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UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
MESTRADO EM ODONTOLOGIA
RONIERY DE OLIVEIRA COSTA
AVALIAÇÃO DA AÇÃO DO LASER, LED E DA TERAPIA FOTODINÂMICA NA
CICATRIZAÇÃO DE QUEIMADURAS EM PELE: ESTUDO CLÍNICO E
HISTOLÓGICO EM RATOS
CAMPINA GRANDE
2013
RONIERY DE OLIVEIRA COSTA
AVALIAÇÃO DA AÇÃO DO LASER, LED E DA TERAPIA FOTODINÂMICA NA
CICATRIZAÇÃO DE QUEIMADURAS EM PELE: ESTUDO CLÍNICO E
HISTOLÓGICO EM RATOS
Orientadora: Profª. Drª. Maria Helena Chaves de Vasconcelos Catão
CAMPINA GRANDE
2013
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Odontologia da Universidade
Estadual da Paraíba, como parte
dos requisitos necessários à
obtenção do título de Mestre em
Odontologia.
Odonto
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL – UEPB
C837a Costa, Roniery de Oliveira.
Avaliação da ação do laser, Led e da terapia
fotodinâmica na cicatrização de queimaduras em pele
[manuscrito] : estudo clínico e histológico em ratos /
Roniery de Oliveira Costa. – 2013.
91 f. : il. color.
Digitado
Dissertação (Mestrado em Odontologia) –
Universidade Estadual da Paraíba, Pró-Reitoria de Pós-
Graduação e Pesquisa, 2013.
“Orientação: Profa. Dra. Maria Helena Chaves de
Vasconcelos Catão, Departamento de Odontologia”.
1. Terapia fotodinâmica. 2. Queimaduras. 3.
Cicatrização. 4. Laser. I. Título.
21. ed. CDD 617.11
RONIERY DE OLIVEIRA COSTA
AVALIAÇÃO DA AÇÃO DO LASER, LED E DA TERAPIA FOTODINÂMICA NA
CICATRIZAÇÃO DE QUEIMADURAS EM PELE: ESTUDO CLÍNICO E
HISTOLÓGICOS EM RATOS.
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Odontologia da Universidade
Estadual da Paraíba, como parte
dos requisitos necessários à
obtenção do título de Mestre em
Odontologia.
Odonto
Esta dissertação é dedicada a
minha esposa Ivna Rafaela
Ribeiro dos Santos Costa e a
minha filha Raquel dos Santos
Costa pelas horas de convívio
“roubadas”.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
A minha orientadora Profa. Dra. Maria Helena Chaves de Vasconcelos Catão
agradeço a oportunidade de partilhar do seu conhecimento e experiência, sempre
presente, apesar de tantos compromissos. Em nenhum momento você deixou de
acreditar no meu potencial, me ensinou que os desafios podem ser superados e me
fez enxergar cada dificuldade como uma ocasião de crescimento. Sua confiança,
amizade e apoio foram imprescindíveis. Meu sincero respeito e admiração!
Ao Prof. Dr. Ricardo Luiz Cavalcanti de Albuquerque Júnior pela
colaboração desde a qualificação do projeto à coloração e leitura do picrosírius, por
tamanha dedicação e empenho em contribuir em cada etapa, pela agradável
companhia e amizade. Sou grato pelo privilégio de ter acompanhado um profissional
dedicado à pesquisa científica e comprometido com o ensino e com a ética. Seu
bom humor e tranquilidade fizeram com que tudo parecesse mais fácil, obrigado por
me acolher e pelos ensinamentos. Seu auxílio foi indispensável no engrandecimento
desta pesquisa. Meu sincero agradecimento!
Ao Prof. Dr. Cassiano Francisco Weege Nonaka pelas contribuições precisas
e sábias, pela solicitude com que sempre atendeu cada uma das minhas dúvidas,
quer pessoalmente ou à distância. Agradeço enormemente suas contribuições, seu
auxílio foi indispensável ao término desta pesquisa em tempo hábil. Muito Obrigado!
AGRADECIMENTO
A Deus, minha fonte inesgotável, por estar sempre comigo em todos os
momentos, dando-me força para mais essa conquista e sabedoria para lidar com as
adversidades.
À minha esposa, Ivna Rafaela, que sempre esteve comigo nas horas que mais
precisei. Por mostrar que duas pessoas podem ser um só pensamento, que duas
vidas podem estar em só momento e que dois sonhos podem triunfar por um só
caminho. Te amo!
Aos meus pais, Assis e Lúcia, pelo amor incondicional, pelo carinho e
dedicação nos momentos difíceis, sendo “peças” fundamentais na minha formação
acadêmica por sempre acreditarem nos filhos e por mostrarem que os sonhos não
têm idade e que somos capazes de realizá-los. Amo Vocês!
Aos meus irmãos, Rosemberg, Rodolpho e Raíssa, pelo carinho, confiança e
dedicação, durante esse trajeto.
À Universidade Estadual da Paraíba (UEPB) pela minha formação na
graduação e pós-graduação.
À Universidade Federal de Campina Grande (UFCG) e à Universidade
Tiradentes (UNIT) pela parceria estabelecida e pela oportunidade de utilizar os
equipamentos necessários à execução desta pesquisa.
A todos os professores da pós-graduação pelos ensinamentos e
disponibilidade em atender cada dúvida, cada questionamento, sobretudo pelo
incentivo em cada etapa do mestrado.
Aos colegas de turma Armiliana Soares, Fabio Gomes, Leonardo Gomes,
Lorena Nóbrega, Marcela Lins, Maria Betânia, Manuela Gouvea, Priscila
Suassuna, Raulison Sousa, Rennaly Lima, Yeska Paola e Vanessa Abilio por
todos os momentos compartilhados.
A Denise Sousa, técnica do Laboratório de Histopatológica da UEPB e
Nely, técnica do Laboratório de Morfologia e Biologia Estrutural da UNIT, que
estiveram sempre dispostas a me auxiliar em toda e qualquer dificuldade nas fases
da pesquisa laboratorial.
Ao Sr. Paulinho, técnico do Biotério da UFCG pela colaboração durante o
experimento com os animais, pela agradável companhia e amizade.
A todos que diretamente ou indiretamente contribuíram para a realização deste
trabalho,
Muito Obrigado!
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Fluxograma dos grupos de tratamento em função dos subgrupos e
dos tempos de sacrifícios ..................................................................
27
Figura 2 Fluxograma da área de colagenização e da análise descritiva das
fibras colágenas. ...............................................................................
33
Figura 3a Balança analítica utilizada na pesagem dos ratos e da ração .......... 34
Figura 3b Garrafa de água para Ratos ............................................................. 35
Figura 4a Anestesia intraperitoneal .................................................................. 36
Figura 4b Tricotomia realizada no dorso do rato .............................................. 36
Figura 4c Instrumental metálico de queimadura .............................................. 36
Figura 4d Aquecimento do instrumental metálico ............................................ 36
Figura 4e Indução da queimadura no dorso do animal .................................... 36
Figura 4f Aspecto da queimadura no dorso do rato ........................................ 36
Figura 5a Aparelho Laser MMO TWIN FLEX Evolution ………………………. 37
Figura 5b Aparelho LED KONDORTECH ........................................................ 37
Figura 5c Irradiação de um dos pontos da queimadura com laser de λ660nm
.........................................................................................................
37
Figura 5d Os quatros pontos de irradiação coincidentes com os ângulos da
queimadura do laser λ660 nm ou λ780 nm .....................................
37
Figura 5e Azul de Metileno Chimiolux, 100µg/mL ........................................... 37
Figura 5f Aplicação de gotas do azul de metileno 0,5µg/mL na ferida .......... 37
Figura 5g Irradiação de um dos pontos da queimadura com LED ................. 37
Figura 5h Irradiação da luz LED nos quatros pontos coincidentes com os
ângulos da queimadura ...................................................................
37
Figura 5i Aferição do diâmetro da ferida. ....................................................... 37
Figura 1
Queimaduras em pele dos grupos CTR, LVER e LED durante os
tempos de sacrifícios (artigo 1).........................................................
47
Figura 2 Avaliação do índice de retração da ferida de cada grupo de
tratamento durante os tempos de sacrifícios (artigo 1)......................
48
Figura 3 Cortes histológicos em Hematoxilina e Eosina em 14 e 21 dias dos
grupos CTR, LVER e LED (artigo 1)................................................ 50
Figura 4
Áreas de colagenização em 14 e 21 dias dos grupos CTR, LVER e
LED (artigo 1)..................................................................................
51
Figura 5
Fotomicrografias em picrosírius das áreas de colagenização em 14
e 21 dias dos grupos CTR,LVER e LED (artigo 1) ..........................
52
Figura 1
Queimaduras em pele pelos grupos CTR, LINF e TFD durante os
tempos de sacrifícios (artigo 2).........................................................
65
Figura 2 Avaliação do índice de retração da ferida de cada grupo de
tratamento durante os tempos de sacrifício (artigo 2) ......................
66
Figura 3
Cortes histológicos em Hematoxilina e Eosina em 14 e 21 dias dos
grupos CTR, LINF e TFD (artigo 2). .................................................
68
Figura 4
Áreas de colagenização em 14 e 21 dias dos grupos CTR, LINF e
TFD (artigo 2) ...................................................................................
69
Figura 5
Fotomicrografias em picrosírius das áreas de colagenização em 14
e 21 dias dos grupos CTR, LINF e TFD (artigo 2) ............................
70
LISTA DE ABREVIATURAS
cm centímetro
cm2 centímetro quadrado
cm3 centímetro cúbico
g grama
J joule
Kg quilo
mg miligrama
mL mililitros
mW miliwatt
mm milímetro
nm nanômetro
p nível de significância
s segundos
µg micrograma
µm micrômetros
µs microsegundos
LISTA DE SIGLAS
AsGaAl Arseneto de Gálio e Alumínio
AM Azul de Metileno
ATP Adenosina Trifosfato
CTR Controle
CESED Centro de Ensino Superior e Desenvolvimento
CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais
FGF-α Fator de crescimento fibroblástico ácido
TGF-β Fator transformante de crescimento beta
FS Fotossenssibilizador
HE Hematoxilina e Eosina
InGaAlP Fosfeto de Índio Gálio e Alumínio
InGaN Nitreto Índio e Gálio
LBI Laser de baixa intensidade
Leds Diodos emissores de luz
LED Led verde
LINF Laser Infravermelho
LVER Laser Vermelho
LMBE Laboratório de Morfologia e Biologia Estrutural
RNAm RNA mensageiro
SPSS Statistical Package for the Social Sciences
TFD Terapia Fotodinâmica
UEPB Universidade Estadual da Paraíba
UFCG Universidade Federal de Campina Grande
UNIT Universidade Tiradentes
RESUMO
O objetivo desta pesquisa foi avaliar a ação do laser vermelho, infravermelho, terapia fotodinâmica e LED na cicatrização de queimaduras em pele, através da análise clínica e histológica em ratos. Para tanto, 100 animais foram aleatoriamente distribuídos em cinco grupos: G1 – controle, não tratado (CTR), G2- laser vermelho (LVER), G3- Laser infravermelho (LINF), G4- Terapia Fotodinâmica (TFD) e G5 - Led verde (LED). A indução da queimadura foi realizada no dorso do rato através da aplicação por 20 segundos de um instrumento metálico previamente aquecido por 40 segundos na chama azul do maçarico. O tratamento dos grupos experimentais foi a irradiação da luz vermelha (10J/cm2, 10s, 40mW e λ660 nm), infravermelha (10J/cm2, 10s, 40mW e λ780 nm), Led verde (60J/cm2, 10s, λ520 a 550 nm) e terapia fotodinâmica (10J/cm2, 40mW e λ660 nm), esta última associada ao fotossenssibilizador azul de metileno na concentração 0,5µg/mL. As aplicações foram pontuais nos quatro pontos coincidentes dos ângulos da ferida e em cada ponto foi depositada a quantidade de 10J/cm2, totalizando 40J/cm2, com exceção do Led verde que foi aplicado 60J/cm², totalizando 240J/cm2 por sessão. As aplicações foram diárias até o dia anterior ao sacrifício do animal em 3, 7, 14 e 21 dias com overdose de anestésico intraperitoneal. Os espécimes removidos foram analisadas clinicamente e logo após, processadas e corados em HE e Picrosírius para análise sob microscopia de luz e luz polarizada, respectivamente. Os animais tratados com LVER, LINF e TFD (p<0,001) e Led (p<0,05) estimularam a produção e maturação do colágeno, além de aumentarem o consumo de ração e água comparado ao grupo controle (p<0,001). O laser λ660 nm e λ780 nm apresentaram as maiores retrações da ferida dos grupos (p=0,012 e p=0,04, respectivamente). Em conclusão, o laser vermelho, infravermelho, terapia fotodinâmica e LED verde favoreceram o processo de cicatrização em queimaduras de terceiro grau em ratos.
