BIANCA FERNANDES MIRRA METABOLISMO ENERGÉTICO DE … · 2019. 8. 15. · iii Mirra, Bianca...

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PPG-PRODBIO - Programa de Pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências

BIANCA FERNANDES MIRRA

METABOLISMO ENERGÉTICO DE POLIFOSFATOS MITOCONDRIAIS E SUA

RELAÇÃO COM O ESTRESSE OXIDATIVO EM Tribolium castaneum.

Macaé – RJ

2017

ii

METABOLISMO ENERGÉTICO DE POLIFOSFATOS MITOCONDRIAIS E

SUA RELAÇÃO COM O ESTRESSE OXIDATIVO EM Tribolium castaneum.


Dissertação apresentada a Universidade

Federal do Rio de Janeiro como parte das

exigências para obtenção do título de Mestre

em Produtos Bioativos e Biociências.

ORIENTADOR: Drº. ELDO CAMPOS

CO-ORIENTADOR: Drº. RODRIGO NUNES DA FONSECA

Macaé – RJ

2017

iii

Mirra, Bianca Fernandes.

Metabolismo energético de Polifosfatos mitocondriais e sua relação com o

estresse oxidativo em Tribolium castaneum/__f.

Dissertação de Mestrado em Produtos Bioativos e Biociências apresentada

a Universidade Federal do Rio de Janeiro, campus Macaé, Professor Aloísio

Teixeira.

Orientador: Eldo Campos

1. Metabolismo de polifosfatos 2. Bioquímica 3. Estresse oxidativo

Co-orientador: Rodrigo Nunes da Fonseca

1. Biologia molecular 2. Biologia Evolutiva do Desenvolvimento

iv

METABOLISMO ENERGÉTICO DE POLIFOSFATOS MITOCONDRIAIS E SUA

RELAÇÃO COM O ESTRESSE OXIDATIVO EM Tribolium castaneum.


Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Produtos

Bioativos e Biociências da Universidade

Federal do Rio de Janeiro, campus Macaé,

Professor Aloísio Teixeira, como parte dos

requisitos para a obtenção do título de

Mestre.

Apresentada em 10/11/2017.

COMISSÃO EXAMINADORA:

________________________________________________________

Profª.Drª. Magdalena Rennó

Titular interno (UFRJ/Macaé)

________________________________________________________

Profº.Drª. José Roberto da Silva

Titular interno (UFRJ/Macaé)

________________________________________________________

Profª.Drª. Flávia Borges Mury

Titular externo (UFRJ/Macaé)

________________________________________________________

Prof. Drº. Rodrigo Nunes da Fonseca – LICM / UFRJ - Campus Macaé

(Co-orientador)

_________________________________________________________

Prof. Drº. Eldo Campos – LIBHM / UFRJ – Campus Macaé

(Orientador)

Macaé – RJ

2017

v

“Dedico aos meus filhos Pedro e Pietra para nunca esquecerem que todo esforço é

recompensado...”

vi

AGRADECIMENTOS:

À Deus, por tudo.

Aos meus filhos, que mesmo sem compreender bem, me apoiaram e reconheceram

meus esforços com os estudos.

À minha mãe, por parar a sua vida para me ajudar quando eu mais precisei cuidando

dos meus filhos para que eu pudesse me dedicar aos estudos.

Ao meu pai, por se preocupar comigo.

Aos meus irmãos, pela admiração em lutar pelos meus objetivos.

Aos meus amigos, pela força.

À querida Ana Maria Barzani Ávila, que me direcionou ao universo do mestrado

acreditando que eu seria capaz.

Ao querido João Batista Orozimbo que sempre foi um grande incentivador do meu

crescimento acadêmico me apoiando e demonstrando grande admiração por minha

determinação.

Ao querido Jovenito Tavares pela admiração perceptível e incentivo ao meu

crescimento acadêmico.

À querida Lorena Guimarães Rosa pelo auxílio em língua inglesa sempre me apoiando

e auxiliando quando precisei.

Ao querido Eduardo Ivanissevich da Costa pelo auxílio em toda formatação da minha

dissertação.

Ao meu professor orientador Eldo Campos, pelos ensinamentos científicos, por

acreditar no meu potencial, pela paciência e atenção sempre que precisei. Agradeço

imensamente pela oportunidade de ver meu sonho se tornar realidade pois sem seu

auxílio eu não teria conseguido.

Ao meu professor co-orientador Rodrigo Nunes da Fonseca, pela disponibilidade em

ajudar sempre.

vii

Ao professor José Roberto da Silva, pelo dom de ensinar, pelo incentivo e pela grande

capacidade de mostrar que tudo dará certo.

Aos meus queridos amigos de laboratório George Domingues, Keity Jaqueline Vilela,

e Bianca Curitiba pela parceria e força em todos, absolutamente todos os momentos

no decorrer do mestrado.

A todos os alunos e funcionários do LIBHM e do NUPEM, em especial a Danielle

Fraga, Otassano Panetto, Carina Oliveira, Lina Lane Ferreira, que se tornaram

grandes amigos. Muito obrigada pela parceria no dia a dia.

Ao técnico José de Souza Lima Júnior pela ajuda para o bom andamento na execução

dos experimentos.

Aos colegas de biotério pelo auxílio na manutenção da colônia.

Aos professores que aceitaram fazer parte das minhas bancas de acompanhamento

Magdalena Rennó e José Roberto da Silva colaborando grandemente para meu

crescimento acadêmico.

À professora Magdalena Rennó que aceitou revisar minha dissertação.

Aos professores que aceitaram fazer parte da minha banca de defesa de mestrado

Magdalena Rennó, Cíntia Monteiro, Flávia Mury, Leonardo Abreu e José Roberto.

À coordenação de pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências, pelo apoio ao

curso.

Às agências de fomento, CAPES, CNPq, e em especial a FAPERJ, pelo financiamento

para este projeto.

Obrigada a todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.

viii

“Graças a Deus, por seu dom indescritível”.

