BACTERIOSENSOR

BACTERIOSENSOR – TECNOLOGIA DE SENSORIAMENTO BACTER IOLÓGICO A

FIBRA ÓPTICA

Aldo Pacheco Ferreira

TESE SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DA COORDENAÇÃO DOS

PROGRAMAS DE PÓS-GRADUAÇÃO DE ENGENHARIA DA UNIVERSIDADE

FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS

PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS EM ENGENHARIA

BIOMÉDICA.

Aprovada por:

___________________________________________ Prof. Marcelo Martins Werneck, Ph.D.

___________________________________________ Profa. Celuta Sales Alviano, D.Sc.

___________________________________________ Profa. Margareth Crisóstomo Portela, Ph.D.

___________________________________________ Prof. Luiz Carlos Guedes Valente, D.Sc.

___________________________________________ Prof. Ricardo Marques Ribeiro, D.Sc.

___________________________________________ Prof. Renan Moritz Varnier R. Almeida, Ph.D.

RIO DE JANEIRO, RJ – BRASIL

DEZEMBRO DE 2000

“Dê início a tudo o que você puder fazer, ou a tudo o que você

julgar que pode fazer. A audácia traz em si o talento, o poder e

a magia” - GOETHE

Agradecimentos

Ao Professor Marcelo Martins Werneck que aceitou mais este desafio na

orientação desta tese.

Ao Professor Ricardo Marques Ribeiro pelas discussões e acompanhamento nos

experimentos.

A todo corpo técnico e alunos do Laboratório de Instrumentação e Fotônica, pela

colaboração nos experimentos, pelas discussões técnicas, pela atenção e convívio.

Aos Professores do Programa de Engenharia Biomédica da COPPE/UFRJ,

pela formação e ensinamentos.

Ao corpo técnico de funcionários do Programa de Engenharia Biomédica.

Ao Dr. Paulo Buss, Diretor da Escola Nacional de Saúde Pública, pelo interesse e

estímulo para o desenvolvimento desta tese.

Aos colegas do Departamento de Saneamento e Saúde Ambiental, da Escola de

Saúde Pública - Ensp/Fiocruz.

Aos colegas da Secretaria de Saúde do Governo do Estado do Rio de Janeiro.

Agradecimentos Especiais

A meu pai.

A Manoel Jacintho Coelho.

A Regina, Fabio e Amanda.

Resumo da Tese apresentada à COPPE/UFRJ como parte dos requisitos necessários

para a obtenção do grau de Doutor em Ciências (D.Sc.)

BACTERIOSENSOR – TECNOLOGIA DE SENSORIAMENTO BACTER IOLÓGICO A

FIBRA ÓPTICA


Dezembro/2000

Orientador: Marcelo Martins Werneck

Programa: Engenharia Biomédica

Um sensor a fibra óptica – Bacteriosensor - em campo evanescente para

detectar bactérias é proposto e estudado experimentalmente. A técnica é baseada na

atenuação do campo evanescente do sinal óptico guiado pelo contato físico direto dos

microrganismos em crescimento.

O sistema sensor para detecção bacteriana foi projetado, construído e

caracterizado quanto a sensibilidade, reprodutibilidade e linearidade da resposta. Para

isso, implementaram-se provas em microrganismos aerobiológicos coletados no

ambiente hospitalar, em microrganismos isolados da água de dois hospitais públicos e,

finalmente, a caracterização do sensor frente a bactéria padronizada cedida pelo

Centers for Disease Control and Prevention [CDC].

Com os resultados experimentais fica sustentável a viabilidade de implementar

um protótipo para detectar, principalmente, baixas concentrações de microrganismos

em curto espaço de tempo, bem como, aprofundar estudo da metodologia

desenvolvida.

Abstract of Thesis presented to COPPE/UFRJ as a partial fulfillment of the

requirements for the degree of Doctor of Science (D.Sc.)

BACTERIOSENSOR – TECHNOLOGY OF BACTERIOLOGICAL SENS ING BY

OPTICAL FIBER


December/2000

Advisor: Marcelo Martins Werneck

Department: Biomedical Engineering

A fiber-optic sensor – Bacteriosensor - in evanescent field for detect bacteria is

proposed and experimentally studied. The technique is based upon the attenuation of

the evanescent field of the optical signal guided by the direct physical contact with the

microorganisms in growth.

The sensor system for bacterial detection was projected, built and characterized

in sensibility, reproducibility, and linearity of sensor response. For that, experiments

were implemented in aerobiological microorganisms collected at the hospital

environment, in microorganisms isolated from water of two public hospitals and, finally,

in the characterization of the sensor with a standard sample of bacteria supplied by the

Centers for Disease Control and Prevention [CDC].

With the experimental results obtained it is maintainable the viability of the

implementation a prototype for detecting, mainly, low concentrations of microorganisms

in short space of time, as well as, to deepen the study of this developed methodology.

ÍNDICE

Folha de rosto................................................................................................................. i

Ficha catalográfica......................................................................................................... ii

Resumo......................................................................................................................... iii

Abstract......................................................................................................................... iv

Dedicatória..................................................................................................................... v

Agradecimentos............................................................................................................ vi

Índice........................................................................................................................... viii

CAPÍTULO I. INTRODUÇÃO....................................................................................... 1

CAPÍTULO II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................. 6

II-1. INTRODUÇÃO............................................................................................... 6

II-2. DETECÇÃO BACTERIANA POR TÉCNICAS BIOLÓGICAS......................... 7

II–2–1. DETECÇÃO BACTERIANA POR MICROSCOPIA................................. 8

II-2-2. DETECÇÃO BACTERIANA POR CULTURA........................................... 9

II-2-3. DETECÇÃO BACTERIANA POR TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS............ 10

II-2-2. DETECÇÃO BACTERIANA POR TÉCNICAS MOLECULARES............. 10

II-3. DETECÇÃO BACTERIANA POR TÉCNICAS ÓPTICAS............................... 12

II-3-1. CONCEITO DE SENSOR BIOLÓGICO................................................... 16

II-3-2. SENSOR BIOLÓGICO POR ONDA EVANESCENTE............................. 17

II-3-3. TIPOS DE SENSORES BIOLÓGICOS ÓPTICOS EM

CAMPO EVANESCENTE DE USO CORRENTE................................... 20

CAPÍTULO III. METODOLOGIA.................................................................................. 25

III-1. PRINCÍPIOS.................................................................................................. 25

III-2. MONTAGEM DO CIRCUITO ÓPTICO (set-up)............................................ 28

III-3. EXPOSIÇÃO DO CAMPO EVANESCENTE NA FIBRA ÓPTICA................. 29

III-4. EXPERIMENTOS, MATERIAIS E MÉTODOS.............................................. 29

III-4-1. MONITORAÇÃO E DIAGNÓSTICO DE PATÓGENOS

AEROBIOLÓGICOS............................................................................. 30

III-4-2. ENSAIOS METODOLÓGICOS PARA CARACTERIZAÇÃO

DO BACTERIOSENSOR.................................................................... 34

III-4-3. DETECÇÃO DE Legionella pneumophila EM HOSPITAIS................. 40

III-4-3-1. Coleta de Amostras para Provas Físico-Químicas........................ 43

III-4-3-2. Coleta de Amostras para Provas Microbiológicas......................... 45

III-4-3-3. Análises de Legionella pneumophila............................................. 48

CAPÍTULO IV – RESULTADOS.................................................................................. 51

IV-1. RESULTADOS OBTIDOS DA MONITORAÇÃO E DIAGNÓSTICO DE

PATÓGENOS AEROBIOLÓGICOS............................................................. 51

IV-2. RESULTADOS OBTIDOS DOS ENSAIOS METODOLÓGICOS PARA

A CARACTERIZAÇÃO DO BACTERIOSENSOR........................................ 56

IV-3. RESULTADOS OBTIDOS NA DETECÇÃO DE Legionella pneumophila.... 73

IV-3-1. ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS........................................................... 73

IV-3-2. ANÁLISES COLIMÉTRICAS............................................................... 74

IV-3-3. ISOLAMENTO DE Legionella pneumophila........................................ 76

IV-4. ESPALHAMENTO DE LUZ: ASPECTOS DA TEORIA MIE......................... 80

CAPÍTULO V – DISCUSSÃO...................................................................................... 90

V-1. DISCUSSÃO DA DETECÇÃO DE PATÓGENOS NO AMBIENTE

HOSPITALAR.............................................................................................. 91

V-2. DISCUSSÃO DA CARACTERIZAÇÃO DO BACTERIOSENSOR................ 93

V-3. DISCUSSÃO DA DETECÇÃO DE Legionella pneumophila......................... 97

V-4. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS NA ASSINATURA ÓPTICA 102

CAPÍTULO VI – CONCLUSÕES E SUGESTÕES.................................................... 104

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................... 107

ANEXOS

ANEXO 1. Artigo publicado - Biotechnology Techniques................................. 134

ANEXO 2. Artigo submetido – Biosensors & Bioelectronics............................. 135

ANEXO 3. Patente: Depósito no BRASIL......................................................... 136

ANEXO 4. Patente: Depósito nos EUA............................................................. 137

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1a. Representação de onda evanescente 19

Figura 1b. Representação de onda evanescente 19

Figura 2. Representação esquemática de plasmons superficiais (SPR) 22

Figura 3. Representação de biosensor por espelho ressonante 23

Figura 4. Representação de biosensor por guias de ondas planares 24

Figura 5. Representação esquemática de Imunosensor 24

Figura 6. Curva de crescimento (generalizada) de uma cultura bacteriana 26

Figura 7. Esquema de Montagem Óptica Experimental do Bacteriosensor 29

Figura 8. Esquema ilustrativo de material utilizado para filtração por membrana 46

Figura 9. Isolamento bacteriano por membrana filtrante à vácuo 47

Figura 10. Sinal óptico de detecção Iout(t) para MRSA 53

Figura 11. Sinal óptico de detecção Iout(t) para Streptococcus pneumoniae 53

Figura 12. Controle negativo: Iout(t) do meio de cultivo Baird-Parker agar base 54

Figura 13. Controle negativo: Iout(t) do meio de cultivo Trypticase soy blood

agar base 55

Figura 14. Resposta óptica Iout(t) para N0 = 10 de E. coli O157:H7 57













Figura 27. ∆tLAG (minutos) versus diferentes N0 de E. coli O157:H7 64

Figura 28. Iout(t) para N0 = 200 de E.coli O157:H7discutindo as três fases 65

Figura 29. Curva de Calibração do Bacteriosensor 66

Figura 30a. Microfotografia óptica de E. coli O157:H7. Aumento de 20x 67

Figura 30b. Microfotografia óptica de E. coli O157:H7. Aumento de 40x 68

Figura 30c. Microfotografia óptica de E. coli O157:H7. Aumento de 80x 68

Figura 30d. Microfotografia óptica de E. coli O157:H7. Aumento de 80x 69

Figura 30e. Microfotografia óptica de E. coli O157:H7. Aumento de 200x 69

Figura 30f. Microfotografia óptica de E. coli O157:H7. Aumento de 800x 70

Figura 31a. Microfotografia eletrônica de E. coli O157:H7. Aumento de 20x 70

Figura 31b. Microfotografia eletrônica de E. coli O157:H7. Aumento de 400x 71

Figura 31c. Microfotografia eletrônica de E. coli O157:H7. Aumento de 800x 71

Figura 31d. Microfotografia eletrônica de E. coli O157:H7. Aumento de 2000x 72

Figura 32. Controle negativo: Iout(t) do meio de cultivo BCYE agar base 77

Figura 33. Resposta óptica Iout(t) para N0 = 100 de de L. pneumophila 78



Figura 36. Diagrama esquemático de Espalhamento e Absorção 81

Figura 37. Espalhamento Angular - Escherichia coli O157:H7 86

Figura 38. Espalhamento Angular - Legionella pneumophila 89

Figura 39. Gráfico representativo dos polinômios de Legendre anexo 14

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Espécies de Legionella spp. 42

Tabela 2. Contagem de CFU para MRSA e Streptococcus pneumoniae 52

Tabela 3. Resultados das análises físico-químicas da água do Hospital A 73

Tabela 4. Resultados das análises físico-químicas da água do Hospital B 74

Tabela 5. Resultados das análises colimétricas do Hospital A 75

Tabela 6. Resultados das análises coliméticas do Hospital B 75

Tabela 7. Resultados de L. pneumophila sorogrupo 1 nos Hospitais A e B 76

CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO

É fundamental que a saúde esteja sempre, direta ou indiretamente, envolvida

em diversas pesquisas para o entendimento das causas de doenças e para o

desenvolvimento de procedimentos que visem a proteção da população em relação a

estas, propiciando a organização de programas de saúde para trazer tecnologia de

ponta para a solução de problemas centrais de uma nação ou comunidade. Em geral,

no vasto campo da saúde, as contribuições que, por sua originalidade, têm modificado

as ações, condutas e atitudes a ela, são o produto de avanços tecnológicos. Do ponto

de vista fisiológico, a saúde traduz o funcionamento harmônico das diversas partes

que integram qualquer organismo vivo. O meio interno ou fisiológico regula a

complexidade dos fenômenos físico-químicos gerados como resposta aos estímulos

do meio externo, ou seja, é o resultado de um ajuste dinâmico adequado do organismo

com os agentes que tendem a alterá-lo. Não é uma inter-relação passiva entre as

substâncias que integram o organismo e os fatores que pretendem romper a

harmonia, mas uma resposta ativa das forças corporais que funcionam estabelecendo

o ajuste. Analisando tais conceitos, a saúde pode ser interpretada como produto de

inter-relação harmônica entre o organismo e o ambiente que a rodeia, fator este de

caráter dinâmico [1].

O controle de doenças transmissíveis baseia-se em intervenções que, atuando

sobre um ou mais elos conhecidos da cadeia epidemiológica de transmissão, sejam

capazes de vir a interrompê-la. Entretanto a interação do Homem com o meio

ambiente é muito complexa, envolvendo fatores em constante modificação. Assim

sendo, os métodos de intervenção tendem a ser aprimorados ou substituídos, na

medida em que novos conhecimentos são aportados, seja por descobertas científicas,

seja pela observação sistemática do comportamento dos procedimentos de prevenção

e de controle estabelecidos. A evolução desses conhecimentos contribui para a

modificação de conceitos e de formas organizacionais dos serviços de saúde, na

contínua busca de seu aprimoramento.

Ao tratar-se de enfermidades de incidência transitória ou permanente, sua

repercussão pode ser evidenciada por políticas assistenciais. Porém quando tais

enfermidades são de natureza infecto-contagiosa, conseqüentemente os danos na

população tem, em ocasiões expressivas, maior transcendência. Para direcionar as

ações para a prevenção de enfermidades, o prolongamento da vida e o fomento da

saúde e da eficiência, têm-se como meta o controle de infecções transmissíveis, aliado

a um nível de ambiente adequado para a conservação da saúde. Entretanto várias

periculosidades ambientais estão longe de solução imediata. As questões de controle

de ambiente e saúde se tornaram conceitualmente intercambiáveis, e o controle

microbiológico tornou-se estratégico, de forma a permitir a integração sustentável nos

modos específicos de prevenção da área privada ou pública. Não é mais possível falar

sobre o ambiente sem se referir à saúde, e vice-versa.

O desenvolvimento de uma sociedade depende da melhoria das condições

sócio-econômicas, combinando crescimento econômico com a melhoria da qualidade

de vida da população, e a invenção de novas tecnologias para racionalizar produção,

processos e serviços. Desta forma, pesquisa e desenvolvimento são setores chaves

de sociedades modernas. Problemas sérios de saúde ambiental são compartilhados

tanto por países desenvolvidos quanto por países em desenvolvimento, afetando

milhões de pessoas que sofrem de doenças, as quais tiveram como causa principal a

exposição a agentes biológicos.

De acordo com recentes dados da Organização Mundial de Saúde [2], há um

quadro de deterioração das condições de saúde da população mundial, e descreve-se

enfaticamente a repetição de doenças comunicáveis e emergentes, as quais

disseminam um quadro mórbido que afeta o mundo inteiro. A situação se complica

drasticamente quando surgem microrganismos resistentes, em especial, nas

incidências de infecção hospitalar, as quais expressam uma resistência causada por

drogas antimicrobianas e outros agentes, tornando-se mais um problema de Saúde

Pública. O problema é agravado pelo fato desta resistência não ter nenhuma barreira

natural, gerando variedades genéticas que podem, em alguns casos (ebola, vírus

recombinante antrax), conduzir rapidamente a um impacto mundial.

Uma doença evidencia formas de interação dos diferentes fatores relativos ao

meio ambiente e ao agente que determina o comportamento desse agravo na

população. Pode-se, portanto, conceituar o comportamento normal ou endêmico de

um agravo à sua ocorrência dentro de padrões regulares, com a elevação brusca do

número de casos, caracterizando, de forma clara, um excesso em relação ao normal

esperado. Desta forma, os conceitos discutidos neste trabalho são desdobramentos de

pesquisas na detecção de microrganismos, com o intuito de ser uma ferramenta de

apoio, em tempo real, na prevenção de acometimentos à população. De uma forma

geral, a presença e a concentração de alguns dos referidos microrganismos afeta por

exemplo: a qualidade (potabilidade e balneabilidade) da água para consumo em

metrópoles e balneários, o que pode causar, entre outras doenças, a diarréia; afeta a

qualidade dos alimentos, o que genericamente pode causar a intoxicação alimentar e,

em particular, o “mal de hambúrguer”; afeta a qualidade do ar em clínicas,

ambulatórios e hospitais, onde a presença de microrganismos aerobiológicos constitui-

se, por exemplo, em um importante vetor das “infecções hospitalares”. Qualquer que

seja o caso, pode ser de interesse, ou mesmo de suma importância, detectar a

presença de certos microrganismos em tempo real ou quase real, e, por conseguinte,

monitorar a sua evolução temporal com o intuito de agilizar ações.

Este trabalho tem como meta o sensoriamento de organismos patogênicos,

utilizando tecnologia óptica, incorporando como objeto das ações a incidência do

acometimento de doenças, o risco e o impacto ambiental, com mecanismos de

detecção bacteriana. O modelo adota novas tecnologias em que os processos ópticos

e microbiológicos constituem parte essencial, e fundamentam o sensor biológico. A

combinação da tecnologia de fibras ópticas e sensores ópticos avançados promete

abrir novos horizontes em aplicações médicas, clínicas e monitoramento ambiental [3-

6]. Tal fato fundamenta-se na necessidade premente de instrumentação seletiva e

sensitiva para a análise destas amostras. Como resultado desta alta especificidade, a

aplicação principal desta tecnologia está na identificação imediata de microrganismos

em substituição aos métodos tradicionais de detecção, nos quais o tempo de

identificação se dá em um período de 3 a 14 dias [7].

O sensor em questão traduz uma tecnologia para realizar a detecção de

microrganismos, utilizando uma combinação de procedimentos microbiológicos com

dispositivos construídos com fibras ópticas e componentes relacionados. A tecnologia

adotada combina procedimentos microbiológicos que permitem que os

microrganismos possam ser seletivamente culturados, com um circuito de fibras

ópticas convenientemente construído que é adequadamente posto em contato físico

direto com o referido meio de cultura biológico. O sensor como um todo é fisicamente

constituído de três sub-sistemas: circuito de fibras ópticas e componentes, elemento

sensor de fibra óptica e o meio de cultura biológico seletivo.

Para fins de melhor sistematização, este trabalho foi dividido em tópicos que

expressam as principais vertentes abordadas no desenvolvimento do bacteriosensor.

A revisão bibliográfica é apresentada no Capítulo II, onde são explanados

vários métodos usados por outros autores para a detecção de microrganismos.

A metodologia usada para o desenvolvimento do sensor de detecção

bacteriana a fibra óptica (Capítulo III) se divide em 5 partes: Introdução, Princípios,

Montagem do Circuito Óptico, Campo Evanescente e Experimentos de

Sensoriamento.

