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DENISE HAIBARA AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA E IMUNOHISTOQUÍMICA DA ENCEFALOPATIA EM GATOS INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE PELO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA DOS FELINOS São Paulo 2011
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DENISE HAIBARA
AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA E IMUNOHISTOQUÍMICA DA
ENCEFALOPATIA EM GATOS INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE PELO
VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA DOS FELINOS
São Paulo
2011
DENISE HAIBARA
AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA E IMUNOHISTOQUÍMICA DA
ENCEFALOPATIA EM GATOS INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE PELO
VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA DOS FELINOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental e Comparada da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências Departamento: Patologia Área de concentração: Patologia Experimental e Comparada Orientador: Prof. Dr. Paulo César Maiorka
São Paulo 2011
FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome do autor: HAIBARA, Denise
Título: Avaliação histopatológica e imunohistoquímica da encefalopatia em gatos
infectados experimentalmente pelo vírus da imunodeficiência dos felinos.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental e Comparada da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências
Data:___/___/____
Banca examinadora
Prof. Dr_________________________Instituição:__________________________
Assinatura:______________________Julgamento:__________________________ Prof. Dr_________________________Instituição:__________________________
Assinatura:______________________Julgamento:__________________________ Prof. Dr_________________________Instituição:__________________________
Assinatura:______________________Julgamento:__________________________
Aos meus pais Mitur e Fujie e à minha
irmã Ana Paula pelo amor de família.
E a todos os meus novos e velhos
amigos pelo apoio e encorajamento
constante.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Dr. Paulo César Maiorka, que me acolheu ainda na
graduação e me ajudou muito nessa caminhada. Muito obrigada pela confiança, e
orientação.
À Profa. Dra. Mitika Kuribayashi Hagiwara pela co-orientação valorosa.
Ao Marcelo de Souza Zanutto, por disponibilizar o seu material de pesquisa.
Ao Adriano Tony Ramos, pela realização das necropsias e por me permitir
acompanhá-las, ainda nos tempos em que eu era estagiária.
Aos colegas: Maria Luisa Landman, Luiz Fernando Panigassi, Caio Rodrigues
dos Santos, Samantha Ive Myashiro e em especial à Adriana de Siqueira e Anna
Carolina Barbosa Esteves Maria que me ajudaram muito em todas as etapas do
projeto. Muito obrigada pelas conversas, risadas, apoio moral e amizade verdadeira.
Ao Bruno Marques Teixeira, pelas discussões sobre FIV, que se mostraram
extremamente esclarecedoras e valiosas para o meu trabalho.
Aos meus pais Mitur Haibara e Fujie Koshiyama Haibara e à minha irmã Ana
Paula Haibara, por toda a dedicação e apoio.
À Profa. Dra. Lilian Rose Marques de Sá e à médica veterinária Luciana
Neves Torres, por todos os ensinamentos, todas as dúvidas tiradas e todas as
gentilezas.
Aos técnicos do laboratório de histologia Luciano Bugalho e Cláudio Arroyo
pela paciência e auxílio no processamento dos materiais histológicos.
À bibliotecária Elza Faquim pelas dicas, presteza em esclarecer minhas
dúvidas e simpatia.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
pelo suporte financeiro.
Á Universidade de São Paulo, em especial o Departamento de Patologia,
professores, funcionários e colegas pelos ensinamentos colaboraram de várias
formas para a realização desse trabalho.
Ao Prof. Dr. Alessandre Hataka, pela amizade e por estar sempre presente
quando precisei.
Aos meus amigos que apesar de não terem colaborado diretamente nesse
projeto, sempre me incentivaram a seguir por esse caminho, e sempre tinham uma
palavra de apoio na ponta da língua.
E especialmente aos gatos Idriel, Murilo, Zenda, Venza, Luciella, Hammerfel,
Valeron, Vicky e Rodolfo, pela colaboração de valor inestimável no estudo dessa
doença.
RESUMO
HAIBARA, D. Avaliação histopatológica e imunohistoquímica da encefalopatia em gatos infectados experimentalmente pelo vírus da imunodeficiência dos felinos [Histopathological and immunohistochemical evaluation of the encephalopathy in cats experimentally infected by feline immunodeficiency virus]. 2012. 65 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011.
Para avaliar a encefalopatia em gatos infectados experimentalmente pelo vírus da
imunodeficiência dos felinos, foram obtidas amostras de encéfalo após necropsia de
nove gatos previamente inoculados pelo subtipo B do vírus e monitorados por quatro
anos. As amostras foram fixadas em formalina 10% para coloração em
Hematoxilina-eosina, e em metacarn para avaliação análise imunohistoquímica.
Através da técnica de imunohistoquímica, as lâminas de encéfalo foram incubadas
com anticorpos específicos para os antígenos Proteína Glial Fibrilar Ácida (GFAP) e
Vimentina para marcação de astrócitos e com anticorpos para a proteína p24 do
capsídeo viral do FIV. Nas lâminas marcadas para GFAP foram observados
astrócitos em substância branca e cinzenta em quantidade moderada, sugerindo
astrocitose reativa. Houve marcação mais evidente da região subpial e em alguns
animais das regiões perivasculares. A marcação para vimentina mostrou raras
células distribuídas pelo neurópilo e forte marcação de astrócitos na região
subependimária nos ventrículos laterais e IV ventrículo, o que pode indicar um
aumento da proliferação e migração de células tronco. Também foram observadas
alterações como: nódulos gliais, vacuolização da substância branca, satelitose e
focos de calcificação de meninge. A satelitose indica a presença de processo
degenerativo em desenvolvimento. A marcação para a proteína p24 confirmou a
presença de células microgliais infectadas. Raros astrócitos com marcação
citoplasmática foram vistos em apenas um animal. Curiosamente, houve marcação
dos neurônios da camada granulosa do cerebelo. Esta técnica deve ser mais bem
explorada para o uso em diagnóstico post mortem. Esses resultados sugerem que
os animais infectados experimentalmente pelo FIV subtipo B apresentam alterações
microscópicas mesmo na ausência de sinais clínicos neurológicos.
Palavras chave: gatos. FIV. Encefalopatia. Resposta astrocitária. Imunohistoquímica.
ABSTRACT
HAIBARA, D. Histopathological and immunohistochemical evaluation of the encephalopathy in cats experimentally infected by feline immunodeficiency virus [Avaliação histopatológica e imunohistoquímica da encefalopatia em gatos infectados experimentalmente pelo vírus da imunodeficiência dos felinos]. 2012. 65 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011.
To evaluate the encephalopathy in cats experimentally infected with feline
immunodeficiency vírus, were obtained brain samples from autopsies of nine cats
previously inoculated with subtype B virus and monitored for four years. The samples
were fixed in 10% formalin for hematoxylin-eosin staining, and in metacarn for
immunohistochemical analysis. Throuh the immunohistochemistry technique, the
brain slides were incubated with antibodies against the glial fibrillary acidic protein
(GFAP) and vimentin to mark astrocytes and against the viral capsid protein p24 of
FIV. On the GFAP marked slides, astrocytes were observed in gray and white matter
in moderate amounts, suggesting reactive astrocytosis. There was evident reactivity
in the subpial area and in some animals, around blood vessels. The markup for
vimentin showed rare cells distributed throughout the neuropil, and strong labeling of
astrocytes in the subependymal region of the lateral ventricules and fourth ventricule,
which may indicate an increased rate of proliferation and migration of stem cells. The
histopathological changes observed were: glial nodules, white matter vacuolization,
sattelitosis and foci of meningial calcification. The sattelitosis indicates the presence
of degenerative process in developing. The use of antibodies against the protein p24
confirmend the presence of infected microglia in the brain of infected animals. Rare
astrocytes with cytoplasmic staining were seen in only one animal. Interestling, there
was labeling of neurons in the granular layer of the cerebellum. This technique
should be further exploited for use in post-mortem diagnosis. These results suggest
that animals experimentally infected with FIV subtype B show microscopic changes in
the absence of clinical neurologic signs.
Key words: cats. FIV. Encephalopathy. Astrocitic response. Immunohistochemistry.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Encéfalo de gato. Gliose reativa da substância cinzenta. Observar aumento de celularidade. Coloração: HE. Obj. 100x ......................................... 35
Figura 2 - Encéfalo de gato. Satelitose. Observar células satélite em contato com um neurônio. Coloração: HE. Obj: 400x ................................................................... 35
Figura 3 - Encéfalo de gato. Nódulos gliais. Coloração: HE. Obj: 400x .................... 36
Figura 4 - Encéfalo de gato. Nódulo glial. Coloração: HE. Obj: 100x ........................ 37 Figura 5 – Encéfalo de gato. Observar a grande quantidade de vacúolos na
substância branca. Coloração: HE. Obj: 40x ...................................................... 38 Figura 6 - Encéfalo de gato. Astrócitos marcados pelo anticorpo anti-GFAP.
