Beta-lactamase AmpC: actualização do diagnóstico laboratorial e … · 2018. 1. 15. · AmpC...

Clínica Universitária de Doenças Infeciosas

Beta-lactamase AmpC: actualização do diagnóstico laboratorial e estratégia terapêutica

Carolina Roias

Julho 2017

ii

Clínica Universitária de Doenças Infeciosas

Beta-lactamase AmpC: actualização do diagnóstico laboratorial e estratégia terapêutica

Carolina Roias

Orientado por:

Dr.ª Carla Mimoso Santos

Julho 2017

iii

Trabalho final do Mestrado Integrado em Medicina apresentado para cumprimento dos

requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Medicina, realizado sob

orientação da Dr.ª Carla Mimoso Santos, assistente convidada de Infecciologia na

Clínica Universitária de Doenças Infecciosas e Parasitárias, dirigida pela Prof.ª Doutora

Emília Valadas.

iv

Agradecimentos

Em primeiro lugar, quero agradecer à Dr.ª Carla Santos por todo o tempo

disponível e, às vezes, indisponível do qual abdicou para me ajudar a orientar, a realizar,

a aconselhar e a rever (entre outras mil coisas) todo o trabalho que foi feito. Quero

também agradecer-lhe por todo o apoio, motivação e entusiasmo que depositou em mim

durante toda esta caminhada. A sua ajuda, amizade e partilha de conhecimentos foi

essencial para a realização deste trabalho. Por último, também lhe quero agradecer pela

paixão que me transmitiu por Infecciologia.

Em segundo lugar, agradeço à Prof.ª Doutora Emília Valadas e à Clínica de

Doenças Infecciosas e Parasitárias por me possibilitar realizar o Trabalho final do

Mestrado Integrado em Medicina no tema proposto.

Em seguida, quero agradecer ao Tiago por todas as imagens editadas e palavras

de motivação. Tenho também de agradecer toda a disponibilidade e paciência que teve

para me aturar durante esta etapa, todas as anteriores e as que estão para vir, pois sei que

vão ser muitas. Obrigada pelo teu valor inestimável, norte glaciar.

Não posso deixar de agradecer à pessoa que me acompanhou de perto durante

todos estes anos, e que não me podia deixar de apoiar e ajudar também nesta etapa,

mesmo que longe. Obrigada Maia por todos estes anos, e espero que venham muitos

mais.

Tenho de agradecer também à minha família por me dar apoio sempre que é

preciso. Sem eles, nada disto seria possível. Obrigada pela confiança investida em mim.

Aos meus amigos de faculdade, aos resistentes e a todos os outros que conheci

nas mais diversas ocasiões, um muito obrigada por tudo. Vocês sabem, não é preciso

dizer mais.

Por último, tenho de agradecer ao meu primo Christopher pela companhia nas

horas mais estranhas da noite e ajuda na conclusão deste trabalho.

v

Resumo

O uso de beta-lactâmicos é muito comum para o tratamento de infecções por

Enterobacteriaceae por ter uma eficácia e espectro de acção apropriados a estes

microrganismos. Sendo as beta-lactamases o principal mecanismo de resistência em

bactérias Gram-negativo, e como as beta-lactamases AmpC têm vindo a ter cada vez

mais significância clínica, torna-se essencial estudar as mesmas. As beta-lactamases

AmpC são enzimas capazes de hidrolisar penicilinas, cefalosporinas da 1ª à 3ª geração,

cefamicinas e inibidores de beta-lactamases. Além disto, muitas destas bactérias quando

expostas a certos beta-lactâmicos, podem ser induzidas, e, ainda, podem adquirir

resistência a um antibiótico beta-lactâmico, ao qual se mostravam anteriormente

susceptíveis, durante a terapêutica com esse antibiótico (selecção de mutantes

desreprimidos). Como até à data não existe nenhum método de detecção de estirpes

produtoras de AmpC aprovado, é fulcral uma maior compreensão do funcionamento das

mesmas microbiologica e clinicamente, de forma a ser criado um teste que seja capaz de

detectar estas bactérias nas suas diferentes variantes. A criação deste teste vai ser

também importante para haver uma optimização terapêutica, tendo em conta que a

eficácia do tratamento não só depende da actividade dos fármacos perante estes

microrganismos, mas também do grau de indução e da capacidade de selecção de cada

antibiótico. De entre os beta-lactâmicos existentes que são capazes de manter a sua

actividade perante as AmpC nas suas distintas variações, os carbapenemes são os beta-

lactâmicos que mostram maior segurança perante o tratamento de infecções graves

causadas por bactérias produtoras de AmpC. No sentido de se usar cada vez menos os

carbapenemes por provável emergência de resistência aos mesmos, há um grande

interesse na descoberta de novos antibióticos beta-lactâmicos e, principalmente, de

inibidores de beta-lactamases que possam ser combinados com beta-lactâmicos,

optimizando a sua já actividade contra as beta-lactamases AmpC.

Palavras-chave: beta-lactamase do tipo AmpC, AmpC plasmídicas,

Enterobacteriaceae, detecção laboratorial, novas terapêuticas.

O Trabalho Final exprime a opinião do autor e não da FML.

vi

Abstract

The use of beta-lactams is very common for the treatment of Enterobacteriaceae

infections, due to it appropriate efficacy and action spectrum for these microorganisms.

Beta-lactamases, as the main resistance mechanism in Gram-negative bacteriae, have

been having an increasing clinical significance, which makes them important to study.

AmpC beta-lactamases are enzymes capable of hydrolyzing penicillins, 1st to 3rd

generation cephalosporins, cephamycins and beta-lactamase inhibitors. Furthermore,

many of these bacteriae when expose to certain beta-lactams, can be induced, and even

acquire resistance to beta-lactams, to which they previously showed susceptibility,

during treatment with these antibiotics (selection of derepressed mutants). Since, to

date, there is no approved method of detection for AmpC-producing strains, it is

essential a greater microbiological and clinical comprehension, in such a way that a test

capable of detection of these bacteriae in all its variants. This test’s existence will be

important for therapeutical optimization, knowing that the treatment efficacy depends,

not only, on the drug’s activity on these microorganisms, but also, on the degree of

induction and selection capacity of each antibiotic. Among the beta-lactams capable of

maintaining its activity before AmpC’s in its distinct forms, carbapenems are the ones

that show greater safety during the treatment of severe infections cause by AmpC-

producing bacteriae. In order to reduce the use of carbapenems, due to a likely

emergence of resistance to them, there is great interest in the discovery of new beta-

lactams and, primarily of beta-lactamase inhibitors which can be combined with beta-

lactams to optimize its already existing activity against AmpC beta-lactamases.

Key-words: AmpC beta-lactamase, plasmidic AmpC, Enterobacteriaceae, laboratorial

detection, new therapies.

vii

Índice geral

Agradecimentos .......................................................................................................... iv

Resumo ........................................................................................................................ v

Abstract ....................................................................................................................... vi

Lista de abreviaturas ............................................................................................... viii

Índice de figuras ......................................................................................................... ix

Índice de tabelas ......................................................................................................... ix

Índice de anexos .......................................................................................................... x

Introdução ................................................................................................................... 1

Beta-lactâmicos ........................................................................................................... 3

Mecanismo de acção dos beta-lactâmicos .................................................................. 4

Mecanismos de resistência aos beta-lactâmicos ......................................................... 5

Genética das beta-lactamases ..................................................................................... 7

Classificação e propriedades das beta-lactamases ..................................................... 7

AmpC cromossómica ................................................................................................ 10

AmpC plasmídica ...................................................................................................... 14

Detecção laboratorial de bactérias produtoras de AmpC ....................................... 16

Terapêutica ............................................................................................................... 20

Grau de indução e capacidade de selecção dos beta-lactâmicos .................. 20

Terapêutica clássica ....................................................................................... 22

Cefalosporinas .................................................................................... 22

Carbapenemes .................................................................................... 24

Penicilinas de largo espectro e inibidores de beta-lactamases .......... 25

Outros fármacos não beta-lactâmicos ............................................... 26

Novas terapêuticas ......................................................................................... 28

Conclusão .................................................................................................................. 30

Referências bibliográficas ......................................................................................... 32

Anexos ....................................................................................................................... 44

viii

Lista de abreviaturas

ADN: ácido desoxirribonucleico

BLEA: beta-lactamases de espectro alargado

CLSI: Clinical Laboratory Standards Institute

CMI: concentração mínima inibitória

D-Ala-D-Ala: acil-D-alanil-D-alanina

ECCMID: European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases

EMA: Agência Europeia do Medicamento (European Medicines Agency)

ESCPM: Enterobacter spp., Serratia spp., Citrobacter spp., Providencia spp. e

Morganella morganii.

EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

FDA: Food and Drug administration

ITU: infecções no tracto urinário

IIA: infecções intra-abdominais

NAG: N-acetilglucosamina

NAM: ácido N-acetilmurâmico

OMP: proteína da membrana externa (outer membrane protein)

PBP: proteína de ligação à penicilina (penicillin-binding protein)

PCR: polymerase chain reaction

PTZ: piperacilina-tazobactam

SPICE: Serratia spp., Providencia spp., "Indole-positive" Proteus spp. (Morganella

morganii), Citrobacter spp. e Enterobacter spp.

ix

Índice de figuras

Figura 1 - Representação da estrutura das diferentes subclasses de beta-lactâmicos. .... 3

Figura 2 - Representação da parede celular em bactérias Gram-negativo e Gram-

positivo ......................................................................................................................... 5

Figura 3 – Principais mecanismos de resistência aos beta-lactâmicos ........................... 6

Figura 4 - Esquema representativo das diferentes formas de expressão de beta-

lactamases em Enterobacteriaceae, com os respectivos exemplos de espécies.............. 10

Figura 5 - Mecanismo de indução e de sobre-expressão de AmpC em

Enterobacteriaceae ...................................................................................................... 13

Figura 6 - Métodos fenotípicos que detectam espécies produtoras de AmpC .............. 17

Figura 7 - Algoritmo para detecção de Enterobacteriaceae que produz AmpC ............ 19

Índice de tabelas

Tabela 1 - Taxonomia de bactérias que expressam beta-lactamases AmpC codificadas

no cromossoma ............................................................................................................. 9

Tabela 2 - Cronologia e homologia das beta-lactamases AmpC plasmídicas ............... 15

Tabela 3 - Perfil de indução de ampC por diferentes beta-lactâmicos e respectivos

fenótipos ..................................................................................................................... 22

Tabela 4 - Espectro de actividade de diferentes beta-lactâmicos associados aos novos

inibidores de beta-lactamases e de um novo beta-lactâmico ......................................... 30

x

Índice de anexos

Anexo 1 - Tabela com um resumo das classes de antibióticos e os seus respectivos

mecanismos ................................................................................................................ 44

Anexo 2 - Beta-lactamases chave que conferem resistência à família

Enterobacteriaceae, integradas na classificação de Ambler e de Bush-Jacoby-Medeiros

................................................................................................................................... 45

1

Introdução

No tratamento de infecções por Enterobacteriaceae, os fármacos mais apropriados

são os beta-lactâmicos, pois são os que interferem com a síntese da parede celular

antimicrobiana. A família Enterobacteriaceae é muito heterogénea e possui múltiplos

mecanismos de resistência à acção dos beta-lactâmicos, o que dificulta a escolha de uma

terapêutica activa nas infecções por estas espécies. São espécies capazes de produzir um

tipo de beta-lactamase denominada de AmpC (entre muitas outras) que para além de ser

capaz de hidrolisar uma série de beta-lactâmicos (penicilinas, cefalosporinas da 1ª à 3ª

geração, cefamicinas e inibidores de beta-lactamases), pode também adquirir formas

indutíveis e desreprimidas que, aquando a sua exposição a certos beta-lactâmicos, tornam

as bactérias resistentes a um maior número de antibióticos (7, 41, 53).

Actualmente, não existe nenhum método de detecção de estirpes produtoras de

AmpC que esteja aprovado. Apesar de estarem muitos testes descritos na literatura, é

emergente a criação de uma metodologia aplicável na clínica que seja capaz de detectar

e identificar estas beta-lactamases sem serem precisos testes suplementares de

confirmação. A criação desta metodologia revela-se ainda mais importante tendo em

conta que as enzimas AmpC podem estar também codificadas em plasmídeos. A

existência de AmpC plasmídicas facilita a dispersão desta resistência inter-espécies, o

que dificulta a detecção de bactérias produtoras de AmpC só pela identificação das

espécies em si. Uma correcta detecção de estirpes que produzem AmpC não só é

importante para a tomada de decisão da terapêutica mais apropriada, como também para,

através de estudos de vigilância epidemiológica, permitir o conhecimento da real

dimensão deste tipo de resistência (22, 53).

A apropriação da terapêutica em Enterobacteriaceae que produzem AmpC não

depende só da actividade dos beta-lactâmicos contra estas enzimas, depende também do

grau de indução e da capacidade de selecção dos diferentes beta-lactâmicos. Os

carbapenemes são a melhor escolha terapêutica para o tratamento de produtoras de

AmpC, pois possuem todas as características necessárias para tratar infecções graves

provocadas por estas espécies. No entanto, há que racionalizar o uso de carbapenemes

para evitar a emergência de resistência aos mesmos. Assim, existe um interesse acrescido

na descoberta de novos beta-lactâmicos, e especialmente de novos inibidores de beta-

2

lactamases que possam melhorar e proteger a actividade dos beta-lactâmicos a serem

usados em associação (7, 41, 84).

3

Beta-lactâmicos

Ao longo do tempo, as infecções têm sido uma das mais importantes doenças com

as quais a humanidade tem lidado. Para as combater, foram inicialmente usados

microrganismos. Com o passar do tempo e a evolução da ciência, foram descobertas a

penicilina, em 1928, e as sulfamidas, em 1932, os primeiros agentes farmacológicos

“antibióticos verdadeiros”. A sua introdução comercial foi uma grande mais-valia clínica,

contribuindo para a descoberta e síntese de cada vez mais antibióticos, mas, ao mesmo

tempo, é uma das grandes causadoras da emergência de resistências, através da pressão

que exerce na selecção de microrganismos patogénicos (71, 74).

Os beta-lactâmicos são uma classe de antibióticos (ver anexo 1), caracterizada

pela presença de um anel beta-lactâmico de quatro lados (com três átomos de carbono,

um de azoto e radicais substituintes), altamente reactivo, normalmente ligado a um

segundo anel (exceptuando os monobactâmicos), como se pode ver na figura 1 (23, 24).

De entre os beta-lactâmicos disponíveis em Portugal podemos nomear as

seguintes subclasses: os penamos ou derivados da penicilina (as penicilinas naturais ou

benzilpenicilinas; as isoxazolilpenicilinas, também conhecidas por serem as resistentes às

penicilinases; as aminopenicilinas; as penicilinas anti-pseudomonas, que abrangem as

carboxipenicilinas e as ureidopenicilinas), os cefemos (cefalosporinas de 1ª, 2ª, 3ª, 4ª e 5ª

geração e cefamicinas), os monobactâmicos e os cabapenemes (7).

Figura 1: Representação da estrutura das diferentes subclasses de beta-lactâmicos. Anel beta-lactâmico ligado a anel de tiazolidina nas penicilinas (1) e a anel di-hidrotiazina nas cefalosporinas (2). Os monobactâmicos possuem unicamente o anel beta-lactâmico (3) e os carbapenemes têm um anel tiazolidina com substituição de enxofre por carbono (4). Adaptado de Babic M, Hujer AM, Bonomo RA. What’s new in antibiotic resistance? Focus on beta-lactamases. Drug

Resist Updat 2006;9:142–56.

4

Mecanismo de acção dos beta-lactâmicos

Os antibióticos beta-lactâmicos são agentes bactericidas que inibem a síntese da

parede celular bacteriana (7, 53).

A estrutura da parede celular bacteriana é diferente em espécies Gram-positivo e

Gram-negativo, como se pode visualizar na figura 2. Comparativamente com as bactérias

Gram-positivo que não possuem membrana externa, as bactérias Gram-negativo têm uma

parede mais complexa e estratificada, composta por membrana externa, espaço

periplasmático, rede de peptidoglicanos e membrana citoplasmática (12).

A membrana externa, constituída por lipopolissacáridos e fosfolípidos, é o local

onde se inserem as proteínas da membrana externa (OMP – outer membrane proteins),

e.g. as porinas, enquanto que, as proteínas de ligação à penicilina (PBP – penicillin-

binding proteins), também designadas de transpeptidases, estão localizadas na face

externa da membrana citoplasmática. Assim, para os beta-lactâmicos actuarem, têm que

atravessar a membrana externa através de porinas, passando o espaço periplasmático e,

finalmente, acedendo ao seu alvo, as PBP (ver figura 3A) (12, 98).

A rede de peptidoglicanos está sob a membrana externa. Estes peptidoglicanos

são consituidos por polissacáridos, que, por sua vez, consistem em unidades alternadas

de N-acetilglucosamina (NAG) e de ácido N-acetilmurâmico (NAM). Cada monómero

de NAM está ligado a uma cadeia peptídica de quatro a cinco aminoácidos, que através

do estabelecimento de ligações cruzadas com sucessivas cadeias peptídicas adjacentes,

contribui para a formação de uma estrutura cristalina de peptidoglicanos interligados. Esta

estrutura é a responsável pela preservação da célula e da sua forma, apesar da elevada

pressão interna existente. A interligação dos peptidoglicanos é catalisada pelas

transpeptidases bacterianas. As transpeptidases, quando expostas a fármacos beta-

lactâmicos, integram-nos como substrato na síntese da parede celular bacteriana devido à

semelhança estrutural com acil-D-alanil-D-alanina (D-Ala-D-Ala), um péptido que

compõe a parede celular das bactérias. Desta forma, as transpeptidases passam pelo

processo de acilação, o que faz com que não consigam proceder à hidrólise dos beta-

lactâmicos. Os subsequentes passos na síntese da parede são, então, impedidos, o que

resulta na degradação da parede celular. A bactéria torna-se permeável à água, o que leva

5

a uma rápida difusão da mesma em direcção ao interior da célula e a eventual lise

bacteriana (31, 32).