Os resultados são apresentados nos Capítulos IV. No Capítulo V é feita uma

discussão dos resultados experimentais, analisando comparativamente a tecnologia

desenvolvida e as apresentadas por outros autores. Aplicações práticas, sugestões e

desdobramentos de futuras teses são descritos no Capítulo VI.

Os Anexos (1-4) constam de artigo publicado na revista “Biotechnology

Techniques”, de artigo submetido à revista “Biosensor & Bioelectronics”, resumos das

patentes depositadas no Brasil (21/7/2000) e nos Estados Unidos (31/7/2000).

CAPÍTULO II

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

II-1. Introdução

As primeiras medidas volumétricas de microrganismos no ar foram publicadas

por Pasteur, em 1861, no estudo da geração espontânea da vida. Desde então a

monitoração biológica passou a ser um conceito importante e estabelecendo-se por

estimação individual ou de grupo de risco. Os métodos principais para amostragem de

microrganismos são baseados na impactação ou filtragem com inoculação posterior

em meios de cultivo, sendo que tais procedimentos, após período de incubação,

necessitam de um tempo de, pelo menos, 72 horas para identificação e quantificação

do microrganismo. Diferentes modos de detecção biológica são possíveis, mas

progressos gerais têm sido feitos com sensoriamento óptico na monitoração de

patógenos.

É bastante vasto o conhecimento médico para o combate aos patógenos que já

tenham infectado o organismo humano, em especial aqueles causadores de infecção

hospitalar. A magnitude do problema das infecções hospitalares no nosso meio é

subestimada em função do escasso volume de informações a respeito da matéria. A

situação se complica com a prática de intervenções cirúrgicas cada vez mais

audaciosas, a internação de pacientes cada vez mais graves e a presença de germes

cada vez mais resistentes. Atualmente, o uso de drogas fotoquímicas ativadas com

diodos semicondutores de alta potência óptica (LEDs), tem obtido destaque no

combate a pacientes infectados com tais microrganismos, permitindo a erradicação

destes sem prejudicar o paciente [8]. Da mesma forma, tem-se em uso um método de

caracterização das bactérias envolvidas nos processos de infecção hospitalar,

conhecido como eletroforese em campo pulsado, o qual é capaz de rastrear com

precisão os microrganismos envolvidos em infecção hospitalar, mapeá-los e avaliar o

nível de impacto ambiental num período de 7 a 14 dias [9].

II-2. Detecção Bacteriana por Técnicas Biológicas

A abordagem para a descoberta de bactérias em humanos, animais, plantas ou

no ambiente é conceitualmente idêntica. A primeira doença causada por bactéria,

comprovadamente, foi o anthrax. Os postulados de Kock são universais e intencionam

provar a relação etiológica entre um microrganismo descoberto e a doença que causa.

Estes microrganismos podem ser observados nas lesões [10] e obtidos em cultura

pura, sendo que a inoculação destes organismos culturados em animais de

experimentação, pode causar, a princípio, uma doença idêntica de onde foi isolado.

A primeira detecção de bactéria foi por microscopia, sendo logo melhorada pela

introdução de procedimentos histológicos.

Culturas puras foram indispensáveis para o estudo da patogenicidade e para o

estabelecimento da relação etiológica entre uma bactéria em particular e doenças. Foi

logo percebido que técnicas sobre meios artificiais eram mais sensíveis do que a

microscopia para a detecção bacteriana. Algumas bactérias, ainda, multiplicam-se in

vitro somente dentro de células eucarióticas e alguns patógenos humanos podem

ainda não ser cultivados in vitro. Era impossível diferenciar em aspectos morfológicos,

exclusivamente, o sempre crescente número de bactérias observadas em doenças,

órgãos e o ambiente. Isto resultou no estudo de suas características fisiológicas e

bioquímicas na cultura, para propósitos de classificação e identificação, permitindo

estudos subseqüentes de patogenicidade e virulência entre os grupos de organismos.

Durante os últimos 20 anos a tecnologia de DNA tem emergido e as

ferramentas da biologia molecular são, agora, disponíveis para detecção, assim como

para a caracterização de microrganismos. As primeiras aplicações foram direcionadas

a provas de hibridização com fragmentos de ácidos nucléicos específicos. Mais tarde,

desenvolveram-se procedimentos de amplificação in vitro de ácido nucléico. Nesse

ponto acreditava-se que esta duplicação enzimática e a amplificação de seqüências

específicas de ácido nucléico poderiam, gradativamente, substituir culturas

bacterianas. Entretanto, rapidamente, tornou-se claro que o diagnóstico molecular

possui dificuldades próprias em termos de sensibilidade, especificidade, tempo e

custo. Como conseqüência, sua aplicação tem sido restrita à solução daqueles

problemas para os quais ele é superior a técnicas convencionais [11]. Técnicas

moleculares devem ainda implementar o conhecimento de patogenicidade e virulência.

II–2–1. Detecção Bacteriana por Microscopia

A detecção bacteriana por microscopia através de esfregaços frescos,

preferivelmente por contraste de fase, pode dar uma primeira aproximação presuntiva

do agente etiológico, pela evidenciação da motilidade e da presença de endosporos

[12,13].

A microscopia em campo escuro é um procedimento de escolha para a

observação de espirochetas em lesões muco-cutâneas, associadas ao estágio

primário da sífilis, como também do exame de sedimentos de urina e fluido cérebro-

espinhal e urina de pacientes com leptospirose.

Mais informação é obtida pelo exame de esfregaços após a fixação. Alguns

métodos diretos de fixação são direcionados para visualizar estruturas, tais como

esporos, flagelos ou grânulos. Contudo, os métodos mais largamente utilizados são as

colorações de Gram e Ziehl-Neelsen. Estas colorações diferenciais não só melhoram a

visualização da bactéria, mas também dão importantes pistas de suas identificações.

Ambas as técnicas são ancoradas na composição da parede celular e estruturas

associadas. A detecção de bacilos álcool-ácido resistente no escarro ou outros fluidos

corpóreos continua sendo um dos pilares para o diagnóstico de tuberculose no mundo,

com a limitação de que outras micobactérias, além da Mycobacterium tuberculosis

possam, ainda, ser responsáveis pela doença. Na prática diária, a morfologia e as

características observadas na coloração de Gram da bactéria, junto com a natureza do

espécime nas quais são observadas, permitem um diagnóstico presuntivo da espécie.

Entretanto, a identificação da maioria dos casos é possível, somente, até o nível de

gênero.

A detecção bacteriana por microscopia atua em uma faixa de 104 a 105

organismos por ml e, como decorrência do diagnóstico presuntivo, é relativamente

induzida a erros por traços de dúvidas no julgamento da forma, reação de Gram e

motilidade do microrganismo.

II-2-2. Detecção Bacteriana por Cultura

O isolamento por cultura de patógenos microbianos permanece como o método

mais confiável nos laboratórios de diagnóstico microbiológico. O refinamento de

técnicas de cultura in vitro provém dos mecanismos e processos de infecção [12,13].

Originalmente, todas as culturas bacterianas eram semeadas em meio líquido.

A necessidade de culturas puras levou ao desenvolvimento de meios sólidos e

permitiu mais facilmente e precisamente a quantificação de bactérias. As

características das colônias bacterianas em meio sólido tornaram-se importante

ferramenta de identificação. Ao longo de muitas décadas, principalmente por tentativa

e erro, os meios de cultivo foram desenvolvidos e melhorados para diferentes

propósitos na microbiologia clínica. Meios de cultivo de isolamento primários servem,

normalmente, para recuperar o patógeno de fontes estéreis, enquanto que meios

seletivos são usados para recuperar o patógeno de fontes polimicrobiais ou

implementar características de isolados primários.

A despeito dos valores estabelecidos, as culturas in vitro possuem alguns

fatores limitantes, dentre eles está o tempo requerido para isolar e identificar o agente

etiológico pelo melhor método disponível, os quais variam de dias a semanas.

II-2-3. Detecção Bacteriana por Técnicas Imunológic as

Esforços para aperfeiçoar a sensibilidade e a especificidade da detecção

bacteriana por microscopia, através do uso de imunofluorescência, usando anticorpos

monoclonais em bacteriologia médica, são limitados a infecções por rickettsiae,

chlamydiae e legionellae [12,13].

Técnicas imunológicas tendem a melhorar a sensibilidade do diagnóstico, em

especial, em imunoensaios enzimáticos. Contudo, levam várias horas em análises e

requerem múltiplos controles, fazendo-os mais adequados para testes múltiplos do

que espécimes individuais, assim perdendo a vantagem da rapidez.

II-2-4. Detecção Bacteriana por Técnicas Moleculare s

Técnicas moleculares são indicadas para a detecção de organismos que não

podem crescer in vitro ou para os quais as técnicas correntes de cultura são muito

insensíveis e, também, para a detecção dos organismos que requererem meios

sofisticados culturas de células ou tempos de incubação prolongados.

O princípio básico de qualquer teste diagnóstico molecular é a detecção de

uma seqüência específica de ácido nucléico por hibridização a uma seqüência

complementar de DNA ou RNA. A detecção bacteriana por teste do ácido nucléico foi,

primeiramente, aplicada no campo das doenças infecciosas por MOSELEY et al. [14],

para a detecção de enterotoxigênica Escherichia coli, pela hibridização DNA-DNA, em

amostras crescidas em placas de Petri com agar MacConkey. Esta aplicação ilustrou a

maior vantagem deste conceito: bactérias patogênicas podendo ser detectadas e

identificadas em uma mistura de bactérias patogênicas e não-patogênicas,

pertencendo à mesma espécie presente na mesma amostra, e difíceis de distinguir por

culturas tradicionais e técnicas de identificação, devido a suas similaridades

bioquímicas.

A detecção de patógenos por provas diretas sem amplificação de seus ácidos

nucléicos foi desenvolvida para vários patógenos bacterianos. É usada com sucesso

para a detecção de Chlamydia trachomatis [15], embora esta técnica seja,

provavelmente, no futuro substituída por testes de amplificação. Para muitas outras

possíveis aplicações, especialmente a detecção de patógenos respiratórios como as

espécies Legionella [16], Mycobacterium pneumoniae [17], Chlamydia pneumoniae e

Mycobacterium tuberculosis [18], o procedimento perde a sensibilidade necessária a

ser aplicada no diagnóstico clínico laboratorial.

A detecção bacteriana por métodos de amplificação é possibilitada pelo fato de

qualquer extensão de ácido nucléico pode ser copiada usando uma DNA-polimerase,

contanto que alguns dados de sucessão sejam conhecidos pelo desenho apropriado

de primers. A replicação in vitro de DNA foi possível quando KORNBERG [19]

descobriu a DNA-polimerase I, mas não se teve progresso até que, em 1986, foi

introduzida a idéia da reiteração do processo da polimerização do DNA [20],

alcançando um incremento exponencial de ácido nucléico pela reação polimerásica

em cadeia (PCR).

Técnicas alternativas de amplificação de ácido nucléico foram desenvolvidas,

usando diferentes enzimas e estratégias, mas todas elas foram baseadas em reações

reiterativas. Na maioria destas, o ácido nucléico é amplificado e, em algumas, este é

multiplicado. Nas técnicas de amplificação de ácido nucléico com PCR, o sistema

baseia-se na transcrição [21] a partir de uma seqüência de replicação [22], derivando

uma seqüência amplificada de ácido nucléico e a amplificação transcritiva mediada,

para fins comerciais [23,24]. Sistemas de amplificação in vitro têm muitas vantagens

sobre métodos clássicos para a detecção de patógenos bacterianos. São altamente

específicos, provêm escolha de primers específicos para um organismo em particular

ou grupo de organismos, assim permitindo imediata identificação. Novos organismos,

muitos dos quais nunca tendo sido cultivados em meios artificiais, estão sendo

detectados e identificados, bem como associados a doenças [25].

Entretanto, há inúmeras restrições práticas. A sensibilidade clínica pode ser

mais baixa do que a sensibilidade analítica. O sucesso desta técnica é altamente

dependente de quantas moléculas possam ser concentradas na amostra teste, da

presença de inibidores de processos enzimáticos responsáveis por reações falso-

negativas e do volume da amostra. Além disso, os procedimentos são particularmente

propensos a contaminação cruzada, através de fragmentos de ácidos nucléicos

previamente amplificados [26]. Conseqüentemente, faz-se necessária a

disponibilidade de pessoal bem treinado, o uso específico de alguns laboratórios e o

uso de material apropriado. Resultados negativos devem ser substanciados pela

inclusão de controles internos específicos. Resultados positivos devem ser

confirmados por uma segunda reação de amplificação de uma fragmento de ácido

nucléico alternativo [27]. Tudo isso torna as técnicas de amplificação bastante caras e

complexas.

II-3. Detecção Bacteriana por Técnicas Ópticas - Se nsores a Fibra Óptica

O primeiro laser foi construído em 1954 e, em apenas uma década, os lasers

cobriram o espectro do infravermelho ao ultravioleta. A utilização de fontes coerentes

de alta potência permitiu a descoberta de todo um conjunto de novos efeitos ópticos

não-lineares (geração de harmônicos, mistura de freqüências). A tecnologia

necessária para produzir sistemas de comunicação óptica, desenvolveu-se

rapidamente. A área militar despertou um interesse no uso do ferramental óptico, que

vai desde a elaboração de “bombas inteligentes”, dispositivos infravermelhos de visão

noturna, até o desenvolvimento de sensores biológicos, em especial.

Desde os anos 70 é focado o uso de fibras ópticas em Telecomunicações.

Avanços na tecnologia de manufaturamento de fibras ópticas, optoeletrônica e

componentes semicondutores promoveram, mais adiante, a intensificação de

pesquisas no campo de sensores a fibra óptica [28]. Projetos iniciais de sensores a

fibra óptica empregavam fibras ópticas como guias de luz através de um sistema

óptico convencional modificado, de tal forma que as medições podiam ser feitas

diretamente no local da reação [29]. Isto imediatamente expandiu o uso de fibras

ópticas para sensoriar diversas aplicações, no lugar de métodos ópticos tradicionais

que já estavam estabelecidos. Outro fato impulsionador deve-se à aplicação de

modernas técnicas eletrônicas integradas ao processamento de sinais.

Em geral, as metodologias ópticas de sensoriamento são baseadas nas

mudanças das propriedades ópticas, através de medidas de reflexão, interferência,

absorção, espalhamento, refração e difração. Quando um ou mais destes fenômenos

acontecem, as mudanças nas propriedades ópticas serão refletidas na modulação de

uma ou mais das seguintes propriedades: comprimento de onda, amplitude, fase ou

polarização. Em comparação aos sensores convencionais puramente eletrônicos,

sensores a fibra óptica oferecem mais vantagens, podendo-se destacar dentre outras:

isolamento elétrico e imunidade a interferência eletromagnética [30].

A maior importância atribuída ao sensor a fibra óptica dá-se pelo fato de fibras

ópticas detectarem mudanças ocorridas em micro-ambientes em torno de sua

superfície. Hoje em dia, presume-se que em termos de detecção biológica, não há

nada que possa deixar de ser monitorado com sensores de fibra óptica, em especial,

em ambientes hospitalares, onde se almeja obter alarmes gerais indicativos de

presença de microrganismos patogênicos. Diferentes modos de monitoração

microbiológica são possíveis, mas progressos gerais têm sido feitos usando

mediadores eletrônicos na monitoração das atividades bacterianas [31].

O primeiro sensor biológico desenvolvido é datado dos anos 50, quando

LELAND C. CLARK, da Fundação de Pesquisa do Hospital de Crianças, em

Cincinnati, elaborou um eletrodo para medir oxigênio dissolvido no sangue de

pacientes em cirurgias. Ele envolveu um eletrodo de platina e um eletrodo de

referência com uma membrana plástica permeável a gases. A voltagem no eletrodo de

platina era fixa, de forma que a taxa de fluxo gasoso pelo circuito dependia da taxa de

oxigênio difundido pela membrana, que, em troca, era diretamente proporcional à

concentração externa de oxigênio.

Em 1962, CLARK estendeu a aplicabilidade do eletrodo de oxigênio de forma a

poder sensoriar níveis sangüíneos de glicose [32]. Ele cobriu o sensor de oxigênio

com uma camada de gel contendo um biocatalisador, a enzima glicose oxidase,

seguida por uma diálise semi-permeável que permitiu à glicose difundir-se dentro do

sensor, mas impediu a enzima de difundir-se fora. Da mesma forma, a membrana

impediu a entrada de enzimas que poderiam degradar o biocatalisador. Quanto mais

entrava glicose no sensor, mais oxigênio era consumido pela enzima. Baixas leituras

de oxigênio traduziam diretamente altos níveis de glicose.

Este sensor nunca firmou-se no cuidado de paciente de rotina. Sua precisão

dependeu criticamente da taxa a qual oxigênio e glicose se difundiam no sensor,

sendo que esta poderia mudar ou com o nível de oxigênio no sangue do paciente, ou

com coágulos que se formavam na superfície do sensor. Não obstante, o dispositivo

proporcionou uma base conceitual para trabalhos subseqüentes, ou seja, um sistema

biológico sensível a uma combinação particular, um transdutor físico para converter a

mudança química em uma medida e membranas para separar elementos do sensor.

A inovação seguinte deu-se em 1969, quando GEORGE G. GUILBAULT, da

Universidade Estadual de Lousiana, em Nova Orleans, construiu um sistema para

medir uréia em fluidos corpóreos. Tal dispositivo usava urease, enzima que converte

uréia em dióxido de carbono e amônia. Um eletrodo era afetado por mudanças na

concentração do íon amônio. O sensor de GUILBAULT [33] marcou um avanço

significativo pelo fato de estar ancorado em detecção potenciométrica, técnica esta

largamente utilizada.

Considerando que o sensor de CLARK media a corrente que fluía através do

eletrodo, o sensor potenciométrico media a propensão de voltagem requerida para

manter a corrente de fluxo zero. O eletrodo não consumia nenhum dos substratos

reativos, sendo então menos suscetível a erros causados por mudanças nas

condições externas.

Nas décadas posteriores, o desenvolvimento de métodos eletroquímicos

abarcaram mais de 100 enzimas diferentes, as quais têm sido amplamente utilizadas

em biosensoriamento. SIDWELL & RECHNITZ [34], da Universidade do Havaí,

desenvolveram métodos proporcionando uma seqüência complexa de reações,

obtendo respostas a aminoácidos e outras importantes moléculas biológicas. Dentre

estas, destacam-se a polpa de banana para medir dopamina, núcleos de milho para

piruvatos, folha de pepino para cisteína, açúcar de beterraba para tirosina, fígado de

coelho para guanina e músculo pulverizado de coelho para adenosina monofosfato.

Sensores biológicos estão, de forma geral, em desenvolvimento para

aplicações práticas in vitro e in vivo, sendo dependentes de uma combinação de várias

tecnologias multidisciplinares, de natureza biológica, bioquímica e física [35,36].

Ensaios convencionais são considerados poderosos acessos para análise de

microrganismos em meios complexos, requerendo mais habilidades com automação

para obterem-se resultados seguros. Entretanto, o desenvolvimento de técnicas de

sensoriamento biológico, geralmente, oferece a possibilidade de redução de preparos

em técnicas microbiológicas auxiliares, a detecção de microrganismos e o

monitoramento em tempo real [37-39].

II-3-1. Conceito de Sensor Biológico

Sensores baseados em materiais biológicos são procedimentos analíticos que

medem interações de biomoléculas. Os sensores ópticos baseados em tecnologia por

campo evanescente atuam pela incorporação do elemento sensitivo, convertendo o

parâmetro físico de um sistema biológico em um sinal mensurável. Avaliam as perdas

mensuráveis de luz como um meio de detectar mudanças externas e, em geral, esta

perda é devida às mudanças no índice de refração ou absorção de luz em uma região

da fibra onde se retirou a proteção (casca). O área sensitiva responde a uma

substância que está sendo medida (o componente biológico). É convertida esta

mudança observada (química ou física) em um sinal mensurável, usualmente um sinal

eletrônico ou óptico onde a magnitude é proporcional à concentração de um (ou mais)

dos compostos que se está medindo [40-42].