Astrocitose em substância branca. Obj: 100x .................................................... 39 Figura 7 – Encéfalo de gato. Astrócitos marcados pelo anticorpo anti-GFAP.
Astrocitose em substância cinzenta. Obj: 100x .................................................. 40 Figura 8– Encéfalo de gato. Astrócitos marcados pelo anticorpo anti-GFAP na
substância cinzenta. Obj: 400x .......................................................................... 40 Figura 9 – Encéfalo de gato. Astrócitos marcados pelo anticorpo anti-GFAP na
substância branca. Obj: 400x ............................................................................. 41 Figura 10 – Encéfalo de gato. Astrócitos marcados pelo anticorpo anti-GFAP.
Aumento da marcação de região subpial. Obj. 100x .......................................... 42 Figura 11 - Encéfalo de gato. Astrócitos marcados pelo anticorpo anti-GFAP.
Marcação perivascular evidente. Obj. 40x ......................................................... 42 Figura 12 – Encéfalo de gato. Astrócitos reativos e células ependimárias marcadas
pelo anticorpo anti-vimentina. Obj: 100x ............................................................ 43 Figura 13 - Encéfalo de gato. Astrócitos reativos marcados pelo anticorpo anti-
vimentina em região subependimária. Obj: 400x ............................................... 44 Figura 14 – Encéfalo de gato. Capilares e astrócitos reativos marcados pelo
anticorpo anti-vimentina. Obj: 400x .................................................................... 45 Figura 15 - Cerebelo de gato. Intensa marcação dos neurônios da camada granulosa
do cerebelo pelo anticorpo anti-FIV p24. Obj: 400x ........................................... 46 Figura 16 – Encéfalo de gato. Células da glia marcadas pelo anticorpo anti-FIV p24.
........................................................................................................................... 46
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 13
2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 16 2.1 VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA DOS FELINOS E A SÍNDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA EM GATOS ....................................................... 16 2.2 ASTRÓCITOS ..................................................................................................... 20 2.3 ENCEFALOPATIA ASSOCIADA À INFECÇÃO PELO FIV ................................. 23 2.3.1 SINAIS CLÍNICOS RELACIONADOS À ENCEFALOPATIA ............................ 27 2.4 DIAGNÓSTICO ................................................................................................... 28
3 MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................... 29 3.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS ................................................................................ 30 3.2 NECROPSIA ....................................................................................................... 30 3.3 PROTOCOLO UTILIZADO PARA MARCAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA .......... 31
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 34 4.1 OBSERVAÇÕES MORFOLÓGICAS DOS CORTES DE ENCÉFALO E CEREBELO CORADOS POR HE À MICROSCOPIA DE LUZ .................................. 34 4.2 OBSERVAÇÕES MORFOLÓGICAS DOS CORTES DE ENCÉFALO E CEREBELO À MICROSCOPIA DE LUZ COM MARCAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA PARA GFAP .............................................................................................................. 39 4.3 OBSERVAÇÕES MORFOLÓGICAS DOS CORTES DE ENCÉFALO E CEREBELO À MICROSCOPIA DE LUZ COM MARCAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA PARA VIMENTINA .................................................................................................... 43 4.4 OBSERVAÇÕES MORFOLÓGICAS DOS CORTES DE ENCÉFALO E CEREBELO À MICROSCOPIA DE LUZ COM MARCAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA PARA P24 ................................................................................................................. 45
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 48
6 CONCLUSÃO ......................................................................................................... 56
7 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 58
INTRODUÇÃO
13
1 INTRODUÇÃO
Muitos estudos mostram que o vírus da imunodeficiência dos felinos (FIV)
induz importantes anormalidades neurológicas em gatos domésticos, porém o
mecanismo da doença neuronal ainda não foi totalmente esclarecido.
A infecção pelo FIV tem sido utilizada como modelo de estudo para o vírus
da imunodeficiência humana (HIV). A infecção pelo HIV está associada á
demência, e após o uso da terapia antiretroviral de alta efetividade, a uma forma
mais sutil de disfunção neurológica, conhecida como desordem cognitiva motora
menor (GONZÁLEZ-SCARANO; MARTÍN-GARCIA, 2005).
Assim como na infecção pelo HIV, a infecção pelo FIV leva à morte
neuronal. Não há evidências de infecção de neurônios pelo FIV. Acredita-se que a
morte neuronal seja uma conseqüência da disfunção das células da glia
(MEEKER et al., 1999).
A caracterização da infecção do sistema nervoso central e a reação dos
diversos tipos celulares que o compõe são de fundamental importância para a
compreensão da fisiopatologia da infecção dos felinos domésticos pelo FIV, como
também da infecção de outras espécies por outros lentivírus.
Os astrócitos estão entre as primeiras células a responder à injúria do SNC
também respondem à lesão das células nervosas. A apresentação de antígenos
por astrócitos e a produção de citocinas pode desempenhar um papel importante
nas interações imunológicas e resposta inflamatória do SNC e pode estar
envolvido na patogênese de várias doenças neurológicas (EDDLESTON;
MUCKE, 1993; KEANE; HICKEY, 1997).
O objetivo deste trabalho é estudar as alterações histopatológicas de
diferentes áreas do encéfalo de felinos e avaliar a resposta morfológica e o
comportamento astrocitário pela técnica de imunohistoquímica para GFAP e
casos em que ocorra a reexpressão de Vimentina frente à infecção do Sistema
Nervoso Central pelo vírus da imunodeficiência felina.
Também foi avaliada a imunorreatividade para a proteína p24, uma
proteína codificada pelo gene gag do FIV, para comprovar a infecção do encéfalo,
14
determinar os tipos celulares que expressam essa proteína e correlacionar os
resultados com a resposta astrocitária nesses animais.
15
REVISÃO DE LITERATURA
16
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA DOS FELINOS E A SÍNDROME DA
IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA EM GATOS
A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida em gatos é causada por um
lentivírus, o vírus da imunodeficiência dos felinos (FIV). Isolado pela primeira vez
por Pedersen et al. (1987) de gatos com síndrome de imunodeficiência crônica
comparável à imunodeficiência causada pelo HIV. Os animais infectados por esse
vírus apresentam maior risco de infecções oportunistas, tumores e doenças auto-
imunes (HARTMANN, 2011).
Esse vírus faz parte da família Retroviridae. O nome retro deriva da enzima
transcriptase reversa (DNA polimerase RNA dependente), que é encontrada em
todos os membros da família (MURPHY et al, 1999).
Os lentivírus são retrovírus complexos contendo genes acessórios além do
gag, pol e env. O gene gag codifica um precursor polipeptídico, que, quando
clivado pela protease codificada pelo gene pol são produzidas a proteína p24 e
pelo menos mais duas proteínas adicionais, p15 e p10 (EGBERINK et al., 1990).
O gene pol codifica a protease, integrase e a transcriptase reversa, assim como
outras enzimas importantes na virulência do FIV. Os genes gag e pol são
relativamente conservados entre os subtipos. O gene env codifica a glicoproteína
viral gp120 e a proteína transmembranosa gp41, as maiores determinantes da
diversidade viral (HOSIE et al., 2009).
Cinco subtipos (A a E) geneticamente distintos foram definidos com uma
considerável diversidade da sequência no gene env. A maioria dos vírus
identificados são dos subtipos A ou B (YAMAMOTO et al., 2007; HOSIE et al.,
2009). A existência de múltiplos variantes (ou quasispecies) também já foi
relatada (HUISMAN ET AL., 2008; TEIXEIRA et al., 2011)
Além disso, a transcriptase reversa viral, que media a transcrição do RNA
em DNA (provírus) é sujeita a erros e não possui a função de revisão
(proofreading), assim, o FIV muta rapidamente e exibe uma grande variabilidade
17
genética. As variantes podem fugir da detecção imune e dificultar o
desenvolvimento de técnicas diagnósticas moleculares e vacinas (HOSIE;
BEATTY, 2007; HOSIE et al., 2009).
Também há evidências que indicam que o vírus, quando submetido à
pressão seletiva no hospedeiro, evolui para escapar do sistema imune e para
alcançar maior capacidade de replicação. Consequentemente, os lentivírus estão
sob contínua evolução e a população viral em um hospedeiro é heterogênea e
dinâmica (TEIXEIRA et al., 2011).
Há poucos dados sobre a prevalência do FIV no Brasil. Estudos
preliminares indicam a predominância do subtipo B na população de gatos
domésticos no Brasil (TEIXEIRA et al., 2011). Foi sugerido que o subtipo B é
mais adaptado ao hospedeiro e menos imunogênico e, portanto menos virulento
(BACHMANN et al., 1997)
O FIV, além da sua importância como patógeno felino, é também
importante como modelo para infecção pelo vírus da imunodeficiência humana
(HIV). Ambos os vírus apresentam similaridades estruturais moleculares e
bioquímicos. Eles também apresentam muitas características clínicas
semelhantes, incluindo a infecção de curso crônico. O desenvolvimento da
imunodeficiência e anormalidades do sistema nervoso central e periférico
(FLETCHER et al., 2008).