Palavras-chaves: Cicatrização; Lasers; Queimaduras; Ratos; Terapia Fotodinâmica.
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the influence of the red laser, infrared, photodynamic therapy and LED on the healing of wound burns through the clinical and histological analysis in rats. Therefore, 100 animals were randomly divided into five groups: G 1- untreated controlled (CTR), G2- red laser (LVER), G3- infrared laser (LINF), G4- photodynamic therapy (TFD) and G5- green led (LED). The induction of wound burns was obtained by applying a squared metal instrument, previously heated on a torch for 40 seconds, on the back of the rats for 20 seconds. The treatment of the experimental groups was the irradiation of red light (10J/cm2, 10s, and 40mW λ660 nm), infrared (10J/cm2, 10s, and 40mW λ780 nm), green LED (60J/cm2, 10s, λ520 to 550 nm) and photodynamic therapy (10J/cm2, and 40mW λ660 nm) that was associated with 0.5 µg/mL of methylene blue .The applications were punctually applied on four coincident points of the wound angles. At each point was added 10J/cm2 totaling 40J/cm2 except from the green LED that was applied 60J/cm², totaling 240J/cm2 per session. The applications were daily until the day before the animal sacrifice that occurred respectively ,considering the group classification, in 3, 7, 14 and 21 days when was applied an overdose of intraperitoneal anesthetic on the animals. The samples were removed and clinically examined then processed and stained with HE and Sirius red for analysis under light microscopy and polarized light, respectively. Animals treated with LVER, LINF, TFD (p <0.001) and LED (p <0.05), stimulated the production and maturation of collagen. Besides the fact that the animals from the group ate better and drink more water if compared to the other untreated controlled group (p<0.001). In conclusion, the red laser, infrared, photodynamic therapy and green led stimulated the healing process in third degree burns in rats.
Key-words: Healing; Lasers; Burns; Rats; Therapy Photodynamic.
SUMÁRIO
1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS .............................................................. 18
2 OBJETIVOS.......................................................................................... 24
2.1 OBJETIVO GERAL.............................................................................. 24
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................... 24
3 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................. 26
3.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO..................................................... 26
3.2 ASPECTOS ÉTICOS ......................................................................... 26
3.3 AMOSTRA ......................................................................................... 26
3.3.1 Critérios de inclusão e exclusão da amostra ............................... 26
3.3.2 Tipos de grupos de tratamento ..................................................... 27
3.4 MÉTODO EXPERIMENTAL .............................................................. 27
3.4.1 Anestesia/tricotomia ....................................................................... 28
3.4.2 Indução da queimadura .................................................................. 28
3.4.3 Estudo piloto ................................................................................... 28
3.5 CARACTERÍSTICAS DO LASER ..................................................... 29
3.6 CARACTERÍSTICAS DO LED .......................................................... 29
3.7 TIPOS DE TRATAMENTO ............................................................... 29
3.8 EUTANÁSIA DOS ANIMAIS E ANÁLISE CLINICA ........................ 31
3.9 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO .............................................. 31
3.9.1 Método de avaliação histológica .................................................. 32
3.9.1.2 Infiltrado inflamatório ......................................................................... 32
3.9.1.3 Análise morfológica do colágeno ...................................................... 32
3.9.1.4 Análise quantitativa da área de colagenização ................................ 32
3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................... 33
4 ARTIGOS A SEREM SUBMETIDOS ............................................... 40
4.1 ARTIGO 1 ......................................................................................... 41
4.2 ARTIGO 2 ......................................................................................... 59
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................. 79
REFERÊNCIAS
APÊNDICE A - Ficha de Avaliação clinica
APÊNDICE B - Ficha do consumo da água e ração
ANEXO A - Parecer do Comitê de Ética no Uso de Animais
18
1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS
A queimadura é um dos traumas mais devastadores que podem atingir o
homem, e considerada uma das causas frequentes de morbidade, mortalidade e de
graves incapacidades a longo prazo. Na Europa, estima-se uma taxa de mortalidade
variando de 1,4% a 34% dos pacientes hospitalizados por queimaduras, na qual
metade desses enfermos tem idade inferior a 16 anos e 75% das vítimas são do
sexo masculino (BRUSSELAERS et al., 2010). Mais de um milhão de queimaduras
ocorrem nos Estados Unidos a cada ano, cerca de 5000 destes ferimentos são
fatais, fazendo com que a queimadura seja a quarta principal causa de morte por
lesões não intencionais neste país (EDELMAN, 2007) enquanto no Brasil são
relatados 1 milhão de casos de queimaduras, de acordo com a Sociedade Brasileira
de Queimaduras, das quais 200.000 são tratados em salas ambulatórias e 40.000
necessitam de hospitalização (POTOKAR; PROWSE; WHITAKER, 2008).
A queimadura é um tipo de ferida aberta em que o processo cicatricial ocorre
por segunda intenção, na qual as bordas da ferida se apresentam afastadas em
consequência da perda de parte dos tecidos (FOULKES; DAVIDSON; GATELEY,
2011), resultando em perda de líquidos corporais, inflamação, edema, infecção, dor
e choque, todos estes fatores podem resultar em morte da vítima (SHARMA, 2007;
VALE, 2005; BARRILO; PAUSEN, 2003; WASSERMANN, 2002; SHERIDAN et al.,
2000).
Quando a integridade da pele é alterada, inicia-se a cicatrização, que é um
processo complexo que envolve a interação de vários tipos de células, tais como
linfócitos, monócitos, células epiteliais e fibroblastos (CLARK, 1993; DIEGELMANN;
EVANS, 2004). Este processo é constituído por três fases independentes e
sobrepostas dinamicamente no tempo (DIEGELMANN; EVANS, 2004).
A fase inflamatória ou exsudativa inicia-se logo após a lesão, com formação de
rede de fibrina e migração de macrófagos e neutrófilos e mais tardiamente, os
linfócitos. Os macrófagos tem o objetivo de fagocitar o tecido necrosado, liberar os
agentes quimiotáticos que atraem fibroblastos e células endoteliais, estimulando
essas células a proliferarem (fase proliferativa), que estimulam a síntese de
19
colágeno por parte dos fibroblastos (MANDELBAUM; DISANTIS; MANDELBAUM,
2003).
A fase proliferativa é dividida em três subfases e é responsável pela formação
do tecido de granulação. A primeira subfase é a fibroplasia, caracterizada pela
proliferação de fibroblastos e produção de colágeno, elastinas e outras proteínas; a
segunda é a angiogênese que ocorre paralelamente à fibroplasia, na qual novos
vasos darão suporte à formação da nova matriz (MANDELBAUM; DISANTIS;
MANDELBAUM, 2003). Nessa fase, os fibroblastos podem se diferenciar em
miofibroblastos que são responsáveis pela redução de 0.60 a 0.75mm por dia da
área da ferida (COELHO; REZENDE; TENÓRIO, 1999). A reepitelização (terceira
subfase) ocorre após a formação da reação de granulação, caracterizada pela
migração de queratinócitos das bordas e anexos remanescentes.
A última fase é a maturação ou remodeladora, caracterizada pela substituição
do colágeno tipo III pelo tipo I, reorientação e reorganização da nova matriz de
colágeno, absorção de água, diminuição do número de vasos e do infiltrado
inflamatório (MANDELBAUM; DISANTIS; MANDELBAUM, 2003; BALBINO;
PEREIRA; CURI, 2005).
Quando o tecido é lesado, ocorre o extravasamento de líquido do interior dos
vasos sanguíneos, levando à produção de um edema. Em uma queimadura muito
extensa, a perda de grande volume de líquido desses vasos pode levar ao choque,
ocasionado pela queda brusca da pressão arterial, reduzindo o sangue que flui para
o cérebro e outros órgãos vitais (VALE, 2005).
Na avaliação desse ferimento deve ser analisado principalmente a
profundidade, a localização e a extensão além da idade da vítima, a existência de
doenças prévias bem como a concomitância de condições agravantes. Com relação
à profundidade, fator determinante do resultado estético e funcional, deve-se levar
em consideração o agente térmico e o tempo de contato (VALE, 2005).
A verdadeira profundidade da queimadura pode não ser precisa ou facilmente
identificada no primeiro dia. Durante sua evolução, uma infecção ou uma
instabilidade hemodinâmica podem aprofundar a lesão. O próprio processo de
reposição volêmica produz vários radicais livres que levam os danos adicionais aos
20
tecidos (BARBOSA et al., 2007) isto permite que uma lesão de espessura parcial
superficial evolua para espessura total depois de 72h após o ferimento (GOMES,
1998).
Para o tratamento de queimaduras é necessário compreender a fisiopatologia
da área afetada, sendo de fundamental importância a extensão e a profundidade da
ferida. A gravidade das lesões cutâneas provocadas pelos danos térmicos é
diretamente proporcional à duração e intensidade da exposição à fonte sendo
dividida em lesões de primeiro, segundo e terceiro graus (MONSTREY et al., 2005).
As queimaduras geram graves prejuízos sociais e psicológicos ao paciente,
deste modo o desenvolvimento de uma modalidade de tratamento eficaz, rápida e
de baixo custo para esse tipo de ferimento, representa um enorme benefício para a
qualidade de vida do paciente (SHOLAR et al., 2007).
Um dos tratamentos evidenciados na literatura na aceleração do reparo
tecidual, com efeitos analgésicos e anti-inflamatórios no processo de cicatrização de
queimaduras é a laserterapia (MEIRELES et al., 2008; ARAÚJO et al., 2007;
HAWKINS; ABRAHAMSE, 2006), Terapia Fotodinâmica (TFD) (GARCIA; LIMA;
OKAMOTO, 2010; KARU, 1989) e Led (LEE; KIM, 2012; FIÓRIO; SILVEIRA; MUNIN
et al., 2011; ADAMSKAYA; DUNGEL; MITTERMAYR et al., 2011; OLIVEIRA;
PINHEIRO; DE CASTRO et al., 2011).
Os primeiros trabalhos com laser de baixa intensidade foram conduzidos por
Mester e colaboradores, que observaram que o laser é capaz de modular processos
biológicos, em particular, estimular processo de regeneração tecidual (MESTER;
MESTER; MESTER, 1985).
Para avaliar a eficácia da absorção e a extensão da interação luz-tecido,
considera-se a associação entre as propriedades físicas do laser (comprimento de
onda, potência e tempo) com as características ópticas do tecido irradiado (KARU;
KOLYAKOV, 2005). Essa interação é responsável pelos efeitos estimuladores nos
diversos mecanismos metabólicos em diferentes níveis celulares. Um dos principais
efeitos da absorção da luz vermelha é a estimulação das mitocôndrias, o que resulta
em aumento de energia e na ativação da síntese de ácido nucleico (TUNÈR; HODE,
2002). Por outro lado, o uso da luz infravermelha (TUNÈR; HODE, 2002) e dos
21
diodos emissores de luz (Led) apresentam resultados semelhantes, sendo o
processo iniciado à nível de membrana celular (RIBEIRO; SILVA; ARAÚJO, 2004).