Sensores biológicos estão sendo usados em aplicações científicas gerais, e

nesta Tese, onde elaborou-se em bacteriosensor, visou-se a qualidade biotecnológica

ambiental, através da mensuração e alerta dos microrganismos que podem causar

impactos adversos.

A chave para a elaboração de qualquer sensor é a seletividade e a

sensibilidade, caracterizadas pelo reconhecimento reativo, tendo como base o tipo de

teste e a escolha da técnica de detecção. Além do fato de poder-se trabalhar com a

célula total, manipulações de espécies microbianas têm uma vulnerabilidade particular

a uma toxina ou grupo de toxinas, que podem aparecer e tornarem-se um

requerimento para dados específicos e, mesmo com tais problemas, proporcionam a

possibilidade de um sistema estável [43].

No trabalho com biosensoriamento, emerge o desenvolvimento de tecnologias

de sensibilidade biológica e óptica. Sistemas de detecção sensitivos são requeridos

para detectar e distinguir uma grande variedade de substâncias. Esforços na pesquisa

de sensores biológicos requerem, cada vez mais a manipulação biológica ou mesmo

passos de inibição ou indução de procedimentos sensitivos e específicos, visando a

detecção de microrganismos em tempo real. Diferentes modos de monitoração

microbiana são possíveis, mas progressos gerais têm agora sido alcançados na

monitoração de microrganismos ambientais [44,45].

II-3-2. Sensor Biológico por Onda Evanescente

Nos sensores por onda evanescente, em geral, o mecanismo sensitivo conta

com a absorção da onda luminosa guiada por meio do campo evanescente acoplado

(Figura 1a ). Quando o feixe de luz toca a interface entre o núcleo e a casca da fibra

óptica, uma reflexão interna total ocorre quando o ângulo de incidência se torna maior

que o ângulo crítico [46]. Neste caso, uma onda evanescente penetra na casca da

fibra, na ordem de um comprimento de onda além da superfície refletora. A

profundidade de penetração (dp) da onda evanescente (Equação 1 ) significa a

distância cuja magnitude do campo elétrico à superfície está a 1/e de seu valor. É

definida como:

dp = ( ) 2/1222 sin2 clco nn −θπλ

(1)

onde θθθθ é o ângulo de raio incidente interno com a normal para a interface de

núcleo/casca, λλλλ é o comprimento de onda no vácuo, con e cln são os índices de

refração do núcleo e da casca, respectivamente. A reflexão total interna ocorre quando

a luz atravessa uma interface onde há uma mudança no índice de refração e quando o

ângulo o qual a luz faz com a interface excede o ângulo crítico. Quando o ângulo

crítico é excedido, ocorre a reflexão total interna e a luz é refletida de volta no primeiro

meio (Equação 2 ). Com uma onda luminosa atuando entre a interface de dois meios

de índices de refração n1 e n2, a reflexão total interna ocorre quando o ângulo de

reflexão θθθθ é tal que:

sin = n

n e n > ncrítico

2

12 1θ (2)

onde n1 refere-se ao meio interno e n2 ao meio externo. Se θθθθ > θθθθcrítico , há uma onda

evanescente através da interface na direção z, que penetra no meio n2 a uma

distância dp, que é dependente do comprimento de onda (Figura 1b ). Pode ser

mostrado que o vetor campo elétrico desta onda (E) é mais intenso na interface (Eo) e

decai exponencialmente com a distância (z), como mostrado na Equação 3 :

−

p0 d

z exp E = E (3)

A luz se propaga de forma confinada através do núcleo de uma fibra óptica. No

entanto, o seu campo evanescente se estende, penetrando por cerca de um

comprimento de onda na casca da fibra.

Figura 1 (a-b). Representação de onda evanescente na interface entre dois meios

ópticos

O campo eletromagnético evanescente (ou onda evanescente) é uma

característica óptica intrínseca que surge quando a radiação eletromagnética (luz) se

propaga ao longo de guias de onda dielétricos, notadamente as fibras ópticas.

A condição necessária para que a radiação eletromagnética possa propagar-se

ao longo de um guia de onda dielétrico (isolante) é que a propagação evolua através

de um meio material com índice de refração superior ao meio material adjacente. No

caso das fibras ópticas, isto é exemplificado pelo fato da luz propagar-se ao longo de

seu núcleo de índice de refração nnúcleo , onde este último está sempre circundado por

uma casca de índice de refração ncasca ligeiramente menor (nnúcleo > ncasca ).

Conclui-se então que o campo evanescente poderá ser acessado, ou seja,

poderá interagir com um certo meio material, caso este meio material esteja

suficientemente próximo da periferia do núcleo, ou mais especificamente de uma

distância ≅≅≅≅ λλλλ.

Devido à existência do campo evanescente, é fácil concluir-se que a propagação

da luz através de uma fibra óptica se processa com uma parte desta luz se

propagando no núcleo de índice de refração nnúcleo , e outra parte através da casca

com índice de refração ncasca . Por conseguinte, o sinal luminoso como um todo, ao se

propagar através de uma fibra óptica, irá experimentar um certo índice de refração

efetivo neff, de tal forma que nnúcleo > neff > ncasca . De uma forma geral, é fácil inferir

que, se o meio adjacente ao núcleo for outro que não seja a casca, o seu índice de

refração será diferente e a luz irá experimentar um índice de refração efetivo neff,

também diferente. Caso o meio exterior mude de características com o passar do

tempo, por uma causa qualquer, o seu índice de refração irá variar e,

conseqüentemente, o índice de refração efetivo também, ou seja, neff = neff (t), onde t

simboliza a coordenada de tempo.

II-3-3. Tipos de Sensores Biológicos Ópticos em Cam po

Evanescente de Uso Corrente

Conceitualmente, sensores biológicos ópticos em campo evanescente

compreendem transdutores para a detecção da presença de moléculas biológicas,

mas o termo adquiriu uso mais específico, significando um transdutor de detecção de

moléculas em uma superfície.

Historicamente, transdutores de superfície foram introduzidos por serem mais

sensíveis, fato este enfatizado pela grande maioria dos processos biológicos de

reconhecimento que atuam em superfícies, como por exemplo em interface

sólido/líquido (citoplasma/membrana) ou interface sólido/sólido (antígeno/anticorpo),

conseqüentemente, estabelecendo o princípio do uso de sensores ópticos para

investigar propriedades biológicas e seu corolário, pelo uso de sistemas biológicos,

como detectores (imunosensores).

A técnica de acoplamento do campo evanescente em uma fibra óptica tem sido

sugerida para a implementação de sensores biológicos que permitam realizar medidas

e, conseqüentemente, a automação de processos de sensoriamento biológico.

Em uso corrente, nas diversas aplicações envolvendo sensores por onda

evanescente, destacam-se as seguintes técnicas: ressonância de plasmons

superficiais (SPR), ressonância através de espelhos e guias de ondas planares.

A técnica SPR é baseada na reflexão interna total (RIT). A onda evanescente a

partir da interface penetra no meio de índice refrativo menor, decaindo

exponencialmente. Quando um filme metálico é inserido na interface, um novo

fenômeno ocorre. O metal tem nuvens de elétrons livres que podem ser acoplados e

são arrastados pelo campo eletromagnético evanescente com certos ângulos

incidentes de luz. Estas nuvens de elétrons (plasmons) possuem uma onda coletiva

paralela à interface. A ressonância absorve energia da luz incidente e a intensidade de

luz refletida é observada. O perfil da onda evanescente é dependente do índice de

refração do meio de prova. Pela mudança do índice de refração, a onda é alterada.

Isto requer um novo ângulo de luz incidente para a ressonância do modelo

experimental e isto é, subsequentemente, medido por uma troca no “ângulo imerso”

refletido, onde a ressonância tiver absorvido energia da luz incidente [47,48]. A Figura

2 reproduz o método de reflexão total atenuada por excitação de plasmons, usando o

arranjo de KRETSCHMANN [49], onde n1, n2, n3, são os índices de refração do prisma

de vidro, da camada metálica e amostra, respectivamente.

Figura 2. Representação esquemática de sensor biológico evanescente por

ressonância de plasmons superficiais (SPR)

A técnica por espelho ressonante usa uma construção similar, exceto pela

superfície sensitiva, onde o filme metálico é substituído por uma camada ressonante

dielétrica de alto índice de refração (ex.: titânio), visando a observação de interações

biomoleculares [50]. No ponto ressonante, a luz se acopla dentro da camada de alto

índice de refração e propaga-se ao longo da interface sensitiva, antes do acoplamento

no prisma (Figura 3 ). O ângulo de excitação da ressonância é, novamente, muito

sensível às mudanças na interface sensitiva e isto pode ser detectado por alterações

de medidas no ângulo de excitação.

Figura 3. Representação esquemática de sensor biológico evanescente por espelho

ressonante

A Figura 4 está relacionada ao sensor biológico em campo evanescente por

guias de ondas planares, o que é o caso particularmente usado em imunosensores

[51]. Mudanças no índice de refração da amostra são medidas pela alteração da forma

da onda propagada. Os imunosensores usam como apoio uma adaptação de técnica

usada em laboratórios de testes imunológicos, o teste ELISA (enzyme-linked

immunosorbant assay), que consiste em evidenciar a presença de patógenos através

de uma reação com anticorpos específicos (monoclonais ou policlonais) [52] marcados

(p. ex.: isotiocianato de fluoresceína), como mostrado na Figura 5 . Dessa forma,

procede-se em detectar a interação antígeno-anticorpo dentro da onda evanescente

de uma fibra óptica [53-57].

Figura 4. Representação esquemática relacionada ao sensor biológico evanescente

por guias de ondas planares

Figura 5. Representação esquemática do mecanismo de interação antígeno-anticorpo

em um Imunosensor

CAPÍTULO III

METODOLOGIA

A Tese aqui apresentada refere-se ao desenvolvimento de um sensor de

detecção bacteriana, baseado na tecnologia óptica, com mecanismo de funcionamento

baseado na modulação de intensidade da luz, através do acoplamento do campo

eletromagnético evanescente. É fundamentada por uma forte natureza multidisciplinar,

na medida em que, para sua implementação, são necessários conhecimentos de

Óptica, tecnologia de fibras ópticas, Biologia, Eletrônica e Informática.

Para o desenvolvimento desta Tese, tendo em vista ser uma linha de pesquisa

nova no Laboratório de Instrumentação e Fotônica (LIF/PEB/COPPE/UFRJ), foi

necessária a adequação física de alguns espaços para a montagem de infra-estrutura

óptica e realização de testes químicos e biológicos, sem descartar o apoio

bacteriológico, fundamental, do Laboratório de bacteriologia da Escola Nacional de

Saúde Pública (ENSP/FIOCRUZ). Incluiu, também, várias coletas de amostras em

diferentes tipos de ambientes, inúmeros testes na elaboração da montagem

experimental para detecção do sinal da reação (bactéria/fibra/área evanescente) e o

desenvolvimento do programa de aquisição do sinal, no software Labview (National

Instruments Corporation).

III-1. Princípios

Crescimento e Reprodução Bacteriana

O aumento na população de células, ou seja, a divisão celular dá-se por um

processo assexuado, chamado de fissão binária, e a evolução do crescimento

bacteriano segue um padrão, como descrito por PELCZAR et al. [12], compreendido

por quatro fases definidas (Figura 6 ):

Figura 6. Curva de crescimento (generalizada) de uma cultura bacteriana

Na fase lag os organismos estão se ajustando ao ambiente (pequena ou

nenhuma divisão). Estão sintetizando DNA, ribossomas e enzimas para nutrientes de

apoio, a serem usados para crescimento.

Na fase logaritímica ou log a divisão está em uma taxa constante (tempo de

geração), mas varia com espécie, temperatura e meio de cultivo. A Equação 4 mostra

que o tempo requerido para a população dobrar após a fase lag é chamado de tempo

de geração (g). É definido a partir do número de gerações (n) que ocorrem em um

período de tempo (t), em minutos:

nt

g = (4)

A Equação 5 é obtida a partir da definição anterior podendo-se chegar

a uma fórmula mais prática:

( )01010 NlogNlog3,3

tg

−= (5)

onde t é o tempo (minutos), N é o número de bactérias no tempo t e No é o

número inicial de bactérias.

A Equação 6 mostra que velocidade de crescimento é inversamente recíproca

ao tempo de geração g e, dessa forma, a população instantânea N(t) na fase log pode

ser derivada da equação anterior, sendo:

( ) t/go 2NtN ×= (6)

Na fase estacionária a morte e a divisão de organismos estão em equilíbrio. A

morte deve-se a nutrientes reduzidos, mudança de pH, desprendimento tóxico ou

oxigênio reduzido. As células são menores e têm menos ribossomas. Em alguns

casos, as células não morrem, entretanto não mais se multiplicam.

Na fase de declínio ou morte a população está morrendo em uma progressão

geométrica, de forma que há mais mortes do que células novas. As mortes são

devidas à ações de enzimas líticas, que são lançadas ao meio quando a bactéria se

degenera.

III-2. Montagem do circuito óptico ( set-up )

A Figura 7 ilustra esquematicamente a montagem experimental. A potência

óptica a partir de um laser pigtail GaAlAs de 3-mW a 840 nm, é unido a um acoplador

óptico bidirecional de 3 dB. Metade da potência óptica emitida segue para o elemento

sensitivo (fibra com o campo evanescente exposto) e incide no fotodiodo (PD2) para

gerar o sinal físico. A outra metade da luz é usada como um sinal de referência e

incide no fotodiodo (PD1). Os dois sinais são medidos por um medidor de potência

óptica de dois canais (S 380 - Graseby Optronics), que eletronicamente adquire o sinal

de referência e o sinal da amostra. Uma placa A/D controlada por um programa de

aquisição elaborado em LabView digitaliza ambos sinais de saída a partir do

optômetro [Sinal AMOSTRA e Sinal REFERÊNCIA] por meio de sua interface IEEE-488. São

coletados 800 pontos por minuto (80 pontos a cada intervalo de 6 segundos), sendo

registrada a média por minuto durante o tempo de aquisição.

O mecanismo sensitivo é baseado na absorção da onda luminosa guiada por

meio do campo evanescente acoplado. Como as bactérias crescem no entorno do

sensor, a onda luminosa guiada varia em intensidade. O meio de cultura é aderente à

área sensitiva e, normalmente, a luz que viaja dentro da fibra óptica sofre reflexão

interna total quando o feixe luminoso toca a interface entre o núcleo e a casca. Isto

ocorre quando o ângulo de incidência é maior que o ângulo crítico. Assim, uma

propagação óptica de uma onda através de uma fibra óptica é limitada pelo núcleo,

mas permite interagir com meios externos pelo acoplamento do campo evanescente,

quando este campo é exposto [58,59].

Estufa

Sensor

Fibra Óptica

Optômetro Placa A/D

Terra óptico

Laser

Acoplador de 3 dB

hPd2

SinalAMOSTRA

SinalAMOSTRA

SinalREFERÊNCIA

SinalREFERÊNCIA

Figura 7 . Esquema de montagem óptica experimental do Bacteriosensor

III-3. Exposição do Campo Evanescente na Fibra Ópti ca

Em uma fibra óptica multimodo de índice gradual (50/125 µm), atacou-se

quimicamente 20 cm para expor o campo evanescente com ácido hidrofluorídrico

(38%) para deixar de 0,5 a 1,0 µm de casca em torno do núcleo da fibra.

O monitoramento do corrosão química [60] foi elaborado a partir de uma

técnica de geração de imagens tridimensionais, permitindo medições precisas,

correlacionando o tempo de exposição da fibra na solução ácida e a espessura final da

fibra na área, utilizando um microscópio óptico calibrado em campo claro [61].

Com este esquema a área sensitiva do sensor foi de, aproximadamente, 33

mm2.

III-4. Experimentos, Materiais e Métodos

Face às respostas obtidas no testes iniciais [62], pesquisas na área hospitalar,

em especial no ambiente hospitalar, foram direcionadas para o monitoramento de

patógenos aerobiológicos, visando-se testar a sensibilidade do sensor em amostras de

campo. Os testes foram realizados em hospital público do Município do Rio de Janeiro

que enfrentava reiterados problemas de infecções hospitalares, destacando-se a

incidência de Staphylococcus aureus meticilina-resistente (MRSA) e Streptococcus

pneumoniae, corroborando com incidências abordadas pela literatura [63-65].

III-4-1. Monitoração e Diagnóstico de Patógenos Ae robiológicos

É bastante relevante dar-se soluções à veiculação problemática de patógenos

aerobiológicos no ambiente hospitalar, sobretudo em áreas críticas, impelindo a

ciência na elaboração de mecanismos de controle como desafios para a área de

proteção à saúde humana contra microrganismos aerobiológicos patogênicos [66-71].

Neste sentido, o zoneamento de unidades e ambientes funcionais deve atentar para a

sensibilidade e risco de transmissão de infecções aos pacientes hospitalizados, no

intuito de minimizar manifestações clínicas por microrganismos oportunistas [72,73].

Concomitantemente, as condições ambientais necessárias ao auxílio do controle da

infecção hospitalar dependem de pré-requisitos ambientais das diferentes áreas

hospitalares. Atribui-se importância destacada à veiculação aérea pelo expressiva

incidência letal [74] e este monitoramento faz-se fundamental pelo descobrimento de

agentes patogênicos a tempo de preverem-se surtos, evitando-se, assim, que o óbito

por infecção hospitalar cause um impacto adverso no ambiente hospitalar,

principalmente quando se tenham intervenções cirúrgicas complexas.

A transmissão de infecções hospitalares provocada pela movimentação de

aerossóis, partículas e poeiras, contendo ou não germes potencialmente

contaminantes, carece de ser monitorada, já que estes fatores abrangem as

alterações na ecologia microbiana hospitalar, pela seleção de microrganismos

resistentes de difícil erradicação, bem como a contaminação de artigos de alto e de

médio risco de transmissibilidade por esses agentes [75]. Esta colonização é afetada

pelo local onde encontra-se o paciente, sendo mais pronunciada nos CTIs. Entre os

fatores que concorrem para que estes pacientes sejam mais afetados do que os de

enfermaria pode-se destacar: gravidade da doença de base, terapia antibiótica

prolongada, comprometimento das floras da faringe intestinal e o emprego de

procedimentos invasivos [76].

A microbiologia no controle de infecções hospitalares tem importância central

na manutenção da qualidade das áreas funcionais do hospital, uma vez que o

fenômeno epidemiológico das infecções hospitalares é identificado, principalmente,

com a monitoração da distribuição de microrganismos no ambiente hospitalar por

apresentarem maior grau de patogenicidade. Dessa forma, o controle do ambiente

hospitalar deve ser procedido de modo sistematizado, a fim de diagnosticar as

infecções hospitalares e direcionar o plano de ação, impedindo o acometimento à

pacientes, em especial, àqueles de áreas críticas (salas de operação ou de parto, CTI,

unidade de queimados, berçário de alto risco, sala de hemodiálise).

Área de Coleta e o Amostrador de Ar Biológico

As técnicas mais comuns para coleção e monitoração de aerobiológicos são os

amostradores de fenda [77] ou impactadores em cascata [78]. Neste trabalho, a

amostragem microbiológica do ar foi feita com a técnica de impactação sobre um gel,

empregando o equipamento de amostragem aérea Merck MAS-100 (Merck Air

Sampler ). Este equipamento consiste em uma bomba de vácuo, com uma taxa de

fluxo volumétrico de 100 litros por minuto por um tela perfurada. O fluxo de ar

resultante, que leva partículas com diâmetros abaixo de 10 µm, é direcionado sobre a

superfície do agar em uma Placa de Petri de 90 mm. As amostras foram coletadas em

um setor localizado na emergência com 12 m2, a 1,3 m do chão e o volume de ar

ambiente aspirado no local de amostragem em cada placa. O equipamento foi

programado para 10 coletas/placa/minuto, perfazendo um total de 1 m³.