2 Coríntios 9:15

https://www.bibliaon.com/versiculo/2_corintios_9_15/

ix

RESUMO:

O besouro Tribolium castaneum surgiu como um interessante modelo de

estudo relacionado ao desenvolvimento dos artrópodes para investigar questões

biológicas básicas. Polifosfatos inorgânicos são polímeros lineares de ortofosfato

cujos resíduos de fosfato estão unidos por ligações fosfoanidrídicas

termodinamicamente equivalentes a Adenosina trifosfato (ATP), que quando

hidrolisadas, geram energia. As exopolifosfatases (PPX) são consideradas enzimas

regulatórias centrais no metabolismo de PoliP onde atua hidrolisando a cadeia de

PoliP, liberando moléculas de fosfato inorgânico (Pi). As ATPases ou

adenosinatrifosfatases constituem uma classe de enzimas que catalisam a

decomposição do ATP em ADP e um íon de fosfato livre. Nosso trabalho investigou a

enzima Exopolifosfatase mitocondrial (mitoPPX), mostrando que sua atividade é

regulada durante a respiração mitocondrial na presença de ADP + Piruvato. Como

inibidor da cadeia respiratória utilizamos KCN, que foi capaz de inibir a atividade da

mitoPPX durante a respiração mitocondrial, resultado antagonicamente observado

quando o gene da pirofosfatase foi silenciado por RNAi. FCCP como desacoplador da

cadeia respiratória estimulou a atividade da mitoPPX, efeito não observado quando o

gene da pirofosfatase foi silenciado por RNAi. PoliP3 ativou a atividade da F1Fo-

ATPase durante a respiração mitocondrial e também com o gene da pirofosfatase

silenciado por RNAi, já PoliP15 não foi capaz de estimular a atividade da F1Fo-ATPase

tanto com silenciamento quanto sem. Tanto a razão ATP/ADP quanto a razão

NADH/NAD+ influenciaram a atividade da mitoPPX onde quanto maior a concentração

de ATP em relação a ADP e NADH em relação a NAD+, menor foi a atividade.

Analisamos também a influência da Acetil-CoA, mostrando que quanto maior a

concentração, menor a atividade da mitoPPX, resultando completamente distinto

quando avaliamos a influência da Glicose 6-P, que ativou a mitoPPX. Nossos

resultados evidenciaram que a catalase provavelmente é a principal enzima

antioxidante atuando na prevenção de espécies reativas de oxigênio no metabolismo

energético do Tribolium castaneum garantindo assim novas perspectivas na área da

bioenergética mitocondrial e do metabolismo de polifosfatos em artrópodes.

Palavras-chave: mitocôndria, polifosfatos, espécies reativas de oxigênio, Tribolium

castaneum.

x

ABSTRACT:

The beetle Tribolium castaneum emerged as an interesting study model related to

the development of arthropods to investigate basic biological issues. Inorganic

polyphosphates are linear orthophosphate polymers whose phosphate residues are

linked by phosphoanhydride bonds thermodynamically equivalent to Adenosine

triphosphate (ATP), which when hydrolyzed, generate energy. Exopolyphosphatases

(PPX) are considered central regulatory enzymes in the metabolism of PolyP where it

acts by hydrolyzing the PolyP chain, releasing inorganic phosphate (Pi) molecules.

ATPases or adenosinetriphosphatase are a class of enzymes that catalyze the

decomposition of ATP into ADP and a free phosphate ion. Our work investigated the

enzyme mitochondrial exopolyphosphatase (mitoPPX), showing that its activity is

regulated during mitochondrial respiration in the presence of ADP + pyruvate. As a

respiratory chain inhibitor we used KCN, which was able to inhibit mitoPPX activity

during mitochondrial respiration, a result that was antagonistically observed when the

pyrophosphatase gene was silenced by RNAi. FCCP as a disruptor of the respiratory

chain stimulated the activity of the mitoPPX, an effect not observed when the

pyrophosphatase gene was silenced by RNAi. PolyP3 activated the F1Fo-ATPase

activity during mitochondrial respiration and also with the silenced pyrophosphatase

gene, since PolyP15 was not able to stimulate F1Fo-ATPase activity with either

silencing or without. Both the ATP / ADP ratio and the NADH / NAD + ratio influenced

the activity of the mitoPPX where the higher the ATP concentration in relation to ADP

and NADH in relation to NAD +, the lower the activity. We also analyzed the influence

of Acetyl-CoA, showing that the higher the concentration, the lower the activity of the

mitoPPX, resulting completely different when we evaluated the influence of Glucose 6-

P, which activated mitoPPX. Our results showed that catalase is probably the main

antioxidant enzyme acting in the prevention of reactive oxygen species in the energy

metabolism of Tribolium castaneum, thus ensuring new perspectives in the area of

mitochondrial bioenergetics and polyphosphate metabolism in arthropods.

Keywords: mitochondria, polyphosphates, reactive oxygen species, Tribolium

castaneum.

xi

LISTA DE ILUSTRAÇÕES:

Figura 1. Depósito de armazenamento de grãos infestado por insetos-praga........3

Figura 2. Besouro Tribolium castaneum adulto.......................................................4

Figura 3. Fases de desenvolvimento do besouro Tribolium castaneum..................5

Figura 4. Fotomicrografia eletrônica da mitocôndria................................................6

Figura 5. Organização ultraestrutural da mitocôndria..............................................7

Figura 6. Cadeia transportadora de elétrons acoplada ao transporte de prótons....7

Figura 7. Estrutura do Polifosfato linear...................................................................8

Figura 8. Atividade da Exopolifosfatase (PPX) durante a respiração mitocondrial

em besouros adultos...............................................................................................30

Figura 9. Atividade da Exopolifosfatase (PPX) durante a respiração mitocondrial

com o gene da pirofosfatase silenciado por RNAi em besouros adultos................31

Figura 10. Atividade da F1Fo-ATPase no metabolismo mitocondrial utilizando

PoliP3 ......................................................................................................................32


PoliP3 com o gene da pirofosfatase silenciado por RNAi.......................................33

Figura 12. Atividade da F1Fo-ATPase no metabolismo mitocondrial utlizando

PoliP15....................................................................................................................34


PoliP15 com o gene da pirofosfatase silenciado por RNAi.....................................35

Figura 14. Influência do ATP/ADP na atividade Exopolifosfatásica (PPX)

mitocondrial.............................................................................................................36

Figura 15. Influência do NADH/NAD+ na atividade Exopolifosfatásica (PPX)

mitocondrial.............................................................................................................37