Diversos estudos (KHOSHVAGHTI; ZIBAMANZARMOFRAD; BAYAT, 2011;
GARCIA; LIMA; OKAMOTO et al., 2010; RIBEIRO; ALBUQUERQUE JÚNIOR;
RAMALHO et al., 2009; MEIRELES; SANTOS; CHAGAS et al., 2008; ROCHA;
OLIVEIRA; FARIAS et al., 2006) tem mostrado que o laser de baixa atua como
coadjuvante na cicatrização, visto que, promove um estímulo à revascularização
precoce, fornece energia em forma de adenosina trifosfato (ATP) às células de
reparo, estimula a secreção do fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e inibe
mediadores químicos da inflamação (HAMBLIN; DEMIDOVA, 2006).
A terapia fotodinâmica (TFD) é a combinação de um fotossensibilizador (FS)
que se liga a célula alvo e a luz de um comprimento de onda específico
(WAINWRIGHT, 1998). Na presença de oxigênio do meio, o FS ativado pode reagir
com moléculas na sua vizinhança levando à produção de oxigênio singlete, que
reage com os componentes celulares, sejam eles bactérias ou células neoplásicas,
provocando inviabilidade celular (DAI; TEGOS; LU, 2009). Isso oferece a terapia
fotodinâmica algumas vantagens, como natureza não invasiva, repetibilidade fácil e
ação antimicrobiana (HUANG, 2005), já que a presença de bactérias na ferida pode
retarda o processo de cicatrização (PARSONS; MCCOY; GORMAN, 2009).
O efeito do TFD no processo de cicatrização de queimaduras evidencia que a
terapia fotodinâmica quando associado a luz vermelha pode promover a
biomodulação do tecido através do aumento da cadeia respiratória mitocondrial e
síntese de adenosina trifosfato, favorecendo assim o processo de cicatrização
(LAMBRECHTS; DEMIDOVA; AALDERS, 2005), através da proliferação celular,
produção de ácidos nucleico, síntese de colágeno e redução da inflamação
(GARCIA et al., 2010; KARU, 1989).
Os diodos emissores de luz (LEDs) são pequenos dispositivos robustos que
atuam com faixa de comprimento de onda, variando do espectro ultravioleta ao
infravermelho (WEISS; MCDANIEL; GERONEMUS et al., 2005) e são bastante
utilizados na odontologia (COUTINHO et al., 2009; TORRES et al., 2011).
22
Os LEDs têm sido utilizados em várias indicações clínicas, destacando-se a
aceleração em pele do processo de cicatrização em incisões (KLEBANOV et al.,
2005; ADAMSKAYA et al., 2011) e queimaduras (LEE; KIM, 2012; FIÓRIO;
SILVEIRA; MUNIN et al., 2011; OLIVEIRA; PINHEIRO; DE CASTRO et al., 2011;
O objetivo deste estudo foi avaliar a ação do Laser, LED e da terapia
fotodinâmica na cicatrização de queimaduras em pele, estudo clínico e histológico
em ratos.
24
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a ação do Laser, LED e da terapia fotodinâmica na Cicatrização de
Queimaduras em Pele, estudo clínico e histológico em ratos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Analisar histologicamente o processo inflamatório, reação de granulação e
fibroplasia das feridas;
Avaliar macroscopicamente as ferida nos grupos;
Calcular o índice de retração das feridas em cada grupo;
Aferir a quantidade de ração consumida por cada grupo de tratamento durante
os tempos de sacrifícios;
Aferir a quantidade de água consumida por cada grupo de tratamento durante
os tempos de sacrifícios.
26
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
Trata-se de um estudo de caráter experimental in vivo, quantitativo e
randomizado.
3.2 ASPECTOS ÉTICOS
Para a realização deste estudo foram seguidas as premissas da COBEA
(Colégio Brasileiro de Experimentação Animal). Este estudo foi aprovado pelo
Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) do Centro de Ensino Superior e
Desenvolvimento (CESED) nº 0019/240712.
3.3 AMOSTRA
Foram utilizados 100 ratos, adultos, da espécie Ratthus norvegicus, classe
Mammalia, ordem Roedentia, da linhagem Wistar, provenientes do biotério do
Departamento de Medicina da Universidade Federal de Campina Grande – UFCG.
Os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno com cama de maravalha,
cada subgrupo (5 ratos) foi divididos em duas gaiolas respectivamente com 2 e 3
animais. A temperatura variava de 23°C ± 2°C sob iluminação controlada (12 hs de
ciclo claro/escuro) com condições adequadas de ração e água ad libitum.
3.3.1 Critérios de inclusão e exclusão da amostra
Os animais selecionados nesta pesquisa foram ratos machos, da linhagem
Wistar, com idade entre 60 a 90 dias e peso entre 200 a 250 gramas. Foram
excluídos do estudo aqueles animais que apresentaram qualquer sinal ou sintoma
de enfermidade local ou sistêmica.
27
3.3.2 Tipos de grupos de tratamento
Os 100 animais foram divididos aleatoriamente em 5 grupos experimentais
(n=20), com subgrupo de 5 ratos para cada tempo de sacrifício (3, 7, 14 e 21 dias),
conforme descrito na figura 1.
Figura 1: Fluxograma dos grupos de tratamento em função dos subgrupos e dos
tempos de sacrifícios. G1-CTR-controle, G2-LVER– Laser vermelho, G3-LINF- Laser
Infravermelho, G4-TFD-Terapia Fotodinâmica, G5- LED – diodos emissores de luz
(LEDs), SG- subgrupos e TS- tempo de sacrifício.
3.4 MÉTODO EXPERIMENTAL
Utilizou-se uma balança analítica (série shimadzu AUY229, São Paulo, SP,
Brasil) (figura 3A) para o controle do peso do animal e da ração consumida e uma
garrafa de água para ratos (figura 3B), com o intuito de calcular da quantidade de
àgua ingerida. Os animais foram pesados antes do experimento e cada gaiola
recebia diariamente uma quantidade de 200 gramas de ração, o consumo era
28
calculado pela diferença da massa entre dois dias consecutivos. Diariamente, cada
gaiola recebia uma garrafa de água para ratos com 250 mL/H2O, essa quantidade
era medida por uma proveta e o consumo calculado pela diferença entre dois
consecutivos.
3.4.1 Anestesia/Tricotomia
Os animais foram anestesiados com uma associação anestesica de 100 mg/Kg
de Ketamina (Cetamin®, Syntec, São Paulo, SP, Brasil) 10% e 5 mg/Kg de Xilazyna
2% (Dopaser®, Syntec, São Paulo, SP, Brasil) aplicados na região intraperitoneal
(figura 4A), através de uma seringa descartável para insulina com agulha de 1 mL.
Depois de constatado o plano anestésico profundo, realizou-se a tricotomia do dorso
do animal (figura 4B), com lâmina de barbear descartável, água e sabão neutro.
3.4.2 Indução da Queimadura
A indução da queimadura foi realizada no dorso de todos os animais com um
instrumental de ferro, com ponta ativa chata e plana de diâmetro 1,0 X 1,0 X 1,0 cm3
(Figura 4C) previamente confeccionado, segundo metodologia empregada por Meyer
e Silva (1999) modificada nas dimensões (5.5 x 2.0 x 2.0 cm3). Esse instrumento foi
aquecido com auxílio de maçarico até que ficasse rubro. O aquecimento se deu pela
chama azul do maçarico em contato direto com o ferro por 40 segundos (Figura 4D).
Quando atingindo esse estado, o instrumental era imediatamente encostado no
dorso do animal (Figura 4E), permanecendo por 20 segundos, queimando a pele
(Figura 4F).
3.4.3 Estudo piloto
Foram selecionados aletoriamente dois animais com intuito de definir o tipo e a
padronização da queimadura. Realizou-se em ambos a anestesia, tricotomia,
aquecimento do instrumento metálico no maçarico por 40 segundos, diferindo no
tempo de queimadura em pele, 20 e 30 segundos respectivamente. Após a leitura
29
das lâminas em Hematoxilina e Eosina, optou-se pelo tempo de 20 segundos,
constatando uma destruição total da epiderme e derme, característico da
queimadura de terceiro grau.
3.5 CARACTERÍSTICAS DO LASER
Neste estudo foi utilizado o laser de baixa intensidade (MMO TWIN FLEX
Evolution, São Carlos, Brasil) InGaAlP – Fosfeto Índio de Gálio e Alumínio, na
emissão vermelha (λ660 nm), e AsGaAl – Arseneto de Gálio e Alumínio, na emissão
infravermelha (λ780 nm). O laser foi devidamente calibrado e possuía potência de
saída de 40 mW (Figura 5A).
3.6 CARACTERÍSTICAS DO LED
Utilizou-se neste estudo os LEDs (KONDORTECH, São Paulo, Brasil) InGaN –
Nitreto Índio e Gálio, na emissão verde (λ520 a 550 nm), devidamente calibrado com
potência de saída individual 60 mW ( Figura 5B).
3.7 TIPOS DE TRATAMENTOS
Aplicação do laser foi feita por um único operador devidamente calibrado e
seguiu as normas de segurança necessárias, ressaltando a utilização dos óculos de
segurança para operador e demais assistentes e utilização de um filme plástico entre
a superfície da ferida e do equipamento evitando assim possíveis contaminações.
Os grupos de tratamento foram divididos, em:
G1 – Controle (CTR)
Não foi aplicado nenhum tipo de tratamento. Tempos de sacrifícios foram 3, 7,
14 e 21 dias após a queimadura.
G2 - laser vermelho – Laser λ660 nm (LVER) – Modo de Aplicação: Pontual
30
A irradiação (40J/cm²; 40 mW; 40s, 660nm) foi aplicada imediatamente após a
queimadura, com o laser de baixa intensidade - InGaAlP (MMO TWIN FLEX
Evolution, São Carlos, Brasil) aplicado de forma pontual em quatro pontos
coincidentes com os ângulos da ferida (Figura 5D), e em cada ponto depositada a
quantidade de 10J/cm2, totalizando 40J/cm2 por sessão de laserterapia. Aplicações
eram diárias, com exceção do dia do sacrifício do animal, na qual não se realizava a
irradiação. Os tempo de sacrifícios foram 3, 7, 14 e 21 dias após a queimadura.
G3 - laser infravermelho – Laser λ780 nm (LINF) – Modo de Aplicação: Pontual
A irradiação (40J/cm²; 40 mW; 40s, 780nm) foi aplicada imediatamente após a
queimadura, com o laser de baixa intensidade - AsGaAl (MMO TWIN FLEX
Evolution, São Carlos, Brasil) aplicado de forma pontual em quatro pontos
coincidentes com os ângulos da ferida (Figura 5D), e em cada ponto depositada a
quantidade de 10J/cm2, totalizando 40J/cm2 por sessão de laserterapia. Aplicações
eram diárias, com exceção do dia do sacrifício do animal, na qual não se realizava a
irradiação. Os tempo de sacrifícios foram 3, 7, 14 e 21 dias após a queimadura.
G4 – Terapia Fotodinâmica (TFD) – Laser λ660 nm associado ao
fotossenssibilizador azul de metileno 0,5 µg/mL - Modo de Aplicação: Pontual
O fotossenssibilizador (FS) azul de metileno (AM) chimiolux (Hypofarma,
Ribeirão das Neves, MG, Brasil) possuía a concentração de 100 µg/mL (Figura 5E).
Segundo Barbosa et al. (2011) concentrações acima de 1 µg/mL são tóxicas, deste
modo, realizou-se a diluição com água deionizada (0,66 µs/ cm) para a
concentração de 0,5 µg/mL. Logo após, com uma seringa descartável, aplicou-se
gotas do AM (Figura 5F) e 5 minutos depois, aplica-se o laser (40J/cm²; 40 mW; 40s,
λ660nm) de forma pontual (Figura 5G) em quatro pontos coincidentes com os
ângulos da ferida (Figura 5H), e em cada ponto depositada a quantidade de 10J/cm2,
totalizando 40J/cm2 por sessão.