Técnica de Coleta e Incubação

Dezoito coletas foram executadas em seis dias escolhidos aleatoriamente no

período de duas semanas. Nos três primeiros dias foi utilizado o meio de cultura

específico para MRSA e, nos três últimos, foi utilizado um meio de cultura específico

para S. pneumoniae.

Após a coleta, as amostras foram incubadas em estufa a 35oC, durante 48 h.

Duas placas foram usadas para contagem de unidades formadoras de colônias (CFU),

identificação e caracterização de especificidade. A outra placa de Petri recebeu o

sensor e, então, 500 µl de salina fosfatada tamponada (PBS), pH 7.0, foi adicionado

para providenciar uma melhor distribuição dos microrganismos no entorno da área

sensitiva da fibra óptica. Após os procedimentos iniciais, as placas de Petri foram

colocadas em uma estufa. Durante as 30 h seguintes, o bacteriosensor monitorou o

crescimento bacteriano sobre a placa, enquanto que as outras duas placas foram

usadas como controle. Após o tempo de incubação total de 48 h, todas as três placas

de Petri foram submetidas a testes de controle de identidade e seletividade.

Meios Seletivos de Cultura e Identificação dos Microrganismos

Os meios seletivos de cultura foram escolhidos para melhorar a sensibilidade

do isolamento e promover o crescimento dos microrganismos selecionados neste

estudo. Para MRSA foi empregado Baird-Parker Agar Base (Difco Laboratories,

Detroit, Michigan - Difco 0768-17-3) suplementado com 4 µg/ml de oxacilin (Sigma-

Aldrich, São Paulo, Brasil), com temperatura de incubação de 35°C. Para S.

pneumoniae, foi empregado Trypticase soy blood Agar Base (Difco Laboratories,

Detroit, Michigan - Difco 0026-17-1) suplementado com sangue de carneiro a 5%,

100.000 U de polimixina B (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil), 4 µg/ml de neomicina

(Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil), 0,5 µg/ml de ácido fusídico (Sigma-Aldrich, São

Paulo, Brasil), com temperatura de incubação de 35°C. Em todos os meios de cultura

acima descritos, adicionou-se glicerol a 0,2%, no intuito de evitar-se ressecamento das

culturas durante os testes ópticos.

Para o controle negativo (especificidade) desses meios de cultura, testes foram

feitos com outros microrganismos, sendo eles: Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa e Proteus mirabilis. Não houve crescimento de nenhum destes, mesmo

após 72 h.

Após as medidas ópticas com o bacteriosensor, culturas de

microrganismos foram submetidas a testes de identidade, visando assegurar que

somente microrganismos específicos tiveram crescimento em cada placa de Petri. As

colônias de S. aureus crescidas foram verificadas com MRSA, através do emprego do

método de aglutinação de partículas (Staphaurex Plus, Murex Diagnostics Ltd.). A

identificação das colônias de S. pneumoniae foram verificadas por meio de testes de

solubilidade de bile e fermentação de carboidratos [79,80].

III-4-2. Ensaios Metodológicos para Caracterização do Bacteriosensor

A maior desvantagem das técnicas convencionais de detecção de patógenos é

a falta de meios seguros e sensíveis para medir a sua presença em tempo real. A

tecnologia de sensoriamento por onda evanescente é uma técnica satisfatória para

medida de microrganismos em sua forma natural que pode ser aplicada ao

desenvolvimento de sensores biológicos tirando proveito do entendimento atual da

arquitetura de célula microbiana [35,43].

Em todos os experimentos descritos nesta fase, usou-se a cepa de Escherichia

coli O157:H7 CDC EDL-933 (ATCC 43894), cedida pelo Centers for Disease Control

and Prevention (CDC, USA).

Os testes preliminares apresentaram resultados significativos [81,82,83] e,

dentro de sua concepção original, realmente funciona e apresenta reprodutibilidade.

Caracterizou-se o sensor com relação à sua seletividade biológica e resposta

temporal. Esta caracterização não só permitiu conhecer mais profundamente a

interação bactéria-fibra-luz, como também permitiu calibrar o sensor. Em decorrência

do procedimento de calibração, foi determinada com grande precisão a sensibilidade e

a faixa dinâmica de operação do sensor.

Escherichia coli O157:H7 - Considerações Clínicas

A E. coli O157:H7 pode ser transmitida através de alimentos, água e contato

pessoa-pessoa. A maioria dos casos dá-se pela ingestão de alimentos contaminados,

principalmente aqueles de origem bovina. A ingestão de alimentos mal-cozidos,

provenientes de restaurantes ou mesmo de origem doméstica, tem denotado ser uma

fonte expressiva de surtos de incidência, aliada ao poder de transmissão através de

alimentos contaminados, destacando-se aqueles de origem bovina, em especial os

hambúrgueres (“Mal dos hambúrgueres”), águas de balneabilidade ou de consumo

[84].

O reconhecimento de que águas poluídas com material de origem fecal podem

disseminar infecções tem proporcionado o desenvolvimento de métodos sensitivos

para exames de rotina que assegurem que a água para consumo humano esteja livre

de tais contaminações. Embora seja possível a detecção de inúmeros patógenos na

água, os métodos de isolamento e enumeração são freqüentemente complexos e

demandam bastante tempo, o que torna o monitoramento impraticável. Dessa forma,

optou-se pelo uso de Escherichia coli como indicador de potabilidade, subtendendo-se

ainda critérios que denotem o nível de tratamento e de desinfecção. Ela é encontrada

em grande quantidade nos excretas de humanos e em quase todos os animais de

sangue quente, servindo, assim, como um seguro indicador de contaminação fecal

recente [85,86]. É um bastonete gram-negativo, não formador de esporos, aeróbico ou

anaeróbico facultativo. Seu metabolismo é respiratório e fermentativo, com produção

ácida na fermentação da glicose e lactose, produção de catalase, não produção de

oxidase e redução de nitratos a nitritos. A tipagem sorológica é baseada em antígenos

somáticos (O), antígenos capsulares (K) e antígenos flagelares (H).

Segundo NATARO & KAPER [84], a E. coli segue um requisito estratégico de

infecção: (i) colonização de um sítio da mucosa, (ii) evasão das defesas do

hospedeiro, (iii) multiplicação e (iv) dano ao hospedeiro. É um habitante normal do

intestino e a grande maioria de suas cepas são não-patogênicas. Entretanto subtipos

são capazes de causar doenças gastrointestinais. Tais cepas de E. coli causam

doença intestinal por uma variedade de mecanismos. São identificadas quatro classes

responsáveis por diarréias: enteropatogênicas, enteroinvasivas, enterotoxigênicas e

enterohemorrágicas (produtoras de verocitotoxinas). Subtipos enteropatogênicos de E.

coli foram primeiramente reconhecidos como resultado de exames sorológicos de

cepas isoladas de surtos diarréicos em crianças. Associações de sorotipos particulares

com doenças foram observadas, mas os mecanismos patogênicos correspondentes

não são totalmente compreendidos e tais cepas têm sido particularmente associadas

com surtos de gastroenterites infantis. Cepas enteroinvasivas produzem disenterias

por um mecanismo similar do Shigella sp., ou seja, com tropismo pela mucosa

gástrica, desencadeando uma diarréia sanguinolenta. Cepas enterotoxigênicas

causam distúrbios intestinais com ampla faixa etária de ação pela produção de

enterotoxinas termolábeis e enterotoxinas termoestáveis.

Embora cepas enteropatogênicas, enteroinvasivas ou enterotoxigênicas

possam causar sérios danos, as evidências sorológicas denotam baixa incidência na

população. Entretanto as cepas enterohemorrágicas de E. coli, reconhecidas pela

ativa produção de citotoxina contra culturas de células Vero, tiveram grande

predominância de amostras do sorogrupo O157:H7 e causam doenças que variam da

diarréia à colite hemorrágica [87]. São, ainda, responsáveis pela síndrome urêmica

hemolítica, comum em crianças e adolescentes, caracterizada pela falha aguda do

sistema renal, trombocitopenia e anemia hemolítica. A síndrome urêmica hemorrágica

se portando como uma anemia hemolítica, causa trombocitopenia e falha do sistema

renal. Esta síndrome pode causar dano aos rins e é letal a, pelo menos, 50% dos

casos. As manifestações clínicas iniciais incluem oligúria ou anúria e, algumas vezes,

calafrios. A maioria dos pacientes recupera-se com apropriada terapia de apoio, mas

de 13 a 15% das crianças afetadas morrem e cerca de 12 a 30% terão seqüelas

severas, tais como: mau funcionamento do sistema urinário, hipertensão ou ainda

manifestações do sistema nervoso central [88,89]. Tal potência danosa, referenciada a

este sorotipo, levou ao reconhecimento de uma classe nova e incrivelmente entérica

patogênica causadora associativamente de doenças intestinais e renais [90].

Assim como qualquer microrganismo tipado como “patógeno emergente”, a

questão que surge é se o organismo esteve sempre presente e foi simplesmente não

diagnosticado, ou se é verdadeiramente um novo patógeno. Após a E. coli O157:H7

ter sido reconhecida como causadora de colite hemorrágica, o CDC reviu cerca de

3000 cepas sorotipadas entre 1973 e 1983 e encontrou somente um caso de O157:H7

[91]; na Inglaterra, o Public Health Laboratory encontrou somente um caso entre

15.000 amostras sorotipadas entre 1978 e 1982 [92] e, no Canadá, o Laboratory

Centre for Disease Control encontrou seis casos de O157:H7 entre 2.000 isolados de

pacientes com diarréia entre 1978 e 1982 [93]. HARCH [94] enfatiza que o patógeno

E. coli O157:H7 talvez seja o mais perigoso entérico que microbiologistas clínicos em

países em desenvolvimento estarão fadados a encontrar. A American

Gastroenterological Association [95] ressalta depoimentos de gastroenterologistas,

enfatizando que a abordagem à E. coli O157:H7 tornou-se a mais significante

contribuição à microbiologia entérica e, da mesma forma, por nefrologistas devido ao

perigo da síndrome urêmica hemorrágica [88,89,93,96]. Outro dado alarmante é seu

expressivo grau tóxico, pois são necessárias somente 10 bactérias desta cepa para

causar infecção [84].

Meio de Cultura Seletivo e Identificação de E. coli O157:H7

Um meio de cultura seletivo foi escolhido para promover um rápido

crescimento, mantendo as características específicas do microrganismo.

Primeiramente, o conteúdo de uma ampola com E. coli O157:H7 foi cultivada em

placas de Petri com Sorbitol MacConkey Agar (SMAC) (Difco Laboratories, São Paulo

- Difco 0079-17-7), incubadas a 35ºC, durante 24 h. Após o período de crescimento,

foram realizados testes de identidade, de forma a avaliar a pureza dos

microrganismos. Uma outra placa com SMAC foi inoculada e incubada a 35ºC por 24

h, sendo as outras foram estocadas a 4ºC.

Para a caracterização do bacteriosensor, usou-se um número variável de

microrganismos no início de cada aquisição. Empregou-se: N0 = 10, 20, 30, 40, 50, 60,

70, 80, 90, 100, 200, 400 e 800 microrganismos. Para cada medida, coletavam-se as

colônias crescidas após 24 h em SMAC e procedia-se à contagem das células,

usando-se um contador Coulter Counter (Beckman), o qual permite um alto grau de

acurácia e precisão de +/- 1% em uma amostra. Então, a solução era ajustada para a

concentração inicial de microrganismos desejada com PBS, pH 7.4.

Características Bioquímicas

A E. coli O157:H7 não fermenta D-sorbitol rapidamente, em contraste a cerca

de 75 a 94% de outras cepas de E. coli [97,98]. Uma característica expressiva desta

cepa que a distingue de outras cepas de E. coli é sua inabilidade de produzir β-

glucuronidade, o qual hidrolisa 4-methyl-umbellieryl-D-glucorinide (MUG) e substratos

relacionados [99].

Procedimentos para a Cultura Bacteriana

Durante 24 h o bacteriosensor monitorou o crescimento bacteriano sobre a

placa. As placas de Petri que receberam o elemento sensor para cada medida de

caracterização foram incubadas em estufa a 35oC. Para as provas com número inicial

de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 e 80 microrganismos recebidas no sensor, usou-se 100 µl

PBS, pH 7.4. Para 90, 100, 200, 400 e 800, o volume usado foi 500 µl PBS, pH 7.4.

Estes volumes foram inoculados no entorno do elemento sensor. A seguir, a aquisição

de dados pelo bacteriosensor era iniciada.

Procedimentos para a Aquisição de Fotografias

Para observação direta da interação dos microrganismos com a fibra óptica

durante a prova, foi feita aquisição de fotografias pelo emprego de microscopia

eletrônica de varredura (fase logarítmica) e microscopia óptica (fase estacionária).

Para imagens obtidas na microscopia óptica, foram usadas amostras de provas

inicializadas com No = 100 microrganismos. O tempo de prova foi de 378 minutos,

correspondendo ao sinal óptico estacionário da concentração usada. As células foram

fixadas com 2% (v/v) glutaraldeído em PBS, pH 7.4, por 3 h a 4°C. Após este período

de tempo, as amostras foram lavadas por três vezes, por 15 minutos, com PBS, pH

7.4. As imagens obtidas em contraste interferente diferencial com o microscópio Zeiss

Axioplan 2 (Carl Zeiss), foram fotografadas com uma Polaroid MC200 (Carl Zeiss),

usando o filme Kodak Tmax 100.

Para imagens obtidas na microscopia eletrônica de varredura foram usadas

amostras de provas inicializadas com No = 20 e 400 microrganismos. O tempo de

prova foi de 393 e 312 minutos, respectivamente, correspondendo ao tempo no qual o

bacteriosensor alcança a metade do sinal óptico, para estas concentrações iniciais. As

células foram fixadas com 2% (v/v) glutaraldeído em PBS, pH 7.4, por 3 h, a 4°C. Após

lavagem por três vezes com PBS, pH 7.4, 4% (v/v) de tetróxido ósmio foi adicionado a

cada amostra durante 1 h, a 4°C. Após desidratação em diluições seriadas de etanol,

as células foram levadas ao ponto crítico de secagem com CO2 (Samdri-780A,

Tousimis Research Corporation). As amostras foram cobertas com uma fina camada

de ouro por meio de um ejetor iônico (JFC-1100 Ion Sputter, JEOL) e examinadas

sobre um microscópio de varredura digital (Carl Zeiss – DSM940A). As fotografias

foram tiradas em filme preto e branco (Agfa APX 100).

III-4-3. Detecção de Legionella pneumophila em Hospitais

O controle de qualidade de água destinada ao consumo humano, desde os

sistemas produtores (mananciais, captação, tratamento), aos sistemas de distribuição

(reservatório, redes), normalmente é realizado pela empresa responsável de

saneamento local e monitorada pelas Secretarias de Saúde Estaduais. Este

monitoramento, estabelecido pela Norma no 36/GM, do Ministério da Saúde, prevê

números mínimos de amostras ou planos de amostragem, além dos padrões para a

água potável, restritos ao trecho que se inicia na captação e se encerra nas ligações

domiciliares dos consumidores [85]. O inter-relacionamento de ações que visem

propiciar o entendimento de meios de aquisição específicos e reservatórios de

patógenos é crucial para o desenvolvimento de métodos para a redução da incidência

de infecções hospitalares. É de destacada importância a monitoração continuada do

ambiente, especialmente reservatório de água, como fonte de inúmeros patógenos

nosocomiais [100-102]. O refugo de legionelosis em hospitais, identificados como

legionelosis nosocomiais, são freqüentemente associados com sistemas de águas

potáveis [103-110]. Na verdade, não se tem um monitoramento regular no que diz

respeito à qualidade sanitária da água de uso hospitalar de onde o produto

acondicionado é realmente consumido.

Neste sentido, este capítulo tem a preocupação de analisar por, amostragem, a

incidência de Legionella pneumophila, de maneira a estabelecer uma metodologia de

seleção prioritária de análise de águas representativa da possibilidade de

contaminação. O objeto de estudo levou em consideração não só a qualidade

bacteriológica, que a princípio é uma água tratada obtida de fonte segura, mas

também a qualidade físico-química, mesmo que praticamente não seja modificada, a

não ser em casos restritos na distribuição.

A família Legionellaceae ocorre naturalmente no ambiente aquático e engloba

um grupo de bactérias fastidiosas que requerem técnicas especiais de isolamento,

gram-negativas, aeróbias, das quais L. pneumophila é o membro mais comumente

encontrado como causa de doença humana [111-115]. Antes de 1976 não tinha sido

evidenciado algum acometimento desta bactéria, até que um surto de doença

respiratória aguda ocorreu entre membros de uma Legião Americana que participavam

de uma conferência em um hotel da Filadélfia, onde foram registrados 221 casos

graves com 34 óbitos [116]. Este organismo é um patógeno oportunista, infectivo,

sobretudo pela exposição a partir de aerossóis gerados por águas saídas de

nebulizadores, torneiras e chuveiros, bem como sistema de ventilação central [117].

Para a doença ocorrer, uma pessoa suscetível deve inalar um aerossol infectado de

partículas de tamanho suficientemente pequenas para penetrar no nível alveolar.

Conforme mostrado na Tabela 1 , há correntemente 14 sorogrupos de L.

pneumophila e pelo menos 29 outras espécies de legionella, embora ainda haja

alguma discordância sobre determinadas cepas pertencerem ou não à família

Legionellaceae. Segundo BUTLER et al. [118] L. pneumophila sorogrupo 1 é a

responsável por mais de 80% de todas as infecções e, em escala bastante reduzida,

aparecem os sorogrupos 4 e 6 como responsáveis pelo restante dos acometimentos.

A freqüência de legionelosis como causa de pneumonia varia entre 2% e 15%, com

mortes ocorrendo em cerca de 15% dos casos [111]. Usualmente inaladas na forma

de aerossóis, após penetração nos pulmões, reproduzem-se intracelularmente nos

macrófagos alveolares, finalmente resultando em pneumonia. Apresenta sintomas

clínicos quase que exclusivamente em indivíduos imunodeprimidos. Além disso, é

responsável por infecções extra-pulmonares fatais pela limpeza de incisões cirúrgicas

de cirurgias pós-cardíacas e, principalmente, em transplantes de órgãos [119-123].

Tabela 1. Espécies de Legionella spp.

Legionella pneumophila sorogrupos 1-14 ∗∗∗∗ L. londiniensis

L. anisa ∗∗∗∗ L. longbeachii ∗∗∗∗

L. birminghamensis L. maceachernii ∗∗∗∗

L. bozemanii ∗∗∗∗ L. micdadei ∗∗∗∗

L. cherrii L. nautarum

L. cincinattiensis L. oakridgensis

L. dumoffii ∗∗∗∗ L. parisiensis

L. erythra L. quateriensis

L. feeleii ∗∗∗∗ L. rubrilucens

L. geestiae L. sainthelensi

L. gormanii ∗∗∗∗ L. santicrucis

L. hackeliae ∗∗∗∗ L. spiritensis

L. israelensis L. steigwaltii

L. jamestownniensis L. wadsworthii ∗∗∗∗

L. jordanis ∗∗∗∗ L. worsliensis

∗ isoladas de acometimentos de pneumonia em pacientes

No Brasil, apesar de dados que demonstram a grande probabilidade de

incidência de L. pneumophila, existem poucas abordagens na literatura sobre esta

questão. VERONESI e colaboradores [124] são os precursores da investigação de

legionelosis no país, em inquérito sorológico em doadores de sangue e trabalhadores

de UTIs de três hospitais de São Paulo, quando evidenciaram anticorpos em 19% das

amostras. Trabalho semelhante foi feito em Petrópolis (RJ) e Curitiba (PR) [125,126].

