therapies. However, more research is

necessary to clarify the beneficial properties of this compound.

103

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112

9. CONCLUSÃO GERAL

Considerando os objetivos propostos e de acordo com os resultados obtidos

neste trabalho, pôde-se concluir que o híbrido cumarina-chalcona 7-metoxi-3-(E)-3-

(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil)-2H-cromen-2-ona (4-MET), nas condições experimentais

realizadas:

-4-MET não foi capaz de induzir mutações do tipo substituição nos pares de base e

“frameshift” (mudança no quadro de leitura) em cepas de Salmonella thyphimurium

TA100 e TA98, pelo teste de Ames;

Ainda pelo teste de Ames, 4-MET foi capaz de proteger o DNA bacteriano contra a

ação dos mutágenos 4-NQO e azida sódica;

Utilizando o teste do micronúcleo em medula óssea de camundongos, nenhum efeito

genotóxico foi apresentado por 4-MET, em três tipos de tratamentos, pré, co e pós-

tratamento.

Pelo ensaio cometa, nenhum efeito genotóxico foi apresentado por 4-MET, em três

tipos de tratamentos, pré, co e pós-tratamento;

Em todas as doses de 4-MET testadas no pré, no co e pós-tratamento com a

ciclofosfamida houve redução significativa na frequência de MN induzidos por esse

agente de alquilação no DNA.

- Os resultados obtidos na avaliação da genotoxicidade e antigenotoxicidade, tanto no

teste do micronúcleo, quanto no ensaio cometa foram similares. Os efeitos

antigenotóxicos observados, em ambos os testes, em diferentes tipos de tratamento

(co, pré e pós-tratamento) indicaram que este composto atua tanto na prevenção de

danos, quanto no processo de reparo celular.

Em todas as concentrações utilizadas não houve aumento significativa no número

de manchas mutantes observadas no teste SMART/asa, demonstrando ausência de

efeitos mutagênicos e /ou recombinogênicos;

Em todas as concentrações utilizadas juntamente com a MMC, houve uma redução

significativa no número de manchas mutantes observadas no teste SMART/asa,

demonstrando efeitos antimutagênico e /ou anti-recombinogênico.

Assim, os efeitos protetores de 4-MET, em diferentes organismos testes in vitro

e in vivo, demonstraram que esse composto pode ser utilizado no desenvolvimento

de novas terapias quimiopreventivas. Entretanto, futuras pesquisas, ainda serão

necessárias para esclarecer os mecanismos de ação quimiopreventivo de 4-MET.

113

ANEXO 1: Parecer Favorável do Comitê de Ética

AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES GENOTÓXICA, ANTIGENOTÓXICA ... · Cumarinas e chalconas são...

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