31
G5 – diodos emissores de luz - LEDs – λ520 a 550nm – Modo de Aplicação:
Pontual
A irradiação (60 mW/cm2; 40s, λ520 a 550nm) foi aplicada imediatamente após
a queimadura, com o laser de baixa intensidade (KONDORTECH, São Paulo, Brasil)
InGaN aplicado de forma pontual em quatro pontos coincidentes com os ângulos da
ferida, e em cada ponto depositada a quantidade de 60mW/cm2, totalizando
240mW/cm2 por sessão.
3.8 EUTANÁSIA DOS ANIMAIS E CÁLCULO DO ÍNDICE DE RETRAÇÃO DA
FERIDA (IRF)
Terminado o período experimental para cada subgrupo definido em 3, 7, 14 e
21 dias os animais foram submetidos à nova administração de anestésico em
quantidade três vezes maior àquela utilizada para anestesia (300 mg/Kg de
Ketamina (Cetamin®, Syntec, São Paulo, SP, Brasil) 10% e 15 mg/Kg de Xilazyna
2% (Dopaser®, Syntec, São Paulo, SP, Brasil) injetada no peritônio. Após a
Eutanásia, realizou-se com auxilio do paquímetro digital o cálculo do índice de
retração da ferida (IRF) pela fórmula: IRF (%) = Área inicial- Área do dia do
sacrifícios ÷ Área inicial x 100. Área inicial tinha 1cm2 e a área do dia do sacrifício foi
calculada pelo quadrado do raio multiplicado por pi (r2π).
3.9 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO
Depois de constatado a morte do animal através da cessação dos sinais vitais
e opacificação da córnea foi realizada a remoção da espécime. Utilizando um bisturi
a ferida foi excisada com margem de segurança de 0,5cm e acondicionada em
recipiente plástico contendo formol a 10% com volume aproximadamente igual a 5
vezes o volume da peça, onde permaneceu por um período mínimo de 24 horas.
Após o período de fixação a peça foi processada seguindo os métodos rotineiros
para coloração em Hematoxilina-Eosina (HE) e Picrosírius. Todo o processamento,
coloração e leitura das lâminas em HE foi realizado no Laboratório de Histopatologia
32
Oral da UEPB, enquanto a coloração, leitura e calibração das lâminas em picrosírius,
realizou-se no laboratório de morfologia e biologia estrutural(LMBE) UNIT-SE.
3.9.1 Método de avaliação Histológica
3.9.1.2 Infiltrado Inflamatório
Análise do infiltrado inflamatório realizado nos cortes histológicos em HE, foi
descritivo para os grupos de tratamento dentro dos tempos de sacrifícios.
3.9.1.3 Análise Morfológica do Colágeno
Cortes histológicos corados em picrosírius e analisadas sob luz polarizada
foram utilizados para a análise descritiva e quantitativa da deposição de colágeno.
As fibras de colágeno foram classificadas de acordo com o seu padrão de
birrefringência (esverdeado / amarelo-esverdeada ou laranja), aparência morfológica
(ondulados ou estirados, delgadas ou espessas, curto ou longo) e disposição
(reticular, paralela ou entrelaçado).
3.9.1.4 Análise Quantitativa da área de Colagenação (AC)
A quantificação da área ocupada pela deposição de colágeno na área de ferida
foi determinada pela densidade óptica do sistema de análise de imagens em 8
campos microscópicos de cada lâmina com amplificação de 100x. O sistema
utilizado consiste de uma câmara de vídeo CCD Sony DXC-101 aplicado a um
microscópio Olympus CX31, a partir do qual as imagens foram enviadas para um
monitor (Trinitron Sony). Por meio de um sistema de digitalização (Olympus C-7070
WideZoom) as imagens foram carregados em um computador (Pentium 133 MHz) e
processados utilizando o software (ImageTool), que proporcionará a interpretação e
a obtenção de valores de mensuração das fibras colágenas, através da
33
quantificação de suas medidas originais, optando em transformar a medida da
imagem digitalizada (o pixel) em medida micrometrada.
Figura 2. Fluxograma da área de colagenização e da análise descritiva das fibras
colágenas.
Os limiares para as fibras colágeno foram estabelecidos para cada lâmina,
depois de aumentar o contraste até um ponto em que as fibras foram facilmente
identificadas como birrefringentes (colágeno). A área ocupada pelas fibras foi
determinada pelos limiares das diferentes densidades de cores do colágeno e
destacada por uma ferramenta de seleção.
3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Na análise estatística foi utilizado o programa Statistical Package for the Social
Sciences (SPSS) versão 17.0. Foram aplicados os testes de Shapiro-Wilk para
verificação da normalidade dos dados, sendo considerado o nível de significância de
5% para as diferenças observadas quando p<0,05. A significância estatística da área
de colagenização e análise quantitativa da água consumida foram avaliadas pela
análise de variância (ANOVA) com pós teste Tukey e Bonferroni, respectivamente,
34
com exceção da ingestão da água em 21 dias, da ração consumida e do cálculo do
IRF em 3, 7 e 21 dias que utilizaram o teste de kruskall Wallis. O IRF em 14 dias foi
avaliado pela ANOVA com pós teste de Tukey.
35
Figura 3
Figura 3A. Balança Analítica Marte utilizada na pesagem dos ratos e da ração
(Campina Grande-PB/2013).
Figura 3B. Garrafa de Água para Ratos (Campina Grande-PB/2013).
36
Figura 4
Figura 4A. Anestesia Intraperitoneal realizada com associação anestésica com
Ketamina 10% e Xilazyna 2% (Campina Grande-PB/2013).
Figura 4B. Tricotomia realizada no dorso do rato (Campina Grande-PB/2013).
Figura 4C. Instrumental metálico de queimadura (Campina Grande-PB/2013).
Figura 4D. Aquecimento do instrumental metálico pela chama azul do maçarico
(Campina Grande-PB/2013).
Figura 4E. Indução da queimadura no dorso do animal por meio da ponta aquecida
do instrumental (Campina Grande-PB/2013).
Figura 4F. Aspecto da queimadura no dorso do rato (Campina Grande-PB/2013).
37
Figura 5
Figura 5A. Aparelho Laser MMO TWIN FLEX Evolution com caneta λ660nm ou
λ780nm, 40mW (Campina Grande-PB/2013).
Figura 5B. Aparelho LED KONDENTECH com caneta λ520nm a 550nm, 60mW
(Campina Grande-PB/2013).
Figura 5C. Irradiação de um dos pontos da queimadura com laser de λ660nm
(Campina Grande-PB/2013).
Figura 5D. Os quatros pontos de irradiação coincidente com os ângulos da
queimadura do laser λ660nm ou λ780nm ou TFD (λ660nm associado ao azul de
metileno). (Campina Grande-PB/2013).
Figura 5E. Azul de Metileno Quimiloux, 100µg/mL (Campina Grande-PB/2013).
Figura 5F. Aplicação de gotas do azul de metileno 0,5µg/mL na ferida com auxilio de
uma seringa descartável (Campina Grande-PB/2013).
38
Figura 5G. Irradiação de um dos pontos da queimadura com LED de λ520 a λ 550
nm (Campina Grande-PB/2013).
Figura 5H. Irradiação da luz LED nos quatros pontos coincidente com os ângulos da
queimadura (Campina Grande-PB/2013).
Figura 5I. Aferição do diâmetro da ferida com auxilio de um paquímetro digital
(Campina Grande-PB/2013).
40
4 ARTIGOS A SEREM SUBMETIDOS
Artigo 1 - Efeitos do Led verde e Laser vermelho no processo de cicatrização de
queimaduras de terceiro grau: estudo clínico e histológico em ratos será
submetido ao periódico Laser in Medical Science.
Artigo 2 - Ação do laser infravermelho e da Terapia fotodinâmica no processo
de cicatrização de queimaduras de terceiro grau em pele: Análise clínica e
histológica em ratos será submetido ao periódico Journal of Photochemistry and
Photobiology B: Biology.
41
4.1 ARTIGO 1
Efeitos do Led verde e Laser vermelho no processo de cicatrização de
queimaduras de terceiro grau: estudo clínico e histológico em ratos
Roniery de Oliveira Costa ● Cassiano Francisco Weege Nonaka ● Ricardo Luiz
Cavalcanti de Albuquerque Júnior ● Patrícia Meira Bento ● Maria Helena Chaves de
Vasconcelos Catão
Resumo:
O objetivo desta pesquisa foi avaliar os efeitos do laser vermelho e do Led verde na cicatrização de queimaduras em pele, através da analise clínica e histopatológica em ratos. Para tanto, 60 animais foram aleatoriamente distribuídos em três grupos: controle (CTR), laser vermelho (LVER) e Led verde (LED). A indução da queimadura foi realizada no dorso do rato através da aplicação por 20 segundos de um instrumento metálico previamente aquecido por 40 segundos na chama azul do maçarico. O tratamento para os grupos experimentais foi laser vermelho (10J/cm2, 10s, λ660 nm) e Led verde (60J/cm2, 10s, λ520 a 550 nm) aplicados pela técnica pontual em quatro pontos coincidentes com os ângulos da ferida. As aplicações eram diárias até o dia anterior à morte animal que se deu em 3, 7, 14 e 21 dias com overdose de anestésico intraperitoneal. Os espécimes removidos foram analisados clinicamente e logo após processadas e corados em hematoxilina-eosina e picrosírius, analisados sob microscopia de luz e luz polarizada, respectivamente. Os animais tratados com laser vermelho e Led verde estimularam a produção, maturação do colágeno (p<0,001 e p<0,05, respectivamente) e aumento do consumo de ração e água (p<0,001) comparado ao grupo controle. O laser λ660 nm apresentou a maior retração da ferida dos grupos (p=0,012). Em conclusão, o laser vermelho e Led verde apresentaram efeitos benéficos na aceleração do processo de cicatrização de queimaduras de terceiro grau.
Palavras-Chaves Cicatrização ● Lasers ● Queimaduras ● Ratos.
R.O. Costa* ● C.F.W. Nonaka ● P.M. Bento ● M.H.C.V. Catão Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Estadual da Paraíba, R. Baraúnas, 351, Bodocongó, Campina Grande - PB, 58429-500, Brasil *Email: [email protected] R.L.C. Albuquerque Júnior Programa de Pós-Graduação em Saúde e Ambiente da Universidade Tiradentes, Av. Murilo Dantas, 300, Farolândia, CEP 49030-490, Aracaju/SE, Brasil
42
Introdução
A queimadura é um tipo de ferida aberta em que o processo cicatricial ocorre
por segunda intenção [1], resultando em perda de líquidos corporais, inflamação,
edema, infecção, dor e choque, todos estes fatores podem resultar em morte da
vítima [2-5].
Nas queimaduras de terceiro grau, a lesão acomete toda espessura da pele,
envolvendo toda a epiderme e derme e, em alguns casos, se estendem aos tecidos
subcutâneos, músculos e ossos. Podem ter um aspecto branco, marrom ou ter uma
textura de couro [6-8].
Um dos tratamentos evidenciados na literatura na aceleração do processo de
cicatrização de queimaduras é a laserterapia [6,9-17] e recentemente os diodos
emissores de luz (Leds) [18-21]. Os primeiros trabalhos foram conduzidos por
Mester e colaboradores, que observaram que o laser é capaz de modular processos
biológicos, em particular, estimular processo de regeneração tecidual [22].