LEVIN e colaboradores [127] discorreram sobre um surto epidêmico causado por L.

pneumophila em uma unidade de transplante renal em São Paulo, demonstrando a

necessidade de ter-se um monitoramento regular no ambiente hospitalar, em especial,

no setor de transplantes, visando identificar e erradicar a presença de L. pneumophila.

A ecologia e sobrevivência das legionellas no ambiente está intimamente

relacionado a protozoários (Hartmanella vermiformis, Tetrahymena pyriformes) e

amebas (Acanthamoeba castellani, Naegleria spp.) que podem suportar a

multiplicação de L. pneumophila. O mecanismo infectivo dá-se pela invasão de L.

pneumophila nestes hospedeiros, a qual apropria-se de macromoléculas intracelulares

destes para realizar multiplicação intracelular. Segue, então, a fase de replicação

intracelular até o ponto em que lisam a célula hospedeira e reinvadem novos

hospedeiros [128-132].

Dentre os cinco hospitais da esfera Municipal, Estadual e Federal

inspecionados de alguns municípios do Rio de Janeiro, dois positivaram quanto à

presença de L. pneumophila. É importante ressaltar que os aspectos físico-químicos e

colimétricos (coliforme fecal e total) foram também analisados, no intuito de ter-se um

conjunto de medidas que evidenciassem a qualidade da água consumida nestes

hospitais pesquisados. Tendo-se como base o trabalho de VICKERS et al. [133],

coletas semanais foram levadas a cabo nestes dois recintos por 10 semanas,

perfazendo um total de 320 análises, com 260 análises físico-químicas, 40 análises

colimétricas e 20 análises para legionella. Os pontos de amostragem foram: setor de

pediatria do hospital A e ambulatório geral do hospital B.

III-4-3-1. Coleta de Amostras para Provas Físico-Qu ímicas

As amostras para provas físico-químicas foram coletadas em frascos

esterilizados com um volume de 1000 ml. As amostras foram submetidas a exames

laboratoriais para os seguintes testes: Sólidos totais (faixa de aceitação: 500,0 –

1200,0 mg/l), ferro (0,3 – 1,0 mg/l), cobre (0,2 – 1,0 mg/l), cálcio (50,0 – 100,0 mg/l),

cloro (1,5 – 3,0 mg/l), zinco (1,5 a 3,0 mg/l), magnésio (50,0 – 150,0 mg/l), sulfato

(200,0 – 400,0 mg/l), carbono orgânico (até 1,0 mg/l), cloretos (até 250,0 mg/l),

nitrato+nitrito (até 50,0 mg/l), dureza total (75,0 mg/l) e pH (6,0 – 8,0).

Os valores da faixa de aceitabilidade das provas realizadas estão preconizadas

pela APHA, WHO e CDC [134-136]. As concentrações dos compostos orgânicos

(nitrato+nitrito, sulfato e cloretos) foram medidas com um cromatógrafo a gás (XL,

Perkin-Elmer) e as concentrações dos metais (Fe, Cu, Ca, Zn, Mg) foram analisadas

com um espectrofotômetro de absorção atômica (A Analyst 300, Perkin-Elmer). A

determinação de pH foi realizada com o objetivo de simplificar a representação da

concentração de ións hidrogênio numa solução. O pH é fator primordial nos processos

de coagulação, desinfecção e abrandamento das águas, bem como no controle da

corrosão e no tratamento biológico de esgotos e despejos industriais. As análises

foram feitas pelo método potenciométrico. A dureza de uma água é causada,

principalmente, pela presença do cálcio e do magnésio, aos quais se juntam como

elementos secundários outros metais como Sr, Fe, Mn, Al. Esses cátions associados a

vários ânions como os bicarbonatos CO3=, SO4

=, Cl-, NO3-, evidenciam efeitos

indesejáveis a equipamentos por incrustações. Foi utilizado o método complexométrico

do EDTA para sua determinação. Para a determinação do teor de cloro residual foi

empregado o método da ortotoluidina.

III-4-3-2. Coleta de Amostras para Provas Microbiol ógica s

Análise de Coliformes Totais e Fecais

Para as análises de coliformes totais e fecais utilizaram-se frascos estéreis

contendo 50 µl de uma solução de tiosulfato de sódio (Na2S2O3) a 1%, de forma a

neutralizar qualquer cloro residual. Coletou-se 100 ml para as análises que foram feitas

pelo método de filtração por membrana [137]. Todas as amostras foram, em prazo

máximo de três horas, encaminhadas para exames laboratoriais acondicionadas em

banho de gelo e ao abrigo da luz.

Isolamento de Coliformes - Filtração por membrana

Conforme mostrado na Figura 8 , o volume da amostra foi filtrado a vácuo

utilizando uma membrana de 0,45 µm (Millipore HAWG 04700). A membrana foi

colocada em placa de Petri de 47 mm (Millipore PD 100 4700) sobre uma almofada

absorvente (Millipore HAWP 04700) saturada com meio líquido (Figura 9 ). Nas

análises de coliformes totais a almofada absorvente foi saturada com 20 ml do meio de

cultura Endo Broth (BBL Microbiolgy Systems, USA). Incubou-se o material a 37°C por

22-24 horas. Nas análises de coliformes fecais a almofada absorvente foi saturada

com 20 ml do meio de cultura FC Broth (BBL Microbiolgy Systems, USA). Incubou-se o

material a 44,5°C por 22-24 horas [137].

número total de colônias contadas Contagem por 100 ml = 100 x ------------------------------------------------------ (7)

ml da amostra testada

Figura 8. Esquema ilustrativo de material utilizado para filtração por membrana

Figura 9. Isolamento bacteriano por membrana filtrante à vácuo

III-4-3-3. Análises de Legionella pneumophila

Para as análises de L. pneumophila utilizaram-se frascos estéreis contendo 750

µl de uma solução de tiosulfato de sódio (Na2S2O3) a 1%, de forma a neutralizar

qualquer cloro residual. Foram coletados em cada hospital 1500 ml e para o isolamento

e concentração de L. pneumophila utilizou-se o método de filtração por membrana.

Todas as amostras foram, em prazo máximo de três horas, encaminhadas para

exames laboratoriais acondicionadas em banho de gelo e ao abrigo da luz.

Isolamento de legionella - Filtração por membrana

Com adequações dos trabalhos descritos na literatura [138,139,140,141],

montou-se o protocolo descrito a seguir para o isolamento de L. pneumophila:

• Após filtração, a membrana de 0,45 µm (Millipore HAWG 04700) foi colocada

assepticamente em um erlenmayer estéril de 30 ml com tampa de rosca contendo 5 ml

de água destilada estéril com 8 pérolas de vidro. A solução foi vigorosamente

homogeneizada.

• Procedeu-se, então, o tratamento ácido (eliminação da microflora competitiva).

Retirou-se 1 ml da solução anterior, colocou-se 9 ml de tampão HCl-KCl,

homogeneizou-se e deixou-se a solução em repouso por 3 minutos.

• Após o período de reação, foi inoculado 0,1 ml em uma placa de Petri com

BCYE Selective Agar GVPC (Oxoid). Incubou-se a 35°C em estufa com atmosfera

umidificada, por 96 horas.

• As colônias foram então especificadas bioquimicamente (Legionella Latex Test –

Legionella species test reagent DR0803M, Legionella pneumophila serogroup 1

DR0801M, Legionella pneumophila serogroup 2-14 DR0802M, OXOID).

• Após a identificação das colônias, procedeu-se a manutenção em laboratório por

repiques semanais de L. pneumophila sorotipo 1 em BCYE Agar (BBL Microbiology

Systems), até que se realizassem provas ópticas no bacteriosensor.

Para testes no bacteriosensor, usou-se um número variável de microrganismos

no início de cada aquisição. Foram realizadas duas provas com números iniciais de

100, 500 e 1000 microrganismos.

Para cada aquisição, foram coletadas as colônias crescidas após 48 h em

BCYE Agar e procedeu-se à contagem das células, usando-se um contador Coulter

Counter (Beckman), o qual permite um alto grau de acurácia e precisão de +/- 1% em

uma amostra. Então, a solução foi ajustada para a concentração inicial de

microrganismos desejada com água destilada estéril (N0 de 100, 500 e 1000).

Durante 2000 minutos (~33 horas) o bacteriosensor monitorou o crescimento

de L. pneumophila sobre a placa de Petri com BCYE Agar com glicerol a 0,2%, que foi

adicionado no intuito de evitar-se ressecamento da cultura durante os testes ópticos.

As placas de Petri que receberam o elemento sensor para cada medida de

caracterização foram incubadas em estufa a 35oC.

Usou-se um volume de 500 µl de Mueller-Hinton Broth, pH 7.3, vertidos na área

sensitiva, antes da deposição dos microrganismos, visando uma melhor distribuição

destes no entorno da área sensitiva da fibra óptica. Cada prova teve início com a

inoculação de cada concentração inicial de microrganismos previamente aferida para

conter 100, 500 e 1000 microrganismos em um volume fixo de água destilada estéril

(100 µl), que foi colocado no elemento sensor.

CAPÍTULO IV

RESULTADOS

IV-1. Resultados Obtidos da Monitoração e Diagnósti co de Patógenos

Aerobiológicos

A Tabela 2 mostra a contagem de CFU de cada microrganismo nas coletas de

controle realizadas no ambiente hospitalar. Este procedimento visou verificar os dados

prévios da comissão de infecção hospitalar da incidência de MRSA e S. pneumoniae

naquele hospital.

Na etapa posterior, coletaram-se amostras do ambiente em dias alternados e

estas foram analisadas opticamente. Assim, pôde-se avaliar a sensibilidade do

bacteriosensor, em especial, pelos microrganismos estarem no ambiente hospitalar

(em condições adversas), podendo, ainda, inferir se a metodologia microbiológica

associada à montagem experimental tinha possibilitado, realmente, a detecção.

As Figuras 10 e 11 mostram, respectivamente, o sinal óptico do sensoriamento

para MRSA e para S. pneumoniae. As linhas 1, 2 e 3 representam o sinal de saída

IOUT(t) provenientes das amostras 1, 2 e 3. Usando-se a Equação 6 , foi

correlacionado o sinal óptico representativo do crescimento dos microrganismos em

teste com o número estimado destes, o que é expresso pela linha 4 . Vale ressaltar

que foram empregados nos cálculos para MRSA N0 = 94 e para S. pneumoniae N0 =

91, como também, o tempo de geração g = 30 minutos para MRSA e g = 48 minutos

para S. pneumoniae [12]. Destaca-se o fato de que todas as medidas mostraram

valores acima dos padrões aceitáveis para bactérias patogênicas de veiculação aérea

em sítios críticos [142].

Tabela 2. Contagem de CFU nas coletas de controle realizadas no ambiente

hospitalar para Staphylococcus aureus (MRSA) e Streptococcus

pneumoniae

Microrganismo Dia No. Coleta No. CFU (m -3)

1

1

2

3

112

94

Teste no sensor (Figura 10,

linha 1)

2

1

2

3

104

100


linha 2)

MRSA

3

1

2

3

80

76


linha 3)

4

1

2

3

76

81


linha 1)

5

1

2

3

92

107


linha 2)

S. pneumoniae

6

1

2

3

98

96


linha 3)

Staphylococcus aureus

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 500 1000 1500 2000

Tempo [minutos]

Iout

(t)

[uni

dade

s ar

bitr

ária

s]

1,0E+01

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

1,0E+07

1,0E+08

1,0E+09

Núm

ero

estim

ado

de b

acté

rias

Linha 1

Linha 4

Linha 2

Linha 3

Figura 10. Sinal óptico de detecção Iout (t) para Staphylococcus aureus (MRSA)

Streptococcus pneumoniae

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

Tempo [minutos]

Iout

(t)

[uni

dade

s ar

bitr

ária

s]

1,0E+01

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

1,0E+07

Núm

ero

estim

ated

o de

bac

téria

s

Linha 1Linha 2

Linha 3

Linha 4

Figura 11. Sinal óptico de detecção Iout (t) para Streptococcus pneumoniae

Para ter-se certeza de que o sinal óptico representava, realmente, a

interação das bactérias/fibra/campo evanescente na área sensitiva, foram realizadas

provas de controle do sinal óptico dos meios de culturas utilizados. As Figuras 12 e 13

evidenciam as respostas ópticas dos meios de cultivo estéreis testados (controle

negativo).

Dessa forma, todos os procedimentos de aquisição de sinais foram feitos nos

meios de cultura utilizados para a detecção de MRSA (Baird-Parker agar base) e S.

pneumoniae (Trypticase soy blood agar base), com o mesmo tempo de duração.

Figura 12. Controle Negativo: Sinal óptico do Meio de Cultivo Baird-Parker

Figura 13. Controle Negativo: Sinal óptico do Meio de Cultivo Trypticase soy blood

agar base

IV-2. Resultados Obtidos dos Ensaios Metodológicos para a Caracterização do

Bacteriosensor

Nesta etapa serão mostrados resultados de testes realizados para a

caracterização do bacteriosensor. Foi usado no esquema de aquisição uma fibra

óptica multimodo (62,5/125 µm). A área sensitiva passou a ser de 40 mm2.

Para caracterizar a sensibilidade do bacteriosensor realizaram-se várias

medidas durante 24 h (1440 minutos), pelo emprego de 13 diferentes concentrações

iniciais (N0), variando de 10 a 800 microrganismos (E. coli O157:H7). As Figuras 14 –

26 mostram gráficos respectivos às concentrações testadas de cada resposta óptica

temporal Iout (t) em unidades arbitrárias. As Linhas 1 e 2 representam o sinal de saída

Iout (t) provenientes das Amostras 1 e 2 . A Linha 3 representa o número estimado de

microrganismos, de acordo com a Equação 6 .

Figura 14. Resposta óptica Iout (t) do bacteriosensor parametrizado por N0 = 10 de E.

coli O157:H7

Figura 15. Resposta óptica Iout (t) do bacteriosensor parametrizado por N0 = 20 de E. coli

O157:H7

Figura 16. Resposta óptica Iout (t) do bacteriosensor parametrizado por N0 = 30 de E. coli O157:H7

Figura 17. Resposta óptica Iout (t) do bacteriosensor parametrizado por N0 = 40 de

E. coli O157:H7


coli O157:H7


coli O157:H7


coli O157:H7

Pela demonstração de reprodutibilidade das curvas nas repostas para

diferentes N0, foram iniciadas análises seqüenciais de cada fase bacteriana obtida pelo

bacteriosensor, relacionando, diretamente, as fases de E. coli O157:H7. O gráfico da

Figura 27 mostra o tempo da fase lag de todos os resultados obtidos. Observe que

esse tempo pouco varia, independentemente do número inicial de bactérias, sendo de

270 ± 4 min.

0 200 400 600 800 10000

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600F

ase

Lag

(min

utos

)

N0

Figura 27. Intervalo de tempo na fase lag ∆∆∆∆tLAG (minutos) versus diferentes N0 de E.

coli O157:H7

A Figura 28 exibe a resposta óptica Iout (t) para N0 = 200, sendo uma curva de

aquisição do bacteriosensor (obtida), outra curva representando o número estimado de

bactérias (calculada) e três linhas representando cada fase de crescimento de E. coli

O157:H7 (fase lag, fase log e fase estacionária) em relação à resposta obtida do

bacteriosensor.

Figura 28. Resposta óptica Iout (t) para N0 = 200 de E.coli O157:H7

Em dados calculados da fase lag de todas as curvas obtidas, a amplitude

máxima de ruído encontrada foi de ∼1,2 dB para N0 = 10, decrescendo com o

incremento de N0 até alcançar ∼ 0,3 dB para N0 = 800.

No início da fase log Iout (t), é demonstrada uma forma derivativa do sinal em

declive (ILOG). Após seu término, obtêm-se o sinal da fase estacionária (ISTAT),

evidenciando um nível DC menor que o nível DC de ILAG.

A partir de análises feitas com cada N0, obteve-se a atenuação óptica ∆∆∆∆IOUT (em

dB). Com análises da largura temporal das declividades (duração da fase log),

evidenciou-se uma variação do tempo de fase log para cada N0 (∆∆∆∆tLOG) em horas. As

medidas indiretas da derivada temporal ββββLOG de Iout (t) na fase log variam com N0,

podendo ser calculado com a Equação 8 , da seguinte forma:

LOG

out0LOG

∆t∆I

)(Nβ ≡ (8)

Na Figura 29 é mostrado um gráfico da sensibilidade do bacteriosensor ββββLOG

(dB/h) com N0 de 10 a 400. Uma linha com um coeficiente de regressão linear de

0,938 ajusta uma curva de calibração ββββLOG(N0) = (∆∆∆∆ββββLOG/∆∆∆∆N0). Concluiu-se que

∆∆∆∆ββββLOG/∆∆∆∆N0 = 0,012 ± 0,001 dB/h/bactéria o que fornece um erro de ~6%.

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 5500

1

2

3

4

5

6

7

8

Sen

sibi

lidad

e na

fase

log

[dB

/h]

N0

Figura 29. Curva de calibração do bacteriosensor. É mostrado a derivada temporal

ββββLOG de Iout (t) na fase log com função de N0

O crescimento bacteriano ocorre indefinidamente, se uma quantidade

adequada de nutrientes for disponibilizada, assim como condições de temperatura, pH

e umidade residual do meio de cultura. Contudo, usando um meio de cultura em uma

placa de Petri é, obviamente, um meio biológico finito e, dessa forma, limita a faixa de

tempo de crescimento. Os primeiros experimentos mostraram que, partindo-se de

concentrações iniciais de 1000 microrganismos, a E. coli O157:H7 continuou em

crescimento, mesmo após 48 h de incubação, o que implica em chegar à fase

estacionária após este período de tempo.

As Figuras 30 (a-f) exibem imagens da interação física bactéria/fibra, obtida

através da microscopia óptica. A prova foi realizada com N0 = 100.

Figura 30-a. Microfotografia óptica de E. coli O157:H7. Aumento de 20 x

Figura 30-b. Microfotografia óptica de E. coli O157:H7. Aumento de 40 x

Figura 30-c. Microfotografia óptica de E. coli O157:H7. Aumento de 80 x

Figura 30-d. Microfotografia óptica de E. coli O157:H7. Aumento de 80 x

Figura 30-e. Microfotografia óptica de E. coli O157:H7. Aumento de 200 x

Figura 30-f. Microfotografia óptica de E. coli O157:H7. Aumento de 800 x

As Figuras 31 (a-d) exibem imagens da interação física bactéria/fibra através

da microscopia eletrônica. A prova foi realizada com N0 = 20 (figuras 31-a e 31-b) e

com N0 = 400 (figuras 31-c e 31-d).

Figura 31-a. Microfotografia eletrônica de E. coli O157:H7 [N0 = 20]. Aumento de 200 x

Figura 31-b. Microfotografia eletrônica de E. coli O157:H7 [N0 = 20]. Aumento de 400 x

Figura 31-c. Microfotografia eletrônica de E. coli O157:H7 [N0 = 400]. Aumento de 800

x

Figura 31-d. Microfotografia eletrônica de E. coli O157:H7 [N0 = 20]. Aumento de 2000 x

IV-3 Resultados Obtidos na Detecção de Legionella pneumophila

IV-3-1. Análises Físico-químicas

A Tabela 3 e a Tabela 4 mostram resultados das análises físico-químicas da

água do Hospital A e do Hospital B .

