AvaliaocomparativaColilert Portugal Pt

7/24/2019 AvaliaocomparativaColilert Portugal Pt

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HEPTADECYLSULPHATE (ISO 9308-1:2000) PARA A


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Procedimento de EnsaioPgina 1 de 12

MTODO COLILERTTM- 18 E QUANTI-TRAYTM PARA PESQUISA E

QUANTIFICAO DE COLIFORMES EESCHERICHIA COLI

NDICE:

1. OBJECTIVO E MBITO...............................................................................................................................................2

2. REFERNCIAS...............................................................................................................................................................2

3. DEFINIES...................................................................................................................................................................2

4. ADVERTNCIAS E PRECAUES DE SEGURANA...........................................................................................2

5. PRINCPIO......................................................................................................................................................................25.1.AVALIAO E CONFIRMAO ......................................................................................................................................3

6. MATERIAL E EQUIPAMENTO .................................................. ........................................................... .....................3

7. MEIOS DE CULTURA E REAGENTES......................................................................................................................3

8. MODO DE PROCEDER.................................................................................................................................................3

8.1. PREPARAO DA AMOSTRA.........................................................................................................................................38.1.1 Amostra de lavados de areia ......................................................... ........................................................... ...........3

8.1.2 Amostra de gua..................................................................................................................................................3

8.2. EXECUO DO ENSAIO ................................................................................................................................................48.3.INCUBAO E DIFERENCIAO ....................................................................................................................................4

9. EXPRESSO DE RESULTADOS.................................................................................................................................4

10. INTERPRETAO DOS RESULTADOS ..................................................... ........................................................... .4

11. RELATRIO DE ENSAIO .......................................................... ........................................................... .....................4

12. VALIDAO DO MTODO.......................................................................................................................................4

12.1.CARACTERSTICAS DE DESEMPENHO DO MTODO ......................................................................................................512.1.1.Tipo de amostra.................................................................................................................................................5

12.1.1.1.Amplitude de aplicao ..................... ..................... ..................... ...................... ..................... ..................... ................. 512.1.1.2.Limite de deteco........................................................................................................................................................512.1.1.3.Limites de quantificao...............................................................................................................................................5

12.1.2.Exactido (erros sistemticos) .................................................... ........................................................... ...........5

13.1.3.Incerteza........................................................ ........................................................... .........................................5

12.1.4.Preciso.............................................................................................................................................................512.1.5.Tempo necessrio anlise...............................................................................................................................5

ANEXO I - INFORMAES ADICIONAIS SOBRE COLIFORMES.........................................................................6

ANEXO II - MEIOS DE CULTURA ........................................................... ........................................................... ...........7

ANEXO III - TABELAS ........................................................... ............................................................ ..............................8

TABELA I - NMERO MAIS PROVVEL (NMP)DEESCHERICHIA COLI E OUTRAS BACTRIAS COLIFORMES EM QUANTITRAYMTDE 51POOS.........................................................................................................................................................8TABELA I I NMERO MAIS PROVVEL (NMP)DEESCHERICHIA COLI E OUTRAS BACTRIAS COLIFORMES EM QUANTITRAYMT/2000 NMP ....................................................... ........................................................... .........................................9

ANEXO IV - FLUXOGRAMA.........................................................................................................................................11

APNDICE D: Procedimento de Ensaio


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1. Objectivo e mbitoO mtodo descrito aplicvel pesquisa e quantificao de bactrias coliformes e Escherichia coliem amostras de gua para consumo humano, de piscinas, de lavagem de areias e a outros tipos degua. Pode ser usado para amostras de guas doces superficiais mas no para guas minerais naturaisengarrafadas ou para guas balneares designadas sob a regulamentao das guas balneares.

2. Referncias

NormasHPA (2004) Enumeration of coliforms andEscherichia coliby Idexx (Colilert TM18) Quanti-TrayTM.National Standard Methods W18 issue 2.3.

US EPA 9223 B - Greenberg, A.E.; Clesceri, L.S.; Eaton, A.D.1992. Standard Methods for theExamination of Water and Wastewater. American Public Health Association. Washington.ISO 17994

3. DefiniesBactrias coliformes bactrias que possuem a enzima -galactosidase que metaboliza o substratoONPG, com produo de cidos e viragem do indicador para amarelo.

Escherichia coli- bactrias que possuem a enzima -glucoronidase, que na presena do nutrienteMUG muda de incolor para amarela fluorescente, quando observada numa cmara de UV.

4. Advertncias e precaues de seguranaTomar as precaues habituais num laboratrio de microbiologia para microrganismos do nvel 2.A luz UV pode causar irritao de olhos e pele. Usar cmara de UV ou culos de proteco e luvas.

5. Princpio

O mtodo ColilertTM-18 detecta simultaneamente Escherichia colie outras bactrias coliformes na

gua. um mtodo baseado na adio de um substrato amostra, com leitura dos resultados em 18 h.Para uma semi-quantificao a amostra com o substrato colocada num Quanti-TrayTMe selada deforma a isolar as vrias clulas.