O laser de baixa intensidade tem demostrado efeitos benéficos no processo de
cicatrização de queimaduras, atuando no infiltrado inflamatório, reepitelização,
formação e maturação do colágeno, além da sua ação analgésica e anti-inflamatória
[6,9-11,14,15,23]. Porém, ainda existe falta de padronização na escolha do melhor
comprimento de onda, potência, frequência, densidade de energia associado às
propriedades ópticas do tecido irradiado [24-26].
Os diodos emissores de luz (LEDs) são pequenos dispositivos robustos que
atuam com faixa de comprimento de onda, variando do espectro ultravioleta ao
infravermelho [27] e são utilizados na odontologia [28,29]. No entanto, recentemente
têm sido estudados seus efeitos sobre o processo de reparo em incisões [21,30] e
queimaduras [18-20].
O objetivo deste estudo foi avaliar a ação do Led verde e Laser vermelho no
processo de cicatrização de queimaduras de terceiro grau: estudo clínico e
histológico em ratos.
Materiais e Métodos
43
Animais
Nesta pesquisa foram utilizados 60 ratos machos da linhagem Wistar com 200
a 250 gramas, provenientes do biotério do Departamento de Medicina da
Universidade Federal de Campina Grande e mantido em gaiolas de polipropileno
revestido com cama de maravalha, submetidos a temperatura (23°C ± 2°C) e
iluminação (12 hs de ciclo claro/escuro) controlada com ração e água ad libitum. Os
animais foram divididos aleatoriamente em 3 grupos experimentais: G1- Controle
(CTR), G2-Laser infravermelho (LINF) e G3-Terapia fotodinâmica (TFD), cada grupo
com 20 animais foram divididos em subgrupos de 5 animais para cada tempo de
3,7,14 e 21 dias de sacrifício. Essa pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética no
Uso de Animais (CEUA) /CESED, conforme parecer nº 0019/240712.
Ração e Água consumida
Utilizou-se uma balança analítica para o controle do peso do animal e da ração
consumida, além de uma garrafa de água para ratos com o intuito de calcular da
quantidade de água ingerida. Os animais eram pesados antes do experimento e
cada gaiola recebia diariamente uma quantidade de 200 gramas de ração e 250mL
de água. O consumo da ração era calculado pela diferença do seu peso entre dois
dias consecutivos, enquanto a ingestão de água era quantificada com uma proveta e
o consumo calculado pela diferença entre dois consecutivos.
Queimadura
Os animais foram anestesiados com uma associação anestesica de 100 mg/Kg
de Ketamina 10% e 5 mg/Kg de Xilazyna 2% aplicados na região intraperitoneal,
logo após realizou-se a tricotomia do dorso do animal com uma lâmina de barbear
descartável associado a água e sabão neutro. A indução da queimadura foi
realizada no dorso de todos os animais com um instrumental de ferro de 1,0 X 1,0 X
1,0 cm3 que foi aquecido com auxilio de maçarico até que ficasse rubro. O
44
aquecimento se deu pela chama azul do maçarico em contato direto com o ferro por
40 segundos. Quando atingindo esse estado, o instrumental era imediatamente
encostado no dorso do animal, permanecendo por 20 segundos, queimando a pele.
Estudo piloto
Foram selecionados aleatoriamente dois animais com intuito de definir o tipo e
a padronização da queimadura. Realizou-se em ambos a anestesia, tricotomia,
aquecimento do instrumento metálico no maçarico por 40 segundos, diferindo no
tempo de queimadura em pele, 20 e 30 segundos respectivamente. Após a leitura
das lâminas em Hematoxilina e Eosina, optou-se pelo tempo de 20 segundos,
constatando uma destruição total da epiderme e derme, característico da
queimadura de terceiro grau.
Irradiação a Luz
A irradiação com laser vermelho (MMO TWIN FLEX Evolution®, São Carlos,
Brasil com 10J/cm²; 40 mW; 10s, λ660 nm/InGaAlP) e Led verde (KONDORTECH,
São Paulo, Brasil com 60J/ cm²; 60 mW; 10s e λ520 a 550 nm/InGaN) foi realizada
imediatamente após a queimadura, de forma pontual nos quatro pontos coincidentes
com os ângulos da ferida. No laser vermelho, em cada ponto, foi depositada a
quantidade de 10J/cm2, totalizando 40J/cm2 por sessão, enquanto no Led Verde era
aplicado 60J/cm², totalizando 240J/cm2. As aplicações foram realizadas diariamente,
com exceção do dia do sacrifício do animal, na qual não se realizava a irradiação.
Eutanásia dos animais e Índice de retração da ferida
Terminado o período experimental para cada subgrupo (3, 7, 14 e 21 dias), os
animais foram submetidos à nova anestesia peritoneal em quantidade três vezes
maior àquela utilizada para anestesia (300 mg/Kg de Ketamina (Cetamin®, Syntec,
São Paulo, SP, Brasil) 10% e 15 mg/Kg de Xilazyna 2% (Dopaser®, Syntec, São
45
Paulo, SP, Brasil). Após a Eutanásia, realizou-se com auxilio do paquímetro digital o
cálculo do índice de retração da ferida (IRF) pela fórmula: IRF (%) = Área inicial-
Área do dia do sacrifícios ÷ Área inicial x 100. Área inicial tinha 1cm2 e a área do dia
do sacrifício foi calculada pelo quadrado do raio multiplicado por pi (r2π)
Processamento Histológico
Depois de constatado a morte do animal através da cessação dos sinais vitais
e opacificação da córnea foi realizada a remoção do espécime. Utilizando um bisturi
a ferida foi excisada com margem de segurança de 0,5cm e acondicionada em
recipiente plástico contendo formol a 10%. Após o período de fixação a peça foi
processada seguindo os métodos rotineiros para coloração em Hematoxilina-Eosina
(HE) e Picrosírius.
Aspectos morfológicos das células inflamatórias e das fibras colágeno
Na análise morfológica do HE foi realizado a descrição das células
inflamatórias nos grupos de tratamento dentro do mesmo tempo de sacrifícios.
Cortes histológicos corados em picrosírius e analisadas sob luz polarizada foram
utilizados para a análise descritiva e quantitativa da deposição de colágeno. As
fibras de colágeno foram classificadas de acordo com o seu padrão de
birrefringência (esverdeado / amarelo-esverdeada ou laranja), aparência morfológica
(ondulada ou estirada, espessa ou delgada, curta ou longa) e disposição (reticular,
paralela ou entrelaçado).
Análise quantitativa da área de colagenização (AC)
A quantificação da área ocupada pela deposição de colágeno na ferida foi
determinada pela densidade óptica do sistema de análise de imagens em 8 campos
microscópicos para cada lâmina com amplificação de 100x. O sistema utilizado
consiste de uma câmara de vídeo CCD Sony DXC-101 aplicado a um microscópio
46
Olympus CX31, a partir do qual as imagens foram enviadas para um monitor
(Trinitron Sony). Por meio de um sistema de digitalização (Olympus C-7070
WideZoom) as imagens foram carregadas em um computador (Pentium 133 MHz) e
processadas utilizando o software (ImageTool), que proporcionou a interpretação e a
obtenção de valores de mensuração das fibras colágenas, através da quantificação
de suas medidas originais, optando em transformar a medida da imagem digitalizada
(o pixel) em medida micrometrada, utilizando-se um barra milimetrada de 50 ɥ m.
Os limiares para as fibras colágeno foram estabelecidos para cada lâmina, depois de
aumentar o contraste até um ponto em que as fibras foram facilmente identificadas
como birrefringentes (colágeno). A área ocupada pelas fibras foi determinada pelos
limiares das diferentes densidades de cores do colágeno e destacada por uma
ferramenta da seleção.
Análise Estatística
Na análise estatística foi aplicado o teste de Shapiro-Wilk para verificação da
normalidade dos dados, sendo considerado o nível de significância de 5% para as
diferenças observadas quando p<0,05. A significância estatística da área de
colagenização e análise quantitativa da água consumida foram avaliadas pela
análise de variância (ANOVA) com pós teste Tukey e Bonferroni, respectivamente,
com exceção da ingestão da água em 21 dias, da ração consumida e do cálculo do
IRF em 3, 7 e 21 dias que utilizaram o teste de kruskall Wallis. O IRF em 14 dias foi
avaliado pela ANOVA com pós teste de Tukey.
Resultados
Índice de Retração da Ferida
Em 3 dias não houve diferença significativa no IRF nos grupos de tratamento.
Em 7 dias o índice nos grupo LVER (mediana -53%), LED (-100%) e CTR (-127%)
foram estatisticamente diferentes (p=0,006). Com 14 dias IRF nos grupos LVER
47
(média 7,8 ± 14,1%) e LED (-9,6 ± 15,4%) foram maiores (p=0,0001 e p=0,013,
respectivamente) que o CTR (-49 ± 18,2%). Em 21 dias o grupo LVER (mediana
72%) apresentou a maior retração da ferida (p=0,012) quando comparado ao CTR
(5%) e LED (5%) (fig. 1 e 2).
Fig. 1 Queimadura em pele de ratos por cada grupo de tratamento durante os
tempos de sacrifícios.
48
5 10 15 20 25
-200
-150
-100
-50
0
50
100CTR
LVER
LED
*
*****
#
Tempo (dias)Índ
ice
de
retr
ação
da
feri
da
(%)
Fig. 2. Avaliação do índice de retração da ferida de cada grupo de tratamento
durante os tempos de sacrifícios.
* Diferença significativa entre os grupos (p=0,006)
** Diferença significativa do LVER com CTR (p=0,0001)
*** Diferença significativa do LED com CTR (p=0,013)
# Diferença significativa do LVER e LED com CTR (p=0,012)
Ração e Água consumida
Em 3 dias de tratamento não houve diferença no consumo de ração e água
entre os grupos. Aos 7 dias o grupo LVER (média 39,28±0,75 mL) ingeriu uma maior
quantidade de água (p=0,013) em relação ao grupo CTR (média 36,71±1,25mL). A
ração consumida não apresentou diferença entre os grupos. Em 14 dias os grupos
LVER (mediana 23g) e LED (mediana 21,5g) consumiram uma quantidade superior
de ração (p=0,04) comparado ao grupo CTR (mediana 18g). Os animais do grupo
LVER (média 40,28±1,38mL) ingeriram uma maior quantidade de água em relação
aos grupos CTR (37±1,17mL) e LED (38,64±2,13mL), p<0,001 e p=0,032
respectivamente. Além do mais, o grupo LED consumiu uma quantidade de água
superior ao CTR (p=0.032). Aos 21 dias os grupos LVER (mediana 25g) e LED
49
(mediana 23g) consumiram uma maior quantidade de ração (p=0,001) em relação ao
CTR (mediana 20g), enquanto os grupos LVER (mediana 40mL) e LED (mediana
39mL) ingeriram uma quantidade superior de água (p<0,001) comparada ao CTR
(mediana 38mL).
Infiltrado inflamatório
Na análise morfológica em três dias os grupos revelaram infiltrado inflamatório
composto por neutrófilos que permeavam as fibras musculares nas margens da
ferida. Na porção mais central da queimadura, a inflamação era predominantemente
linfocítica e limitada ao tecido conjuntivo fibroso frouxo hipodérmico, bem como foi
observado uma proeminente dilatação vascular (arteríolas e vênulas), por vezes
associada à marginação leucocitária (fig. 3a).
Em 7 dias os grupos exibiram infiltrado inflamatório predominantemente
neutrofílico, disposto tanto nas margens quanto na porção mais central da ferida.
Nesta última região, o infiltrado inflamatório limitava-se ao tecido conjuntivo fibroso
frouxo hipodérmico. Como identificado no período de 3 dias, foi observada
importante dilatação de arteríolas e vênulas, com ocasional marginação leucocitária
(fig. 3b).