Tabela 3 . Resultados das análises físico-químicas da água do Hospital A

Hospital A

Coleta n °°°°

Análises 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sólidos totais 865 943 110

5

1145 997 980 880 910 940 935

Ferro 0,5 0,4 0,5 0,61 0,5

6

0,46 0,7

7

0,6

4

0,44 0,33

Cobre 0,3

6

0,41 0,1

5

0,22 0,3

1

0,33 0,4 0,2

2

0,38 0,21

Cálcio 107 88 61 60 82 93 87 91 64 93

Cloro 0,8 1,2 0,6 0,5 1,3 1,5 1,4 1,9 1,1 1,6

Zinco 2,2 1,7 1,3 0,9 3,1 2,3 2,2 4,1 1,8 0,9

Magnésio 88 96 187 192 98 66 133 157 161 113

Sulfato 188 170 125 222 234 190 201 216 178 165

Carbono orgânico

total

0,9 0,6 0,3 0,88 1,2

3

1,11 0,9

8

1,0

3

1,33 0.88

Cloretos 134 122 156 141 98 101 57 49 67 73

Nitrato+nitrito 33 22 28 31 17 42 35 61 40 37

Dureza 34 12 17 19 23 14 8 22 17 14

pH 6,7 6,1 6,3 6,6 5,8 5,6 6,3 6,0 5,7 5,5

Tabela 4 . Resultados das análises físico-químicas da água do Hospital B

Hospital B

Coleta n °°°°

Análises 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sólidos totais 480 550 605 588 493 555 603 662 545 679

Ferro 0,22 0,31 0,17 0,12 0,16 1,2 0,4

7

0,98 0,8

7

0,6

6

Cobre 0,06 0,04 0,05 0,14 0,12 0,2

1

0,2 0,23 0,2

2

0,1

8

Cálcio 65 73 78 85 61 102 99 134 147 151

Cloro 1,5 1,8 1,6 1,2 1,5 0,8 1,0 0,9 1,1 1,4

Zinco 0,11 0,16 0,38 0,25 0,34 0,4

1

0,5

2

0,99 1,1 0,9

Magnésio 127 98 106 88 134 166 157 144 119 163

Sulfato 188 133 145 178 222 210 98 94 123 65

Carbono orgânico

total

0,1 0,22 0,16 0,08 0,12 0,3

4

0,4

5

0,31 0,1

6

0,2

Cloretos 110 93 99 82 78 110 102 134 56 69

Nitrato+nitrito 23 33 49 51 63 32 47 56 45 38

Dureza 23 22 15 19 28 25 11 9 19 26

pH 6,0 6,2 6,1 5,7 6,3 6,4 6,2 5,6 6,0 5,9

IV-3-2. Análises Colimétricas

Os resultados das análises colimétricas do hospital A são expressas na Tabela

5 e os resultados das análises colimétricas do hospital B são expressas na Tabela 6.

Tabela 5. Resultados das análises colimétricas do hospital A

Hospital A

Coleta

n°

Coliformes

totais/100 ml

Coliformes

fecais/100 ml

1 2 1

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

6 0 0

7 1 0

8 0 0

9 2 1

10 0 0

Tabela 6. Resultados das análises coliméticas do hospital B

Hospital B

Coleta

n°

Coliformes

totais/100 ml

Coliformes

fecais/100 ml

1 0 0

2 1 0

3 4 2

4 2 1

5 7 3

6 13 7

7 0 0

8 3 1

9 5 4

10 1 0

IV-3-3. Isolamento de Legionella pneumophila

Espécies de Legionella Isoladas nos Hospitais Pesquisados

Legionella spp. foram isoladas em 60% das amostras coletas no Hospital A e

100% das amostras coletadas no Hospital B . No Hospital A isolou-se: Legionella

bozemanii, Legionella anisa, Legionella micdadei e Legionella pneumophila

sorogrupos 1 , 3 e 4. No Hospital B isolou-se: Legionella micdadei e Legionella

pneumophila sorogrupo 1. A Tabela 7 exprime os resultados das análises de pesquisa

de isolamento de L. pneumophila sorogrupo 1 , no Hospital A e no Hospital B .

Tabela 7. Resultados das análises da água para Legionella pneumophila sorogrupo 1

nos Hospitais A e B

Hospital A Hospital B

Coleta n° CFU/ litro de L. pneumophila sorogrupo 1

1 0 2,3 x 105

2 0 4,0 x 102

3 1,2 x 103 5,1 x 104

4 0,4 x 102 3,2 x 105

5 0 3,9 x 103

6 1,1 x 103 5,3 x 104

7 2,5 x 104 4,2 x 103

8 0 1,8 x 104

9 0,3 x 102 2,4 x 105

10 2,2 x 104 6,6 x 106

Resultados dos Testes Ópticos

Na Figura 32 é mostrada a resposta óptica (controle negativo) do meio de

cultura BCYE agar base. As Figuras 33-35 representam duas respostas ópticas para

cada teste de detecção de L. pneumophila sorogrupo 1 com N0 = 100, N0 = 500 e N0 =

1000, respectivamente. A Linha 1 diz respeito ao primeiro teste óptico e a Linha 2 ao

segundo teste óptico.

Figura 32. Controle Negativo: Sinal óptico do meio de cultivo BCYE agar base


Legionella pneumophila





IV-4. Espalhamento de Luz: Aspectos da Teoria Mie

Este tópico descreve a possibilidade de uso de novo método para

predição de células microbianas, através de parâmetros biológicos com base nos

perfis de espalhamento de luz. Enfoca, ainda, considerações preliminares e discute

resultados teóricos impulsionados pelas novas diretrizes de pesquisa envolvendo o

espalhamento de luz em meios biológicos.

Recentes trabalhos têm sugerido que o uso da espectroscopia do

espalhamento de luz pode proporcionar um método valioso, não-invasivo para

diagnóstico morfológico de tecidos, diferenciando tecidos normais de acometidos por

alguma anomalia em diferentes materiais biológicos, tais como: pele, bexiga e cólon

[143-145]. Os métodos ópticos são muito poderosos para medidas não-invasivas de

amostras biológicas. Porém, as medidas quantitativas são muito duras, porque as

amostras biológicas vivas são normalmente turvas, e isto torce os parâmetros ópticos

observáveis. Superar estes problemas impele investigações do transporte de fóton em

meios turvos [146].

Quando o transporte de luz é descrito por uma equação de transporte, adquiri-

se um perfil temporal da intensidade I(t) da luz como I(t) = Io(t)exp(-uvt) onde u é o

coeficiente de absorção, v é a velocidade da luz e Io(t) é o perfil temporal com

ausência da absorção. Assim, é extraída a absorbância do perfil temporal da luz. Há

muitos caminhos de fótons que atravessam meios turvos e uma luz pulsada é alargada

por estes. O perfil temporal da intensidade da luz espalhada reflete o caminho da

distribuição no meio. Quando a absorção do meio aumenta, a intensidade da luz se

atenua e a atenuação é forte ao longo de caminhos mais longos (Figura 36 ).

.

Figura 36 . Diagrama esquemático de Espalhamento e Absorção

A natureza da luz sempre foi um dos temas que chamaram a atenção dos

grandes cientistas desde a antigüidade (300 a. C.), com Euclides, até Einstein e

Planck, no século XX. Hoje em dia, duas teorias que explicam a natureza da luz são

aceitas: a teoria corpuscular e a teoria ondulatória. Na teoria ondulatória, a luz é

tratada como campos eletromagnéticos oscilantes propagando-se no espaço. Essa

teoria explica fenômenos como reflexão, refração, difração. Na teoria corpuscular, a

luz é tratada como pacotes de energia chamados fótons. Essa teoria explica

fenômenos como o efeito Compton e o desvio do raio luminoso ao passar perto de

corpos celestes.

Quando se leva em conta a teoria ondulatória, a luz é regida pelas equações

de Maxwell. Assim, se resolverem-se as equações de Maxwell para as condições

(chamadas condições de contorno) da fibra óptica, que é um guia de onda, tais como

diâmetro do núcleo, comprimento de onda, abertura numérica, etc., encontra-se um

certo número de soluções finitas. Dessa maneira, a luz que percorre a fibra óptica não

se propaga aleatoriamente, mas é canalizada em certos modos especiais, como nas

fibras ópticas multimodo utilizadas no bacteriosensor.

Modo de propagação é, portanto, uma onda com determinada distribuição de

campo eletromagnético que satisfaça as equações de Maxwell e que transporta uma

parcela individual (mas não igual) da energia luminosa total transmitida. Esses modos

podem ser entendidos e representados como sendo os possíveis caminhos que a luz

pode ter no interior do núcleo. Numa fibra óptica, o número de modos está relacionado

com a freqüência normalizada V que é uma grandeza definida por:

Va AN= ⋅ ⋅ ⋅2 πλ

(9)

onde:

• a é o raio do núcleo

• λλλλ é o comprimento de onda

• AN é a abertura numérica

Para fibras de índice gradual a relação entre a freqüência normalizada e o número de

modos M é dada por:

4

2VM = (10)

Em um estudo piloto sobre a quantificação de bactérias em suspensão via

multi-ângulos gerados pelo espalhamento da luz, JONES et al. [147] abordam que a

intensidade do espalhamento da luz em provas microbianas é dependente (não-

linearmente) de vários fatores, tais como: o comprimento de onda, o tamanho relativo

do espalhamento e a diferença entre o índice de refração do microrganismo e o do

meio.

O espalhamento é o mecanismo de atenuação que causa desvio de parte da

energia luminosa guiada pelos vários modos de propagação para outras direções. A

atenuação do sinal óptico provocado pelas bactérias em crescimento exprime o

espalhamento Mie, tendo-se como suporte os achados de BURMEISTER &

MASCHKE, YGUERABIDE & YGUERABIDE, QUINTEN et al., SORENSEN &

FISCHBACH [148-151]. Ocorre, principalmente, devido a não homogeneidade

microscópica de flutuações de disposição de partículas esféricas e coeficiente de

extinção de ondas evanescentes, que é uma dedução atribuída a GUSTAV MIE

(Prêmio Nobel de Física, 1908). Fica também evidenciado um efeito óptico linear onde

há transferência de potência de modos guiados para modos vazados ou radiantes, no

mesmo comprimento onda, ocorrendo, principalmente, na direção de propagação da

luz [152].

Pelo fato do uso de provas de espalhamento Mie com microrganismos como

medida de crescimento [147] e, principalmente, com células/tecidos biológicos [153-

162], buscou-se simular condições preliminares de observação do comportamento de

dois microrganismos utilizados na Tese (E. coli O157:H7 e L. pneumophila) em provas

de espalhamento Mie. Estes procedimentos pretendem discutir a possibilidade de, em

futuro próximo, ter-se uma diretriz de estudo de espalhamento Mie de forma a

evidenciar, assim, uma assinatura óptica individualizada por tipo de microrganismo. O

programa de modelagem da teoria Mie foi empreendido para uma análise do

espalhamento angular [163]. Parâmetros utilizados: raio, comprimento de onda, índice

de refração no meio, índice de refração da partícula e índice de refração imaginário.

Na modelagem angular da teoria Mie com E. coli O157:H7, objetivou-se estimar

a assinatura óptica de E. coli O157:H7. A Figura 37 mostra o espalhamento angular

de E. coli O157:H7.

Dados:

====================================

Mie calculation Input parameters: wavelength = 0.84000 radius = 1.50000 ref. index = 1.45000 +i 0.00000 ref. index of medium = 1.53000 Angular scattering 1. column: angle in degrees 2. column: perpendicular polarization 3. column: parallel polarization ==================================== 0.0 2.29915E+04 2.29915E+04 1.0 2.25957E+04 2.25850E+04 2.0 2.14434E+04 2.14029E+04 3.0 1.96356E+04 1.95523E+04 4.0 1.73263E+04 1.71958E+04 5.0 1.47032E+04 1.45307E+04 6.0 1.19656E+04 1.17642E+04 7.0 9.30168E+03 9.08982E+03 8.0 6.86910E+03 6.66675E+03 9.0 4.78179E+03 4.60648E+03 10.0 3.10323E+03 2.96699E+03 11.0 1.84730E+03 1.75493E+03 12.0 9.85304E+02 9.34305E+02 13.0 4.57483E+02 4.39458E+02 14.0 1.86585E+02 1.89667E+02 15.0 9.12275E+01 1.02908E+02 16.0 9.70691E+01 1.06739E+02 17.0 1.44507E+02 1.45205E+02 18.0 1.92409E+02 1.81495E+02 19.0 2.18145E+02 1.96906E+02 20.0 2.14730E+02 1.87184E+02 21.0 1.86256E+02 1.57549E+02 22.0 1.42812E+02 1.17665E+02 23.0 9.59191E+01 7.74735E+01 24.0 5.51800E+01 4.44656E+01 25.0 2.64320E+01 2.24681E+01 26.0 1.13444E+01 1.17413E+01 27.0 8.11780E+00 9.93665E+00 28.0 1.28158E+01 1.34215E+01 29.0 2.08470E+01 1.85348E+01 30.0 2.82136E+01 2.24859E+01 31.0 3.22961E+01 2.37764E+01 32.0 3.21091E+01 2.21767E+01 33.0 2.81032E+01 1.83916E+01 34.0 2.16737E+01 1.35866E+01 35.0 1.45671E+01 8.93552E+00 36.0 8.35128E+00 5.29816E+00 37.0 4.06031E+00 3.07410E+00 38.0 2.05703E+00 2.21983E+00 39.0 2.09269E+00 2.37851E+00 40.0 3.50233E+00 3.05622E+00 41.0 5.45631E+00 3.78539E+00 42.0 7.19439E+00 4.23591E+00 43.0 8.19039E+00 4.25942E+00 44.0 8.22424E+00 3.87393E+00 45.0 7.36573E+00 3.20972E+00 46.0 5.89402E+00 2.44179E+00 47.0 4.18634E+00 1.73027E+00 48.0 2.60863E+00 1.18240E+00 49.0 1.43288E+00 8.39486E-01 50.0 7.93804E-01 6.85099E-01 51.0 6.85767E-01 6.65857E-01 52.0 9.91615E-01 7.15627E-01 53.0 1.52988E+00 7.75635E-01 54.0 2.10604E+00 8.06466E-01 55.0 2.55600E+00 7.91287E-01 56.0 2.77429E+00 7.32234E-01 57.0 2.72461E+00 6.43130E-01 58.0 2.43419E+00 5.41683E-01 59.0 1.97677E+00 4.43430E-01 60.0 1.44969E+00 3.58472E-01 61.0 9.50785E-01 2.90889E-01 62.0 5.59423E-01 2.40048E-01 63.0 3.24292E-01 2.02700E-01 64.0 2.58878E-01 1.74972E-01 65.0 3.44021E-01 1.53682E-01 66.0 5.35862E-01 1.36833E-01 67.0 7.76964E-01 1.23454E-01 68.0 1.00823E+00 1.13113E-01 69.0 1.17954E+00 1.05414E-01 70.0 1.25749E+00 9.96853E-02 71.0 1.22943E+00 9.49453E-02 72.0 1.10341E+00 9.00726E-02 73.0 9.04719E-01 8.40800E-02 74.0 6.69744E-01 7.63599E-02 75.0 4.38614E-01 6.68161E-02 76.0 2.47846E-01 5.58519E-02 77.0 1.24306E-01 4.42365E-02 78.0 8.13441E-02 3.29031E-02 79.0 1.17572E-01 2.27416E-02 80.0 2.18265E-01 1.44336E-02 81.0 3.58916E-01 8.35797E-03 82.0 5.10148E-01 4.56988E-03 83.0 6.43039E-01 2.83873E-03

84.0 7.33933E-01 2.72473E-03 85.0 7.67951E-01 3.67180E-03 86.0 7.40759E-01 5.10064E-03 87.0 6.58436E-01 6.49112E-03 88.0 5.35652E-01 7.44814E-03 89.0 3.92620E-01 7.74688E-03 90.0 2.51418E-01 7.35435E-03 91.0 1.32355E-01 6.42411E-03 92.0 5.09487E-02 5.26305E-03 93.0 1.59286E-02 4.27195E-03 94.0 2.84742E-02 3.86689E-03 95.0 8.26756E-02 4.39286E-03 96.0 1.67014E-01 6.04482E-03 97.0 2.66530E-01 8.81160E-03 98.0 3.65275E-01 1.24557E-02 99.0 4.48661E-01 1.65351E-02 100.0 5.05374E-01 2.04671E-02 101.0 5.28631E-01 2.36230E-02 102.0 5.16674E-01 2.54389E-02 103.0 4.72536E-01 2.55233E-02 104.0 4.03181E-01 2.37401E-02 105.0 3.18231E-01 2.02544E-02 106.0 2.28479E-01 1.55296E-02 107.0 1.44429E-01 1.02776E-02 108.0 7.50348E-02 5.36766E-03 109.0 2.67747E-02 1.70940E-03 110.0 3.14033E-03 1.26916E-04 111.0 4.53847E-03 1.24305E-03 112.0 2.85695E-02 5.38999E-03 113.0 7.05953E-02 1.25581E-02 114.0 1.24492E-01 2.23888E-02 115.0 1.83474E-01 3.42106E-02 116.0 2.40885E-01 4.71122E-02 117.0 2.90878E-01 6.00416E-02 118.0 3.28913E-01 7.19184E-02 119.0 3.52057E-01 8.17450E-02 120.0 3.59079E-01 8.87046E-02 121.0 3.50357E-01 9.22357E-02 122.0 3.27639E-01 9.20779E-02 123.0 2.93708E-01 8.82854E-02 124.0 2.51988E-01 8.12107E-02 125.0 2.06156E-01 7.14618E-02 126.0 1.59782E-01 5.98399E-02 127.0 1.16043E-01 4.72660E-02 128.0 7.75072E-02 3.47025E-02 129.0 4.60192E-02 2.30789E-02 130.0 2.26597E-02 1.32267E-02 131.0 7.78358E-03 5.82765E-03 132.0 1.11283E-03 1.37896E-03 133.0 1.86722E-03 1.74855E-04 134.0 8.91347E-03 2.30492E-03 135.0 2.09158E-02 7.66647E-03 136.0 3.64743E-02 1.59885E-02 137.0 5.42400E-02 2.68633E-02 138.0 7.30028E-02 3.97834E-02 139.0 9.17487E-02 5.41794E-02 140.0 1.09687E-01 6.94562E-02 141.0 1.26256E-01 8.50261E-02 142.0 1.41104E-01 1.00337E-01 143.0 1.54059E-01 1.14893E-01 144.0 1.65093E-01 1.28272E-01 145.0 1.74278E-01 1.40132E-01 146.0 1.81750E-01 1.50216E-01 147.0 1.87673E-01 1.58352E-01 148.0 1.92209E-01 1.64446E-01 149.0 1.95504E-01 1.68476E-01 150.0 1.97670E-01 1.70484E-01 151.0 1.98781E-01 1.70560E-01 152.0 1.98875E-01 1.68839E-01 153.0 1.97959E-01 1.65487E-01 154.0 1.96014E-01 1.60692E-01 155.0 1.93010E-01 1.54655E-01 156.0 1.88912E-01 1.47586E-01 157.0 1.83697E-01 1.39693E-01 158.0 1.77362E-01 1.31183E-01 159.0 1.69929E-01 1.22252E-01 160.0 1.61457E-01 1.13083E-01 161.0 1.52044E-01 1.03849E-01 162.0 1.41823E-01 9.47022E-02 163.0 1.30966E-01 8.57785E-02 164.0 1.19674E-01 7.71946E-02 165.0 1.08169E-01 6.90479E-02 166.0 9.66840E-02 6.14158E-02 167.0 8.54521E-02 5.43563E-02 168.0 7.46919E-02 4.79091E-02 169.0 6.45978E-02 4.20961E-02 170.0 5.53296E-02 3.69235E-02 171.0 4.70057E-02 3.23835E-02 172.0 3.96996E-02 2.84569E-02 173.0 3.34401E-02 2.51156E-02 174.0 2.82157E-02 2.23255E-02 175.0 2.39821E-02 2.00493E-02 176.0 2.06722E-02 1.82496E-02 177.0 1.82083E-02 1.68912E-02 178.0 1.65140E-02 1.59443E-02 179.0 1.55257E-02 1.53857E-02 180.0 1.52012E-02 1.52012E-02

Figura 37. Espalhamento angular – E. coli O157:H7

O mesmo procedimento foi feito com L. pneumophila na modelagem angular

com base na teoria Mie. Objetivou-se também a obtenção preliminar de uma

assinatura óptica de L. pneumophila. Os cálculos foram realizados pelo programa de

simulação. A Figura 38 mostra o espalhamento angular de L. pneumophila.