Mecanismos de resistência aos beta-lactâmicos

A resistência das bactérias Gram-negativo aos beta-lactâmicos pode ocorrer através

de três principais mecanismos (figura 3):

Alteração da permeabilidade

A diminuição na permeabilidade da parede bacteriana aos beta-lactâmicos

pode ser causada por diminuição da expressão das OMP ou mesmo por total

ausência das mesmas (7). Tendo em conta que os beta-lactâmicos penetram na

bactéria por difusão passiva através de porinas existentes na membrana externa

(96), alterações variadas destas proteínas, nomeadamente, a nível estrutural,

quantitativo, de selectividade ou de tamanho, podem estar na origem de resistência

a estes antibióticos (102). Quando existem alterações nestas porinas, a entrada de

antibiótico para o espaço periplasmático é restringida. Desta forma, o acesso às

PBP na membrana interna fica impedido, conferindo resistência ao antibiótico

(ver figura 3C) (34, 54, 77).

Alterações no alvo

Alterações na estrutura das PBP podem resultar numa afinidade diminuída

para os beta-lactâmicos, dificultando a ligação dos mesmos ao local de acção

Figura 2: Representação da parede celular em bactérias Gram-negativo (a) e Gram-positivo (b). Adaptado de Brown L, Wolf JM., Prados-Rosales R, Casadevall A. Through the wall: extracellular vesicles in Gram-

positive bacteria, mycobacteria and fungi. Nat Rev Microbiol 2016;13:620–30.

6

(102). Estas modificações tornam as PBP relativamente resistentes à inactivação

pelos antibióticos actuantes (ver figura 3B) (7).

Produção de beta-lactamases

A produção de beta-lactamases é o mecanismo de resistência mais

importante nas bactérias Gram-negativo. Contrariamente às bactérias Gram-

positivo, a existência da membrana externa e do espaço periplasmático na

estrutura das bactérias Gram-negativo constituem um espaço propício a maior

concentração de beta-lactamases, potenciando assim a sua eficácia. As beta-

lactamases são enzimas bacterianas que hidrolisam o anel beta-lactâmico e

inactivam o antibiótico antes de este alcançar o seu alvo, as PBP. A afinidade

estrutural que as beta-lactamases partilham com as PBP permite que as mesmas

sejam capazes de se ligar, acilar e hidrolisar o beta-lactâmico, inactivando-o (ver

figura 3D) (86).

Figura 3: Principais mecanismos de resistência aos beta-lactâmicos. (A) Mecanismo de acção dos beta-lactâmicos. (B) Alterações no alvo, as PBP. (C) Impermeabilidade por alteração das OMP. (D) Produção de beta-lactamases. Adaptado de Pitout JD, Sanders CC, Sanders WE. Antimicrobial resistance with focus on beta-lactam resistance in

gram-negative bacilli. Am J Med 1997;103:51–9.

7

Genética das beta-lactamases

Os genes que codificam beta-lactamases (denominados de genes bla) podem estar

localizados no cromossoma bacteriano, em plasmídeos ou em transposões. Consoante a

localização do gene bla e o mecanismo pelo qual o mesmo é adquirido, a resistência a

antibióticos beta-lactâmicos por produção de beta-lactamases pode ser intrínseca (ou

natural), quando o gene de resistência está codificado no cromossoma bacteriano de uma

espécie, fazendo parte do seu genoma e sendo transmitido verticalmente; ou pode ser

adquirida, tanto por mutações cromossómicas espontâneas ou induzidas, como pela

transmissão horizontal de elementos genéticos móveis, como plasmídeos ou transposões,

possuidores de genes bla. Este último mecanismo tem especial relevância na transmissão

inter-espécies de fenótipos de resistência (7, 8).

Os integrões são elementos genéticos que tornam possível a transmissão de genes

entre espécies diferentes ao conter um sistema de recombinação específico (gene

cassettes) capaz de integrar, exprimir e trocar elementos específicos de ácido

desoxirribonucleico (ADN) (38). Os plasmídeos ou transposões que possuam integrões

são, então, fontes importantes de propagação de genes bla e também de outros

determinantes de resistência (7).

Classificação e propriedades das beta-lactamases

As beta-lactamases estão categorizadas com base na semelhança da sequência de

aminoácidos, como na classificação Ambler (classe A a D) ou consoante o seu substrato

e perfil inibitório, como na classificação Bush-Jacoby-Medeiros (grupo 1 a 3) (ver anexo

2) (3, 13, 47, 55, 99).

As enzimas classificadas como classe A ou grupo 2, hidrolisam penicilinas e

cefalosporinas; classe B ou grupo 3, inactivam os carbapenemes; classe C ou grupo 1,

actuam sobre as cefalosporinas; e a classe D ou grupo 2d, possuem oxacilinases que

podem ter acção de carbapenemase. Para quebrar a ligação de amido no anel beta-

lactâmico, o centro activo das beta-lactamases pode conter um resíduo de serina (Classe

Ambler A, C, D ou grupo 2, 1 e 2d de Bush-Jacoby-Medeiros) ou um ião metálico (Zn2+)

(Classe Ambler B ou grupo 3 de Bush-Jacoby-Medeiros) (41).

8

Na classe C da classificação de Ambler ou no grupo 1 de Bush-Jacoby-Medeiros

estão incluídas as beta-lactamases do tipo AmpC codificadas a nível cromossómico em

muitas espécies, podendo também ser indutíveis por exposição a certos beta-lactâmicos.

O que dita se estas enzimas são produzidas de forma constitutiva ou indutível é o ambiente

genético circundante ao gene bla (7).

Estas beta-lactamases podem ser encontradas no cromossoma de variadas

espécies tais como Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Morganella morganii,

Serratia marcescens, entre outras mencionadas na tabela 1. A origem da enzima AmpC

é ainda matéria de debate. Uma hipótese é que a AmpC tenha derivado de uma PBP, com

quem partilha analogia sequencial e estrutural (94). Outra possibilidade é que tenha

surgido na sequência da pressão antimicrobiana exercida por beta-lactâmicos ancestrais,

produzidos por bactérias e fungos (75).

As AmpC mostram actividade contra penicilinas e, especialmente, contra

cefalosporinas de 3ª geração (como a ceftriaxona, ceftazidima e cefotaxima). Estas

enzimas podem também hidrolisar inibidores beta-lactâmicos (como o ácido clavulânico

e o tazobactam), cefamicinas (como a cefoxitina e o cefotetan) e monobactâmicos (como

o aztreonam), este último com uma taxa de hidrólise inferior a 1% comparativamente à

das penicilinas (41). Por outro lado, as AmpC não têm actividade perante os

carbapenemes, e na maioria das vezes, também perante as cefalosporinas de 4ª e 5ª

geração, pois já foram relatados casos de resistência à cefepima (41, 53).

As enzimas AmpC podem ser cromossómicas ou plasmídicas (figura 4), conforme

estejam codificadas no cromossoma (resistência intrínseca ou adquirida) ou codificadas

em plasmídeos, sendo que as AmpC adquiridas por meio de um plasmídeo foram

transmitidas horizontalmente por outras bactérias que caracteristicamente possuem

AmpC (7, 41, 53).

Relativamente aos mecanismos de expressão cromossómica de AmpC, estes

podem ser não-indutíveis, indutíveis, constitutivos com sobre ou híper-expressão. Este

último mecanismo é exemplificado pelo caso específico da Escherichia coli

(normalmente produz AmpC sem relevância clínica), que quando possui uma mutação no

promotor, consegue produzir beta-lactamases AmpC em quantidade significativa (7, 41,

53).

9

Os mecanismos de expressão plasmídicos são mais complexos (havendo

diferentes variantes do gene ampC) e geralmente produzem AmpC de uma forma

constitutiva e não-indutível (7, 41, 53).

Adaptado de Jacoby GA. AmpC β-Lactamases. Clin Microbiol Rev 2009;22:161-82.

Tabela 1: Taxonomia de bactérias que expressam beta-lactamases AmpC codificadas no cromossoma.

10

AmpC cromossómica

A produção de AmpC está normalmente reprimida, ou seja, a sua produção é feita

em quantidades baixas (40, 51, 52). A repressão e a activação do gene ampC estão

intimamente ligadas aos processos de síntese e destruição da parede celular (41). A

regulação da expressão de ampC é realizada por factores de transcrição que respondem a

alterações da parede celular sob a influência da exposição a beta-lactâmicos, levando a

um aumento marcado dos níveis de AmpC – expressão indutível (51).

Os genes ampC indutíveis estão normalmente localizados no cromossoma e são

intrínsecos a algumas espécies, particularmente Enterobacter cloacae, Enterobacter

aerogenes, Serratia marcescens, Citrobacter freundii, Providencia spp., e Morganella

morganii. Estas espécies foram informalmente denominadas de organismos “ESCPM” ou

Figura 4: Esquema representativo das diferentes formas de expressão de beta-lactamases em Enterobacteriaceae, com os respectivos exemplos de espécies. Adaptado de Ruppé É, Woerther PL, Barbier F. Mechanisms of antimicrobial resistance in Gram-negative bacilli.