Com 14 dias os grupos apresentaram infiltrado inflamatório constituído por
linfócitos, macrófagos e neutrófilos. Estes últimos predominavam em áreas
superficiais da ferida. Tanto nas margens quanto nas áreas centrais da ferida, era
possível constatar a presença de exuberante reação de granulação, com vasos
sanguíneos neoformados e fibroblastos jovens, dispostos em meio a uma matriz
extracelular constituída por feixes colágenos delgados e alongados. As queimaduras
se apresentavam recobertas por crosta seroemática de espessura variável e exibiam
reepitelização em estágios iniciais (fig. 3c).
Em 21 dias os grupos exibiram infiltrado inflamatório constituído por neutrófilos,
linfócitos e macrófagos, com predomínio do componente mononuclear. Ao longo de
toda a extensão da ferida, evidenciava-se uma exuberante reação de granulação,
com vasos sanguíneos neoformados, muitos dos quais ingurgitados, e fibroblastos
50
jovens, dispostos em meio a uma matriz extracelular constituída por feixes
colágenos ora curtos ora alongados, com espessuras variadas (fig. 3d). Em
comparação com o período de 14 dias, as fibras colágenas se apresentavam mais
espessas e mais densamente organizadas. As queimaduras se apresentavam
recobertas por crosta de espessura variável e exibiam reepitelização em estágios
ainda parciais.
Fig. 3. Cortes histológicos dos grupos CTR (a), LED (b), LVER (c) e LED (d) nos
tempos 3,7,14 e 21 dias, respectivamente (HE,100x). Em destaque nas
fotomicrografias (a) e (b) o infiltrado inflamatório composto por neutrófilos que
permeavam as fibras musculares nas margens da ferida e, em (c) e (d) predomínio
de linfócitos, macrófagos e neutrófilos (HE, 400x).
51
Quantificação do colágeno usando a luz polarizada
Em 3 e 7 dias, não houve formação de colágeno nos grupos de tratamento,
com 14 dias não houve diferença significativa nas áreas de colagenização entre os
grupos: LED e CTR/ LVER e LED. Entretanto, os animais tratados com o LVER
apresentaram uma maior área de colagenização (p<0,05) comparado ao CTR (Fig.
4a). Em 21 dias o grupo LVER apresentou uma área de colagenização bastante
superior (p<0,001) aos demais grupos, enquanto o LED apresentou uma maior área
de colagenização (p<0,05) em relação ao CTR (Fig. 4b).
Fig. 4 Áreas de colagenização formada em 14 dias (a) pelos grupos CTR, LVER e
LED e, em 21 dias (b) pelos grupos CTR, LVER e LED.
*Diferença significativa com CTR (p<0,05)
**Diferença significativa com CTR e LED (p<0,001)
Descrição morfológica do colágeno usando a luz polarizada
As fibras colágenas em 14 dias nos grupos CTR (Fig.5a), LVER (Fig.5b ) e
LED (Fig.5c) apresentaram em relação ao seu padrão de birrefringência um
predomínio do colágeno tipo I nos grupos LVER (n=3 ratos/60%) e LED (n=3
ratos/60%), enquanto no grupo CTR foi observado em 20% dos animais (n=1 rato).
Quanto à aparência morfológica e a disposição, não houve variações nas
descrições, apresentando em todos os animais fibras colágenas onduladas,
delgadas, curtas e reticulares.
52
As Fig. 5d, 5e e 5f mostram o colágeno em 21 dias nos grupos CTR,LVER e
LED, respectivamente. Neste tempo, os grupos LVER e LED apresentaram em
relação ao seu padrão de birrefringência um predomínio de colágeno tipo I em todos
os animais, e o grupo CTR apresentou em 60% dos ratos (n=3 animais). Aparência
morfológica e a disposição das fibras do grupo do LVER foram estiradas, espessas,
longas e reticulares em 3 animais (60%), no grupo LED 20% apresentava essa
característica e o CTR apresentou fibras onduladas, delgadas, curtas e reticulares
(100%).
Fig. 5. Fotomicrografias das áreas de colagenização da ferida nos grupo CTR (a),
LVER (b) e LED(c) em 14 dias e, em 21 dias os grupo CTR (d), LVER(e) e LED(f),
(Picrosírius, 100x, 50 ɥ m).
Discussão
Neste estudo, o aumento significativo do consumo da ração e água ingerida
pelos grupos nos tempos de sacrifícios, provavelmente seja decorrente do efeito
analgésico do LVER e LED, já que estudos imuno-histoquímicos [31] afirmam que o
53
laser de baixa intensidade (LBI) inibem a expressão da enzima ciclo-oxigenase 2,
evitando a conversão do ácido araquidônico em prostaglandina [32]. Apesar do
grupo LVER já ingerir uma quantidade de água significativa em relação ao CTR em 7
dias, destaca-se os resultados do LED, diodo emissor de luz bastante utilizado na
odontologia no clareamento dental e pouco estudado na cicatrização de
queimaduras de terceiro grau.
Um dos principais efeitos da absorção do LVER na pele é a estimulação das
mitocôndrias, o que resulta no aumento de energia das células, estimulação da
liberação de mediadores químicos e na ativação da síntese de ácido nucleico [33].
Por outro lado, o LED tem seus efeitos sobre a bicamada lipídica da membrana
celular, como as extremidades polarizadas dos lipídios tendem a rotacionar em
direção à fonte de luz, ocorre alteração da estrutura da membrana devido à
transferência de energia pelas proteínas da bicamada [34].
Na análise do IRF observou-se principalmente nos tempos de 3 e 7 dias valores
negativos, possivelmente decorrentes do edema intersticial que aumenta as
dimensões macroscópicas da ferida. Nos demais tempos o aumento da retração da
ferida provavelmente seja decorrente da diferenciação miofibroblástica. Ribeiro et al.
[14] afirmaram que o LVER estimula o aumento de miofibroblastos na queimadura,
sugerindo também a transformação de fibroblastos em miofibroblastos nas fases
iniciais. No entanto, Al-Waltban e Delgado [24] discordaram dos resultados
encontrados, afirmaram que o LVER não acelera a retração da ferida.
O LVER e o LED, neste estudo, promoveram uma substituição mais rápida das
fibras de colágeno do tipo III para o tipo I e uma formação de colágeno significativa a
partir de 14 dias para LVER e 21 dias para LED comparado ao CTR. A maioria dos
estudos evidenciam os benefícios do LVER [6,9-11,14,15] e/ou LED [18-20] no
processo de cicatrização em queimaduras. Apoiando estes resultados, Pereira et al.
[35] e Pereira et al. [36] demostraram que o LVER é capaz de regular a liberação de
citocinas que são responsáveis pela proliferação de fibroblastos e síntese de
colágeno, tal como fator de crescimento fibroblástico ácido (FGF-α) e fator
transformante de crescimento beta (TGF-β), respectivamente. Entretanto, autores
afirmam que a irradiação com LVER [24,25,37,38] e/ou LED [39] não auxiliam no
54
processo de cicatrização de queimaduras.
Além do mais, a dose diária de 40J/cm2 aplicada em 21 dias no grupo LVER
foi eficaz na estimulação dos fibroblastos na formação de colágeno e na retração da
ferida, contrariando os estudos de Meireles et al. [15] que afirmaram que doses
acima de 38J/cm2 possuem efeitos inibitórios sobre estes tipos celulares.
Provavelmente essa divergência na eficácia da interação luz-tecido seja dependente
da falta de padronização na escolha do comprimento de onda, potência, frequência e
densidade de energia associado às propriedades ópticas do tecido irradiado [26,40].
A quantidade significativa de colágeno formada em 21 dias pelo grupo LVER
pode ser confundida com a formação de cicatrizes hipertróficas [41], entretanto
durante a análise morfológica não foi constatado a formação da última fase do
processo de cicatrização (maturação ou remodelação) [42,43], deste modo pode-se
afirmar neste estudo que a síntese de colágeno, não formou cicatrizes e seja
decorrente da aceleração do processo de cicatrização. A reepitelização parcial
encontrada neste estudo é justificada por autores [10,15] que demonstram que a
irradiação do LVER em queimaduras de terceiro grau por 21 dias favoreceu o
processo de cicatrização, no entanto não houve uma reepitelização total,
provavelmente decorrente do pequeno tempo de acompanhamento no processo de
reparo para esse tipo de ferimento.
É importante ressaltar a formação significativa de colágeno em 21 dias pelo
LED verde em relação ao CTR, Taga et al. [44] relatam que os LEDs podem
estimular os fibroblastos na produção de colágeno, aumentando a expressão do
RNAm do procolágeno tipo I. Deste modo propomos novos estudos para um melhor
entendimento da luz verde sobre o processo de cicatrização de queimaduras de
terceiro grau, já que há poucos estudos na literatura.
Em conclusão, o LVER e LED apresentaram efeitos benéficos na aceleração
do processo de cicatrização de queimaduras de terceiro grau, esses grupos
estimularam os fibroblastos na produção e maturação do colágeno, nos efeitos
analgésicos provavelmente decorrentes do aumento do consumo de água e ração
comparado ao grupo CTR, além da maior retração da ferida em 21 dias dos animais
tratados com LVER em relação aos demais grupos.
55
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59
4.2 ARTIGO 2
Ação do laser infravermelho e da Terapia fotodinâmica no processo de
cicatrização de queimaduras de terceiro grau em pele: Análise clínica e
histológica em ratos.
R.O. Costa a,*, C.F.W. Nonaka a, R.L.C. Albuquerque Júnior b, M.H.C.V. Catão a
a Universidade Estadual da Paraíba, R. Baraúnas, 351, Bodocongó, Campina Grande/PB, 58429-500, Brasil b Universidade Tiradentes, Av. Murilo Dantas, 300, Farolândia, CEP 49030-490, Aracaju/SE, Brasil.
Resumo
O objetivo deste estudo foi avaliar a ação do laser infravermelho e da terapia fotodinâmica na cicatrização de queimaduras em pele, através da análise clínica e histológica em ratos. Para tanto, 60 animais foram aleatoriamente distribuídos em três grupos: G1 – controle, não tratado (CTR), Laser infravermelho (LINF) e Terapia Fotodinâmica (TFD). A indução da queimadura foi realizada no dorso do rato através da aplicação por 20 segundos de um instrumento metálico previamente aquecido por 40 segundos na chama azul do maçarico. O tratamento dos grupos experimentais foi a irradiação da luz infravermelha (10J/cm2, 40mW e 780nm) e vermelha (10J/cm2, 40mW e 660nm) na terapia fotodinâmica com fotossenssibilizador azul de metileno na concentração 0,5µg/mL. As aplicações foram pontuais nos quatro pontos coincidentes dos ângulos da ferida e em cada ponto foi depositada a quantidade de 10J/cm2 com o tempo de 10s, totalizando 40J/cm2
por sessão realizada com intervalo de 24 horas até o dia anterior ao sacrifício do animal em 3, 7, 14 e 21 dias com dose letal de anestésico intraperitoneal. Os espécimes removidos foram analisados clinicamente e logo após processados e corados em HE e Picrosírius para análise sob microscopia de luz e luz polarizada, respectivamente. Os animais tratados com Laser infravermelho e terapia fotodinâmica estimularam a produção e maturação do colágeno (p<0,001), além do aumento no consumo de ração e água comparado ao grupo controle (p<0,001). O laser λ780 nm apresentou a maior retração da ferida dos grupos (p=0,04). Em conclusão, o laser infravermelho e terapia fotodinâmica favoreceram a cicatrização de queimaduras de terceiro grau em ratos. Palavras Chaves: Lasers; Queimaduras; Ratos; Terapia Fotodinâmica.
* Autor correspondente
Roniery de Oliveira Costa
Endereço: Rua José Gonçalves de Lucena, 407B, Cruzeiro, 58415-375, Campina
Grande, PB, Brasil. Tel. (83) 3066-8257. Email: [email protected].