Baseado em análises filogenéticas, chegou-se a conclusão que o FIV
representa um lentivírus mais primitivo que o HIV, que está circulando na
população de gatos há mais tempo que o HIV na população humana (FLETCHER
et al., 2011).
O vírus tem tropismo por linfócitos, macrófagos peritoneais e cerebrais e
astrócitos. (PEDERSEN et al., 1990; NOVOTNEY et al., 1990; PEDERSEN;
BARLOUGH, 1991; BENDINELLI et al., 1995). A glicoproteína gp120 do envelope
viral se liga ao receptor primário, o CD134. Ocorre uma mudança conformacional
em Env, que permite a interação com o co-receptor CXCR4, desencadeando a
fusão das membranas e entrada viral (HOSIE; BEATTY, 2007; HOSIE et al.,
2009).
Em comparação com o HIV, o FIV possui um tropismo celular linfocítico
expandido, infectando células CD8+, além de células CD4+ e células B.
Diferentemente do HIV, o FIV não usa a molécula CD4 e CCR5 como receptores,
18
ele se liga primeiramente ao CD134, um receptor da família do fator de necrose
tumoral, e a sua subseqüente interação com o receptor CXCR4 permite a entrada
na célula (FOX; PHILLIPS, 2002; REGGETI; ACKERLEY; BIENZLE, 2008).
Nishino et al. (1992) mostrou uma similaridade entre o vírus da
imunodeficiência humana (HIV), o vírus da imunodeficiência símia (SIV) e o FIV
em termos de habilidade de expressar o epítopo gag p24 nas células infectadas.
Porém, não há reação cruzada entre o p24 do FIV e o p24 do HIV e do SIV.
Em humanos infectados pelo HIV, foram observadas reações imunes como
citotoxicidade celular anticorpo-dependente e linfócito T citotóxico contra o
antígeno p24, o que sugere que esse antígeno é expresso na superfície de
células infectadas pelo HIV em portadores do HIV-1 (NISHINO et al., 1992)
O FIV está presente no sangue, líquor e na saliva. Sendo que a
concentração é muito alta na saliva e baixa no sangue (WILLS; WOLF, 1993). A
mordedura é a principal via de transmissão. A transmissão pode ocorrer durante
uma briga entre gatos através de uma única mordida (YAMAMOTO et al., 1989;
HOSIE; BEATTY, 2007). Machos têm uma probabilidade quase três vezes maior
de infecção que as fêmeas. Gatos de vida livre apresentam um risco maior de
infecção que aqueles domiciliados (ISHIDA et al., 1989). Transmissão vertical é
incomum. A infecção via uterina e pós-natal acontece principalmente quando a
exposição da fêmea ao FIV ocorre durante a gestação ou a lactação, antes do
aparecimento dos anticorpos (WASMOEN et al., 1992). Apesar de não ter sido
documentada, a infecção natural oronasal ou venérea, gatos podem ser
infectados experimentalmente por inoculação viral no nariz, boca, vagina e reto
(HOSIE et al. 2009).
A primeira fase (fase aguda) ocorre de 4 a 5 semanas após a infecção. É
caracterizado por febre, neutropenia e linfonodomegalia generalizada. Também
pode ocorrer diarréia. A mortalidade nessa fase é baixa, e alguns gatos não
apresentam sinais clínicos (YAMAMOTO et al., 1989; BARLOUGH et al., 1991).
Esta fase da doença é raramente identificada. Isso ocorre porque os sinais
clínicos são menos severos em gatos mais velhos, ou porque os gatos infectados
naturalmente geralmente são expostos a pequenas doses do vírus, ou por causa
da natureza não específica dos sinais clínicos (HOSIE; BEATTY, 2007).
Após a infecção, ocorre uma viremia acentuada e os gatos rapidamente
produzem anticorpos vírus-específicos e células T citotóxicas, porém, apesar da
19
forte resposta imunológica, ela não é capaz de debelar a infecção. O pico da
viremia ocorre em 2 a 4 semanas, após o qual diminui progressivamente junto
com o aparecimento doa anticorpos, depois o nível de anticorpos diminui ,
ocorrendo novamente a viremia (YAMAMOTO et al., 1988; HOSIE; BEATTY,
2007).
Tipicamente, as infecções por lentivírus são caracterizadas por um
prolongado período assintomático (HOSIE; BEATTY, 2007). Nesta fase (portador
assintomático) há altos níveis de anticorpos circulantes, diminuição da carga viral
e há progressiva disfunção das células T. Há depleção gradual de linfócitos CD4+,
resultando em uma diminuição da relação dos linfócitos CD4+:CD8+. Esta fase
ocorre 18 a 24 meses após a infecção e pode durar anos (BARLOUGH et al.,
1991, TORTEN et al., 1991).
Há progressiva deterioração da função imune, juntamente com o
esgotamento dos linfócitos CD4+. Acredita-se que os macrófagos sejam o
principal reservatório do HIV, e essas células provavelmente possuem papel
similar em gatos infectados pelo FIV (BRUNNER; PEDERSEN, 1989).
A infecção se torna latente quando a célula possui uma cópia do provírus
integrada, mas não produz partículas virais, a não ser que a células se torne ativa.
Essas células infectadas latentes são o reservatório da infecção, que não é
alcançada por anticorpos neutralizantes (HOSIE et al., 2009).
A fase terminal é caracterizada por uma descompensação imunológica e
aumento da carga viral (HOSIE; BEATTY, 2007). A maioria dos sinais clínicos não
são causados diretamente pelo FIV. O vírus é responsável pela imunodeficiência,
(tornando o gato mais susceptível a infecções secundárias) ou imune estimulação
(resultando em doenças auto-imunes). Doenças cutâneas parasitárias severas e
incomuns ou tumores devem alertar ao clínico quanto à possibilidade de infecção
pelo FIV. Complexo gengivite-estomatite crônico é um dos sinais mais comuns
dos gatos infectados. Lesão renal glomerular e tubulointersticial também são
muito freqüentes e são possivelmente causados pelo vírus, juntamente com
depósito de imunecomplexos. A ativação policlonal de células B sustenta
hiperglobulinemia, altos níveis de imunecomplexos circulantes e auto-anticorpos
(HOSIE et al., 2009).
20
2.2 ASTRÓCITOS
As células gliais são classificadas em duas grandes categorias: a microglia
e a macroglia. A macroglia envolve os oligodendrócitos e os astrócitos.
Classicamente, os astrócitos são divididos em protoplasmáticos, encontrados
predominantemente na substância cinzenta, e fibrosos, achados na substância
branca (PETERS; PALAY; WEBSTER, 1970).
E as células microgliais são pequenas células, quando comparadas com
astrócitos, presentes nas substâncias cinzenta e branca. Em indivíduos adultos
normais, essas células parecem estar inativas, porém são rapidamente ativadas
por qualquer lesão inflamatória ou degenerativa do sistema nervosos. Elas
migram para o local da injúria e se diferenciam em macrófagos (PETERS; PALAY;
WEBSTER, 1970).
Os astrócitos são as maiores e mais numerosas células gliais presentes no
Sistema Nervoso Central. São caracterizadas pelo núcleo grande e claro,
cromatina localizada na perifericamente e um nucléolo grande (MACHADO et al.,
2001). Além de seu papel na sustentação estrutural do Sistema Nervoso Central,
têm muitas outras funções. Eles mantêm uma íntima relação funcional com os
neurônios e são importantes no metabolismo neuronal. Estão envolvidas na
regulação de neurotransmissores, destoxificação da amônia e regulação do
potássio. Emitem prolongamentos que envolvem quase totalmente os vasos
sanguíneos, formando a barreira hematoencefálica. Controlam o fluxo de
macromoléculas entre o sangue, o liquor e o encéfalo. E são as principais células
responsáveis pela reparação e formação de tecido cicatricial no cérebro
(PETERS; PALAY; WEBSTER, 1970; KEANE; HICKEY, 1997; JONES; HUNT;
KING, 2000; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2004).
Uma das principais funções propostas para os astrócitos reativos é dar
início às respostas imunes no sistema nervoso central. Eles produzem
mediadores imunes e respondem a fatores imunológicos, proliferando e
sintetizando citocinas, moléculas de adesão, moléculas de MHC e fatores
neurotróficos. Portanto, ocorrem importantes interações entre astrócitos e
linfócitos, microglia e células endoteliais. A apresentação de antígenos por
21
astrócitos e a produção de citocinas pode desempenhar um papel importante nas
interações imunológicas e resposta inflamatória do SNC e pode estar envolvido
na patogênese de várias doenças neurológicas (EDDLESTON; MUCKE, 1993;
KEANE; HICKEY, 1997).