Ann Intensive Care 2015;5:61

11

“SPICE”1 (42, 84). Pode ainda incluir espécies variáveis como Proteus vulgaris ou

Proteus penneri que apresentam cefalosporinases pouco indutíveis, mas do tipo Classe A

(75). No entanto, não existe uma clara definição destas siglas, pois pode incluir variadas

espécies, podendo haver uma subestimação da variabilidade da expressão de ampC em

cada espécie e das respectivas consequências clinicas (41).

Sabe-se que o processo de indução está ligado à reciclagem da parede celular, que

envolve: uma interacção complexa de produtos que advêm da destruição de

peptidoglicanos, PBP, o gene ampC e os seus reguladores (como AmpR), enzimas

envolvidas na reciclagem de muropeptidases (como AmpD), entre outros elementos

moduladores como a permease AmpG (58, 69, 85).

Como já foi dito, na ausência de beta-lactâmicos indutores, os níveis basais de

AmpC produzidos são geralmente baixos. Normalmente, a reciclagem de peptidoglicanos

envolve o transporte de muropéptidos através da membrana interna celular pela permease

AmpG. Durante o processo de reciclagem da parede celular, são formadas espécies de

tripéptidos 1,6-anidro-MurNAc, cujos níveis são regulados pela enzima AmpD. Esta

enzima tem como função reciclar estes últimos para formar pentapéptidos UDP-MurNAc

que vão ser de novo incorporados na parede celular. Os pentapéptidos UDP-MurNAc,

sob estas condições, predominam em relação aos tripéptidos 1,6-anidro-MurNAc, e, por

isso, ligam-se ao regulador AmpR, inibindo-o, o que resulta numa acção inibitória sobre

a expressão do gene ampC. Desta forma, a bactéria produz níveis de AmpC baixos

(basais) (figura 5.1) (41).

Em contraste, sob a influência de beta-lactâmicos de indução forte que causam

disrupção da biossíntese de peptidoglicanos, os níveis citosólicos de tripéptidos 1,6-

anidro-MurNAc aumentam por haver maior produção de produtos de degradação da

parede celular. Sob estas condições, os pentapéptidos UDP-MurNAc, que competem com

os tripéptidos 1,6-anidro-MurNAc pela ligação ao regulador AmpR, são deslocados, não

podendo assim ligar-se ao mesmo. Desta forma, potencia-se a ligação entre os tripéptidos

1,6-anidro-MurNAc e a enzima AmpR, com resultante efeito estimulatório na actividade

de AmpR, o que causa uma promoção da expressão de ampC que resulta na maior

produção de AmpC. É de notar que existe uma acumulação dos tripéptidos 1,6-anidro-

1 SPICE: Serratia spp., Providencia spp., "Indole-positive" Proteus spp. (Morganella

morganii), Citrobacter spp. e Enterobacter spp.

12

MurNAc, não só pelo que já foi explicado, mas também pelo facto de AmpD, que está

responsável pela reciclagem destes tripéptidos, estar de certa forma saturada. Este

fenómeno de indução só confere à bactéria um fenótipo de resistência aos beta-lactâmicos

que estão a ser utilizados quando os mesmos são indutores fortes (como a amoxicilina, a

ampicilina, a cefoxitina, o imipeneme e o ácido clavulânico). No caso de indutores fracos

ou indutores que permaneçam estáveis na presença de AmpC, estes continuam eficazes

(figura 5.2). É de referir que assim que a exposição aos beta-lactâmicos com poder indutor

forte cessa, os níveis de AmpC produzidos retornam aos níveis basais (41).

É importante distinguir o processo de indução da produção de beta-lactamases

(explicado antes) de o de selecção dos mutantes desreprimidos (ou sobre-produção

constitutiva de AmpC). As mutações espontâneas em elementos reguladores, como a

AmpD, ocorrem numa frequência de 1 em 106 a 108 células (41) e podem ocorrer durante

a terapia antibiótica. As mutações em AmpD, que são as mais frequentes (114), levam a

uma acumulação dos tripéptidos 1,6-anidro-MurNAc no citoplasma, o que faz com que

exista uma sobre-expressão de ampC mediada pela desrepressão de AmpR. As mutações

em AmpR, embora menos frequentes (53), podem causar um fenótipo similar. Já que a

sobre-produção de AmpC pode ocorrer na ausência de um agente indutor, este processo

pode aumentar o espectro de beta-lactâmicos a que estas espécies são resistentes,

incluindo penicilinas de largo-espectro, cefalosporinas de 3ª geração, aztreonam (5, 41,

53, 63) e ainda o ertapeneme quando a enzima é produzida de forma ainda mais massiva

(5) (figura 5.3). Apesar de estas mutações poderem ocorrer espontaneamente, pode

também ocorrer selecção (e não indução) após terapia com beta-lactâmicos, o que

predispõe a falência terapêutica (41, 53).

Para além das espécies SPICE, existem ainda outras espécies que possuem

enzimas do tipo AmpC com expressão e significância clínica variáveis (53).

Em algumas espécies da família Enterobacteriaceae, a AmpC é expressa em

níveis clinicamente irrelevantes como E. coli e Shigella spp.. Estas espécies não têm um

gene ampR (11, 45) e a regulação de AmpC é concretizada por um fraco promotor e um

forte atenuador (56). Deste modo, estas espécies normalmente são sensíveis à cefoxitina,

e são não indutíveis, o que não altera o efeito inibidor dos beta-lactâmicos nestas espécies,

a não ser que por mutações nas regiões do promotor, se tornem híper-produtoras,

passando a ser resistentes à cefoxitina e às cefalosporinas de 3ª geração (20). Estes

13

mutantes ocorrem esporadicamente, por isso não são frequentes como mecanismo de

resistência em E. coli comparativamente com a aquisição de beta-lactamases de espectro

alargado (BLEA) (80).

As espécies não-fermentadoras, como Pseudomonas aeruginosa, podem também

possuir enzimas AmpC indutíveis homólogas às de Enterobacteriaceae (81). Muitos

aspectos na regulação de AmpC em P. aeruginosa são complexos, como o facto de AmpR

estar envolvido na regulação de outros genes para além da do gene ampC (68), de

possuírem múltiplos genes ampD (62) e um gene ampE que codifica uma proteína

Figura 5: Mecanismo de indução e de sobre-expressão de AmpC em Enterobacteriaceae. (1) Expressão de AmpC normal não induzida (sem exposição de beta-lactâmicos) e com produção basal de enzimas AmpC. (2) Indução da expressão de AmpC sob acção de beta-lactâmicos indutores e com produção aumentada das beta-lactamases. Quando a exposição aos indutores cessa, a produção de AmpC volta a ser em quantidades basais. (3) Sobre-expressão de AmpC de forma constitutiva ou selecção de mutantes desreprimidos, onde há continuamente uma produção aumentada de AmpC. Adaptado de Harris PN. Clinical management of infections caused by Enterobacteriaceae that express

extended-spectrum β-Lactamase and AmpC enzymes. Semin Respir Crit Care Med 2015;36:56–73.

14

citoplasmática que age como transdutor na expressão de ampC (61). Estas e outras

propriedades fazem com que esta espécie tenha particularidades diferentes no que diz

respeito ao tratamento das infecções provocadas pela mesma.

AmpC plasmídica

A presença de AmpC em microrganismos conhecidos por não possuírem genes

ampC codificados nos seus cromossomas, como Klebsiella, Proteus e Salmonella, define-

as como bactérias produtoras de AmpC mediadas por plasmídeo (11, 56, 101).

Alguns estudos de sequenciação genética sugerem que os genes plasmídicos

derivam de genes ampC cromossómicos (tabela 2), mais tarde integrados em elementos

genéticos móveis por meio de elementos de inserção, como os integrões, que facilitam a

sua dispersão (53, 82, 100).

A existência de pequenas diferenças na sequência de aminoácidos das AmpC

plasmídicas define seis famílias: CIT, derivada de genes blaAmpC de C. freundii e que

inclui os grupos LAT e CMY, este último com duas origens distintas (ver tabela 2); DHA,

derivada de genes blaAmpC de M. morganii; ACC, derivada de genes blaAmpC de Hafnia

alvei; FOX, derivada de genes blaAmpC de Aeromonas caviae; MOX, que se pensa ter

derivado de AmpC cromossómico de Aeromonas hydrophila; ECB, derivada de genes

blaAmpC de E. cloacae e/ou Enterobacter asburiae e que inclui os grupos ACT e MIR

(116). Mais recentemente, foi descrita uma nova variante, CFE-1, derivada de genes

blaAmpC de C. freundii (94). Actualmente, o GenBank tem descritas cento e quatro

variantes de CMY, oito de MOX, oito de DHA, nove de ACT, quatro de ACC, dez de

FOX, uma de LAT e cinco variantes de MIR, sendo que a variante CMY-2 é a AmpC

plasmídica mais prevalente em todo o mundo (116).

Os genes de AmpC codificados em plasmídeos são habitualmente não-indutíveis,

já que lhes falta o aparelho genético regulatório necessário para o controlo da sua

expressão (2, 41). No entanto, existem alguns relatos de AmpC plasmídicas indutíveis

(7).