60
1. Introdução
A queimadura é um dos traumas mais devastadores que podem atingir o
homem, e uma das causas frequentes de morbidade, mortalidade e de graves
incapacidades em longo prazo. Na Europa, estima-se uma taxa de mortalidade que
varia de 1,4% a 34% para pacientes hospitalizados por queimaduras [1]. Nos
Estados Unidos, mais de um milhão de queimaduras ocorrem a cada ano e cerca de
5000 destes ferimentos são fatais [2]. Por sua vez no Brasil são relatados 1 milhão
de casos de queimaduras, de acordo com a Sociedade Brasileira de Queimaduras,
das quais 200.000 são tratados em ambulatórios e 40.000 necessitam de
hospitalização [3].
Nas queimaduras de terceiro grau a lesão acomete toda espessura da pele,
envolvendo toda a epiderme e derme e, em alguns casos, se estendem aos tecidos
subcutâneos, músculos e ossos. [4-6].
Várias modalidades terapêuticas tem sido proposta na literatura para minimizar
os efeitos prejudiciais das queimaduras [7]. O laser de baixa intensidade tem
demonstrado efeitos benéficos no processo de cicatrização de queimaduras,
atuando no infiltrado inflamatório, reepitelização, formação e maturação do colágeno,
além da ação analgésica e anti-inflamatória [4,8-13]. Entretanto, ainda existe muita
divergência entre os pesquisadores [14-16].
A terapia fotodinâmica (TFD) é a combinação de um fotossensibilizador que se
liga a célula alvo e a luz com comprimento de onda específico [17], sendo utilizada
na odontologia [18,19], na ação antimicrobiana [20] e na cicatrização de incisões
cutâneas [21]. Há poucos trabalhos sobre a TFD no processo de cicatrização de
queimaduras [22], no entanto estudo recente [23] evidencia seus efeitos na
aceleração do processo de cicatrização deste ferimento.
O objetivo deste estudo foi avaliar ação do laser infravermelho e da terapia
fotodinâmica no processo de cicatrização de queimaduras de terceiro Grau: estudo
clínico e histológico em ratos.
2. Materiais e Métodos CTR-21dias
CTR-21dias
61
2.1 Animais
Após aprovação pelo Comitê de Ética no uso de Animais (CEUA)/CESED, nº
0019/240712, foram selecionados 60 ratos machos, adultos, da linhagem Wistar,
com massa entre 200 a 250g, provenientes do biotério do Departamento de Medicina
da Universidade Federal de Campina Grande. Os animais foram mantidos em
gaiolas de polipropileno revestido com cama de maravalha, submetidos à
temperatura (23°C ± 2°C) e iluminação (12 hs de ciclo claro/escuro) controlada, com
ração e água ad libitum. Os animais foram divididos aleatoriamente em 3 grupos:
G1- Controle (CTR), G2-Laser infravermelho (LINF) e G3-Terapia fotodinâmica
(TFD). Posteriormente cada grupo com 20 animais foi dividido em subgrupos de 5
animais para cada tempo (3,7,14 e 21 dias) de observação.
2.2 Ração e água consumida
Utilizou-se uma balança analítica para o controle do peso do animal e da ração
consumida, além de uma garrafa de água para ratos, com o intuito de calcular da
quantidade de água ingerida. Os animais eram pesados antes do experimento e
cada gaiola recebia diariamente uma quantidade de 200 gramas de ração e 250mL
de água. O consumo da ração era calculado pela diferença do seu peso entre dois
dias consecutivos, enquanto que a ingestão de água era quantificada com uma
proveta e o consumo calculado pela diferença entre dois consecutivos.
2.3 Anestesia/Tricotomia/Queimadura
Os animais foram anestesiados com uma associação anestésica de 100
mg/Kg de Ketamina 10% e 5 mg/Kg de Xilazyna 2%, aplicados na região
intraperitoneal. Logo após, realizou-se a tricotomia do dorso do animal com uma
lâmina de barbear
62
descartável associado a água e sabão neutro. A indução da queimadura foi
realizada no dorso de todos os animais com um instrumental de ferro de 1,0 X 1,0 X
1,0 cm3. Esse instrumento foi aquecido com auxílio de maçarico até que ficasse
rubro. O aquecimento se deu pela chama azul do maçarico em contato direto com o
ferro por 40 segundos. Quando atingi esse estado, o instrumental era imediatamente
encostado no dorso do animal permanecendo por 20 segundos, queimando a pele.
2.4 Estudo piloto
Foram selecionados aleatoriamente dois animais com intuito de definir o tipo e
a padronização da queimadura. Realizou-se em ambos a anestesia, tricotomia e
aquecimento do instrumento metálico no maçarico por 40 segundos, diferindo no
tempo de queimadura em pele, 20 e 30 segundos respectivamente. Após a leitura
das lâminas em Hematoxilina e Eosina, optou-se pelo tempo de 20 segundos,
constatando uma destruição total da epiderme e derme, característico da
queimadura de terceiro grau.
2.5 Irradiação a Luz
Na irradiação dos grupos do LINF (AsGaAl/ λ780 nm) e da TFD (InGaAlP/ λ
660 nm) utilizou-se o laser de baixa intensidade (MMO TWIN FLEX Evolution®, São
Carlos, Brasil) com a dose, potência e tempo de 10J/cm², 40 mW e 10s
respectivamente, que foram aplicada imediatamente após a queimadura, de forma
pontual nos quatro pontos coincidentes com os ângulos da ferida, em cada ponto era
depositada a quantidade de 10J/cm2 totalizando 40J/cm2 por sessão.. As aplicações
eram diárias até as vésperas do sacrifício do animal. No grupo da TFD foram
utilizadas gotas do fotossenssibilizador azul de metileno aplicado diariamente
durante 5 minutos antes da irradiação pontual da luz λ 660nm, a concentração do
AM foi 0,5µg/mL, já que concentrações acima de 1 µg/mL são tóxicas para a pele
[24].
2.6 Eutanásia / Avaliação clínicas / Procedimentos Histológicos
63
Os animais foram sacrificados através da associação anestésica de 300 mg/Kg
de Ketamina (Cetamin®, Syntec, São Paulo, SP, Brasil) 10% e 15 mg/Kg de
Xilazyna 2% (Dopaser®, Syntec, São Paulo, SP, Brasil) injetada no peritônio. Após a
Eutanásia, realizou-se com auxilio do paquímetro digital o cálculo do índice de
retração da ferida (IRF) pela fórmula: IRF (%) = Área inicial- Área do dia do
sacrifícios ÷ Área inicial x 100. Área inicial tinha 1cm2 e a área do dia do sacrifício foi
calculada pelo quadrado do raio multiplicado por pi (r2π). Em seguida realizou a
remoção do espécime utilizando um bisturi, a ferida foi excisada com margem de
segurança de 0,5cm e fixada em formol a 10%. Após o período de fixação a peça foi
processada seguindo os métodos rotineiros para coloração em Hematoxilina-Eosina
(HE) e Picrosírius.
2.7 Aspectos morfológicos das células inflamatórias e das fibras colágenas
Na análise morfológica do HE foi realizado a descrição das células
inflamatórias nos grupos de tratamento dentro do mesmo tempo de sacrifícios.
Cortes histológicos corados em picrosírius e analisados sob luz polarizada foram
utilizados para avaliação descritiva e quantitativa da deposição de colágeno. As
fibras de colágeno foram classificadas de acordo com o seu padrão de
birrefringência (esverdeado / amarelo-esverdeada ou laranja), aparência morfológica
(ondulada ou estirada, delgada ou espessa, curta ou longa) e disposição (reticular,
paralela ou entrelaçado).
2.8 Análise quantitativa da área de colagenização (AC)
A quantificação da área ocupada pela deposição de colágeno na ferida foi
determinada pela densidade óptica do sistema de análise de imagens em 8 campos
microscópicos para cada lâmina com amplificação de 100x. O sistema utilizado
consiste de uma câmara de vídeo CCD Sony DXC-101 aplicado a um microscópio
Olympus CX31, a partir do qual as imagens foram enviadas para um monitor
(Trinitron Sony). Por meio de um sistema de digitalização (Olympus C-7070
64
WideZoom) as imagens foram carregadas em um computador (Pentium 133 MHz) e
processadas utilizando o software (ImageTool), que proporcionou a interpretação e a
obtenção de valores de mensuração das fibras colágenas, através da quantificação
de suas medidas originais, optando em transformar a medida da imagem digitalizada
(o pixel) em medida micrometrada, utilizando-se um barra milimetrada de 50 ɥ m.
Os limiares para as fibras colágeno foram estabelecidos para cada lâmina, depois de
aumentar o contraste até um ponto em que as fibras foram facilmente identificadas
como birrefringentes (colágeno). A área ocupada pelas fibras foi determinada pelos
limiares das diferentes densidades de cores do colágeno.
2.9 Análise Estatística
Na análise estatística foi aplicado o teste de Shapiro-Wilk para verificação da
normalidade dos dados, sendo considerado o nível de significância de 5% para as
diferenças observadas quando p<0,05. A significância estatística da área de
colagenização e análise quantitativa da água consumida foram avaliadas pela
análise de variância (ANOVA) com pós teste Tukey e Bonferroni, respectivamente,
com exceção da ingestão da água em 21 dias, da ração consumida e do cálculo do
IRF em 3, 7 e 21 dias que utilizaram o teste de kruskall Wallis. O IRF em 14 dias foi
avaliado pela ANOVA com pós teste de Tukey.
3. Resultados
Índice de Retração da Ferida (%)
Em 3 dias IRF nos grupos LINF (mediana -53%), TFD (-76%) e CTR (-154%)
foram estatisticamente diferentes (p=0,012). Com 7 dias houve diferença significativa
(p=0,011) no índice entre os grupos LINF (mediana -53%), TFD (-76%) e CTR (-
124%). Em 14 dias IRF nos grupos LINF (média 0,4 ± 22,9%) e TFD (1,0 ± 14,3%)
foram maiores (p=0,002) que o CTR (-49,2 ± 18,2%). Com 21 dias os grupos LINF
65
(mediana 87%), TFD (72%) e CTR (5%) foram estatisticamente diferentes (p=0,004)
(Fig. 1 e 2).
Fig. 1. Queimadura em pele de ratos por cada grupo de tratamento durante os
tempos de sacrifícios.
66
5 10 15 20 25
-200
-150
-100
-50
0
50
100CTR
LINF
TFD
***
***
****
Tempo (dias)Índ
ice d
e r
etr
ação
da f
eri
da (
%)
Fig. 2. Avaliação do índice de retração da ferida para cada grupo de tratamento
durante os tempos de sacrifícios.
* Diferença significativa entre os grupos LINF, TFD e CTR (p=0,012)
** Diferença significativa entre os grupos LINF, TFD e CTR (p=0,011)
*** Diferença significativa do LINF e TFD com CTR (p=0,002)
**** Diferença significativa entre os grupos LINF, TFD e CTR (p=0,04)
3.2. Controle da ração e água consumida
Nos 3 dias iniciais de tratamento não houve diferença no consumo de ração e
água entre os grupos. Aos 7 dias os grupos tratado com LINF (média 43,71±2,21
mL) e TFD (42,28±3,19 mL) ingeriram uma maior quantidade de água (p<0,001) em
relação ao CTR (36,71±1,25 mL). A ração consumida não apresentou diferença
entre os grupos. Em 14 dias os animais tratados com LINF (média 43,71±1,89 mL) e
TFD (média 42±2,48 mL) apresentaram um consumo de água superior (p<0,001) ao
CTR (média 37±1,17mL). A ração consumida pelo grupo LINF (mediana 24,5g) foi
maior (p<0,001) que CTR (mediana 18g). Aos 21 dias os grupos LINF (mediana 43
67
mL) e TFD (mediana 41 mL) ingeriram maior quantidade de água (p<0,001) em
relação ao CTR (mediana 38 mL), enquanto o consumo de ração foi superior nos
grupos LINF (mediana 26g) e TFD (mediana 25g) comparado ao CTR (mediana
20g).