A mistura da amostra com o substrato incubada a 37 C durante 18 a 22 h.

Os resultados positivos so visveis visualmente, uma vez que, o substrato utilizado constitudo porindicadores especficos para estas bactrias.

As bactrias coliformes, possuem a enzima -galactosidase que metaboliza o substrato ONPG,acidificando o meio, o que permite a mudana de cor do indicador para amarelo.

No caso daE. coli, o mecanismo semelhante; a enzima -glucoronidase, actuando sobre o substrato(MUG), o que permite que a soluo mude de incolor para amarela fluorescente, quando observadanuma cmara de UV.


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5.1.Avaliao e confirmaoContam-se o nmero de poos amarelos e o nmero de poos amarelos e fluorescentes. A contagemem NMP de bactrias coliformes e E. coli obtida a partir da tabela ou software apropriado(fornecido pelo fabricante) (Anexo III)

Este mtodo no necessita de confirmaes.

O mtodo utilizado um mtodo alternativo que permite a deteco e clculo do NMP de E. colieoutras bactrias coliformes.

6. Material e Equipamento

Material corrente de laboratrio de Microbiologia, e em particular:

7.1. Estufa de incubao,7.2. Lmpada de Ultravioleta, comprimento de onda 365nm,7.3. Aparelho Selador de Quanti-trayTM(Quanti-tray 2x).

7. Meios de cultura e reagentes

Neste procedimento s utilizado um substrato cromognico, o ColilertTM-18, que est disponvelcomercialmente (a composio est descrita no AnexoII). As embalagens so constitudas por dosesunitrias, o que elimina a necessidade de preparao.

8. Modo de proceder8.1. Preparao da amostraInicia-se a anlise, de preferncia, imediatamente a seguir colheita da amostra. Se as amostras somantidas temperatura ambiente (no escuro, sem exceder 25 C), a anlise deve ser iniciada dentrode 6 h aps a colheita. Em circunstncias excepcionais, as amostras podem ser mantidas a (5 3) Cat 24 h antes da anlise.

8.1.1 Amostra de lavados de areiaPesar 50g da amostra de areia com auxlio de uma esptula esterilizada, numa balana monoprato(d=0,01 g).Em condies de assepsia, introduzir a amostra de areia num frasco de vidro esterilizado contendo500ml de gua destilada e esterilizada.Agitar o frasco durante 30 minutos num agitador rotativo, para garantir uma lavagem eficiente, daareia.A partir deste lavado, retirar, em condies de assepsia, uma alquota de 10 ml do sobrenadante,colocar num recipiente estril prprio e completar com gua destilada estril at perfazer 100 ml.Adicionar o contedo de uma ampola do meio de Colilert. Agitar at dissolver.

8.1.2 Amostra de gua

Colocar 100 ml de amostra (ou um volume menor completado com gua destilada estril at perfazer100 ml) num frasco estril e adicionar o contedo de uma ampola do meio. Agitar at dissolver.


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8.2. Execuo do ensaioColocar a mistura obtida dentro de Quanti.TrayTMou Quanti-TrayTM/2000 e fechar no Selador deQuanti-tray.

8.3.Incubao e diferenciaoIncubar a (37+1) C durante 18 h.

NOTA: Olhar para a fluorescncia com luz UV de 6 watt, 365 nm, num ambiente escuro.

9. Expresso de resultados

Atravs da contagem do nmero de poos amarelos/fluorescentes, determina-se o nmero maisprovvel (NMP), que consta na tabela do Anexo III

10. Interpretao dos resultados

Aparncia ResultadoIncolor Negativa para coliformes totais eEscherichia coliAmarelo Positiva para bactrias coliformesAmarelo + Fluorescncia Positiva para eEscherichia coli

NOTA: Os resultados do ColilertTM-18 so definitivos aps 18 horas. Se a aparncia for duvidosa

reincubar mais 3-4 horas at 22 horas. Os resultados no so vlidos aps 22 horas.

11. Relatrio de ensaio

O relatrio de ensaio deve conter pelo menos a seguinte informao:a) Referncia ao mtodo,b) Todos os pormenores necessrios completa identificao da amostra;c) Expresso de resultados de acordo com a alnea 10;d) Qualquer ocorrncia observada durante o decurso do ensaio e qualquer procedimento no

especificado no mtodo que pode ter influenciado os resultados.

12. Validao do MtodoEspecfico de cada laboratrio cada laboratrio deve seguir os seus prprios processos devalidao.


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Foi demonstrada a equivalncia entre este mtodo e o mtodo de referncia num estudo europeu queserviu de base Norma ISO 17994, que estabelece critrios para a avaliao da equivalncia entremtodos microbiolgicos. Posteriormente, foi demonstrada ao Instituto Regulador de guas eResduos (IRAR), a equivalncia entre este mtodo e TTC Lactose Agar With Sodium

Heptadecylsulphate (ISO 9308-1:2000) de acordo com a Norma ISO 17994.