Dados: ================================== Mie calculation Input parameters: wavelength = 0.84000 radius = 3.00000 ref. index = 1.45000 +i 0.00000 ref. index of medium = 1.53000 Angular scattering 1. column: angle in degrees 2. column: perpendicular polarization 3. column: parallel polarization 0.0 7.80775E+05 7.80775E+05 1.0 7.25355E+05 7.24927E+05 2.0 5.79005E+05 5.77682E+05 3.0 3.91386E+05 3.89531E+05 4.0 2.17869E+05 2.16381E+05 5.0 9.56693E+04 9.52393E+04

6.0 3.28823E+04 3.34647E+04 7.0 1.39191E+04 1.48356E+04 8.0 1.47281E+04 1.52582E+04 9.0 1.70283E+04 1.69353E+04 10.0 1.41375E+04 1.37138E+04 11.0 8.12390E+03 7.81227E+03 12.0 3.31689E+03 3.31134E+03 13.0 1.66422E+03 1.82613E+03 14.0 2.12290E+03 2.20411E+03 15.0 2.67674E+03 2.57552E+03 16.0 2.29656E+03 2.11078E+03 17.0 1.31640E+03 1.19893E+03 18.0 5.54689E+02 5.55491E+02 19.0 3.91630E+02 4.37197E+02 20.0 5.86511E+02 5.81661E+02 21.0 7.06855E+02 6.31753E+02 22.0 5.70944E+02 4.81781E+02 23.0 3.12764E+02 2.68768E+02 24.0 1.46569E+02 1.51426E+02 25.0 1.43613E+02 1.54564E+02 26.0 2.13871E+02 1.93819E+02 27.0 2.38333E+02 1.90513E+02 28.0 1.83300E+02 1.39000E+02 29.0 1.01463E+02 8.33959E+01 30.0 5.65368E+01 5.86601E+01 31.0 6.29477E+01 6.23321E+01 32.0 8.81234E+01 7.03382E+01 33.0 9.47935E+01 6.57095E+01 34.0 7.39980E+01 4.99347E+01 35.0 4.39378E+01 3.41675E+01 36.0 2.66161E+01 2.61133E+01 37.0 2.84294E+01 2.52741E+01 38.0 3.90585E+01 2.65962E+01 39.0 4.40063E+01 2.58164E+01 40.0 3.71421E+01 2.18962E+01 41.0 2.36722E+01 1.64632E+01 42.0 1.36276E+01 1.20219E+01 43.0 1.28554E+01 1.01922E+01 44.0 1.88672E+01 1.06880E+01 45.0 2.40101E+01 1.16176E+01 46.0 2.24754E+01 1.10378E+01 47.0 1.49992E+01 8.57562E+00 48.0 7.55468E+00 5.65510E+00 49.0 5.65798E+00 4.09557E+00 50.0 9.56102E+00 4.42600E+00 51.0 1.44638E+01 5.51425E+00 52.0 1.51730E+01 5.75888E+00 53.0 1.07302E+01 4.58153E+00 54.0 4.90154E+00 2.80392E+00 55.0 2.43531E+00 1.70804E+00 56.0 4.77218E+00 1.82357E+00 57.0 9.05202E+00 2.57765E+00 58.0 1.09904E+01 2.97580E+00 59.0 8.73669E+00 2.52986E+00 60.0 4.25525E+00 1.57633E+00 61.0 1.28246E+00 8.29526E-01 62.0 1.96571E+00 7.07637E-01 63.0 5.18838E+00 1.04876E+00 64.0 7.81664E+00 1.36726E+00 65.0 7.50526E+00 1.31519E+00 66.0 4.55966E+00 9.24878E-01 67.0 1.42734E+00 4.91428E-01 68.0 5.01061E-01 2.79427E-01 69.0 2.19905E+00 3.28966E-01 70.0 4.82457E+00 4.83991E-01 71.0 6.11065E+00 5.59980E-01 72.0 5.04575E+00 4.85375E-01 73.0 2.53318E+00 3.19620E-01 74.0 5.13659E-01 1.71639E-01 75.0 3.94823E-01 1.08422E-01 76.0 2.04656E+00 1.22148E-01 77.0 4.04317E+00 1.59952E-01 78.0 4.83079E+00 1.74379E-01 79.0 3.86504E+00 1.52219E-01 80.0 1.90472E+00 1.09562E-01 81.0 3.49776E-01 6.91815E-02 82.0 1.99613E-01 4.29615E-02 83.0 1.40003E+00 2.97052E-02 84.0 2.98262E+00 2.32238E-02 85.0 3.80852E+00 1.97659E-02 86.0 3.34487E+00 1.88962E-02 87.0 1.95419E+00 2.00877E-02 88.0 5.66312E-01 2.06785E-02 89.0 2.21411E-02 1.77921E-02 90.0 5.51241E-01 1.17366E-02 91.0 1.69598E+00 6.62465E-03 92.0 2.67043E+00 6.87891E-03 93.0 2.87413E+00 1.26960E-02 94.0 2.22750E+00 1.90242E-02 95.0 1.15425E+00 1.96874E-02 96.0 2.73610E-01 1.35404E-02 97.0 2.49870E-02 7.22693E-03 98.0 4.49212E-01 1.13989E-02 99.0 1.22265E+00 3.24564E-02 100.0 1.88211E+00 6.58440E-02 101.0 2.08574E+00 9.64622E-02 102.0 1.76637E+00 1.06995E-01 103.0 1.11950E+00 8.92858E-02 104.0 4.65735E-01 5.13614E-02 105.0 8.12566E-02 1.50562E-02 106.0 8.33010E-02 4.94188E-03 107.0 4.09870E-01 3.46271E-02 108.0 8.79203E-01 9.81983E-02 109.0 1.28355E+00 1.71722E-01 110.0 1.47096E+00 2.24180E-01 111.0 1.38817E+00 2.32241E-01

112.0 1.08131E+00 1.91499E-01 113.0 6.66093E-01 1.18905E-01 114.0 2.83703E-01 4.55964E-02 115.0 5.64289E-02 3.78991E-03 116.0 5.27256E-02 1.37045E-02 117.0 2.68805E-01 7.58969E-02 118.0 6.31084E-01 1.71599E-01 119.0 1.01965E+00 2.70192E-01 120.0 1.30684E+00 3.40357E-01 121.0 1.39908E+00 3.60588E-01 122.0 1.26772E+00 3.25598E-01 123.0 9.57600E-01 2.47052E-01 124.0 5.70006E-01 1.49129E-01 125.0 2.26672E-01 6.08756E-02 126.0 2.83733E-02 7.94721E-03 127.0 2.33931E-02 6.03011E-03 128.0 1.96409E-01 5.74407E-02 129.0 4.79872E-01 1.51348E-01 130.0 7.81378E-01 2.67133E-01 131.0 1.01540E+00 3.79733E-01 132.0 1.12772E+00 4.65546E-01 133.0 1.10548E+00 5.07509E-01 134.0 9.71993E-01 4.98323E-01 135.0 7.71630E-01 4.41329E-01 136.0 5.52138E-01 3.49086E-01 137.0 3.51410E-01 2.40215E-01 138.0 1.92019E-01 1.35364E-01 139.0 8.29829E-02 5.32315E-02 140.0 2.53857E-02 7.42757E-03 141.0 1.78241E-02 4.67517E-03 142.0 5.89529E-02 4.44740E-02 143.0 1.46620E-01 1.20049E-01 144.0 2.75045E-01 2.20181E-01 145.0 4.32313E-01 3.31433E-01 146.0 6.00023E-01 4.40328E-01 147.0 7.55666E-01 5.35133E-01 148.0 8.77004E-01 6.07062E-01 149.0 9.46886E-01 6.50858E-01 150.0 9.56907E-01 6.64800E-01 151.0 9.08850E-01 6.50277E-01 152.0 8.13650E-01 6.11081E-01 153.0 6.88401E-01 5.52568E-01 154.0 5.52312E-01 4.80845E-01 155.0 4.22711E-01 4.02054E-01 156.0 3.11991E-01 3.21841E-01 157.0 2.26082E-01 2.45010E-01 158.0 1.64617E-01 1.75372E-01 159.0 1.22547E-01 1.15716E-01 160.0 9.26599E-02 6.78897E-02 161.0 6.83059E-02 3.28949E-02 162.0 4.56088E-02 1.09886E-02 163.0 2.46346E-02 1.74967E-03 164.0 9.21197E-03 4.12099E-03 165.0 5.44116E-03 1.64457E-02 166.0 1.92758E-02 3.65309E-02 167.0 5.38823E-02 6.17691E-02 168.0 1.07656E-01 8.93339E-02 169.0 1.73685E-01 1.16444E-01 170.0 2.41040E-01 1.40661E-01 171.0 2.97606E-01 1.60159E-01 172.0 3.33544E-01 1.73923E-01 173.0 3.44085E-01 1.81806E-01 174.0 3.30627E-01 1.84444E-01 175.0 2.99747E-01 1.83051E-01 176.0 2.60676E-01 1.79144E-01 177.0 2.22406E-01 1.74264E-01 178.0 1.91630E-01 1.69759E-01 179.0 1.72151E-01 1.66643E-01 180.0 1.65536E-01 1.65536E-01

Figura 38. Espalhamento angular – L. pneumophila

CAPÍTULO VI

CONCLUSÕES e SUGESTÕES

Embora o bacteriosensor aqui descrito tenha demonstrado grande potencial,

algumas desvantagens devem ser apontadas, tais como:

� Só uma cepa bacteriana é possível de ser mensurada. Isto significa que a

monitoração de patógenos diferentes irá requerer sistemas individuais para

cada uma. Uma aproximação para superar esta limitação seria a

miniaturização da área sensitiva, de tal forma que a detecção pudesse ser

multiplexada. Sistemas possíveis: WDM (Wavelenght Division Multiplexing) que

é uma multiplexação óptica em comprimento de onda ou SDM (Space Division

Multiplexing) que é uma multiplexação por divisão no espaço.

� Requer do operador boa prática de manipulação microbiológica.

� A miniaturização do protótipo colide, ainda, com o fato de não se ter nesse

momento um substrato de crescimento bacteriano mantenedor de umidade (na

forma de filme fino), fundamental para o transporte ativo de nutrientes para o

interior da célula.

Entretanto, acena o futuro com uma possibilidade bastante interessante de

utilização de fibras ópticas plásticas (POFs) no sensoriamento biológico, por

permitirem variadas manipulações, além do fato de serem mais resistentes a

manipulações. Recentemente foram introduzidos experimentos piloto com POFs [172]

e, fundamentalmente, estes serão inseridos nos trabalhos futuros com sensores

biológicos.

Existe o interesse por metodologias de diagnóstico rápido de infecções

oportunistas, como as pneumonias em pacientes pós-operados, constituindo-se em

19% de todas as infecções hospitalares, sendo as mais fatais. O problema de

infecções hospitalares assume também grande relevância para pacientes no CTI.

Nestes pacientes, a incidência chega a 40% e a taxa de mortalidade a 47%,

diferentemente da taxa de mortalidade de 13% de pacientes não-infectados [2]. Estes

dados demonstram falha nos métodos de controle antiinfecciosos.

Segundo ZANON [173], a rede hospitalar brasileira, no que diz respeito ao

controle de infecções hospitalares, tem graves problemas com surtos epidêmicos

constantes, advindos das mais variadas causas e, por conseguinte, as taxas de

morbidade e letalidade em números bastantes expressivos. Reitera, ainda, a

priorização quanto ao grau de desenvolvimento técnico de cada unidade hospitalar, e

procedimentos com estreitas normas de segurança ambiental.

Esta Tese também se insere nos apelos dos órgãos institucionais

governamentais da área da saúde, respaldando-se em duas leis, fundamentais, para

as ações gestoras de saúde. A promulgação da lei 8.080 que instituiu, em 1990, o

Sistema Único de Saúde – SUS [174], a qual teve importantes desdobramentos em

termos de explicitar a importância de pesquisas continuadas na busca de resolver as

incidências de acometimentos na área da saúde, conceitua-se como “um conjunto de

ações que proporciona o conhecimento, a detecção ou prevenção de qualquer

mudança nos fatores determinantes e condicionantes de saúde individual ou coletiva,

com a finalidade de recomendar e adotar as medidas de prevenção e controle das

doenças ou agravos”. Baseia-se, ainda, nos dados da Norma Operacional Básica do

Sistema de Saúde [175]: “O direito à saúde, o que significa que cada um e todos os

brasileiros devem construir e usufruir de políticas públicas – econômicas e sociais –

que reduzam riscos e agravos à saúde”, no que tange ao acesso universal e eqüânime

a serviços e ações de promoção, proteção e recuperação da saúde.

A detecção de microrganismos patogênicos, em tempo real, é um problema

altamente complexo e, inegavelmente, requerendo esforços multidisciplinares.

Investigações adicionais, empregando tecnologia óptica, são fundamentais para

melhorar várias características do bacteriosensor em estudo, podendo destacar,

dentre outras, sua possível aplicabilidade a outros microrganismos e ambientes.

Crê-se que os resultados aqui apresentados [61,62,81-83,176-180] e os

desdobramentos que advirão poderão contribuir, significativamente, para a solução

real de monitoramento e diagnóstico de patógenos, abrandando muitos dentre vários

problemas de Saúde Pública.

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A N E X O 1

A N E X O 2

Composição do meio de cultura Baird-Parker Agar Base

Baird-Parker Agar Base

Composição por litro

Agar 17,0 g

Glicina 12,0 g

Piruvato de Sódio 10,0 g

Digesto pancreático de caseína 10,0 g

Extrato de carne 5,0g

LiCl 5,0 g

Extrato de levedura 1,0 g

Solução de sulfametazona 10 ml

pH 7.0 ± 0.2 a 25°C

Composição do meio de cultura Trypticase soy blood Agar Base

Trypticase Soy Agar Blood Agar



Agar 15,0 g

Digesto papaíco de soja 5,0 g

NaCl 5,0 g

Sangue de carneiro desfibrinado 50 ml

pH 7.3 ± 0.2 a 25°C

Composição do meio de cultura Sorbitol MacConkey Agar

Sorbitol MacConkey Agar


Peptona 20,0 g

Agar 15,0 g

Sorbitol 10,0 g

NaCl 5,0 g

Sais de bile N° 3 1,5 g

Vermelho neutro 0,03 g

Cristal violeta 1,0 mg

pH 7.1 ± 0.2 a 25°C

Composição do meio de cultura Endo Broth

Endo Broth


Lactose 12,5

g

Peptone 10,0

g

NaCl 5,0

g


Digesto péptico de tecido animal 5,0 g

K2HPO4 4,375

g

Na2SO3 2,1

g


KH2PO4 1,375

g

Fucsina básica 1,05

g

Deoxicolato de sódio 0,1 g

Etanol (solução 95%) 20,0 ml

pH 7.2 ± 0,2 a 25°C

Composição do meio de cultura FC Broth

FC Broth


Lactose

12,5 g

Triptose

10,0 g

NaCl 5,0

g

Proteose peptone No. 3 5,0

g


Sais de bile 1,5

g

Anilina azul 0,1

g

Solução ácida rosólica 10,0

ml

pH 7.4 ± 0,2 a 25°C

Composição do Tampão HCl-KCl

Tampão HCl-KCl (pH 2,2)

3,9 ml 1,2 M HCl

2,5 ml 0,2 M KCl

Composição do meio de cultura BCYE Selective Agar with GVPC (Buffered Charcoal

Yeast Extract Selective Agar with Glycine, Vancomycin, Polymixin B, and

Cyclohexomide)

BCYE Selective Agar with GVPC Composição por 1014 ml

Agar 15,0 g


ACES buffer (2-[2-Amino-2-oxoethyl)-

amino]-ethane sulfonic acid 10,0 g

Carvão ativado 2,0 g

α-Cetoglutarato 1,0 g

Fe4(P2O7)3.9H2O 0,25 g

Solução de antibióticos 10,0 ml

Solução L-Cisteína-HCL-H2O 4 ml

pH 6,9 ± 0,2 a 25°C

Composição da solução L-Cisteína-HCL-H 2O

Solução L-Cisteína-HCL-H 2O

Composição por 10 ml

L-Cisteína-HCL-H2O 1,0 g

Composição da Solução de antibióticos

Solução de antibióticos

Composição por 10 ml

Glicina 3,0 g

Cicloheximida 0,08 g

Vancomicina 1,0 mg

Polimixina B 79200 U

Composição do meio de cultura BCYE Agar (Buffered C harcoal Yeast Extract

Agar)

BCYE Agar


Agar 15,0 g


ACES buffer (2-[2-Amino-2-oxoethyl)-

amino]-ethane sulfonic acid 10,0 g

Carvão ativado 2,0 g

α-Cetoglutarato 1,0 g

L-Cisteína-HCL-H2O 0,4 g

Fe4(P2O7)3.9H2O 0,25 g

pH 6.9 ± 0.2 a 25°C

Composição do meio de cultura Mueller-Hinton Broth (BBL Microbiology

systems, Difco)

Mueller-Hinton Broth


Hidrolisado ácido de caseína 17,5 g

Extrato de carne 3,0 g

Amido 1,5 g

PH 7.3 ± 0.1 a 25°C

A N E X O 3

Aspectos Teóricos do espalhamento Mie

A solução do espalhamento Mie inicia-se com a discretização das Equações de Maxwell

no domínio do tempo. Usando a representação complexa de vetores de indução elétrica (E) e de

indução magnética (H) as Equações de Maxwell assumem a forma:

(11)

(12)

(13)

(14)

Definindo:

(15)

as equações de onda dos vetores elétricos e magnéticos se tornam:

(16)

(17)

Segundo SORENSEN & FISCHBACH [151], para obter-se a solução da equação de

onda escalar, desde que assumido que a partícula tem simetria esférica, coordenadas esféricas

são a escolha óbvia. Por outro lado, fica evidenciado que o espalhamento ocorrendo para outras

formas de partículas, possa ser resolvido nesta conjuntura pela escolha de um sistema de

coordenada na qual a forma de partícula tenha assumido uma forma particularmente simples.

Assim, assumindo uma simetria esférica, podemos fazer uma separação direta de variáveis na

equação de onda esférica obtendo uma solução geral:

(18)

onde )(xP ml são polinômios de Legendre [164-167], como mostrado na Figura 39.

Figura 39. Gráfico representativo dos polinômios de Legendre

Segundo ROMAN [168], esta série demonstra que as condições limite são

especificadas em coordenadas esféricas (de acordo com a simetria da partícula), onde a

onda incidente é planar e determinada em coordenadas cartesianas. Assim, expressa-se a

onda incidente e condições de contorno no mesmo sistema de coordenada, de forma a

transformar a onda plana em vetores esféricos harmônicos ou as condições de contorno

da partícula em coordenadas cartesianas. A expansão desejada da onda plana complexa

(denotada Ec) em termos de se mostrar harmônicos esféricos sendo dada por:

(19)

Se a onda plana está polarizada na direção e movendo-se ao longo do eixo , então

somente contribui, de forma que a expansão torna-se:

(20)

A combinação de vetores harmônicos esféricos ocorrendo nesta expansão pode ser

dividida em dois componentes escalares, cada um dos quais contêm uma função esférica

Bessel de primeira ordem. O campo inicial fora da esfera torna-se, então, conhecido: o

espalhamento da onda fora da partícula (aqui representado por uma bactéria) e a onda

produzida no interior do campo. Segundo RIUS et al. [153] e SANSONE [167], ambos

são similares quanto à forma de expansão da onda incidente, mas o espalhamento da

onda externa da partícula envolve funções esféricas (Hankel), enquanto que

interiormente envolve funções esféricas (Bessel). A razão para esta simetria é devido as

funções esféricas de Hankel serem combinações lineares das funções esféricas de Bessel

de primeira ordem, que são singulares a infinidade de funções esféricas de Bessel de

segunda ordem (também conhecidas como funções Weber ou Neumann).