A população de astrócitos não é uniforme, suas propriedades podem variar
de acordo com sua localização. Por exemplo: a habilidade dos astrócitos corticais
de capturar o glutamato é alta, enquanto no cerebelo e no tronco cerebral é
relativamente baixa (KEANE; HICKEY, 1997).
Como os astrócitos são capazes de produzir fatores neurotróficos, sendo
também células apresentadoras de antígenos, o resultado é duplo: os fatores
neurotróficos liberados contribuem para a sobrevida dos neurônios atingidos, e os
antígenos exteriorizados na membrana astrocítica provocam a ação defensiva de
células do sistema imune (LENT, 2010).
Os astrócitos estão entre as primeiras células a responder à injúria do SNC
também respondem à lesão das células nervosas. Eles podem aumentar
numericamente (astrocitose) e podem também aumentar de tamanho devido ao
aumento na quantidade de citoplasma (astrogliose). Esses astrócitos tumefeitos
são chamados de gemistócitos. Trata-se de uma alteração proliferativa
comparável à formação do tecido fibroso de granulação (JONES; HUNT; KING,
2000).
Além disso, os astrócitos e a micróglia regulam o tráfego e ativação de
células mononucleares periféricas através da barreira hematoencefálica.
Astrócitos parecem aumentar a transmigração de células imunes, enquanto a
microglia reduz a transmigração. Porém, a micróglia infectada aumenta a
transmigração de monócitos através da monocamada de células endoteliais,
sugerindo um papel central da micróglia no tráfego do FIV através da barreira
hematoencefálica no início da infecção. Uma vez estabelecida a infecção do SNC,
o controle interno do fluxo através da barreira hematoencefálica é alterada de
forma ainda não completamente compreendida (FLETCHER et al., 2008).
Os astrócitos têm sido identificados pela expressão de uma proteína que
lhes é exclusiva, a proteína glial fibrilar ácida (conhecida pela sigla GFAP). A
GFAP e a Vimentina são componentes dos filamentos intermediários presentes
em astrócitos. Os filamentos intermediários formam uma rede estrutural que
conecta as membranas celulares, organelas e o núcleo. Logo após o nascimento
22
existe um progressivo desaparecimento de Vimentina e sua substituição por
GFAP. Frente a uma injúria ocorre um aumento na intensidade de marcação
imunohistoquímica do GFAP, associado à hiperplasia e hipertrofia dos astrócitos e
a recuperação da sua capacidade de expressar a Vimentina. A intensidade da
expressão da GFAP difere entre os astrócitos protoplasmáticos e fibrosos. Os
astrócitos protoplasmáticos, situados na substância cinzenta têm corpo celular
irregular, possuem prolongamentos muito ramificados, apresentam intensa
expressão de GFAP e são chamados astrócitos protoplasmáticos. E os astrócitos
fibrosos, localizados na substância branca são mais alongados e menos
ramificados, e expressam pouco GFAP (MACHADO; FIGUEIREDO, 1996;
BONDAN et al., 2003; LENT, 2010;)
Outra modificação que afeta astrócitos durante a maturação diz respeito à
sua morfologia: astrócitos imaturos exibem uma organização radia com pouca
quantidade de processos, enquanto astrócitos maduros exibem uma organização
estrelada com grande quantidade de processos ramificados (ALONSO, 2001).
O alto grau de insolubilidade da vimentina sugere sua função estrutural no
citoplasma. Algumas evidências bioquímicas e morfológicas indicam que os
filamentos de vimentina estão associados à membrana nuclear e plasmática,
mantendo a posição do núcleo e do fuso mitótico, durante a vida da célula.
Shoeman et al., (1991) sugeriu que os filamentos intermediários, GFAP, vimentina
e desmina possa servir de substrato para o HIV e estar relacionado com a
infecção viral.
Há evidências que os glioblastos desempenham importante papel na
neurogênese, incluindo migração e diferenciação dos precursores neuronais. Em
astrócitos maduros, essa função é perdida (ALONSO, 2001). A reexpressão de
vimentina em astrócitos circundando múltiplos tipos de injúria demonstra que essa
população pode ter papel na migração de neuroblastos para o local da lesão
(WANG et al., 2004).
23
2.3 ENCEFALOPATIA ASSOCIADA À INFECÇÃO PELO FIV
Embora o FIV seja basicamente conhecido por causar imunodeficiência, é
importante admitir que a infecção por esse vírus também pode afetar o SNC.
Dow, Poss e Hoover (1990) foram os primeiros a relatarem que gatos infectados
experimentalmente desenvolviam infecção cerebral quando inoculados tanto via
intracerebral quanto via periférica.
Um terço dos gatos infectados com o FIV pode desenvolver encefalopatia.
Tanto os gatos infectados experimentalmente quanto naturalmente tendem a
exibir sintomas estáticos ou discretamente progressivos durante meses, e alguns
gatos apresentam melhora do quadro neurológico (DEWEY, 2006).
A neurovirulência é cepa específica e foi correlacionada com a supressão
imune, indicando que fatores sistêmicos influenciam na neuropatogênese. A idade
do animal também pode influenciar a patogênese. Animais mais jovens são mais
susceptíveis à doença do SNC. E a coinfecção com o vírus da leucemia felina
(FelV) ou PIF exacerbam a encefalopatia (PATRICK; JOHNSTON; POWER,
2002).
O vírus foi isolado do córtex cerebral, núcleo caudato, mesencéfalo,
cerebelo, tronco cerebral rostral e caudal, mas não do plexo coróide. O exame
histopatológico após sete meses da inoculação revelou infiltrado perivascular
mononuclear, gliose difusa, nódulos gliais e palidez da substância branca (DOW;
POSS; HOOVER, 1990).
O FIV produz anormalidades neurológicas no início da infecção, sendo que
alguns desses parâmetros são reversíveis. Essa característica, e as mínimas
alterações histopatológicas encontradas no início da infecção indicam que se a
terapia for iniciada cedo, essa disfunção neurológica pode ser revertida ou
prevenida (PHILLIPS et al., 1994).
Foi proposto que a porta de entrada do vírus no encéfalo seria a barreira
hematoencefálica e o plexo coróide em linfócitos e monócitos/macrófagos
infectados (FOX; PHILLIPS, 2002; FLETCHER et al. 2008). O reabastecimento
da população de macrófagos perivasculares por monócitos circulantes que
migram para o encéfalo tem o efeito colateral de “abrir a porta” para patógenos
24
intracelulares. Subsequentemente a micróglia é infectada (GONZÁLEZ-
SCARANO; MARTIN-GARCIA, 2005).
Monócitos infectados possuem um fenótipo que torna essas células mais
inclinadas a migrar para tecidos do que monócitos ativados não infectados.
Quando o monócito entra no SNC adulto, ele sofre a influência do ambiente, que
o induz a um fenótipo microglial. (KEANE; HICKEY, 1997; GONZÁLEZ-
SCARANO; MARTIN-GARCIA, 2005).
Após a inoculação do vírus, o vírus é detectado no líquor logo após o
aumento da carga viral no plasma. A concentração no líquor é menor que no
plasma, essa falta de equilíbrio indica que o vírus não é transferido passivamente
(FLETCHER et al., 2011)
Estudos histopatológicos mostraram que durante a fase aguda da infecção,
há tráfego de linfócitos através da barreira hematoencefálica e através do plexo
coróide simultaneamente. Essas células são compostas inicialmente por células T
CD3+, e células B CD79+ e mais tarde por células T CD4+ e CD8+ (FLETCHER
et al., 2011).
Células endoteliais são relativamente resistentes à infecção. A infecção de
células endoteliais não parece ser uma rota importante para a entrada do FIV no
SNC (DOW; DREITZ; HOOVER, 1992). Porém, assim como pro HIV ainda há
controvérsias quanto à permissividade de células endoteliais à infecção
(FLETCHER et a., 2008).
Outra porta de entrada proposta é a migração de partículas virais livres
entre as células endoteliais (para-celular), ou dentro de vacúolos com posterior
liberação para o SNC (trans-celular). Porém essas rotas não são consideradas
importantes, pelo menos na fase aguda da infecção (FLETCHER et al. 2011).
O vírus alcança o SNC de gatos independentemente da via de inoculação.
As primeiras lesões consistem de infiltrados de células mononucleares
perivasculares e está geralmente localizado no gânglio basal e no tronco cerebral
(DOW; POSS; HOOVER, 1990). Gliose difusa, nódulos gliais e palidez da
substância branca são outras alterações encontradas em animais infectados
(PHILLIPS et al., 1994, YAMAMOTO et al, 2007).