12.1.Caractersticas de desempenho do mtodo

12.1.1.Tipo de amostraAplicvel a todos os tipos de amostras de gua incluindo guas para consumo humano, superficiais,balneares* (com excepo de gua salgada), e lavados de areia. principalmente aconselhvel paraguas com grande quantidade de matrias em suspenso.

12.1.1.1.Amplitude de aplicao

12.1.1.2.Limite de deteco

Um microrganismo por 100 mL.

12.1.1.3.Limites de quantificao

Limite inferior - NMP 1 microrganismo por 100 mL de amostra de gua analisada

Limite superior NMP 200,5 microrganismos por 100 mL de amostra de gua analisada numQuanti- TrayTMde 51 poos.

Limite superior- NMP 2419,6 microrganismos por 100 mL de amostra analisada num Quanti-TrayTM

/2000 NMP.

O limite superior pode ainda ser aumentado se forem analisadas diluies da amostra.

12.1.2.Exactido (erros sistemticos)No aplicvel directamente. Veja-se resultados da Avaliao Externa da Qualidade.

13.1.3.IncertezaEspecifico de cada laboratrio

12.1.4.PrecisoEspecifico de cada laboratrio

12.1.5.Tempo necessrio anlise

Preparao da suspenso e colocao no Quanti TrayTM 5 m. Incubao a 37C: entre 18 e 22 horas, mais um curto espao de tempo para a contagem de

poos positivos. Clculo do nmero mais provvel por leitura em tabela muito rpido Total: Mnimo 18:30 horas

*Para gua salgada existe uma adaptao deste mtodo. Contactar o representante local.


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Anexo I - Informaes adicionais sobre coliformes

Os coliformes so bacilos Gram -negativos, no formadores de esporos, oxidase - negativos, capazesde crescimento em aerobiose e em anaerobiose (facultativo), na presena de sais biliares (ou outrosagentes tensioactivos, com propriedades semelhantes de inibio do crescimento similares) e que sonormalmente capazes de fermentar a lactose com produo de cido e aldedo em 48 h, quandoincubados a uma temperatura de (362)C. Possuem tambm a enzima -galactosidase.

AE. coli um coliforme capaz de produzir indol a partir do triptofano em (213) h a (44,00,5)C.Possui a enzima -glucoronidase, d resultado positivo no teste vermelho de metilo, capaz dedescarboxilar o cido L-glutmico, mas no capaz de produzir acetil-metil-carbinol, utilizar ocitrato como nica fonte de carbono ou crescer em caldo KCN (cianeto de potssio).


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ANEXO II - Meios de cultura

Reagente

ColilertTM 18

Composio dos meios de cultura

Contactar o fabricante ou o representante local

Armazenamento

Guardar a 2-25 C ao abrigo da luz solar directa.


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Anexo III - Tabelas

Tabela I - Nmero mais provvel (NMP) deEscherichia coli e outras bactriascoliformes em Quanti TrayTMde 51 poos


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Tabela

IINmeromaisprovve

l(NMP)deEscherichiacol

ieoutrasbactriascoliform

esemQuantiTray

TM/2000NMP


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Procedimento de EnsaioPgina 11 de 12

MTODO COLILERTTM- 18 E QUANTI-TRAYTM PARA PESQUISA E

QUANTIFICAO DE COLIFORMES EESCHERICHIA COLI

Anexo IV - Fluxograma

Pesquisa e quantificao deEscherichia coli e outras bactrias coliformes (NMP),Mtodo ColilertTM-18

MEDIR100 ml DA AMOSTRA

PARA FRASCO GRADUADO COM ANTIESPUMA

JUNTAR O MEIODE UMA AMPOLA TOMA DA AMOSTRA

DEIXAR REPOUSARPELO MENOS10 min

AGITARSUAVEMENTE AT DISSOLUO

DEITAR NO QUANTY TRAY ADEQUADOE IDENTIFICADO

(Continua na pgina seguinte)

(Continuao)

100 mL

100mL


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SELAR

INCUBAR COM OS POOS PARA CIMANO SOBREPOR MAIS DE 6

18A 22HORAS A 37C

CONTAR O N.DEPOOS AMARELOS E ANOTAR LER NA TABELA NMP

CONTAR O N.DE POOS FLUORESCENTES E ANOTAR LER NA TABELA NMP

Bactrias coliformes

Escherichia coli


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APNDICE E: Laboratrios e pessoal que realizaram as anlises e o estudo

Intituto Nacional de Sade Dr. Ricardo Jorgecom a participao de:

Dra. Leonor Falco, Coordenadora da Unidade de Riscos Ambientais eOcupacionais Emergentes Laboratrio de Microbiologia.Fernanda OliveiraRaquel Esaguy RodriguesCeclia Maria da Costa SilvaManuela Barroso

Instituto Tcnico Superior com a participao de:

Dra. Manuela Cadete, Directora do Laboratrio de anlisesRicardo SantosSilvia Santos

Ftima Ferreira

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