Figura 16. Influência da Acetil-CoA na atividade Exopolifosfatásica (PPX)

mitocondrial.............................................................................................................38

Figura 17. Influência da Glicose 6-fosfato na atividade Exopolifosfatásica (PPX)

mitocondrial.............................................................................................................39

Figura 18. Atividade da enzima Catalase no metabolismo mitocondrial utilizando

PoliP3......................................................................................................................40

xii

Figura 19. Atividade da enzima Catalase no metabolismo mitocondrial utilizando

PoliP15....................................................................................................................41

Figura 20. Atividade da enzima Glutationa Redutase no metabolismo mitocondrial

utilizando PoliP3......................................................................................................42

Figura 21. Atividade da enzima Glutationa Redutase no metabolismo mitocondrial

utilizando PoliP15....................................................................................................43

Figura 22. Atividade da enzima Superóxido Dismutase no metabolismo mitocon-

drial utilizando PoliP3..............................................................................................44

Figura 23. Atividade da enzima Superóxido Dismutase no metabolismo mitocon-

drial utilizando PoliP15............................................................................................45

xiii

LISTA DE TABELAS:

Tabela 1. Ocorrência de Polifosfato (PoliP) nas diversas células e tecidos..............10

Tabela 1. Classificação de Exopolifosfatase em Saccharomyces cerevisiae............12

xiv

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS:

Δψm - Mitochondrial membrane potential

µg – Micrograma

µL – Microlitro

µM – Micromolar

Abs - Absorbância

ADP – Adenosina difosfato

ANOVA – Análise sobre variância

ATPase – Adenosinatrifosfatase

CAT - Catalase

CoA – Coenzima A

DNA – Ácido Desoxirribonucleico

dsRNA – RNA dupla fita

ERO – Espécies Reativas de Oxigênio

FAD - Flavina-adenina-dinucleotideo

FADH2 – Flavina-adenina-dinucleotideo reduzida

FCCP - Carbonil-cianuro-p-trifluorometoxifenilhidrazona

GR – Glutationa redutase

KCN – Cianeto de potássio

mitoCAT – Catalase mitocondrial

mitoGR – Glutationa redutase mitocondrial

mitoPPX – Exopolifosfatase mitocondrial

mitoSOD – Superóxido dismutase mitocondrial

mTOR - Mammalian Target of Rapamycin

NAD+ - Nicotinamida-adenina-dinucleotideo

NADH - Nicotinamida-adenina-dinucleotideo reduzida

Pi – Fosfato inorgânico

xv

PoliP – Polifosfato inorgânico

PPase - Pirofosfatase

PPi – Pirofosfato inorgânico

PPX – Exopolifosfatase

pH – Potencial hidrogeniônico

RNAi – RNA de interferência

SOD – Superóxido dismutase

TCA - Cycle of Tricarboxylic Acids (Ciclo dos Ácidos Tricarboxílicos)

xvi

SUMÁRIO:

RESUMO............................................................................................................ ix

ABSTRACT ......................................................................................................... x

1.INTRODUÇÃO ................................................................................................ 1

1.1. Danos causados por insetos-praga ............................................................. 1

1.2. O besouro Tribolium castaneum como modelo de estudo .......................... 2

1.3. Mitocôndria....................................................................................................5

1.4. Espécies reativas de oxigênio (ERO’s) e enzimas antioxidantes.... .............9

1.5. Polifosfatos inorgânicos...............................................................................10

1.5.1. Polifosfato - Uma importante biomolécula ............................................. 8

1.5.2. Localização celular de polifosfatos..........................................................9

1.5.3. Principais enzimas no metabolismo de polifosfatos .............................. 9

2.JUSTIFICATIVA ............................................................................................ 22

3.OBJETIVO GERAL ....................................................................................... 23

3.1. Objetivos específicos ................................................................................ 23

4.METODOLOGIA ........................................................................................... 24

4.1. Animais ...................................................................................................... 24

4.2. Isolamento da fração mitocondrial ............................................................. 24

4.3. Preparo da suspensão de mitocôndrias rompidas para determinação de

atividades enzimáticas mitocondriais ............................................................... 25

4.4. Quantificação de fosfato inorgânico (Pi) solúvel ........................................ 25

4.5. Atividade da mitoPPX durante a respiração mitocondrial .......................... 25

4.6. Atividade da F1Fo-ATPase durante a respiração mitocondrial....................26

4.7. Silenciamento gênico da pirofosfatase por dsRNA ................................... 26

4.8. Atividade da enzima antioxidante Catalase mitocondrial .......................... 27

4.9. Atividade da enzima antioxidante Glutationa redutase mitocondrial ......... 27

4.10. Atividade da enzima antioxidante Superóxido dismutase ....................... 27

xvii

4.11. Análises estatísticas ................................................................................ 28

5.RESULTADOS .............................................................................................. 29

5.1. Atividade da Exopolifosfatase (PPX) durante a respiração mitocondrial em

besouros adultos .............................................................................................. 29

5.2. Atividade da Exopolifosfatase (PPX) durante a respiração mitocondrial com

o gene da pirofosfatase silenciado por RNAi em besouros adultos ................. 30

5.3. Atividade da F1Fo-ATPase no metabolismo mitocondrial utilizando PoliP3

............................................................................................................................31


com o gene da pirofosfatase silenciado por RNAi ............................................ 32

5.5. Atividade da F1Fo-ATPase no metabolismo mitocondrial utilizando

PoliP15 ............................................................................................................. 33


com o gene da pirofosfatase silenciado por RNAi ............................................ 34

5.7. Influência do ATP/ADP na atividade Exopolifosfatásica (PPX) mitocon-

drial .................................................................................................................. 35

5.8. Influência do NADH/NAD+ na atividade Exopolifosfatásica (PPX) mitocon-

drial .................................................................................................................. 36

5.9. Influência da Acetil-CoA na atividade Exopolifosfatásica (PPX) mitocon-

drial .................................................................................................................. 37

5.10. Influência da Glicose 6-fosfato na atividade Exopolifosfatásica (PPX)

mitocondrial ...................................................................................................... 38

5.11. Atividade da enzima Catalase no metabolismo mitocondrial utilizando

PoliP3................................................................................................................ 39

5.12. Atividade da enzima Catalase no metabolismo mitocondrial utilizando

PoliP15 .............................................................................................................. 41