3.3. Infiltrado Inflamatório
Aos 3 dias observou-se durante análise morfológica que os grupos revelaram
infiltrado inflamatório composto por neutrófilos que permeavam as fibras musculares
nas margens da ferida. Na área mais central da queimadura, a inflamação era
predominantemente linfocítica e limitada ao tecido conjuntivo fibroso frouxo
hipodérmico, bem como foi observado uma proeminente dilatação vascular
(arteríolas e vênulas), por vezes associada à marginação leucocitária (Fig. 3a).
Com 7 dias os grupos exibiram infiltrado inflamatório predominantemente
neutrofílico, disposto tanto nas margens quanto na porção mais central da ferida.
Nesta última região, o infiltrado inflamatório limitava-se ao tecido conjuntivo fibroso
frouxo hipodérmico. Como identificado no período de 3 dias, foi observada
importante dilatação de arteríolas e vênulas, com ocasional marginação leucocitária
(Fig. 3b).
Aos 14 dias os grupos apresentaram infiltrado inflamatório constituído por
linfócitos, macrófagos e neutrófilos. Estes últimos predominavam em áreas
superficiais da ferida. Tanto nas margens quanto nas áreas centrais da ferida, era
possível constatar a presença de exuberante reação de granulação, com vasos
sanguíneos neoformados e fibroblastos jovens, dispostos em meio a uma matriz
extracelular constituída por feixes colágenos delgados e alongados. As queimaduras
se apresentavam recobertas por crosta seroemática de espessura variável e exibiam
reepitelização em estágios iniciais (Fig. 3c).
Em 21 dias os grupos exibiram infiltrado inflamatório constituído por neutrófilos,
linfócitos e macrófagos, com predomínio do componente mononuclear. Ao longo de
toda a extensão da ferida, evidenciou-se uma exuberante reação de granulação,
com vasos sanguíneos neoformados, muitos dos quais ingurgitados, e fibroblastos
68
jovens, dispostos em meio a uma matriz extracelular constituída por feixes
colágenos ora curtos ora alongados, com espessuras variadas (Fig. 3d). Em
comparação com o período de 14 dias, as fibras colágenas se apresentavam mais
espessas e mais densamente organizadas. As queimaduras se apresentavam
recobertas por crosta de espessura variável e exibiam reepitelização em estágios
ainda parciais.
Fig. 3. Cortes histológicos dos grupos TFD (a), LINF(b), CTR (c) e LINF (d) nos
tempos 3,7,14 e 21 dias, respectivamente (HE, 100x). Em destaque nas
69
fotomicrografias (a) e (b) o infiltrado inflamatório composto por neutrófilos nas
margens da ferida e, em (c) e (d) predomínio de linfócitos, macrófagos e neutrófilos
(HE, 400x).
3.4. Quantificação do colágeno usando a luz polarizada
Em 3 e 7 dias, não houve formação de colágeno nos grupos de tratamento,
com 14 dias o grupo do LINF apresentou uma maior área de colagenização em
relação ao CTR (p<0,001) e ao TFD (p<0,05), enquanto o grupo TFD apresentou
uma maior área de colagenização (p<0,05) em relação ao CTR (Fig. 3a). Em 21 dias
(Fig. 3b), o grupo LINF formou uma maior área de colagenização comparado ao
CTR e TFD (p<0,001) e o grupo TFD apresentou uma maior área de colagenização
em relação ao CTR (p<0,001).
Fig. 4 Áreas de colagenização formada em 14 dias (a) pelos grupos CTR, LINF e
TFD e, em 21 dias (b) pelos grupos CTR, LINF e TFD.
*Diferença significativa com CTR (p<0,05)
**Diferença significativa com TFD (p<0,05)
***Diferença significativa com CTR (p<0,001)
#Diferença significativa com CTR e TFD (p<0,001)
3.5. Descrição morfológica do colágeno usando a luz polarizada
70
As fibras colágenas em 14 dias nos grupos CTR (Fig.5a), LINF (Fig.5b) e TFD
(Fig.5c) apresentaram em relação ao seu padrão de birrefringência um predomínio
do colágeno tipo I nos grupos LINF (n=3 ratos/60%) e TFD (n=3 ratos/60%),
enquanto no grupo CTR observou-se em 20% dos animais (n=1 ratos). Quanto à
aparência morfológica e a disposição, não houve variações nas descrições,
apresentando em todos os animais fibras colágenas onduladas, delgadas, curtas e
reticulares.
As Fig. 5d, 5e e 5f mostram o colágeno em 21 dias nos grupos CTR, LINF e
TFD, respectivamente. Neste tempo, os grupos LINF e TFD apresentaram em
relação ao seu padrão de birrefringência um predomínio de colágeno tipo I em todos
os animais, e o grupo CTR apresentou em 60% dos ratos (n=3 animais). Aparência
morfológica e a disposição das fibras do grupo TFD foram estiradas, espessas,
longas e reticulares em 3 animais (60%), no grupo LINF 20% apresentava essas
características, e o CTR apresentou em todos os ratos (n=5 animais) fibras
onduladas, delgadas, curtas e reticulares.
71
Fig 5. Fotomicrografias das áreas de colagenização da ferida nos grupo CTR (a),
LINF(b) e TFD(c) em 14 dias e, em 21 dias os grupo CTR (d), LINF(e) e TFD(f)
(Picrosírius, 100x, 50 ɥ m).
4. Discussão
Apesar das divergências entre os pesquisadores [14,15,25,26] a laserterapia
tem sido proposta como uma das modalidades de tratamento para lesões de tecido
mole, principalmente devido a suas propriedades bioestimulantes que podem
acelerar o processo de cicatrização de queimaduras [4,12,13]. No presente estudo,
os grupos TFD e LINF consumiram uma maior quantidade de água e ração em
relação grupo CTR, possivelmente esse resultado seja decorrente do efeito
analgésico, já que todos os animais eram do mesmo sexo, raça, espécie e faixa de
peso, provenientes do mesmo local e estavam sobre as mesmas condições de
temperatura e iluminação. Estudos imuno-histoquímicos afirmam que a laserterapia
inibe a expressão da enzima ciclo-oxigenase 2 [27], evitando a conversão do ácido
araquidônico em prostaglandina [28].
O mecanismo de ação da TFD na pele, quando associado a luz vermelha, é
através das mitocôndrias que pode promover a biomodulação do tecido através do
aumento da cadeia respiratória e síntese de adenosina trifosfato, favorecendo o
processo de cicatrização, através da proliferação celular, produção de ácidos
nucléicos, síntese de colágeno e redução da inflamação [23,29,30]. Por outro lado, o
uso do LINF têm também resultados semelhantes, sendo o processo iniciado em
nível de membrana celular [30].
Na análise do IRF observou-se principalmente nos tempos de 3 e 7 dias
valores negativos, possivelmente decorrentes do edema intersticial que aumenta as
dimensões macroscópicas da ferida. Nos demais tempos o aumento da retração da
ferida provavelmente seja decorrente da diferenciação miofibroblástica. Estudos
recentes afirmam que LINF estimula a diferenciação miofibroblástica na queimadura
em 8 dias de tratamento [10], célula responsáveis pela contração da ferida [12]
72
demonstrando sua ação na aceleração do processo de retração da queimaduras em
pele comparado ao grupo CTR [31-33].
O LINF apresenta o maior poder de penetração na pele se comparado ao laser
vermelho utilizado na TFD [31], essa característica pode ter influenciado neste
estudo, na substituição mais rápida das fibras de colágeno do tipo III para o tipo I e
uma formação de colágeno significativa em 14 e 21 dias comparado ao CTR.
Estudos evidenciam os benefícios do LINF [10,31-33,35] e da TFD [23] no processo
de cicatrização em queimadura, demonstrando que a laserterapia é capaz de regular
a liberação de citocinas que são responsáveis pela proliferação de fibroblastos e
síntese de colágeno, tal como fator de crescimento fibroblástico - ácido (FGF-α) e
fator transformante de crescimento- beta (TGF-β), respectivamente [36,37].
Observou-se que a dose diária de 40J/cm2 aplicada em 21 dias no grupo LINF
foi eficaz na estimulação dos fibroblastos na formação de colágeno e na retração da
ferida, contrariando os estudos que afirmam que doses acima de 38J/cm2 possuem
efeitos inibitórios [13]. Provavelmente essa divergência na eficácia da interação luz-
tecido seja dependente da falta de padronização na escolha do comprimento de
onda, potência, frequência e densidade de energia, associados às propriedades
ópticas do tecido irradiado [16,38].
A quantidade significativa de colágeno formada em 21 dias pelo grupo LINF
pode ser confundida com a formação de cicatrizes hipertróficas [39], entretanto
durante a análise morfológica não foi constatado a formação da última fase do
processo de cicatrização (maturação ou remodelação) [40,41], deste modo pode-se
afirmar neste estudo que a síntese de colágeno, não formou cicatrizes e seja
decorrente da aceleração do processo de cicatrização. A reepitelização parcial
encontrada neste estudo é justificada por autores [13] que demonstram que a
irradiação do LINF em queimaduras de terceiro grau por 21 dias favoreceu o
processo de cicatrização, no entanto não houve uma reepitelização total,
provavelmente decorrente do pequeno tempo de acompanhamento do processo de
reparo para esse tipo de ferimento.
Há poucos estudos sobre a atuação da TFD no processo de cicatrização de
queimaduras em pele, principalmente quando utiliza a luz vermelha sobre o azul de
73
metileno diluído a concentrações atóxicas (0,5 µg/mL) [24]. Deste modo, os
resultados significativos encontrados na síntese, formação, maturação do colágeno e
consumo de ração e água relação ao CTR podem ser decorrentes da combinação
do azul de metileno que se liga a célula alvo e a luz de comprimento de onda 660nm
na presença de oxigênio do meio, o FS é ativado podendo reagir com moléculas
vizinhas levando à produção de oxigênio singlete, que reage com os componentes
celulares, sejam eles bactérias ou células neoplásicas, provocando inviabilidade
celular [42]. Isso oferece à TFD algumas vantagens, como natureza não invasiva,
repetibilidade fácil e ação antimicrobiana [43], já que a presença de bactérias na
ferida pode retardar o processo de cicatrização [44].
Os resultados do presente estudo sugerem que o LINF e a TFD favorecem o
processo de cicatrização de queimaduras de terceiro grau em ratos através do
estímulo à produção e maturação do colágeno pelos fibroblastos, além dos efeitos
analgésicos decorrentes do aumento do consumo de ração e água. É importante
ressaltar que o maior índice de retração da ferida nos animais tratados com LINF
sugere que este tipo de terapia apresenta maior potencial para estimular a
diferenciação de miofibroblastos.
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79
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Neste estudo, pode-se concluir que os grupos LVER, LINF, TFD E LED
favoreceram o processo de cicatrização de queimaduras de terceiro grau em ratos,
apresentando as maiores áreas de colagenização, promovendo uma substituição
mais rápida das fibras de colágeno tipo III em tipo I, apresentaram também efeitos
analgésicos decorrentes do aumento do consumo de ração e água, contudo os
grupos LINF e LVER obtiveram os maiores índices de retração da ferida em relação
aos demais grupos.
Convém ressaltar que os resultados dos grupos TFD e LED foram de extrema
importância, já que carece de estudos sobre suas aplicações em queimaduras e,
neste estudo, apresentaram efeitos benéficos na aceleração do processo de
cicatrização desse ferimento, deste modo, propomos novos estudos visando
fundamentar melhor essas terapias utilizadas.
81
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89
Apêndice A
Ficha de Avaliação Clínica
Rato número __________ Grupo de tratamento:_______________________ Ferimento – Queimadura
Dia
Pus Escara Área avermelhada
Área esbranquiçada
Sangramento
Maior diâmetro lesão (mm)
03
07
14
21
Observações:
90
Apêndice B
Ficha do consumo de água e ração
Tempo
(dias)
CTR
A R
LVER
A R
LINF
A R
TFD
A R
LED
A R
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21