Foi descrita também a presença de células bizarras com grandes núcleos
hipercromáticos, sendo algumas multinucleadas. Acredita-se que sejam derivadas
da fusão de macrófagos. Porém, essas células são raramente observadas em
25
gatos, em contraste, são frequentemente observadas em pacientes infectados
pelo HIV. E são o principal achado neuropatológico da demência associada à
AIDS. Possíveis explicações são: os gatos infectados são eutanasiados antes do
estágio terminal da doença ou diferenças interespécies na habilidade de
responder à inflamação crônica (ABRAMO et al., 1995; GUNN-MOORE et al.,
1996).
Hurtrel et al. (1992) demonstrou que as lesões do SNC são vistas em um
mês pós-infecção quando o vírus era inoculado via intracerebral, e em dois meses
pós-infecção quando o vírus era inoculado intravenosamente.
As células cerebrais infectadas pelo FIV incluem a micróglia e os astrócitos.
O vírus não infecta neurônios. Culturas celulares da micróglia e astrócitos foram
produtivamente infectados pelo FIV in vitro. Entretanto, culturas similares com
neurônios, oligodendrócitos e células do plexo coróide não mostraram evidências
da infecção (HURTREL et al., 1992).
Astrócitos parecem ser mais susceptíveis à infecção, seguido da micróglia.
A infecção de astrócitos resulta em formação de sincício e morte celular,
enquanto as células da micróglia permanecem infectadas persistentemente e
produtivamente, sem efeito citopático evidente. Desta forma, macrófagos
cerebrais infectados podem se tornar reservatórios da infecção pelo FIV no
cérebro. (GIULIAN; VACA; NOONAN, 1990; DOW; DREITZ; HOOVER, 1992;
BENDINELLI et al., 1995).
O mecanismo de lesão neuronal não está claro. Alguns estudos
demonstraram que a neurotoxicidade do FIV pode estar relacionada tanto a
fatores codificados pelo gene viral quanto a fatores codificados pelo genoma das
células do hospedeiro (BRAGG et al. 1999).
Power et al. (1997), observou um aumento da atividade glutamatérgica no
encéfalo de animais infectados pelo FIV, causado provavelmente pela diminuição
da expressão da enzima glutamato descarboxilase em neurônios GABAérgicos.
O glutamato descarboxilase é a enzima responsável pela conversão do glutamato
para GABA.
Uma das funções dos astrócitos é regular o nível de glutamato extracelular
e outras moléculas excitatórias. A presença de grande quantidade de glutamato
ou outras moléculas excitatórias na proximidade de neurônios causa influxo
incontrolável de Ca++ e apoptose. Assim, a infecção dos astrócitos pelo FIV pode
26
ocasionar morte neuronal por acúmulo de glutamato extracelular (GIULIAN;
VACA; NOONAN, 1990; GONZÁLEZ-SCARANO; MARTÍN-GARCIA, 2005).
Segundo Yu, Billaud e Phillips (1998), o FIV induz a neurotoxicidade pela
diminuição da habilidade de astrócitos de remover glutamato da fenda sináptica.
Bragg et al. (1999) demonstrou que os efeitos neurotóxicos do FIV podem
ser devido, pelo menos em parte, às interações tóxicas, não infecciosas entre as
proteínas do envelope viral e a membrana celular neuronal. O potencial
neurotóxico da glicoproteína vira gp120 foi comprovada pela observação que
culturas expostas ao gp120 mostram aumento da excitotoxicidade pelo glutamato
(BRAGG et al., 1999; POWER, 2001).
Outra hipótese é que o efeito neurotóxico seja mediado pela microglia. O
número de macrófagos/microglia aumenta rapidamente após exposição ao vírus.
A ativação inapropriada ou proliferação por proteínas teciduais específicas ou
virais podem levar à atividade citotóxica e neurodegeneração gradativa.
(MEEKER et al., 1999; POWER, 2001). As culturas de micróglia infectadas pelo
HIV produzem citocinas e proteínas virais que podem lesar os neurônios
adjacentes. É provável que a microglia infectada pelo FIV produza neurotoxinas
semelhantes, como: TNFα, Interleucinas, Fator ativador de plaquetas (PAF), óxido
nítrico (NO), quinolinato e NTox (GIULIAN; VACA; NOONAN, 1990, GIULIAN et
al., 1996; BRAGG et al. 1999).
A proliferação da microglia parece ser dependente da interação do vírus
com astrócitos. Astrócitos podem produzir uma proteína mitogênica microglial que
estimula a proliferação da microglia. Portanto, é possível que o FIV possa
estimular uma via regulatória normal da proliferação da micróglia regulada por
astrócitos. Esse fenômeno parece ocorrer através de interações virais não
infecciosas, uma vez que o FIV inativado pelo calor também pode estimular a
proliferação glial (GIULIAN; VACA; NOONAN, 1990; MEEKER et al, 1999).
Devido à inacessibilidade de encéfalo para estudo invasivo em humanos, o
estudo do FIV tem grande utilidade para o estudo da encefalopatia associada à
síndrome da imunodeficiência adquirida, sua caracterização desde os estágios
iniciais e sua progressão até a fase terminal (FOX; PHILLIPS, 2002).
27
2.3.1 SINAIS CLÍNICOS RELACIONADOS À ENCEFALOPATIA
O FIV deve ser incluído no diagnóstico diferencial de qualquer gato com
alterações inexplicáveis da função neurológica (PHILLIPS, 1996). Os sinais de
doença neurológica causada pelo FIV geralmente são sutis e inespecíficos (DOW;
DREITZ; HOOVER, 1992a)
Os sinais clínicos tendem a ser primeiramente comportamentais. Os
animais infectados podem demonstrar alterações de comportamento, como se
tornarem mais agressivos ou medrosos ou exibirem padrões comportamentais
compulsivos. A localização da lesão causada pelo FIV é consistente com as
anormalidades observadas, uma vez que o gânglio basal e estruturas adjacentes
são responsáveis pelo humor e personalidade do animal (HOOVER, E.A., 1992a;
DOW, S. W.; DREITZ, M. J.; GUNN-MOORE et al., 1996).
Outros sintomas, como head tilt, andar em círculos e paralisias, tendem a
ser observadas em fases mais avançadas da infecção, e geralmente estão
associadas com infecções secundárias (PEDERSEN et al., 1989; DOW et al.,
1990; GUNN-MOORE et al., 1996).A paresia posterior pode ser observada, como
ataxia ou incapacidade de lidar com pequenos saltos com sucesso (Phillips 1996).
Os gatos infectados também podem apresentar tremores musculares, anisocoria,
padrões de sono alterados e sinais de demência (DOW; DREITZ; HOOVER,
1992a; PHILLIPS et al.; 1994).
O FIV pode produz alterações neurológicas na fase aguda da infecção.
Algumas dessas alterações são reversíveis. A demonstração de que algumas das
funções neurológicas retornam ao normal indicam que uma terapia efetiva,
iniciada cedo no curso da infecção pode prevenir a disfunção neurológica
(PHILLIPS et al.; 1994).
28
2.4 DIAGNÓSTICO
Os métodos de diagnóstico do FIV incluem: isolamento viral, testes
imunológicos para anticorpos ou antígenos específicos e testes moleculares
(BENDINELLI et al., 1995).
Os anticorpos FIV- específicos no sangue aparecem em 2 a 4 semanas
após a infecção (YAMAMOTO et al. 1988). Podem ser detectados através da
imunofluorescência indireta, ELISA, radioimunoprecipitação, Western blot e
neutralização viral (PEDERSEN et al., 1987; O’CONNOR et al., 1989 e
YAMAMOTO et al., 1989). Resultados falso negativos não são comuns, mas pode
ocorrer quando os animais são testados no início ou nos estágios terminais da
infecção, quando não há níveis detectáveis de anticorpos (HOSIE; JARRET,
1990).
O diagnóstico também pode ser realizado através do isolamento viral no
sangue, líquor e saliva (BRUNNER; PEDERSEN, 1989; HOSIE; JARRET, 1990) e
do PCR (PHILPOTT; EBNER; HOOVER, 1992). O isolamento no sangue é mais
produtivo durante os estágios inicial e final da infecção.
A análise do líquor geralmente fornece evidências mais conclusivas da
infecção do SNC pelo FIV (DOW; DREITZ; HOOVER, 1992a). A presença de
anticorpos em uma amostra de líquor, que não tenha sido contaminada com
sangue é uma evidência sugestiva da infecção do cérebro pelo FIV. A síntese de
anticorpos pode ser detectadas em 6 a 8 semanas após a inoculação, e
geralmente é acompanhada do aumento de leucócitos no líquor. O vírus também
pode ser isolado no líquor destes animais (DOW et al., 1990).
29
MATERIAIS E MÉTODOS
30
3 MATERIAIS E MÉTODOS
O presente estudo foi realizado com amostras de encéfalo e cerebelo
previamente fixados em metacarn e emblocados em parafina. Os materiais e
métodos utilizados serão descritos a seguir:
3.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS
As amostras foram obtidas de 9 gatos (Felis catus), sem raça definida, com
idades variando entre 4-5 anos, previamente infectados experimentalmente,
mantidos e monitorados por 4 anos no Gatil do Centro de Estudos de Doenças de
Cães e Gatos do Departamento de Clínica Médica (VCM) da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da Universidade de São Paulo (USP).