5.13. Atividade da enzima Glutationa Redutase no metabolismo mitocondrial

utilizando PoliP3 ............................................................................................... 42

xviii


utilizando PoliP15 .............................................................................................. 43

5.15. Atividade da enzima Superóxido dismutase no metabolismo mitocondrial

utilizando PoliP3 ............................................................................................... 43

5.16. Atividade da enzima Superóxido dismutase no metabolismo mitocondrial

utilizando PoliP15 .............................................................................................. 44

6.DISCUSSÃO ................................................................................................. 46

7.CONCLUSÕES ............................................................................................. 59

8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 60

1

1. INTRODUÇÃO:

1.1. Danos causados por insetos-praga:

Estudos mostram que os danos causados por insetos-praga em grãos

armazenados são imensuráveis e podem causar prejuízos anuais que chegam a US$

77 bilhões, em todo o planeta. Perdas de culturas devido a pragas e doenças são uma

grande ameaça para os rendimentos das famílias rurais e para a segurança alimentar

em todo o mundo (SAVARY e WILLOCQUET, 2014; AVELINO, et al. 2015). Para

alguns autores, a perda de colheitas e a redução do rendimento da cultura definida

tanto em quantidade quanto em qualidade pode ocorrer no campo (pré-colheita) ou

no armazenamento (pós-colheita) devido a fatores bióticos ou abióticos (OERKE,

2006; SAVARY, et al. 2006). Para outros, a perda de culturas também inclui a

diminuição do valor e dos retornos financeiros da safra (NUTTER, et al. 1993).

Os insetos são também responsáveis por propagar doenças entre seres

humanos e animais e causar danos que vão desde a aniquilação de colheitas e

reservas até a devastação de florestas, alterando ecossistemas inteiros e tornando-

os mais frágeis. Um fato ainda mais preocupante é que, em geral insetos praga de

grãos armazenados consomem mais de 40% da produção agrícola, o suficiente para

alimentar um milhão de seres humanos (COURCHAMP, 2016).

A comunidade de insetos no agroecossistema de grãos armazenados consiste

em várias categorias de espécies, como colonizadores primários e secundários,

alimentadores de fungos, predadores e parasitóides (WHITE, 1995). Estas espécies

coexistem e infestam o produto em várias densidades populacionais (ARBOGAST e

THRONE, 1997; ATHANASSIOU, et al. 2005). Assim, em contraste com pragas de

campo onde as medidas de controle de pragas muitas das vezes podem ser

direcionadas para o controle de uma espécie de praga principal, as medidas de

controle de pragas para produtos armazenados duráveis precisam ser selecionadas

para controlar as múltiplas espécies que coexistem nestas mercadorias

(ATHANASSIOU, et al. 2014).

Durante as duas últimas décadas, apenas alguns estudos relacionaram a

coexistência de múltiplas espécies e sua possível incorporação em práticas de

manejo. NANSEN, et al. 2009, examinando grandes conjuntos de dados de amostras

de silos, (benfeitoria destinada ao armazenamento de produtos agrícolas, geralmente

2

depositados no seu interior sem estarem ensacados - SOARES et al, 2000) em

Kansas, relataram que o número de besouros de farinha Tribolium castaneum

aumentou com o aumento da presença da broca menor de grãos, Rhyzopertha

dominica na mesma unidade de amostragem, mas o número destas duas espécies

estava negativamente correlacionado com a presença do besouro de grão oxidado,

Cryptolestes ferrugineus. Nosso estudo se baseia no metabolismo energético

mitocondrial do besouro de farinha vermelho Tribolium castaneum, inseto praga de

grãos secundário.

1.2. O besouro Tribolium castaneum como modelo de estudo:

O conhecimento do desenvolvimento de artrópodes vetores de doenças e

pragas agrícolas é condição fundamental para estratégias eficazes de controle

populacional. Estudos sobre o metabolismo de artrópodes são na maior parte restritos

ao inseto-modelo Drosophila melanogaster, que possui várias características

peculiares ausentes em grupos filogeneticamente mais basais, como por exemplo, o

besouro Tribolium castaneum, além de outros quelicerados de importância médico-

sanitária (LYNCH, et al. 2009).

Coletivamente conhecidos como besouro vermelho de farinha, várias espécies

de Tribolium e Tenebrio, que pertencem à família Tenebrionidae (escaravelhos pretos)

da ordem Coleoptera, são pragas de grãos armazenados, incluindo milho, farinha e

outros produtos à base de cereais (HUNT, et al. 2007) (Figura 1).

3

Figura 1. Depósito de armazenamento de grãos infestado por insetos-praga.

Fonte: http://brisado.1apps.com/madagascar/bichoamendoim01.jpg

Os besouros (Coleoptera) são a ordem com a maior riqueza em espécie dentre

os eucariotos, com mais de 350 mil espécies descritas (DALY, 1998). O T. castaneum

(Figura 2) é o único membro da família que apresenta seu genoma sequenciado e

disponível publicamente (RICHARDS, et al. 2008) e é considerado o segundo modelo

de estudo nesta área, tendo a Drosophila melanogaster em primeiro lugar, e, além

disso, possui interesse econômico por ser uma das principais pragas de grãos

armazenados no Brasil (BURCHER, et al. 2002).

Figura 2. Besouro Tribolium castaneum.

Fonte:http://2.bp.blogspot.com/FDSYPQ0ofOk/UOiriTCdNoI/AAAAAAAAAjE/Ff8nSMs73a4/s

1600/tribolium.castaneum.jpg

Segundo LAZZARI e LAZZARI (2009), T. castaneum tem preferência por

farinhas e farelos, mas pode atacar grande variedade de grãos de cereais e rações

animais, especialmente quando estes produtos estiverem com elevado conteúdo de

umidade e/ou quando deterioram pela presença de fungos. Em laboratório,

populações do besouro T. castaneum são mantidas em estufa com farinha de trigo

integral específica não necessitando de suprimento de água.