A N E X O 4

Development of an evanescent-field optical-fibre bacteriosensor

A.P. Ferreira1, M. M. Werneck2 and R. M. Ribeiro3

1Department of Sanitation and Environmental Health, National School for Public Health,

Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, Brazil.

2,3Biomedical Engineering Department, Federal University of Rio de Janeiro, PO Box

68564,

21945-970, Rio de Janeiro/RJ, Brazil.

[email protected] Abstract

A large number of bacteria have becoming pathogenic for different environment. Conventional techniques allow the biological detection but needs at least 1-10 days. We have being developing a technique based on an evanescent-field optical-fibre sensor - bacteriosensor - for detecting/monitoring pathogens.

Firstly, the evanescent field fibre optic sensor was employed for detecting and monitoring aerobiological pathogen contamination in hospital environment. Measurements of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Streptococcus pneumoniae colonies were detected in 6 and 13 hours, respectively, faster than those obtained by means of conventional techniques.

The biosensor was calibrated using Escherichia coli O157:H7, motivated by countless cases of diarrheic infections occurred in developing countries, we understand that urges the necessity to search such facts, in special, for this pathogen which is, perhaps, the most dangerous enteric pathogens that clinical microbiologists are likely to encounter. The level of biohazard is high due to the extremely low dose required for infection (10 microorganisms). The device sensitivity has been calibrated for colony forming units (CFU) from 10 to 800 yielding an error less than 11%. A correlation between optical response and the instantaneous number of bacteria was achieved. The optical output signal was 0.016 (±0.001) dB per hour per bacteria. In all cases detection started after (270 ± 4) minutes, 5-10 times faster than conventional bacteriological techniques. Key-words: Optical-fibre sensor, evanescent field, bacteria detection, biosensor Introduction

The greatest drawback for pathogen-detection techniques is the lack of reliable and sensitive means for measuring their presence in real time. Evanescent-wave-coupling sensor technology is a suitable technique for microorganism measurement in its natural form that may be applied to the biosensors development taking advantage of the current understanding of the whole cell architecture of the microbial. Are important devices for the environmental monitoring embracing a rapid measurement of pathogens presence in the environmental control of hospital areas, specially in intensive care units (ICU).

Firstly, at the hospital environment where we found the most varied dissemination infection forms, especially aerobiological pathogens, it were done emphasis in detection of methicillin-resistent Staphylococcus aureus (MRSA) and Streptococcus pneumoniae, for the fact of its presence in the great majority of expressive attacks of hospital infections [1,2] The Centers for Disease Control (CDC, USA) defines emergent diseases as those infectious diseases whose incidence increased in the last two decades or they tend to increase in the future [3]. In the sense of specifying that definition better, they are mentioned different

circumstances that can characterize the emergency of new problems of health, in special, possible connections among genetic engineering/new pathogenic agents and biological weapons, the global traffic of microorganisms and the exchange of diseases between the old and the new world. Escherichia coli has been recognised as a commonplace microorganism found in the intestinal tract of human and other warm-blooded animals. Usually it remains harmlessly confined to the intestinal lumen only becoming pathogenic in the debilitated or immunosuppressed host, or when gastrointestinal barriers are violated. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 is an emerging pathogen, which is the cause of foodborne illness, the major cause of serious outbreaks and sporadic cases of hemorrhagic colitis and hemolytic-uremic syndrome [4-6]. The major challenge of induced diarrhoeal disease is on children under the age of 10 years and elderly people, living in less-developed countries of the world in which bacterial diarrhoeal diseases remain a significant public health problem. E. coli O157:H7 is the cause of acute and persistent diarrhoeal disease and ongoing morbidity that has as contributors the poor nutrition [7].

A fibre optic-based biological sensor has been designed in our laboratory and was described elsewhere [8,9]. In this work, using the same measurement principle the sensor has been designed to measure and quantify E. coli. We have chosen E. coli O157:H7 as prototype for the sensor development because it is one emerging pathogen of worldwide public health importance, responsible for expressive outbreaks and by the fact that few pathogens can routinely cause such striking clinical syndromes in different organ systems as can E. coli O157:H7. By monitoring its presence it will be possible to diagnose and detect outbreaks. Methodology

The sensing mechanism of the biosensor described here relies upon the attenuation of a

guided lightwave by means of evanescent-field coupling that takes place at the fibre optic

sensor. As the bacteria grow in the neighbourhood of the sensor, the guided lightwave is

changed in intensity. The guided evanescent field of the lightwave penetrates beyond the core

surface and exponentially decreases in its magnitude an order of a wavelength away from the

core/clad-reflecting interface. The biosensor described here may be envisaged as comprised by

three parts: The optical circuitry, the evanescent probe-fibre and the biological culture medium.

The probe-fibre was put over the culture medium in which the bacteria grows, selectively.

The sensing mechanism of the biosensor described here relies upon the attenuation of a

guided lightwave by means of evanescent-field coupling that takes place at the so called

sensitive fibre. As the bacteria grow in the neighbourhood of the sensitive fibre, the guided

lightwave is changed in intensity. The culture medium is adherent to the cladding of the almost

unclad sensitive fibre. Normally, the light travelling inside the fibre experiences total internal

reflection when light beams strike the interface between the fibre core and the cladding. This

occurs when the angle of incidence is greater than the critical angle. Thus, a propagating optical

wave through the optical fibre is bounded in its core, but allowed to interact with the outside

medium by evanescent-field coupling when this field is exposed [10].

The most common techniques for airborne microorganisms collection and monitoring are slit samplers or cascade impactors. In this work the microbiological air sampling collection was done by impaction-on-a-gel technique employing a Merck MAS-100 air sampler equipment. It consists of a vacuum pump with a volumetric flow rate of 100 litres per minute aspirating ambient air through a perforated plate for 30 seconds. The resulting air stream, which carries particles with diameters below 10 µm, is directed onto the agar surface of a 90-mm standard Petri plate. Eighteen collections were performed in six random days, three per day, for two weeks. In the three first days we used a specific culture medium for MRSA and in the three last ones we used a specific culture medium for S. pneumoniae. After collection, the samples were taken to an oven at 35oC for incubation, during 48 hours. Two Petri plates were used for c.f.u. count, identification and specificity characterization. The other Petri plate received the sensor, and then 500 µl of phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4, was poured into it in order to provide a better microorganism distribution around the fibre optic sensitive area (see the description of the sensor below). After those initial procedures, the Petri plates were put into the oven. During the following 30 hours the sensor monitored the bacteria growth on one plate, whereas the other two plates were used as control. After the total incubation time of 48 hours all three Petri plates were taken to identification of the bacteria for selectivity control.

The device sensitivity had been calibrated using Escherichia coli O157:H7 CDC EDL-

933 (ATCC 43894), supplied by the Centre for Disease Control and Prevention (CDC/USA).

Fig. 1 shows a schematic drawing of the biosensor set-up. The optical source is a 3-mW CW GaAlAs laser with graded-index multimode fibre pigtail, emitting at 840 nm. The output fibre was spliced with a bi-directional optical fibre coupler. Half of the emitted optical power propagates over the probe-fibre (sensing element). The light modulated by the growing bacteria exits the fibre and is detected by the photodiode PD2 providing the electrical signal Samplein. The other half of the optical power is detected by the photodiode PD1 from which an electrical reference signal Refin is obtained. Both electrical signals are amplified and measured by a two-channel calibrated optical power meter (Graseby Optronics). An A/D board controlled by the LabVIEW software (National Instruments Corporation) digitises both output signals from the optical power meter (Sampleout.and Refout) by means of its IEEE-488 interface. The A/D board collects 800 points per minute of both Sampleout.and Refout recording and storing the respective averages for a period of 24 hours. For exposition of the evanescent lightwave field of the optical fibre, 20 cm of a graded-index

multimode optical fibre (62.5/125 µm) was clad-stripped by chemical etching. The

etching was performed by means of hydrofluoric acid solution (38%) during 11 minutes

in order to leave between 0.5 to 1 µm of clad over the core of the fibre. After this time,

the chemical reaction was stopped by immersion in deionised water and then in PBS

(pH 7.4) for 15 minutes in order to remove all remains of water from the probe. The

exact etching time was determined by monitoring diameters in a previous experience

using a calibrated optical microscope [11]. After the chemical etching the fibre was

wound into a single loop, with a total sensitive surface area of approximately 40.0 mm2,

in which the evanescent field can be accessed.

Oven

Microbial sensor

Optical fibre

Optometer A/D Board

Index matching

Laser3 dB Coupler

hPd2

Samplein Refin

Sampleout

Sampleout Samplein

Samplein

Figure 1. Optical set-up of the biosensor

The selective culture media for microorganisms growth Selective culture media were chosen to improve the sensitivity of isolation and promote

the growth of the microorganisms selected in this study. For MRSA it was employed the Baird-Parker Agar Base (Difco Laboratories, Detroit, Michigan - Difco 0768-17-3) at an incubation temperature of 35°C. For S. pneumoniae it was employed the Trypticase soy blood agar base (Difco Laboratories, Detroit, Michigan - Difco 0026-17-1) supplemented with sheep blood (5%) at an incubation temperature of 35°C. In all culture media above described, glycerol at 0.2% was added in order to avoid the culture from going dry during all tests. For E. coli O157:H7 growth, the selective culture medium employed was MacConkey Sorbitol Agar (SMAC) from Difco Laboratories (São Paulo/Brasil - Difco 0079-17-7) at an incubation temperature of 35°C.

In order to calibrate the biosensor for its sensitivity, several tests were performed using different initial number of bacteria (N0). E. coli O157:H7, available lyophilised in ampoules, was restored with 1.0 ml of PBS, pH 7.4, inoculated in several Petri plates with SMAC and incubated for 35°C for 24 hours. At the end of this period, the purity of the material was checked and the Petri plates were stored at 4°C, for further dilution. For obtaining a dilution with N0=10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 and 80 microorganisms, it was used 100 µl of PBS, pH 7.4 whereas for N0 = 90, 100, 200, 400 and 800 the volume used was 500 µl of PBS, pH 7.4. For each sample the cells were counted using the Coulter Counter (Beckman), which allows an accuracy of ±1%. Finally, the probe was inserted into the Petri plates with the culture as described above, the dilution with a known number of microorganisms was poured onto the sensitive area of the probe and the hardware and software were started. In all cases the SMAC was supplemented with glycerol at 0.2% that allows the maintenance of the residual humidity and provides a better interaction between the microorganisms and the sensitive area. This was done in order to avoid the culture going dry during the tests and thus inserting another variable into the process.

Results

Fig. 2 and Fig. 3 shows respectively the optical signal of the sensor for MRSA and S. pneumoniae growth. Line 1, line 2 and line 3 represent the output signal for sample 1, sample 2 and sample 3 respectively. Line 4 correlates the bacteria growth with the estimated number of bacteria, according to the following formula:

GT

t

o2N)t(N = , (1)

where t is the time in minutes, N is the total number of bacteria at time t, No is the initial number

of bacteria (equals to 94 for MRSA and 91 for S. pneumoniae) and GT is the generation time

(equals to 30 minutes for MRSA and 48 minutes for S. pneumoniae) [12].

Figure 2. Output signal from the sensor with MRSA. Lines 1-3 are the output of the sensor and line 4 is the estimated number of bacteria.

Staphylococcus aureus

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 500 1000 1500 2000Time [minutes]

Out

put p

ower

[arb

itrar

y un

its]

1,0E+01

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

1,0E+07

1,0E+08

1,0E+09

Est

imat

ed n

umbe

r of

bac

teria

Line 1Line 2Line 3

Line 4

Figure 3. Output signal from the sensor with S. pneumoniae. Lines 1-3 are the output of the sensor and line 4 is the estimated number of bacteria.

In order to characterize the sensitivity of the biosensor, several measurements were

carried out, each one during a 24-hour interval (1440 minutes) employing thirteen different values of colony forming units (CFU), or initial numbers of bacteria, N0. These values varied from 10 to 800 E. coli O157:H7 bacteria samples. Fig. 4 shows the plot of the temporal optical response I out(t) (in arbitrary units) of three of such measurements (N0 = 10, 80 and 800). The results of the optical measurements were reproducible. The reproducibility is also observed in all measurements corresponding to different N0 (Lag phase, Log phase and Stationary phase). It should also be observed the curves closely match between themselves. In the first phase, it may be observed a DC level I out(t)=I LAG with an almost similar time range. The ILAG level is assigned to the biosensor response in which the E. coli O157:H7 remains in its lag phase during ∆∆∆∆tLAG time delay.

0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 00 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

1 ,2

N0 = 8 0 0

N0 = 8 0

N0 = 1 0

Out

put p

ower

[arb

itrar

y un

its]

T im e [m in u te s ]

Figure 4. Optical response I out(t) of the biosensor parameterised by the initial number N0 = 10, 80 and 800 of E. coli O157:H7.

S tr e p to c o c c u s p n e u m o n ia e

0

0 . 2

0 . 4

0 . 6

0 . 8

1

1 . 2

0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0

T im e [ m in u t e s ]

Out

put p

ower

[arb

itrar

y un

its]

1 . 0 E + 0 1

1 . 0 E + 0 2

1 . 0 E + 0 3

1 . 0 E + 0 4

1 . 0 E + 0 5

1 . 0 E + 0 6

1 . 0 E + 0 7

Est

imat

ed n

umbe

r of

bac

teria

L in e 1L in e 2L in e 3

L in e 4

Fig. 5 shows a plot of ∆∆∆∆tLAG against N0 for all measurements. The linear relationship with an almost null angular coefficient was fitted with an average of 270±4 minutes or approximately 4.5 hours, meaning a repeatability of ~1.5%. ∆∆∆∆tLAG may be attributed to the time range that E. coli O157:H7 spent in its LAG phase despite their initial number N0.

0 200 400 600 800 10000

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

Lag

phas

e: ti

me

dela

y (m

inut

es)

N0

Figure 5. Time delay in the LAG phase ∆∆∆∆tLAG (minutes) against the initial number N0 of E. coli O157:H7.

The optical attenuation ∆Iout (in dB) for each N0 it means the difference between the time

width ∆tLOG (in hours) of the log phase for each N0. The time derivative βLOG of Iout(t) in the log phase varies with N0 and may be calculated from Eq.2:

LOG

out0LOG

∆t

∆I)(Nβ ≡ (2)

Fig. 6 shows a plot of the biosensor sensitivity ββββLOG (dB/hour) at the log phase when the initial number of bacteria is changed from N0=10 to N0=400. A linear fit with a correlation coefficient of 0.985 provides a straight-line calibration curve ββββLOG(N0)=(∆∆∆∆ββββLOG/∆∆∆∆N0)N0.

0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 00

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

6 0 0 0

7 0 0 0

Sen

sitiv

iy a

t LO

G p

hase

(dB

/h)

N0

Figure 6. Biosensor calibration curve. It is shown the time derivative βLOG of Iout(t) in the log phase against N0. A linear dependence was fitted.

The angular coefficient was calculated to be ∆∆∆∆ββββLOG/∆∆∆∆N0 = (0.016 ± 0.001) (dB/hour)/bacteria meaning that for each E. coli O157:H7 bacterium inoculated upon the Petri plate, the speed of the biosensor response at the log phase increases by 0.016 dB/hour. For N0 = 800 the angular coefficient ββββLOG(800)~6 dB/h. Therefore, it is possible to tell from the output signal, the initial number of bacteria by measuring the angular coefficient of the log phase. The CFU is directly related to the degree of contamination of the sample, when applying the system in vivo.

Discussion and Conclusions

The biosensor response relies on the interaction between the lightwave and the bacteria causing the optical attenuation at the probe-fibre. The optical interaction rises from the evanescent-field coupling since there is a physical contact between the fibre and the bacteria. The physical contact between the SiO2 (probe-fibre) and the whole cell occurs because the bacteria are allowed to grow around the fiber-probe. This mechanism greatly simplifies the construction of a biosensor when compared with other processes, for instance the silanization technique [13]. This technique consists of a complex immune procedure by which means antibodies from microbiological species are covalently linked to the SiO2 of the fiber thus forming a tightly structure capable of coupling the lightwave travelling inside the fiber. The cells that happen to be all over the Petri plate, without physical contact with the probe-fibre remains growing for 72 hours because there are enough nutrients. However, these “optically isolated” bacteria do not affect the biosensor response I out(t) since they are out of reach of the sensing mechanism, the evanescent field, which extends only about one wavelength from the core-clad interface. On the other hand, the bacteria that touched the fiber during the inoculation, together with those that happen to grow over and around the fiber are within the evanescent field and are sensed and monitored. However, since the probe-fibre was rested upon the surface of the biological medium prior to the optical measurements, the lightweight probe-fibre was not completely buried inside the gel-like culture medium because of the superficial tension and the nutrients in excess slowly slide down from the top of the probe-fibre. Also due to the surface tension, only a thin film of culture medium will remain touching the fibre. Therefore, the bacteria that happen to be isolated in the probe-fibre will grow and reproduce until the exhaustion of this limited amount of nutrients.

It is possible to observe in Fig. 2 and Fig. 3 which present three distinct regions (or time

derivative): the first one is a plateau in which no response was detected (lag phase). The results

for MRSA and S. pneumoniae have shown a time-detection threshold (lag phase) of

approximately 6 and 13 hours respectively. This difference is related to the different generation

times of each microorganism: 30 minutes for the MRSA and 48 minutes for S. pneumoniae. The

second region exhibits a negative slope, first with a relatively small time derivative, followed by

a higher time derivative. This region is the exponential phase of the bacteria growth; the initial

smaller time derivative reflects the coexistence of the lag and exponential phases. The decaying

curves last a total time of 560 minutes for MRSA and 700 minutes for S. pneumoniae. The

reason for this difference is also due to the different generation time for each bacteria. The third

region is characterised by a volume saturation occurring around the sensor fibre. This is not yet

the stationary phase of the culture, since the bacteria continue to grow for a total time of 48

hours. What occurred at the this point was that the bacteria growth filled all volume around the

sensor and therefore no more light could be coupled out of the fibre.

The calibration of the biosensor sensitivity with N0 as shown by Fig. 4, features a linear dependence of ββββLOG (= ∆∆∆∆I out/∆∆∆∆tLOG) from N0=10 until N0=400. For N0=800 it was observed a deviation from the linear dependence which suggests a possible saturation of the biosensor response. The linear relationship with an almost null angular coefficient was fitted with an average of 270±4 minutes or approximately 4.5 hours, is shown in Fig. 5 and the biosensor sensitivity ββββLOG (dB/hour) was demonstrated in Fig. 6.

In order to increase the sensitivity and the time derivative (speed at the log phase) of the biosensor in its presently basic configuration, some simple improvements are suggested: a) Optimisation of the wavelength for a better sensitivity. For instance, by using a longer wavelength we would have a larger sensitivity area because the evanescent field would also be larger. By testing the sensor with a modulated light source, several wavelengths could be tested; b) The use of a longer probe-fibre (the actual measures 20 cm) will absorb more light and therefore will present a higher sensitivity for the same bacteria concentration; c) Since it is possible to detected only one microorganism at a time, one approach to overcome this limitation would be the miniaturisation of the probe fibre such that an array of them, each one specific for different microorganisms, could be wavelength division multiplexing (WDM).

Acknowledgements: We would like to thank the Escola Nacional de Saúde Pública of the

Fundação Oswaldo Cruz (ENSP/FIOCRUZ) for the bacteriological support on this work; the

Foundation for the Research Support of the State of Rio de Janeiro (FAPERJ) and the Brazilian

National Research Centre, (CNPq/PADCT) for financial support.

References

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