A infecção foi confirmada e classificada como sendo da estirpe B pelo
método de imunoadsorção e nested-PCR (ZANUTTO et al. 2011).
3.2 NECROPSIA
Após a eutanásia, os animais foram enviados para o Departamento de
Patologia (VPT) da FMVZ-USP, para exame necroscópico. O material colhido
através da necropsia,foram imediatamente fixados em Formalina 10% para
análise histopatológica e em Metacarn (70% metanol, 20% clorofórmio e 10%
ácido acético glacial) para análise imunohistoquímica.
As amostras foram desidratadas, diafanizadas e incluídas em parafina.
Foram obtidos cortes de 5 µm, montados em lâminas histológicas e corados pela
técnica de Hematoxilina-Eosina (HE), ou em lâminas histológicas silanizadas
(Starfrost® - Objektträger, Medite Medizintechnik) para a realização da técnica
imunohistoquímica.
31
3.3 PROTOCOLO UTILIZADO PARA MARCAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA
Os cortes histológicos em lâminas silanizadas foram desparafinizados e
hidratados em sequência xilol-álcool, seguido de lavagem em água corrente por
cinco minutos.
O bloqueio da Peroxidase endógena foi realizada com solução de Peróxido
de Hidrogênio a 5% por 30 minutos a 37ºC, seguido de mais uma lavagem em
água corrente por cinco minutos. Para o bloqueio de reações inespecíficas as
lâminas foram incubadas por 30 minutos a 37ºC em leite desnatado.
Após lavagem em solução PBS, os cortes foram incubados em câmara
úmida por aproximadamente 16 horas a 4ºC, com o anticorpo policlonal anti-
GFAP (Rabbit anti-cow GFA, code number ZO334, Dako Cytomation), anticorpo
monoclonal anti-vimentina (mouse anti-swine VIM, code number MO725, Dako
Cytomation) e o anticorpo monoclonal anti-P24 (mouse anti-FIV P24, PAK3-2C1,
Santa Cruz Biotechnology) padronizados nas diluições 1:1000, 1:200 e 1:10
respectivamente.
Após nova etapa de lavagem em solução PBS, foi realizada a incubação
dos cortes por 30 minutos a 37ºC com anticorpo secundário anti-coelho e anti-
camundongo diluído em tampão Tris-HCl (Advance™ HRP Link, Dako), e após
nova lavagem em PBS, aplicação por 30 minutos a 37ºC com anticorpos
polimerizados com peroxidase em tampão Tris-HCl (Advance™ HRP Link, Dako),
seguido de nova lavagem em PBS.
A revelação é procedida com diaminobenzidina (Liquid DAB + Substrate,
Chromogen System, code number K3468,Dako) por aproximadamente 3 minutos.
Finalmente, para interromper a reação, os cortes foram lavados em água corrente
por 5 minutos.
Finalmente, os cortes foram contracorados em hematoxilina por um minuto,
desidratados e diafanizados por sequencia de solução crescente de álcool-xilol e
montados com lamínula e resina sintética (Entellan®, Merck).
As reações foram acompanhadas por lâminas controle, que foram
submetidas a todas as etapas do protocolo, exceto pela aplicação do anticorpo-
32
primário. Sendo que, nesse caso, os cortes foram incubados com solução de
PBS.
33
RESULTADOS
34
4 RESULTADOS
Os achados morfológicos no encéfalo e cerebelo de gatos infectados
experimentalmente pelo FIV, submetidos à coloração de HE e à marcação
imunohistoquímica para GFAP, Vimentina e P24 serão descritos a seguir.
4.1 OBSERVAÇÕES MORFOLÓGICAS DOS CORTES DE ENCÉFALO E
CEREBELO CORADOS POR HE À MICROSCOPIA DE LUZ
Enquanto macroscopicamente, os encéfalos dos gatos infectados pelo FIV
não apresentaram alterações dignas de nota, microscopicamente estes
mostraram alterações de caráter inflamatório. Foi observado aumento de
celularidade (Figura 1) caracterizado pela grande quantidade de núcleos gliais
entre os neurônios, sendo que muitas dessas células estavam encostadas entre si
formando aglomerados, ou encostadas em neurônios (aspecto conhecido como
satelitose) (Figura 2) . A gliose difusa estava acometendo tanto substância branca
quanto substância cinzenta.
35
Figura 1 - Encéfalo de gato. Gliose reativa da substância cinzenta. Observar aumento de celularidade. Coloração: HE. Obj. 100x
Figura 2 - Encéfalo de gato. Satelitose. Observar células satélite em contato com um neurônio. Coloração: HE. Obj: 400x
36
Não foram observados manguitos perivasculares em nenhum dos cortes
avaliados. Sete animais apresentaram nódulos gliais (Figura 3 e Figura 4),
localizados principalmente na região cortical.
Figura 3 - Encéfalo de gato. Nódulos gliais. Coloração: HE. Obj: 400x
37
Figura 4 - Encéfalo de gato. Nódulo glial. Coloração: HE. Obj: 100x
Em meninge, discretos focos de calcificação distrófica foram observadas
em cinco animais, sendo que em quatro, essa alteração se encontrava na área de
cerebelo. Não foram observados células inflamatórias em meninge.
Quatro animais apresentaram vacuolização de substância branca, de
distribuição focal. A vacuolização foi moderada em apenas um dos quatro animais
(Figura 5), o restante foi classificada como vacuolização discreta.
38
Figura 5 – Encéfalo de gato. Observar a grande quantidade de vacúolos na substância branca. Coloração: HE. Obj: 40x
Dois animais apresentavam injúria neuronal isquêmica moderada.
As alterações microscópicas e o número de animais afetados encontram-
se resumidas na Tabela 1.
Tabela 1 - Alterações neuropatológica encontradas nos gatos infectados experimentalmente pelo FIV à avaliação histopatológica – São Paulo – 2011
TIPO DE LESÃO NÚMERO DE ANIMAIS AFETADOS
Gliose da substância cinzenta 9/9 Gliose da substância branca 9/9 Satelitose 9/9 Nódulos gliais 7/9 Calcificação da meninge 5/9 Vacuolização da substância branca 4/9 Manguito perivascular 0/9 Meningite 0/9
39
4.2 OBSERVAÇÕES MORFOLÓGICAS DOS CORTES DE ENCÉFALO E
CEREBELO À MICROSCOPIA DE LUZ COM MARCAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA
PARA GFAP
A imunorreatividade para GFAP marcou exclusivamente astrócitos e
evidenciou astrocitose acometendo substância branca (Figura 6) e cinzenta
(Figura 7) de forma difusa. As células imunorreativas foram identificadas pela
coloração marrom do seu citoplasma e seus prolongamentos e ramificações
(Figura 8 e Figura 9). Houve marcação levemente mais intensa de astrócitos na
substância branca em 4 animais, e na substância cinzenta de um animal, nos
demais, não houve tal distinção.
Figura 6 - Encéfalo de gato. Astrócitos marcados pelo anticorpo anti-GFAP. Astrocitose em substância branca. Obj: 100x
40
Figura 7 – Encéfalo de gato. Astrócitos marcados pelo anticorpo anti-GFAP. Astrocitose em substância cinzenta. Obj: 100x
Figura 8– Encéfalo de gato. Astrócitos marcados pelo anticorpo anti-GFAP na substância cinzenta. Obj: 400x
41
Figura 9 – Encéfalo de gato. Astrócitos marcados pelo anticorpo anti-GFAP na substância branca. Obj: 400x
Foi observada uma marcação mais intensa de astrócitos no córtex
imediatamente subjacente à pia-máter do que de astrócitos no córtex profundo
(Figura 10). E em dois animais houve marcação marcadamente mais nítida ao
redor de vasos sanguíneos (Figura 11). Nota-se também uma leve aumento da
intensidade da marcação na junção entre substância cinzenta e branca.
42
Figura 10 – Encéfalo de gato. Astrócitos marcados pelo anticorpo anti-GFAP. Aumento da marcação de região subpial. Obj. 100x
Figura 11 - Encéfalo de gato. Astrócitos marcados pelo anticorpo anti-GFAP. Marcação perivascular evidente. Obj. 40x
43
4.3 OBSERVAÇÕES MORFOLÓGICAS DOS CORTES DE ENCÉFALO E
CEREBELO À MICROSCOPIA DE LUZ COM MARCAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA
PARA VIMENTINA
Em cerebelo foi observada expressão normal de vimentina nos
prolongamentos dos astrócitos de Bergmann na camada molecular do cerebelo,
nas células endoteliais, meningeais e ependimárias.