As fases de desenvolvimento do besouro Tribolium castaneum envolvem ovo,

larva, pupa e adulto (Figura 3). Em relação aos ovos de T. castaneum, estes são

4

pequenos medindo aproximadamente 0,6x0,3 mm de comprimento, claros e

recobertos por substância viscosa, postos aleatoriamente, sendo que o período de

incubação é de sete dias. Cada fêmea pode ovipositar até 450 ovos, sob condições

ótimas para o desenvolvimento da espécie que são: 32ºC e 70% de umidade relativa

(PUZZI, 1977). Já para BOOTH, et al (1990, apud ELIAS, et al. 2008), a duração de

uma geração pode ser inferior a 20 dias, em condições favoráveis. O ciclo de vida de

T. castaneum é de 30 a 40 dias em condições ótimas de temperatura a 35 ºC e

umidade relativa a 70% (BERNARDO, 2006). A oviposição é efetuada fora dos grãos

e em média de duas a três vezes ao dia em sacarias, fendas ou alimentos (BELCHOL

e TEIXEIRA, 2007). De acordo com GALLO et al (2002) as larvas são branco-

amareladas, cilíndricas, medindo 7mm de comprimento. As pupas estão localizadas

na parte superficial do local atacado, sendo que a espécie T. castaneum possui um

período pupal de 7 a 8 dias. CORRÊA (2008) e ELIAS, et al (2008) descrevem que na

fase adulta pode atingir de 3 a 4 mm de comprimento, possuindo coloração marrom

avermelhada, considerado uma praga secundária.

Figura 3. Fases de desenvolvimento do besouro Tribolium castaneum.

Fonte: https://www.researchgate.net/figure/262436999_fig1_Figura-1-Ciclo-de-vida-del-T-

castaneum-Al-igual-que-otros-insectos-T-castaneum-posee

O sucesso adaptativo dos insetos é notável ocupando virtualmente todos os

ambientes do planeta, e isso só é possível pela grande diversidade de características

como: locomoção, alimentação e reprodução. Essa adaptação é intrigante, nos

levando a investigar melhor o metabolismo energético mitocondrial do inseto Tribolium

5

castaneum. Estudos anteriores já demonstraram que os polifosfatos encontram-se em

3 compartimentos celulares diferentes (mitocôndria, citoplasma e núcleo) os

polifosfatos apresentam funções distintas nestes compartimentos (CARVALHO et al,

2014). Isso nos leva a conhecer melhor sobre a mitocôndria, organela relacionada ao

metabolismo energético e sua relação com polifosfatos mitocondriais.

1.3. Mitocôndria:

A mitocôndria é uma organela de alta complexidade e extremamente

necessária para a respiração celular. Ela é responsável por realizar um conjunto de

reações químicas através das quais a célula obtém energia para suprir suas

necessidades vitais. Foi descoberta em meados do século XIX, e, durante décadas

sua existência foi então questionada por alguns citologistas. Somente em 1890 foi

demonstrada de modo incontestável a presença de mitocôndrias no citoplasma das

células, sendo descrita por ALTMANN, em 1894, que sugeriu a sua relação com a

oxidação celular. (Figura 4).

Figura 4. Fotomicrografia eletrônica de mitocôndria.

Fonte: http://cientistaonline.wordpress.com/2008/03/01/organelas-i/

Somente em 1946 a mitocôndria finalmente foi reconhecida como a principal

região celular responsável pelo metabolismo energético. Posteriormente, através de

estudos na década de 50 foram sendo descobertas as principais etapas do

metabolismo energético. Tais etapas foram estudadas e desvendadas por um grupo

de pesquisadores atualmente conhecidos, como Warbug, Keilin, Krebs, Kalckar,

Belister e Lehninger (SOUZA, 2005). A mitocôndria possui o seu próprio DNA, que é

http://cientistaonline.wordpress.com/2008/03/01/organelas-i/

6

distinto do DNA nuclear. Apesar da presença do DNA mitocondrial, a organela realiza

funções dirigidas pelo DNA nuclear, como replicação, transcrição, tradução e reparo.

E é também através de alguns genes nucleares que a mitocôndria se divide e se

prolifera durante o seu desenvolvimento (SOUZA, 2005).

A mitocôndria está presente na maioria dos eucariontes, exceto num grupo de

protistas chamado Archezoa, apesar da análise genômica destes organismos indicar

que podem ter perdido as mitocôndrias ao longo da evolução. Nas células humanas,

a mitocôndria possui funções essenciais como: produção de energia para as

atividades do organismo, atuação na morte celular por apoptose, produção de calor e

contribuição genética a partir do DNA mitocondrial. MARIN-GARCIA e AKHMEDOV,

2016, relatam que quando a estrutura mitocondrial está danificada, a disfunção celular

relacionada à mitocôndria, leva à diminuição da produção de ATP, e o fornecimento

de energia insuficiente promove a apoptose das células do miocárdio, por exemplo.

As células em geral possuem um número variado de mitocôndrias. Algumas

contêm até 10.000 mitocôndrias, tais como as células do músculo estriado e outras

não contém nenhuma mitocôndria, tais como os eritrócitos (hemácias). No organismo

humano, há uma média de 500 a 2.000 mitocôndrias por célula (SOUZA, 2005). A

estrutura de uma mi-tocôndria consiste em duas membranas altamente

especializadas, separadas por um espaço intermembranal revestindo o espaço

interno da matriz. (ALBERTS, et al. 2004) (Figura 5).

Figura 5. Organização ultraestrutural de mitocôndria. Adaptado de Lehninger; Nelson;

Cox, (2004). Formada por estruturas complexas, com duas membranas altamente

especializadas, uma externa e outra interna. A membrana interna apresenta numerosas

dobras, como cristas que aumentam grandemente a sua superfície total. Na matriz estão

7

presentes proteínas que formam o complexo enzimático chamado ATP sintase, responsável

por produzir ATP. O espaço intermembranoso e o espaço interno da matriz onde estão

presentes o DNA mitocondrial, os ribossomos mitocondriais, os RNAs e várias enzimas.

Células vivas dependem de um sistema complexo, regulado de maneira

intrincada, de reações químicas que produzem e utilizam energia, chamado

metabolismo, que consiste em dois processos contrastantes, catabolismo e

anabolismo, que juntos constituem as alterações químicas que convertem alimentos

em formas utilizáveis de energia e em moléculas biológicas complexas. Reações

catabólicas são geralmente exergônicas, com a energia liberada geralmente

capturada na formação de ATP.