15

Este tipo de AmpC é cada vez mais comum em Klebsiella e E. coli (2, 30, 107,

118). No entanto a grande propagação destes plasmídeos para novos hospedeiros (91),

faz com que seja impossível predizer se é uma resistência AmpC mediada por plasmídeo

só pela identificação das espécies em si (53).

Em Portugal, num dos poucos estudos existentes sobre estas enzimas, foram

detectadas AmpC plasmídicas do tipo CMY-2 e DHA-1 num isolado de E. coli e de K.

oxytoca, respectivamente, que também expressavam BLEA (60). Estas enzimas são muito

menos frequentes (0,8%) do que as BLEA (60), mas aparentam estar a aumentar de

número mundialmente, em países como Canadá, China, França, Bélgica, e inclusive

Portugal (30).

Normalmente, têm o mesmo fenótipo de resistências que as AmpC

cromossómicas, para além do fenótipo adicional que podem revelar por possuírem outras

resistências, quer sejam intrínsecas ou adquiridas (7, 41, 53).

Laboratorialmente, apresentam um fenótipo compatível com espécies produtoras

de BLEA (com resistência a cefalosporinas da 3ª geração), mas não são susceptíveis ao

clavulanato (o teste standard usado para confirmar uma espécie BLEA), sendo

adicionalmente resistentes à cefoxitina (107). Todavia, outros mecanismos como a

alteração da permeabilidade das OMP podem conceder resistência à cefoxitina, que caso

estejam simultaneamente presentes, tornam ainda mais difícil a sua identificação (39).

Muitos inibidores foram propostos para ajudar na confirmação da produção de

AmpC (tais como o ácido boriónico [57] e a cloxacilina [107]), mas a sensibilidade e a

especifidade destes testes é variável, não sendo estes usados como rotina (41).

Tabela 2: Cronologia e homologia das beta-lactamases AmpC plasmídicas.

Adaptado de Jacoby GA. AmpC β-Lactamases. Clin Microbiol Rev 2009;22:161-82.

16

Além disto tudo, as enzimas AmpC mediadas por plasmídeo podem coexistir com

enzimas BLEA no mesmo hospedeiro, o que faz com que a interpretação fenotípica seja

ainda menos fiável (2). A espécie K. pneumoniae pode ainda possuir alterações em

porinas que se traduzem em resistência ao imipeneme, ertapeneme e meropeneme, e

geralmente susceptibilidade à cefepima (54).

As espécies que possuem AmpC codificadas em plasmídeos podem ser

identificadas em infecções nosocomiais, adquiridas na comunidade e associadas aos

cuidados de saúde, revelando uma mortalidade elevada (108).

Detecção laboratorial de bactérias produtoras de AmpC

Actualmente, não existe nenhum teste de detecção ou nenhuma abordagem

diagnóstica standard que integre testes de rastreio e de confirmação com critérios

aprovados para a detecção de espécies produtoras de AmpC (22, 103). Contudo, vários

testes estão descritos na literatura (22, 53).

Uma vez que os testes de susceptibilidade antimicrobiana de rotina não são

suficientemente precisos para a detecção e a identificação de beta-lactamases emergentes

nos bacilos Gram-negativo, são necessários testes suplementares de confirmação, que têm

sido um grande objecto de estudo nas últimas duas décadas (128).

Os métodos de detecção laboratorial da enzima AmpC podem ser genotípicos ou

fenotípicos, consoante sejam usadas técnicas de biologia molecular para detectar e

identificar os genes responsáveis pela produção de AmpC ou técnicas que detectam a

presença de enzimas que hidrolisam determinados antibióticos, respectivamente (99,

127).

Os testes genotípicos, como o polymerase chain reaction (PCR) multiplex,

conseguem detectar uma variedade de genes AmpC, incluindo as diferentes famílias e

variantes existentes. No entanto, apesar de ser uma técnica golden standard, tem as

desvantagens de ser muito dispendioso e moroso, não sendo possível aplicar a um grande

número de amostras numa rotina diária hospitalar (70, 103).

17

As técnicas fenotípicas têm exibido um maior potencial de utilização na prática

clínica. Até à data, os métodos fenotípicos propostos para a detecção de AmpC podem

ser divididos em dois grupos: os que detectam a actividade de AmpC em extractos

Figura 6: Métodos fenotípicos que detectam espécies produtoras de AmpC. (a) Teste tridimensional, onde é inoculada uma estirpe de E. coli ATCC 25922 (sensível à cefoxitina) com um disco de cefoxitina. Resultados positivos quando se observa crescimento do organismo testado junto à zona de inibição com distorção da mesma. (b) Teste AmpC, que utiliza Tris-EDTA de forma a permeabilizar a parede bacteriana para haver libertação de beta-lactamases para o meio. Inoculação da mesma estirpe usada no teste tridimensional e colocado disco de cefoxitina. Considerado positivo quando há distorção no halo de inibição da cefoxitina junto ao disco que contém a espécie testada. (c) Teste de sinergia de duplo-disco usando a cloxacilina como inibidor, onde é colocado um disco de cloxacilina entre um de ceftazidima e outro de cefotaxima. Resultado positivo quando existe um aumento da zona de inibição à volta dos discos dos

antibióticos. (d) E-test, coloca-se uma tira de cefotetan/cefotetan-cloxacilina. Considera o teste positivo se se observar uma redução de pelo menos três diluições de CMI do cefotetan na presença de cloxacilina. (e) Método de discos de antibióticos combinados com inibidores. ZA: cepdoxima + indutor de AmpC; ZB: cefpdoxima + indutor de AmpC + inibidor de BLEA; ZC: cepfpdoxima + indutor de AmpC + inibidor de AmpC. Positivo para AmpC quando ZC - ZA ou ZC - ZB ≥ 5 mm. Negativo para AmpC quando todas as zonas de inbição diferem por ≤ 3 mm. Adaptado de Gude MJ, Seral C, Sáenz Y, González-Domínguez M, Torres C, Castillo FJ. Evaluation of four phenotypic methods to detect plasmid-mediated AmpC β-lactamases in clinical isolates. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2012;31:2037-43 e de Mast group. AmpC detection set. Disponível em:

http://www.mastgrp.com/Identification%20products/Glossies/AmpC_Detection_4pp.pdf

http://www.mastgrp.com/Identification%20products/Glossies/AmpC_Detection_4pp.pdf

18

enzimáticos; e os que avaliam os efeitos provocados pelos inibidores de AmpC sobre as

enzimas (36). Regra geral, os testes fenotípicos são sensíveis, fáceis de executar e de

baixo custo (116). Os testes AmpC e tridimensional são exemplos de técnicas que

detectam AmpC em extractos enzimáticos, ilustrados na figura 6 (90). Dentro dos testes

que avaliam os efeitos dos inibidores de AmpC, existem os métodos de sinergia de duplo

disco, o E-test (90) e os métodos de discos de antibióticos combinados com inibidores

(36), exemplificados na figura 6.

É importante referir que todo e qualquer microrganismo pertencente à família

Enterobacteriacae cujo perfil de susceptibilidade aos antibióticos retrate resistência às

penicilinas, cefalosporinas (da 1ª à 3ª geração) e cefamicinas, bem como à associação de

beta-lactâmicos/inibidores de beta-lactamases, especialmente à amoxicilina/ácido

clavulânico, deverá ser investigado como provável produtor da beta-lactamase do tipo

AmpC (36).

Uma das propostas de detecção compreende um algoritmo (ver figura 7) que

contém testes de rastreio e de confirmação, escolhidos em função da sua sensibilidade e

especificidade, para diferentes espécies de Enterobacteriaceae que produzem AmpC,

incluindo AmpC codificadas em plasmídeos. No caso de se obter resultados inconclusivos

(poucos casos esperados), os investigadores propõem um método molecular, PCR

multiplex, que deverá dar uma resposta fidedigna (22).

Como teste de rasteio, foi utilizado o método de difusão de disco Kirby-Bauer

com cefoxitina com um cutoff de ≤ 18 mm (segundo os critérios da Clinical Laboratory

Standards Institute [CLSI] de 2009). Valores inferiores ou iguais a 18 mm foram

considerados como resultados positivos para espécies produtoras de AmpC, e valores

superiores a 18 mm foram classificados como resultados negativos. A sensibilidade deste

teste foi de 97,4% no respectivo estudo (22).

Em relação ao teste de confirmação fenotípica, o teste de sinergia de duplo-disco

com cefoxitina-cloxacilina (cefoxitina num disco e cefoxitina mais cloxacilina no outro

disco), foi considerado o mais adequado, devido à sua elevada especificidade (100% no

estudo realizado [22]). Este teste tem por base o efeito inibitório da cloxacilina em

microrganismos produtores de AmpC. Se a diferença entre a zona de inibição da

cefoxitina mais a cloxacilina e a zona de inibição da cefoxitina for maior do que 4 mm, é

considerado indicativo de produção de AmpC, sendo que se for menor do que 4 mm

19

indica que não existe produção significativa de AmpC. Apesar ter ocorrido raramente,

um resultado inconclusivo neste método pode ser considerado quando não existem zonas

visíveis de inibição ao redor dos dois discos, com ou sem cloxacilina (22).