Porém, em todos os animais, houve marcação de quantidades variadas de
células nas áreas próximas à superfície do ventrículo lateral e do IV ventrículo,
observado durante a avaliação de cerebelo. As células fortemente marcadas se
encontravam concentradas adjacente às células ependimárias, e se estendiam
em direção do córtex (Figura 12).
Figura 12 – Encéfalo de gato. Astrócitos reativos e células ependimárias marcadas pelo anticorpo anti-vimentina. Obj: 100x
44
Figura 13 - Encéfalo de gato. Astrócitos reativos marcados pelo anticorpo anti-vimentina em região subependimária. Obj: 400x
Também houve marcação de células isoladas no neurópilo,,algumas vezes
na região subpial e mais raramente dispersas (Figura 14) e em 4 animais na
região de giro dentado porém essas células eram raras.
45
Figura 14 – Encéfalo de gato. Capilares e astrócitos reativos marcados pelo anticorpo anti-vimentina. Obj: 400x
4.4 OBSERVAÇÕES MORFOLÓGICAS DOS CORTES DE ENCÉFALO E
CEREBELO À MICROSCOPIA DE LUZ COM MARCAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA
PARA P24
Em cerebelo houve intensa marcação dos núcleos de neurônios da
camada granulosa (Figura 15).
No encéfalo houve marcação difusa dos núcleos de células da micróglia
(Figura 16), não houve evidência de marcação de neurônios, células endoteliais,
ependimárias e células do plexo coróide. A marcação citoplasmática astrócitos foi
observada em apenas um animal (Figura 17)
46
Figura 15 - Cerebelo de gato. Intensa marcação dos neurônios da camada granulosa do cerebelo pelo anticorpo anti-FIV p24. Obj: 400x
Figura 16 – Encéfalo de gato. Células da glia marcadas pelo anticorpo anti-FIV p24.
47
DISCUSSÃO
48
5 DISCUSSÃO
Serão discutidos a seguir aspectos referentes às alterações
histopatológicas e à resposta astrocitária de gatos infectados experimentalmente
pelo FIV através da análise de amostras de encéfalo marcados pelos anticorpos
anti-GFAP e anti-vimentina pelo método de imunohistoquímica, comparando-os
com achados de trabalhos publicados na literatura.
No presente estudo, a inoculação do FIV foi realizado aproximadamente 4
anos antes da necropsia. Ao exame clínico, não apresentaram sintomas que
indicassem lesão nervosa apresentavam sinais clínicos indicativos da síndrome
da imunodeficiência dos felinos, ou seja, estavam entrando na fase terminal.
Resumidamente, os principais sinais clínicos manifestados pelos animais foram:
rinite crônica, complexo gengivite-estomatite, linfadenopatia e doença renal.
Macroscopicamente os encéfalos dos animais estavam dentro dos padrões
anatômicos normais.
As alterações microscópicas observadas mostram algumas similaridades
com estudos prévios.
Gliose difusa é uma alteração freqüente nos animais infectados e parece
ocorrer cedo na infecção, sem grandes mudanças durante o seu curso crônico
(HURTREL et al., 1992). Ela acomete tanto a substância cinzenta quanto a
branca, e algumas vezes, o cerebelo. A gliose é definida tradicionalmente como
uma resposta à injúria e é caracterizada pela hipertrofia e proliferação de
astrócitos. Além dos astrócitos, as células da linhagem mononuclear fagocitária
também têm papel importante na gliose (KEANE; HICKEY, 1997).
Uma vez que astrócitos são células que respondem prontamente à um
insulto ao tecido nervoso (EDDLESTON; MUCKE, 1993; KEANE; HICKEY, 1997).
e ao mesmo tempo são células alvo do FIV (HURTREL et al., 1992), o estudo do
comportamento astrócitário durante o curso da infecção torna-se importante.
No exame de rotina em HE os processos dos astrócitos são de difícil
visualização, por isso torna-se necessário a utilização da técnica de
imunohistoquímica para a avaliação da resposta astrocitária (MILLS, 2007).
49
A reação astrocitária é refletida também por outras alterações estruturais,
como espessamento dos feixes de filamentos gliais e consequentemente aumento
da intensidade de marcação para a GFAP (EDDLESTON; MUCKE, 1993). Esse
fenômeno é conhecido como astrocitose fibrilar reacional, e pode ser de dois
tipos: isomórfica, na qual os processos astrocitários apresentam-se orientados
pelos elementos teciduais preservados e o arranjo dos feixes de filamentos gliais
é uniforme e paralelo; ou anisomórficas, na qual sua disposição é irregular ao
redor de lesão geralmente causadora de dano grosseiro (BONDAN et al, 2003).
Abramo et al. (1995) e Poli et al. (1997) confirmaram a gliose em animais
experimentalmente infectados pelo FIV por estudo morfométrico dos astrócitos
marcados com GFAP. Poli et al. (1997) observou uma maior imunorreatividade de
astrócitos dos animais infectados ao redor de vasos sanguíneos, na região
subpial e na substância cinzenta, quando comparado a animais hígidos.
A astrocitose reativa também é observada em todos os casos de
encefalopatia associado ao HIV e é caracterizada pelo aumento da reatividade
para GFAP e apoptose (COSENZA-NASHAT et al., 2006).
A marcação para o anticorpo anti-GFAP, mostrou o mesmo padrão
observado por Poli et al. (1997), exceto pela marcação mais forte da substância
cinzenta em comparação com a substância cinzenta, sendo que esta
característica foi observada em apenas um animal. Todos os animais
apresentaram uma marcação nitidamente mais forte na região subpial do que no
córtex profundo e em dois animais houve marcação mais intensa ao redor de
vasos sanguíneos. Essa distribuição difusa dos astrócitos sugere a ocorrência de
astrocitose fibrilar do tipo isomórfica, uma vez q não foram observados danos
grosseiros no tecido nervoso.
A gliose dos gatos foi classificada como moderada, porém em 4 animais
ela se apresentava comparativamente mais severa. Essa diferença pode ser
explicada por fatores individuais do hospedeiro.
Muitos autores observaram que em resposta a uma injúria do SNC, há a
reexpressão da vimentina de astrócitos circundando lesões teciduais (TAKAMIYA
et al., 1988; BONDAN et al, 2003; MACHADO et al., 2007, ORSINI et al., 2007). A
expressão da vimentina foi associada com proliferação astrocitária,
remodelamento da cicatriz glial e pode ser um indicativo de que estas células
50
estejam “relembrando” o processo migratório. Essa população de astrócitos pode
ter papel na migração de células para o local (WANG et al. 2004).
Nos gatos infectados experimentalmente pelo FIV, a marcação para
vimentina não coincidiu com a marcação para GFAP dos astrócitos. A avaliação
das lâminas marcadas pelo anticorpo anti-vimentina mostrou marcação de
astrócitos reativos principalmente em regiões subventrículares, observada em
ventrículos laterais e no IV ventrículo. Nessas regiões as células fortemente
marcadas se concentravam próximas às células ependimárias e se estendiam em
direção ao córtex. Também foram encontradas algumas células marcadas em
região subpial e poucas células na região de giro dentado. A vimentina é a
principal proteína do citoesqueleto de astrócitos fetais e raramente é expressa em
astrócitos adultos (SCHIFFER et al, 1986).
Em um animal observou-se uma concentração de astrócitos marcados para
vimentina em uma pequena área em que a superfície encefálica se encontrava
retraída. Nesse caso acredita-se tratar de uma cicatriz glial devido a uma
microlesão.
Alguns estudos mostraram que em roedores e na maioria dos mamíferos,
ocorre neurogênese pós-natal em específicas zonas germinativas. A zona
subventricular dos ventrículos laterais e o giro dentado hipocampal são as
principais zonas germinativas e a estimulação da proliferação de células
precursoras ocorre pela interação com astrócitos (ALONSO, 2001).
Alonso (2011) sugere que astrócitos imaturos presentes nas zonas
germinativas podem fornecer um microambiente favorável à proliferação das
células precursoras.
A forte marcação para vimentina de astrócitos na zona subventricular pode
ser um indicativo da estimulação de proliferação de células tronco em resposta á
lesão neuronal causada pelo FIV. Porém, essas alterações só poderão ser
confirmadas após estudo com animais hígidos não infectados pelo FIV
Não foi observada marcação evidente de astrócitos no giro dentado,
porém, estudos prévios indicam que há uma diminuição da neurogênese desta
região relacionada com a idade e com a secreção de glicocorticóides. A
expressão de vimentina de astrócitos fibrosos também parece se alterada por
glicocorticóides ( ALONSO, 2001).
51
Segundo Alonso (2001), a idade e a secreção de glicocorticóides não
afetam a expressão de vimentina em astrócitos localizados em regiões
específicas do encéfalo que tem acesso direto ao líquor, ou em astrócitos reativos
localizados em bordas de lesões onde a barreira hematoencefálica tenha sido
rompida. Os astrócitos da zona subventricular estão localizados na borda da luz
ventricular, portanto não há supressão da expressão de vimentina.