Durante as reações de oxidação de ácidos graxos e do ciclo dos ácidos

tricarboxílicos (TCA), equivalentes de redução derivados da oxidação de substratos

são transferidos de NAD+ e FAD (formando NADH e FADH2), que são oxidados pela

cadeia de transporte de elétrons, um sistema de transportadores de elétrons

localizado na membrana interna da mitocôndria. Em presença de O2, a cadeia de

transferência de elétrons converte equivalentes de redução em energia utilizável,

como o ATP, por fosforilação oxidativa. A cadeia respiratória possui ainda dois

transportadores de elétrons, ubiquinona e citocromo c. Estes constituintes bem como

o complexo V, ATP sintase, formam o sistema de fosforilação oxidativa (OXPHOS),

que fornece o ATP necessário à célula.

A função global da cadeia respiratória é a oxidação de nicotinamida-adenina-

dinucleotideo reduzida (NADH) e flavina-adenina dinucleotideo reduzida (FADH2),

provenientes de outras vias metabólicas, bem como o transporte de equivalentes

reduzidos ao longo de uma série de transportadores para o aceptor final, o oxigênio

(LEHNINGER e NELSON e COX, 2004).

O fluxo de prótons leva à condensação do ADP e de fosfato inorgânico em ATP

(SARASTE, 1990ª,b; WALLACE, 1999a,b). A ATP sintase é uma enzima

funcionalmente reversível que pode catalisar tanto a síntese quanto a hidrólise de ATP

(SARASTE, 1990ª,b) como podemos observar na Figura 6 analisando a cadeia de

transporte de elétrons.

8

Figura 6. Cadeia transportadora de elétrons acoplada ao transporte de prótons.

Fonte: HARVEY e FERRIER (2009).

O gradiente eletroquímico, assim formado pela cadeia transportadora de

elétrons fornece a energia potencial que é usada para direcionar síntese de ATP pela

ATP sintase. Em nossos experimentos utilizamos o cianeto de potássio (KCN) que

inibe o Complexo IV na etapa da citocromo c oxidase responsável por catalisar a etapa

final da cadeia transportadora de elétrons impedindo a transferência de elétrons para

O2. Assim, a inibição do transporte mitocondrial de elétrons resulta em prejuízo da

função geradora de energia da fosforilação oxidativa. Respiração mitocondrial e

produção de energia cessam, e morte celular ocorre rapidamente pois a síntese de

ATP e o fluxo de elétrons estão fortemente acoplados. O acoplamento entre transporte

de elétrons e síntese de ATP pode ser desfeito por certas condições e reagentes

químicos.

1.4. Espécies reativas de oxigênio (ERO’s) e enzimas antioxidantes:

Sendo o oxigênio vital para as atividades celulares, ele é utilizado como aceptor

final de elétrons pelos organismos aeróbicos permitindo elevada produção de energia

na respiração em consequência de seu alto potencial eletroquímico. Entretanto,

devido à sua configuração eletrônica, o oxigênio pode sofrer reduções parciais e levar

à formação de radicais livres, de forma que as Espécies Reativas de Oxigênio (ERO’s)

9

estão constantemente presentes nas células eucarióticas. A principal via de

metabolismo do oxigênio no organismo envolve a sua completa redução em água,

incorporando quatro elétrons ao final da cadeia de transporte de elétrons no interior

da mitocôndria. Uma pequena quantidade do oxigênio consumido (2 a 5%) é então

reduzido produzindo uma variedade de substâncias químicas altamente reativas,

denominadas espécies reativas do oxigênio (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999;

DAMASCENO, et al. 2002).

As ERO’s podem provocar injúria tecidual (KINNULA, et al. 1995) e em altas

concentrações danificar organelas celulares, ácidos nucleicos, lipídeos e proteínas

(VALKO, et al. 2007).

Os principais componentes geradores de ERO’s da cadeia respiratória são os

complexos I e III, sendo que a produção de radicais livres aumenta no caso de um

bloqueio na transferência de elétrons (NICHOLLS e BUDD, 2000; SIPOS e TRETTER

E ADAM-VIZI, 2003a,b). Pode-se citar a produção de superóxido (O2•-) e a de peróxido

de hidrogênio (H2O2) como os principais agentes causadores do estresse oxidativo na

célula. Para contrabalancear a produção de espécies reativas, a mitocôndria possui

sistemas de defesa antioxidantes, como as enzimas manganês superóxido dismutase

(Mn-SOD; EC 1.15.1.1) que possui afinidade por radicais ânion superóxido (O2-) e é

capaz de convertê-los inicialmente a peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio (O2) na

presença do H+, catalase (CAT, oxidoredutase; EC1.11.1.6) que catalisa a

degradação de duas moléculas de peróxido de hidrogênio (H2O2) em água (H2O) e

oxigênio (O2), peroxiredoxinas, o sistema glutationa peroxidase/glutationa redutase, a

glutationa reduzida (GSH) na presença de um agente oxidante é oxidada a GSSG e,

novamente reduzida pela ação da glutationa redutase (GR; EC 1.6.4.2) na presença

de NADPH recuperando assim a GSH (FELTON e SUMMERS, 1995; OKADO-

MATSUMOTO e FRIDOVICH, 2001a,b,; DRÖGE, 2002a,b,c; SWITALA e LOEWEN,

2002; FERNANDEZ-CHECA, 2003; JAMES, et al. 2004; KOJO, 2004; VALKO, et al.

2006, 2007; LU, 2009). Se houver ao longo da cadeia respiratória redução do oxigênio

com número menor de elétrons, haverá produção de ERO’s, como o superóxido (O2+

e-→O2-), o peróxido de hidrogênio (O+ e-+ 2H+→H2O2) e a hidroxila (H2O2+ e-→OH

+ OH) (DAMASCENO, et al. 2002; ANDRADE JUNIOR, et al. 2005).

10

Sabe-se ainda que a taxa de produção de ERO’s é inversamente proporcional

à disponibilidade de ADP intramitocondrial (KORSHUNOV e SKULACHEV e

STARKOV, 1997; CADENAS e DAVIES, 2000). O desequilíbrio entre ERO e níveis

antioxidantes leva a danos celulares e problemas de saúde (STEER, et al. 2002).