Se o resultado do teste de confirmação for inconclusivo, o próximo passo a seguir

no algoritmo (figura 7) é a realização de PCR multiplex, com a detecção ou não de AmpC

plasmídica ou, alternativamente, de mutação no promotor (no caso de E. coli) (22).

Este algoritmo, sugere também a detecção de BLEA com testes de rastreio e de

confirmação (não especificados no estudo em questão) paralelamente à detecção de

AmpC, de forma a abranger um espectro maior de beta-lactamases e facilitar a decisão

terapêutica (22).

Figura 7: Algoritmo para detecção de Enterobacteriaceae que produz AmpC. a) Esta categoria inclui Enterobacteriaceae spp. desconhecida por produzir AmpC codificada no

cromossoma e também E. coli. b) Inconclusivo quando não existem zonas de inibição visíveis em redor de ambos os discos. c) Referente a mutações na região do promotor de ampC de E. coli que resultam em híper-produção de AmpC. Adaptado de: Doi Y, Paterson DL. Detection of plasmid-mediated class C beta-lactamases. Int J Infect Dis 2007;11:191–7.

20

A detecção de bactérias produtoras de AmpC é de grande importância clínica, pois

a administração de cefalosporinas de 3ª geração a bactérias que aparentam um fenótipo

de susceptibilidade in vitro às mesmas, pode selecionar mutantes desreprimidos por

emergência de resistência, o que resulta em ineficácia do tratamento (41, 53). Além disto,

numa época em que é aconselhado racionalizar o uso de carbapenemes por eventual

resistência emergente aos mesmos, uma correcta detecção destas espécies ajudaria a uma

escolha de antibiótico mais adaptada, em que a recorrência aos carbapenemes seria feita

apenas em infecções graves sem outras alternativas fiáveis. Neste sentido, as directrizes

fornecidas por CLSI, European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

(EUCAST), entre outras, devem ser reavaliadas e reformuladas, de forma a facilitar o

desenvolvimento de uma estratégia de pesquisa eficiente para a detecção de beta-

lactamases emergentes em bacilos Gram-negativo, com especial foco para as AmpC, que

deverá ser implementada na rotina laboratorial hospitalar.

Terapêutica

Existe uma lacuna significativa entre o nosso conhecimento acerca de biologia

básica sobre bactérias produtoras de AmpC e a aplicação clínica desta informação. Apesar

de existirem muitos estudos relativos à resistência em espécies Gram-negativo, a maioria

foca-se em aspectos epidemiológicos, laboratoriais e de controlo de infecção, poucos

fornecem informação confiável acerca da optimização terapêutica, sendo em número

reduzido os que se referem especificamente às beta-lactamases AmpC (41).

Grau de indução e capacidade de selecção dos beta-lactâmicos

É relevante clarificar as características das subclasses de beta-lactâmicos

relativamente ao seu grau de indução de AmpC, de susceptibilidade à hidrólise por AmpC

e de selectividade de mutantes desreprimidos, pois estas mesmas características tornam-

se essenciais para uma melhor análise da terapêutica a ser utilizada.

A tabela 3 ilustra a relação entre o grau de indução de AmpC e de susceptibilidade

à hidrólise por AmpC que o substrato (antibiótico) apresenta. Os beta-lactâmicos que são

indutores fortes e bons substratos (mais susceptíveis à hidrólise) mostram-se ineficazes

21

contra espécies indutíveis. Por outro lado, os agentes indutores fracos ou maus substratos

(menos susceptíveis à hidrólise), ou mesmo ambos, são capazes de serem activos contra

as estirpes indutíveis (53, 76). A variação do grau de indução entre os beta-lactâmicos

poderá dever-se ao facto de diferentes beta-lactâmicos ligarem-se a PBP distintas, visto

que a inactivação de PBP distintas pode conduzir à degradação de produtos que

contribuem para uma maior ou menor expressão de ampC (112).

Em relação aos efeitos indutores dos inibidores de beta-lactamases, sabe-se que o

ácido clavulânico possui um efeito indutor forte, e que o tazobactam e o sulbactam são

indutores fracos. Além disto, o tazobactam e o sulbactam têm um efeito inibidor sobre as

enzimas AmpC superior ao do ácido clavulânico (14, 65, 73).

Há que frisar que as características mencionadas anteriormente e relatadas na

tabela 3, e as repercussões resultantes, só se aplicam a bactérias produtoras de AmpC

indutíveis, não incluindo os casos de sobre ou híper-expressão constitutiva de ampC.

Quando falamos de bactérias com sobre ou híper-expressão constitutiva de ampC,

temos de ter em consideração o grau de selectividade de mutantes que o antibiótico tem.

As cefalosporinas de 3ª e 4ª geração são bons selectores de mutantes

desreprimidos, enquanto que, o imipeneme, as cefalosporinas de 1ª e 2ª geração e as

cefamicinas, são selectores fracos. Normalmente, os antibióticos que são considerados

indutores fracos tendem a ser bons selectores, e vice-versa (33).

A selecção de mutantes desreprimidos deve ser sempre considerada quando uma

infecção por produtores de AmpC indutíveis não melhora, ou recidiva depois da primeira

Tabela 3: Perfil de indução de ampC por diferentes beta-lactâmicos e respectivos fenótipos.

.

Adaptado de Macdougall C. Beyond susceptible and resistant, Part I: Treatment of infections due to gram-negative organisms with inducible β- lactamases. J Pediatr Pharmacol Ther 2011;16:23–30.

1. Macdougall C. Beyond susceptible and resistant, Part I: Treatment of infections

due to gram-negative organisms with inducible β- lactamases. J Pediatr

Pharmacol Ther 2011;16:23–30.

22

linha de terapêutica com um certo beta-lactâmico. Esta situação deve ser confirmada por

repetição do teste de susceptibilidade em nova amostra (109). Este mecanismo de

selecção de mutantes desreprimidos parece acontecer mais frequentemente em infecções

mais graves ou em doentes imunodeprimidos, cujo sistema imune é incapaz de eliminar

a subpopulação resistente (84).

Terapêutica clássica

A terapêutica a administrar em bactérias produtoras de AmpC é diferente para

estirpes não-indutíveis, indutíveis, híper-produtoras constitutiva de AmpC, desreprimidas

e AmpC plasmídicas. Dentro das indutíveis, existem casos especiais, como o da bactéria

P. aeruginosa, que normalmente apresenta um número superior de resistências a beta-

lactâmicos e, por isso, o tratamento diferencia-se das restantes indutíveis.

Cefalosporinas

No que diz respeito às cefalosporinas, não está aconselhado o uso das mesmas

como terapêutica sem associação de um inibidor, sendo a cefepima uma possível

excepção.

As cefalosporinas de 1ª e 2ª geração mostram-se geralmente ineficazes perante as

espécies produtoras de AmpC. Mesmo quando estas bactérias revelam um antibiograma

com susceptibilidade perante estes beta-lactâmicos, o seu uso deve ser evitado, por serem

indutores fortes da produção de AmpC, que aquando a sua administração clínica nestas

estirpes, irão demonstrar posteriormente ineficácia (7, 41, 53).

Além disto, as cefalosporinas de 3ª e 4ª geração, que geralmente mostram eficácia

em estirpes indutíveis, são bons selectores de mutantes desreprimidos, e, por poderem

provocar a emergência desta resistência, desaconselha-se a sua utilização, em especial

das cefalosporinas de 3ª geração, sem associações. No entanto, mesmo quando associadas

a outro antibiótico, é preciso ter cuidado na sua utilização, pois não houve redução

significativa da taxa de selecção de mutantes desreprimidos quando testaram a eficácia

de cefalosporinas de 3ª geração em combinação com aminoglicosídeos ou

fluoroquinolonas (18).

23

O uso das cefalosporinas de 3ª geração só é recomendado nas infecções por E. coli

(não híper-produtora e quando sensível) e nas infecções simples, como infecções do tracto

urinário (ITU), onde o efeito bactericida pode ser atingido antes que a selecção de

mutantes sobre-produtores possa acontecer (78).

Até à data é sugerido pelo EUCAST que, para as espécies Enterobacter spp.,

Citrobacter freundii complex2 e Hafnia alvei, no resultado do antibiograma, a

susceptibilidade a cefalosporinas de 3ª geração seja acompanhada de uma observação

salientando que pode emergir resistência durante o tratamento com cefalosporinas de 3ª

geração. Sugerem também a hipótese de não disponibilizar o resultado desta

susceptibilidade para os clínicos, dado que frequentemente induz erradamente a utilização

destas cefalosporinas como terapêutica para o tratamento de infecções provocadas pelas

espécies mencionadas (67). Num estudo apresentado no 27th European Congress of

Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID) em 2017, foi testado a

frequência de emergência da resistência de sobre-produção de AmpC, após terapêutica

com cefalosporinas de 3ª geração, nalgumas espécies de Enterobacteriaceae. Neste estudo

concluíram que Enterobacter spp., Citrobacter freundii group e Hafnia alvei tinham mais

propensão para desreprimirem do que as outras espécies testadas, o que vai de acordo

com as recomendações do EUCAST (67).