Além da gliose, foram observadas alterações inespecíficas, porém
frequentemente associadas à infecção pelo FIV, como nódulos gliais,
vacuolização da substância branca e satelitose (DOW; POSS; HOOVER, 1990;
HURTREL et al., 1992; PHILLIPS et al., 1994; POLI et al., 1997; YAMAMOTO et
al., 2007).
Foram observados nódulos gliais em 7 animais principalmente nas
camadas mais externas do córtex. Estudos prévios relatam a presença de
manguitos perivasculares com linfócitos. No presente estudo não foram
observados tais alterações. Phillips et al. (1994) observou nódulos gliais no giro
para-hipocampal e infiltrados perivasculares nas regiões corticais e subcorticais.
Gunn-moore (1996) relata a presença de infiltrado linfocítico perivascular,
gliose e vacuolização de substância branca, além da presença de gemistócitos e
células bizarras multinucleadas. Nesse caso, o gato apresentava doença
neurológica progressiva grave. Células gigantes multinucleadas são
frequentemente observadas em pacientes infectados por HIV, mas essas células
são raras em gatos infectados pelo FIV. Possivelmente porque em muitos casos,
os animais são eutanasiados antes da evolução para doença neurológica grave.
No presente estudo não foram observadas células multinucleadas, exceto
em um animal, em que elas eram raras. Sendo observada apena uma única
célula em toda a lâmina.
Não foi observada palidez da substância branca, lesão frequentemente
descrita em gatos infectados pelo FIV (ABRAMO et al., 1995; BENDINELLI et al.,
1995 POLI et al., 1997, POWER et al., 1997) . Quatro animais apresentaram
vacuolização da substância branca, porém as lesões eram focais e discretas na
maioria dos animais.
Alterações meningeais são freqüentes em animais naturalmente infectados
(BENDINELLI et al. 1995). Hurtrel et al. (1992) descreve calcificação meningeal
perivascular e meningite leve a moderada em animais naturalmente infectados.
52
Não foram observados edema ou células inflamatórias nas meninges, porém
cinco animais mostravam discretos focos de calcificação distrófica na meninge,
sendo que em quatro, estes se localizavam na região de cerebelo.
Os neurônios dos gatos eram frequentemente visto rodeados e em contato
com células satélites. Esse neurônios eram morfologicamente normais. Meeker et
al. (1997), observou que a satelitose não era freqüente em gatos do grupo
controle e em gatos infectados pelo FIV em fase terminal e com doença
neurológica avançada. Porém, era freqüente em animais infectados pelo FIV na
fase assintomática, sugerindo que a satelitose reflete um estágio de
desenvolvimento da doença nervosa. Essas observações indicam a presença de
processos neurodegenerativos. A satelitose também foi descrita em outro trabalho
(POLI et al., 1997)
No presente estudo, nenhum dos animais apresentava sintomas
neurológicos. E as lesões histopatológicas foram consideradas leves a
moderadas.
Os fatores responsáveis para a progressão da doença neurológica e
desenvolvimento de sinais clínicos é pouco conhecida. Entretanto, provavelmente
resulta de uma combinação de elementos, incluindo a cepa viral, alterações
imunológicas e a carga viral (DOW; DREITZ; ROOVER, 1992).
Na demência associada ao HIV há perda de neurônios corticais e
subcorticais, e a neurodegeneração é considerada fator principal no
desenvolvimento da demência. O estudo de indivíduos assintomáticos infectados
pelo HIV mostrou que a neurodegeneração está presente antes da fase terminal,
porém a doença neurológica se manifesta somente no estágio terminal (MEEKER,
et al. 1997).
Na encefalopatia causada pelo FIV também há um processo
neurodegenerativo em animais assintomáticos acompanhado de alterações
compensatórias, como sinaptogênese e aumento da produção de
neurotransmissores. Foi demonstrado um aumento da marcação de sinaptofisina
nos cortes histológicos desses animais (MEKKER, et al. 997),
De modo geral, o FIV causa uma encefalopatia de progressão lenta que
inicia cedo no curso da infecção. Sabe-se que o subtipo B, o único subtipo isolado
no Brasil, e utilizado nesse estudo, parece ser melhor adaptado ao hospedeiro
(BACHMANN et al., 1997) do que outros subtipos mais virulentos. As alterações
53
observadas indicam que esse subtipo também é menos neurovirulento, levando a
uma neuropatia branda não suficiente para causar sintomas clínicos neurológicos.
Além disso, alguns autores relatam diferenças na severidade das lesões
neurológicas entre animais infectados naturalmente e animais infectados
experimentalmente (HURTREL et al., 1992; POLI, et a., 1997). Os animais
infectados naturalmente apresentam lesões mais severas provavelmente, pelo
maior tempo de infecção e por possíveis infecções secundárias (BENDINELLI et
al., 1995).
Também foi realizada a marcação imunohistoquímica da proteína viral p24
nas amostras de encéfalo dos gatos infectados experimentalmente pelo FIV. A
quantificação do p24 no soro de pacientes infectados pelo HIV tem se mostrado
útil como marcador prognóstico da evolução da doença. A avaliação
imunohistoquímica com anticorpos anti-p24 é útil na localização de células
infectadas (LOMBARDI et al., 1994).
A marcação do p24 comprovou a infecção do encéfalo pelo FIV. Houve
principalmente a marcação de células gliais, comprovando que estas são os alvos
principais do vírus no SNC. Porém observaram-se duas características não
esperadas na marcação desta proteína. Houve marcação intensa dos neurônios
da camada granulosa do cerebelo. E o padrão da marcação foi nuclear, enquanto
que estudos prévios mostraram que a marcação imunohistoquímica para o
anticorpo anti-p24 específico do HIV, a marcação é citoplasmática (ENAM et al.,
2004; STRAPPE et al., 1997).
As células marcadas pelo p24 parecem ter características de células da
micróglia. Foram observadas células marcadas em nódulos gliais. Foi observada
marcação citoplasmática de astrócitos em apenas um animal. Esse resultado
indicam um possível tropismo do vírus por células microgliais, ou expressão
limitada das proteínas virais por astrócitos. Assim, como na infecção pelo HIV, em
que análises fenotípicas mostraram que os vírus do encéfalo são mais similares
aos vírus encontrados nos macrófagos. Esses fenótipos virais específicos podem
ser resultado in vivo da replicação em macrófagos cerebrais ou pela seleção de
variantes que são em pequena quantidade na periferia, mas são amplificados pela
ausência de uma pressão imunológica forte (GONZÁLEZ-SCARANO; MARTÍN-
GARCIA, 2005).
54
Em pacientes com HIV a marcação de proteínas codificadas pelo gag
ocorre em células gigantes multinucleadas e na micróglia. Não há marcação de
astrócitos (WILEY et al, 1986; BELL et al., 1998).
Consenza-Nashat et al. (2006) demonstrou que o HIV-1 afeta astrócitos
infectados e não infectados de maneiras opostas. O vírus possui um potente
efeito anti-proliferativo em astrócitos infectados p24+, por outro lado ocorre
proliferação de astrócitos não infectados p24-. Os mecanismos envolvidos no
processo proliferação podem estar relacionados à liberação de fatores solúveis
pelo vírus ou por células infectadas.
Além disso, sabe-se que os astrócitos infectados pelo FIV formam sincícios
e morrem. Nas lâminas analisadas não foram observados sincícios, ou qualquer
outro efeito citopático.
A marcação dos neurônios da camada granulosa também deve ser
investigada, não há relatos que confirmem a infecção dessas células pelo FIV.
Esse resultado levanta a hipótese de uma possível infecção latente dessas
células.
55
CONCLUSÃO
56
6 CONCLUSÃO
A infecção pelo FIV, subtipo B, leva à uma encefalopatia de progressão
lenta quando comparada com casos relatados na literatura.
Esses resultados confirmam a existência de alterações morfológicas
associadas á infecção pelo FIV, mesmo na ausência de sintomas neurológicos.
Alterações microscópicas, como gliose difusa, com imunorreatividade para
GFAP da zona subpial, nódulos gliais, vacuolização de substância branca e
satelitose podem ser listadas como as mais frequentemente encontradas na
infecção pelo FIV.
Não há ativação astrocitária caracterizada pela reexpressão de vimentina
acompanhando a expressão de GFAP. Porém a sua expressão em áreas
subependimárias deve ser estudada.
O uso da marcação imunohistoquímica de células nervosas infectadas por
anticorpos anti-FIV p24 deve ser melhor explorada e estudada. A marcação de
células da glia confirmou a presença do vírus no encéfalo. Uma vantagem na
disponibilidade deste teste é a possibilidade de diagnóstico post mortem da
infecção e de estudos retrospectivos.
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REFERÊNCIAS
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