A partir de um balanço entre as defesas antioxidantes e os efeitos tóxicos das

EROs às biomoléculas, os seres vivos conseguem manter o metabolismo e o

funcionamento celular em equilibrio. Porém, em situações específicas, este panorama

pode ser comprometido através do excesso de produção de EROs, falha das defesas

antioxidantes ou ambos, gerando estresse oxidativo. Nas últimas duas décadas tem

havido uma mudança fundamental no conceito sobre o papel de EROS na fisiologia

celular, não sendo unicamente tóxico, especialmente o H2O2 foi reconhecido como

essencial para sobrevivência celular devido a sua função reguladora de uma ampla

gama de eventos, incluindo a regulação gênica, a sinalização celular,

ativação/desativação de proteínas, diferenciação celular e apoptose, entre outros

(BRANDES SCHMITT, et al. 2009; KLOMSIRI, et al. 2011; GANDHI e ABRAMOV,

2012; SOHAL e ORR, 2012). O excesso de produção de ERO’s recentemente tem

efeitos seletivos nas células-tronco e na sua progênie em várias outras configurações,

incluindo linhagens de células neurais e de sangue, geralmente, mas nem sempre,

oposição à manutenção de células-tronco (KOBAYASHI e SUDA, 2011).

Evidências atuais sugerem que a insuficiência mitocondrial e o estresse

oxidativo atuam como atores centrais na patogênese de formas esporádicas e

genéticas da doença de Parkinson (NICKLAS, et al. 1987; SANTOS e CARDOSO,

2012).

O conhecimento dos mecanismos de formação e de regulação dos níveis de

ERO’s in vivo são de fundamental importância para a compreensão de eventos

celulares relacionados ao controle da sobrevivência, da morte e da proliferação celular

e possibilita a geração de outros conhecimentos que podem interferir na modulação

de tais processos, a fim de compreender melhor alguns sistemas biológicos e suas

atividades celulares. Estudos relacionados ao metabolismo mitocondrial do besouro

Tribolium castaneum e a compreensão do envolvimento dos polifosfatos na prevenção

à formação de EROS’s contribuem para esclarecer a relação dos polifosfatos com

mecanismos bioenergéticos mitocondriais e eventos antioxidantes na biologia dos

artrópodes.

11

1.5. Polifosfatos inorgânicos:

1.5.1. Polifosfato – Uma importante biomolécula:

Pouco se sabe sobre a síntese ou metabolismo de PoliP em organismos

eucariontes. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o único modelo eucariótico em

que a fisiologia do PoliP foi devidamente caracterizada por uma abordagem genética.

PoliP também foi documentado na ameba Dictyostelium discoideum. Sua

presença em amebas foi reconhecida pela primeira vez por extração bioquímica no

início da década de 1970 (GEZELIUS, 1974). Além da levedura, a ameba é o único

outro eucarionte onde a enzimologia da síntese de PoliP havia sido estudada. A

primeira evidência da presença de polifosfatos (PoliP) em células de mamífero data

da década de 70 (GABEL e THOMAS, 1971). No entanto, PoliP também está presente

em archaea (ORELL, et al. 2012), eucariontes (LANDER, 2013) e células humanas

(RUIZ, et al. 2004). Independentemente da sua origem, o polifosfato inorgânico está

presente nos organismos vivos e precisa ser ainda mais estudado afim de elucidar

questões relacionadas à bioquímica desse polímero.

Por ser um composto energético e estruturalmente mais simples que o ATP, o

PoliP é considerado um precursor do ATP na evolução bioquímica (HAROLD, 1966;

KULAEV, et al. 1999). A função do polifosfato como reserva de Pi é bem caracterizada

em procariontes e também em eucariontes inferiores (KULAEV, 1975; KULAEV e

VAGABOV, 1983; KORNBERG, 1995). O fosfato inorgânico é, portanto, essencial

para todos os organismos, sendo requerido para vários processos metabólicos, tais

como: biossíntese de ácidos nucléicos e fosfolipídeos, metabolismo energético e

transdução de sinal. Sendo assim, os organismos precisaram desenvolver um

eficiente mecanismo regulatório para a sua aquisição, reserva e utilização. Uma

importante conquista dos últimos anos foi a descoberta de conjuntos não-idênticos de

enzimas do metabolismo de polifosfatos em diferentes organelas das células

eucarióticas obtidos, principalmente, em levedura (KULAEV e KULAKOVSKAYA,

2000; LICHKO, et al. 2003). A importância de se manter um nível baixo e constante

de Pi nas células é relevante por diversos motivos, como: a concentração de Pi ser

conhecidamente um importante fator de controle de processos bioquímicos; a

acumulação de quantidades significantes de Pi em células poder resultar em uma

mudança considerável da sua pressão osmótica e no seu pH; além do Pi livre em altas

12

concentrações ser tóxico para as células (SMIRNOV, et al. 2002a, b; KULAEV, et al.

2004).

Enzimas chave do metabolismo energético são amplamente conservadas entre

as espécies, mas estas podem apresentar peculiaridades. Tais enzimas e o polifosfato

são moléculas de essencial importância em inúmeros eventos e fenômenos celulares.

Dessa forma, estudos direcionados para a identificação, localização e mapeamento

dessas moléculas permitirão um maior entendimento sobre inúmeros eventos

biológicos, não apenas ao nível ultraestrutural, bem como, ao nível bioquímico e

fisiológico (KULAEV, et al. 2004). Dessa forma, este trabalho vem investigar

peculiaridades importantes no metabolismo de polifosfatos do besouro Tribolium

castaneum, que vem sendo estabelecido como um eficiente e poderoso modelo de

estudos (BENTON e PAVLOPOULOS, 2014). A vasta ocorrência de polifosfatos e sua

multifuncionalidade indicam que muitas importantes funções em distintos organismos

ainda estão por serem descobertas possibilitando a ampliação do conhecimento da

bio-energética celular e mitocondrial.

O Polifosfato (Poli P) é um polímero linear formado por resíduos de ortofosfato

ou fósforo inorgânico, unidos por ligações fosfoanidrídicas, termodinamicamente

equivalentes ao fosfato de alta energia do Trifosfato de Adenosina (ATP), que formam

estruturas não ramificadas quando hidrolisadas, gerando energia (HAROLD, 1966)

(Figura 7). Análises demonstraram que a ligação P-O-P de polifosfatos quando

hidrolisada libera energia equivalente à quantidade de energia liberada na hidrólise do

grupo fosfato terminal do ATP, aproximadamente 10 Kcal/mol (KULAEV, et al. 2004).