A excepção a esta subclasse de beta-lactâmicos, é a cefepima, a única

cefalosporina com estabilidade demonstrada perante as beta-lactamases AmpC in vitro,

incluindo estirpes desreprimidas com produção constitutiva de AmpC (113). Em estudos

recentes de comparação com os carbapenemes, a cefepima mostra ser eficaz em infecções

provocadas por Enterobacteriaceae que produzem AmpC (119, 125). Este fármaco

também se mostrou tão eficaz como o imipeneme no tratamento de pneumonias

nosocomiais em pacientes internados na unidade de cuidados intensivos (UCI), em que o

principal isolado foi P. aeruginosa (129).

A eficácia da cefepima baseia-se no facto de esta ser um composto zwitterionic

(com carga positiva e negativa) que lhe proporciona a vantagem de conseguir penetrar a

membrana externa mais rapidamente, o que lhe permite alcançar o seu alvo antes de ser

inactivada pelas beta-lactamases (97,119). Adicionalmente, a cefepima tem uma baixa

2 Citrobacter freundii complex inclui Citrobacter braakii, Citrobacter murlinieae, Citrobacter werkmanii

e Citrobacter youngae (4).

24

afinidade para beta-lactamases e é também um fraco indutor de AmpC (tabela 3) (95,

111).

Contudo, há que ter em atenção que as espécies como Enterobacter, Citrobacter

e Serratia spp., podem frequentemente adquirir simultaneamente BLEA, às quais a

cefepima não se mostra estável (35). A cefepima também não se mostra eficaz na maioria

dos casos de sobre-expressão de ampC se forem infecções graves com elevado inóculo

bacteriano (efeito de inóculo) (27). Todavia, é uma escolha terapêutica a considerar em

mutantes desreprimidos sempre que as bactérias mutantes se mostrarem susceptíveis à

cefepima e a origem da infecção esteja controlada, tornando-se uma opção que permite

evitar o uso dos carbapenemes (44, 125).

Carbapenemes

Os carbapenemes têm sido considerados a primeira linha de tratamento para

infecções graves causadas por espécies produtoras de AmpC, incluindo mutantes

desreprimidos e P. aeruginosa (12). Estes beta-lactâmicos são geralmente estáveis à

hidrólise por parte das beta-lactamases AmpC e são também menos afectados pelo efeito

de inóculo, demonstrando uma excelente farmacodinâmica (64).

As opções terapêuticas para espécies de Enterobacteriaceae produtoras de AmpC

indutíveis que também produzem BLEA são limitadas, o que faz com que os

carbapenemes sejam fármacos de eleição nestas situações, demonstrando uma taxa de

mortalidade inferior em relação às outras alternativas (29, 83).

Todavia, resistências a carbapenemes têm vindo a ser descritas durante o

tratamento de espécies de Enterobacteriaceae produtoras de AmpC com estes fármacos,

o que se deve à existência simultânea de sobre-produção de AmpC e de mutações nas

porinas ou de bombas de efluxo (27, 121, 123, 124).

No que diz respeito à espécie P. aeruginosa, os carbapenemes mostram-se

eficazes, com excepção do ertapeneme que mostra pouca actividade contra Pseudomonas

(41).

25

Penicilinas de largo espectro e inibidores de beta-lactamases

De entre as penicilinas de espectro-alargado mais estudadas que se pode usar nas

espécies produtoras de AmpC, existem a piperacilina e a ticarcilina com os seus

respectivos inibidores beta-lactâmicos, e a temocilina.

A utilização da piperacilina é geralmente em associação ao tazobactam. A

piperacilina tem um comportamento lábil perante as enzimas AmpC, mas é um indutor

fraco, e, por isso, exibe actividade contra AmpC indutíveis, mas não contra mutantes

desreprimidos. O tazobactam exibe alguma actividade inibitória para beta-lactamases, e

é também um fraco indutor de AmpC (16, 88).

A utilização de piperacilina-tazobactam (PTZ) exibe uma eficácia clínica

controversa (41). O seu uso tem vindo a ser desaconselhado porque, apesar de exibir

algum nível de eficácia in vitro (1), pode demonstrar frequentemente valores de CMI

elevados (41), e pode ainda causar pressão na selecção de mutantes desreprimidos (115).

Muitos laboratórios não apresentam os resultados da susceptibilidade à PTZ para

produtores de AmpC, por provável ineficácia clinica ou resistência que possa emergir.

Esta prática é de alguma forma extrapolada dos maus resultados obtidos com as

cefalosporinas de 3ª geração (19). Apesar disto, existe pouca evidência clinica que suporte

evitar o seu uso por parte dos clínicos quando as espécies de Enterobacteriaceae se

mostrem susceptíveis à PTZ. O risco de emergência de resistência com consequente

insucesso clínico, aparenta ser pequeno e não pode ser inferido indirectamente de estudos

em Enterobacter e com cefalosporinas de 3ª geração (109).

Curiosamente a enzima AmpC produzida por M. morganii é bem inibida pelo

tazobactam, mesmo quando a sua expressão está aumentada (1, 105). Contudo, não

existem estudos clínicos para corroborarem a sua eficácia em infecções graves por M.

morganii (41, 53).

A existência de estudos clínicos para se averiguar a eficácia de PTZ em infecções

graves causadas por produtores de AmpC é limitada (41, 42).

A ticarcilina pode ser usada no tratamento de infecções por bactérias produtoras

de AmpC indutíveis quando as mesmas são susceptíveis. No entanto, os mutantes

desreprimidos mostram-se resistentes a esta penicilina. Este antibiótico quando usado em

combinação com o ácido clavulânico, exibe uma eficácia clínica controversa contra as

26

espécies de Enterobacteriaceae produtoras de AmpC indutíveis. Como já foi mencionado,

o ácido clavulânico é um indutor potente de AmpC (maior grau de indução que o

tazobactam) e inibe pouco a sua actividade (exibe menos actividade contra as AmpC do

que o tazobactam). Desta forma, pode então antagonizar a actividade da ticarcilina

quando usada em combinação contra espécies com beta-lactamases indutíveis (73). Ao

contrário da PTZ, esta associação não demonstra eficácia in vitro contra mutantes

desreprimidos (1).

A combinação de beta-lactâmicos com inibidores de beta-lactamases é uma boa

forma para ultrapassar a acção hidrolítica das beta-lactamases. Os inibidores devem ser

compostos que apresentam grande afinidade para as beta-lactamases. Estes devem ligar-

se ao centro activo destas enzimas sem serem hidrolisados eficientemente, através de uma

hidrólise muito lenta ou da produção de um complexo enzimático permanentemente

inactivo. Desta forma, os inibidores são usados de forma a protegerem os antibióticos

beta-lactâmicos de serem hidrolisados pelas beta-lactamases (7, 41).

A temocilina é uma carboxipenicilina derivada da ticarcilina, que foi modificada

para melhorar a sua estabilidade perante as enzimas BLEA e AmpC, apesar de ter uma

actividade menor contra Pseudomonas spp.. Existem alguns estudos com resultados

favoráveis à utilização da temocilina em estirpes que produzem AmpC (9, 79), sendo a

sua eficácia maioritariamente em ITU (por atingir bons níveis urinários) e bacteriemias

causadas por produtores de AmpC desreprimidos e BLEA (9). Contudo, os dados clínicos

são limitados (53). São necessários novos estudos para se poder considerar a temocilina

como uma opção alternativa aos carbapenemes, especialmente em infecções não

urinárias.

Outros fármacos não beta-lactâmicos

Anitbióticos que não sejam beta-lactâmicos como as fluoroquinolonas, os

aminoglicosídeos e trimetroprim-sulfametoxazol (co-trimoxazol) podem ser boas

escolhas como terapêutica definitiva, apesar da sua toxicidade ser geralmente maior do

que a dos beta-lactâmicos. A biodisponibilidade oral que as fluoroquinolonas e o co-

trimoxazol possuem, faz com que o seu uso para infecções ligeiras a moderadas seja

adequado quando se mostram susceptíveis a espécies produtoras de AmpC (84).

27

Estudos que utilizaram as fluoroquinolonas em espécies de Enterobacteriaceae

produtoras de AmpC, concluem que estes antibióticos não mostraram um aumento da

mortalidade quando comparados com carbapenemes, frisando que isto provavelmente se

deve ao facto de terem sido usados em infecções menos complexas e graves, pelo que as

fluoroquinolonas devem ser consideradas quando existe susceptibilidade às mesmas em

infecções com gravidade moderada (43).

A resistência aos aminoglicosídeos continua a ser um problema no tratamento de

infecções nosocomiais, pela baixa absorção do fármaco e pela aquisição de enzimas por

plasmídeo em espécies de Enterobacteriaceae e na espécie Pseudomonas spp. (59).

Muita da literatura que suporta o uso de co-trimoxazol especificamente para

microrganismos que produzam AmpC é limitada a casos clínicos antigos ou com amostras

pequenas, havendo pouca informação recente disponível (42).

A tigeciclina tem actividade contra a maioria de espécies de Enterobacteriaceae

produtoras de AmpC e também de BLEA (120). No entanto, é necessário ter em conta

que esta tem uma penetração limitada no tracto urinário e pulmonar, podendo não ser

eficaz nesta localização. Além disto, pode também apresentar níveis séricos baixos dado

o seu grande volume de distribuição, limitando a sua eficácia em caso de bacteriemia

(17). Num estudo no Reino Unido, a tigeciclina mostrou boa actividade in vitro contra

88% de isolados híper-produtores de E. coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp. e

Citrobacter spp. (46). Contudo, uma meta-análise sugeriu que o tratamento com

tigeciclina está associado a mortalidade excessiva nestas espécies, o que limita o

entusiasmo da sua utilização em infecções graves quando existem alternativas (106).

A fosfomicina tem sido usada durante muitos anos nalguns países como

tratamento de ITU não complicadas causadas por E. coli. Existe um interesse renovado

no seu uso contra infecções causadas por E. coli ou K. pneumoniae produtoras de BLEA

e AmpC plasmídeo-mediadas, pois está demonstrado uma actividade excelente contra

estas estirpes in vitro (6, 37, 48, 92). Estudos acerca da eficácia clínica deste antibiótico

são necessários para aferir o seu potencial.

28

Novas terapêuticas

Actualmente existe um interesse renovado em desenvolver novos compostos

inibidores das beta-lactamases (25).

Um dos inibidores mais promissores é o avibactam, um novo inibidor não beta-

lactâmico que apesar de ter pouca actividade antibacteriana, possui um grande poder de

inibição sobre as enzimas das classes A, C e algumas da D de Ambler, protegendo com

eficácia os beta-lactâmicos associados (89). Este inibidor é caracterizado por ser muito

eficiente na sua ligação com as beta-lactamases por carbamilação (transferência de

carbonos), e por ser capaz de descarbamilar muito lentamente, o que resulta numa longa

semi-vida do aducto (beta-lactamase + avibactam) produzido (89, 122). Além disto, a

descarbamilação resulta na regeneração intacta do avibactam, e não na sua hidrólise (26).

Adicionalmente, é um fraco indutor da expressão de AmpC (89).

Associações do avibactam com a ceftazidima, a ceftarolina e o aztreonam estão

actualmente em investigação, pelo que, in vitro, o seu efeito contra as AmpC e as suas

variantes está a ser demonstrado como sendo eficaz (104).

In vitro, quando o avibactam está combinado com a ceftazidima, mostra uma

eficácia de espectro alargado contra diferentes espécies (28), e também diminui as CMI

da ceftazidima em P. aeruginosa sobre-produtora de AmpC (110). A associação

ceftazidima-avibactam foi aprovada pela Food and Drug Administration (FDA) e pela

Agência Europeia de Medicamentos (EMA) com base em estudos que demonstraram a

eficácia desta associação contra microrganismos produtores de AmpC (ver tabela 4).

Estes estudos incluíram ITU complicadas, infecções intra-abdominais (IIA) e pneumonias

adquiridas na comunidade e associadas ao ventilador. Também demostraram eficácia em

isolados resistentes à ceftazidima (87, 117, 130).

As associações ceftarolina-avibactam e aztreonam-avibactam (tabela 4) têm

mostrado resultados promissores in vitro contra Enterobacteriaceae resistentes a

cefalosporinas de 3ª geração (72, 126).

Vários estudos clínicos estão a decorrer em fase dois e três para várias

combinações do avibactam com beta-lactâmicos (25).

29

Associações com outros inibidores de beta-lactamases estão em avaliação em

estudos clínicos a decorrer em fase dois ou três, como imipeneme-relebactam,

meropeneme-varborbactam e cefepime-zidebactam (tabela 4). Estas associações têm

demonstrado eficácia contra microrganismos produtores de AmpC (15).

O cefiderocol é uma nova cefalosporina que tem a capacidade de atravessar de

forma activa a membrana externa da parede celular dos bacilos Gram-negativo por

ligação ao ferro sérico, usando o sistema de transporte do ferro da bactéria. A entrada

deste antibiótico pelo sistema de transporte do ferro acelera e aumenta o influxo do

cefiderocol até ao espaço periplasmático, o que melhora a sua actividade antimicrobiana

em relação aos carbapenemes, às combinações de beta-lactâmicos com inibidores de beta-

lactamases e às cefalosporinas de gerações mais recentes (49, 50). Esta cefalosporina

mostra-se muito estável contra a beta-lactamase AmpC e tem demonstrado grande

actividade in vitro contra Enterobacteriaceae (66). Estudos clínicos relativos a esta

cefalosporina encontram-se em fase três, como indicado na tabela 4 (88).

Tabela 4: Espectro de actividade de diferentes beta-lactâmicos associados aos novos inibidores de beta-lactamases e de um novo beta-lactâmico.

Adaptado de Carmeli Y. New antibiotics for XDR Gram-negatives, oral presentation #SY0483. 27th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 2017. Disponivel em:

http://www.eccmidlive.org/#resources/new-antibiotics-for-xdr-resistant-non-fermenters


30

Conclusão

As enzimas AmpC são beta-lactamases importantes para as espécies que as

produzem por evitarem a actividade dos beta-lactâmicos sobre as mesmas. As variantes

da expressão de AmpC, como a sua indução e desrepessão sob a exposição a certos beta-

lactâmicos, são uma forma de as mesmas conseguirem escapar à actividade inibitória

destes mesmos beta-lactâmicos. Estas variantes de expressão apresentam resultados de

susceptibilidade in vitro sem correlação com eficácia in vivo. Desta forma, os clínicos que

não conheçam o mecanismo de acção de AmpC e as suas variações de expressão, são

induzidos erradamente a prescrever uma terapêutica que se revelará ineficaz.

Actualmente, é essencial que os laboratórios sigam as directrizes do EUCAST, que alerta

para a existência desta problemática, em situações de AmpC cromossómicas. No entanto

a emergência de AmC plasmídicas em estirpes não relacionadas, como K. pneumoniae e

E. coli, mantêm-se por identificar. Torna-se premente, a existência de uma metodologia

de detecção e de identificação inequívoca destas bactérias de forma a abranger todos os

tipos de bactérias produtoras de AmpC, incluindo as plasmídicas.

Na escolha da terapêutica deve-se ter em consideração a actividade do fármaco

contra espécies produtoras de AmpC, o seu grau de indução e também a sua capacidade

de selecção de mutantes desreprimidos. A selecção de mutantes desreprimidos tem um

maior impacto clínico que a indução de AmpC, porque na selecção de mutantes

desreprimidos, a AmpC é produzida de forma constitutiva, não retornando à produção de

níveis basais de AmpC quando a exposição aos beta-lactâmicos selectores cessa –

fenótipo de resistência alargado. Em contraste, a produção de AmpC por indução, cessa

quando as respectivas bactérias deixam de estar expostas aos beta-lactâmicos indutores –

fenótipo de resistência estreito.

Torna-se fulcral a execução de mais estudos clínicos específicos para bactérias

produtoras de AmpC que avaliem o efeito da terapêutica existente, pois existe ainda uma

discrepância entre o que se sabe microbiologicamente e a prática clínica. Adicionalmente,

existe um interesse na descoberta de novos beta-lactâmicos e inibidores de beta-

lactamases que sejam mais eficazes, fracos indutores e pouco selectores. Os inibidores

vão potencializar a já eficácia do beta-lactâmico associado. A utilização de inibidores

para combater as infecções provocadas por espécies produtoras de AmpC, faz com que a

haja uma maior utilização de beta-lactâmicos com espectro mais estreito. A utilização de

31

beta-lactâmicos com espectro mais estreito, evita o uso de beta-lactâmicos com espectro

mais alargado, como os carbapenemes, reduzindo a emergência de resistência aos

mesmos.

Em suma, a importância clínica crescente das espécies produtoras de beta-

lactamases AmpC, reforça a necessidade da investigação tanto na área do diagnóstico

como na terapêutica destas infecções, sendo previsível ser uma das futuras áreas de maior

interesse no campo da resistência antimicrobiana.

32

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Anexos

Anexo 1: Tabela com um resumo das classes de antibióticos e os seus respectivos

mecanismos.

Disponível em: https://mynotes4usmle.tumblr.com/post/139882185685/mynotes4usmle-

antibiotics-cheat-sheet-also#.WW01S4g1_IU (acesso em Julho de 2017).

https://mynotes4usmle.tumblr.com/post/139882185685/mynotes4usmle-antibiotics-cheat-sheet-also#.WW01S4g1_IU

https://mynotes4usmle.tumblr.com/post/139882185685/mynotes4usmle-antibiotics-cheat-sheet-also#.WW01S4g1_IU

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Anexo 2: Beta-lactamases chave que conferem resistência à família Enterobacteriaceae,

integradas na classificação de Ambler e de Bush-Jacoby-Medeiros.

Adaptado de: Harris PN. Clinical management of infections caused by Enterobacteriaceae

that express extended-spectrum β-Lactamase and AmpC enzymes. Semin Respir Crit

Care Med 2015;36:56–73.

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