O valor do grau de polimerização (n) para o resíduo PO3- pode variar entre 2 e 300,

quando obtidos de forma sintética (VAN WAZER e CALLIS, 1955; VAN WAZER, 1958)

ou ainda na natureza podem ser encontrados polifosfatos cujo n pode chegar a 106

(KULAEV, et al. 2000; KULAEV e KULAKOVSKAYA, 2000), ou seja, n pode variar de

poucos a várias centenas, dependendo da origem, localização celular e do estado

metabólico (RAO, et al. 2009).

13

Figura 7. Estrutura do polifosfato linear onde M pode ser um H+ ou um cátion metálico

Fonte: KULAEV, et al. 2004.

Polifosfatos inorgânicos foram identificados no século passado. Em seu

primeiro relato há mais de 100 anos, LIEBERMAN (1888) encontrou polímeros de

polifosfatos de cadeia longa em leveduras, chamados de metafosfatos e,

posteriormente foram identificados como grânulos metacromáticos em

microrganismos primitivos (KORNBERG, 1999).

Dentre suas diversas funções, polifosfatos e as enzimas de seu metabolismo

estão diretamente ligados a processos patogênicos causados por bactérias (RAO et

al., 2009), protozoários (KULAEV e VAGABOV, 1983) e outros microrganismos, sendo

provado que estes compostos ocorrem em representantes de todos os reinos de

organismos vivos, incluindo os animais superiores. Dessa forma, tornou-se notório

que polifosfatos são necessários para a maioria dos seres vivos, em diferentes

estágios de evolução (HAROLD, 1966). As funções dos polifosfatos na mitocôndria

estão associadas com a fosforilação oxidativa e com a síntese de ATP (ABRAMOV,

et al. 2007; KULAKOVSKAYA, et al. 2010). Já foi estabelecido também que PoliP

serve como reserva de fosfato inorgânico para o metabolismo celular e crescimento

(KULAEV, et al. 2004; LEMERCIER, et al. 2004), especialmente em procariotos e

eucariotos inferiores, além de contribuir para reserva de energia (BEAUVOIT, et al.

1991; KULAEV, et al. 1999).

Inicialmente, os polifosfatos foram considerados como “fóssil molecular” ou

somente como reserva de fósforo e de energia para a sobrevivência de organismos

em condições severas. Evolutivamente, alguns autores sugerem que os polifosfatos

tenham tido origem abiótica (WEST e PONNAMPERUMA, 1970; YAMAGATA, et al.

1991). A vasta ocorrência e multifuncionalidade do polifosfatos inorgânicos indicam

que muitas importantes funções em distintos organismos ainda estão por serem

descobertas possibilitando, neste caso, a ampliação do conhecimento da bio-

energética celular e do metabolismo energético em artrópodes.

Diante de inúmeras evidências de pesquisas mostrando o papel dos PoliP, o

conhecimento deste polímero e de suas enzimas no metabolismo energético do

Tribolium castaneum se mostra ainda mais relevante. Este estudo, portanto, trata da

hipótese de polifosfatos de diferentes tamanhos estarem simultaneamente envolvidos

14

no suporte energético do T. castaneum e atuando na prevenção a danos oxidativos

durante o seu desenvolvimento, abrindo novas perspectivas para esta área do

conhecimento da bioenergética mitocondrial em artrópodes.

1.5.2. Localização celular de Polifosfatos:

PoliP são biopolímeros multifuncionais, com localizações em diferentes

compartimentos (Tabela 1) e múltiplas funções nas células vivas, as quais foram

mudando e sofrendo adaptações durante o processo de evolução, desde procariotos

a eucariotos inferiores e superiores (KULAEV, et al. 1999). Para os procariotos, as

principais funções de PoliP estão relacionadas à reserva de fosfato e fonte de energia,

enquanto que nos eucariotos predominam as funções reguladoras. Com isso, há

diferenças marcantes entre os grupos de organismos com relação às enzimas do

metabolismo do polifosfato (KULAEV e KULAKOVSKAYA, 2000; KULAEV, et al.

2000).

Tabela 1. Ocorrência de Polifosfato (PoliP) nas diversas células e tecidos

Fonte: KORNBERG, et al. (1999). Os níveis de PoliP variam dependendo do estado

metabólico da célula. Os valores dessa tabela foram obtidos sob condições metabólicas e são

úteis somente para ilustração.

15

1.5.3. Principais enzimas no metabolismo de Polifosfatos:

As exopolifosfatases (PPX) são consideradas as enzimas regulatórias centrais

do metabolismo de PoliP (KULAEV, et al. 2000) e foram identificadas principalmente

em diferentes organelas de levedura, como mostra a Tabela 2. A isoforma de PPX

encontrada no compartimento nuclear tem sido relacionada com a regulação gênica,

e no compartimento mitocondrial com a bio-energética celular (KULAEV e

KULAKOVSKAYA, 2000; LICHKO, et al. 2003).

Tabela 2. Classificação de Exopolifosfatase em S. cerevisiae

Fonte: LICHKO et al (2003).

Esta enzima está presente em procariotos e eucariotos, onde atua hidrolisando

a cadeia de PoliP desde sua extremidade para o interior, liberando moléculas de

fosfato inorgânico (Pi) (KULAEV, et al. 2004; UGOCHUKWU, et al. 2007).

As enzimas do metabolismo de PoliP são bastante estudadas em bactérias e

leveduras. Em Sacaromyces cerevisae, a exopolifosfatase (PPX, EC 3.6.1.11),

apresenta 4 isoformas. O subfracionamento mitocondrial de S. cerevisiae revelou que

tanto a preparação de membrana quanto a de fração solúvel possuem atividade de

exopolifosfatase em igual proporção (LICHKO, et al. 1998). CAMPOS, et al (2007),

descreveram a atividade de exopoliposfatases mitocondriais moduladas pela

demanda de fosfato em embriões do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

Em 2008, CAMPOS, et al., também demonstraram a presença de isoformas de PPX

no núcleo e na mitocôndria com distinta dependência de metais, sensibilidade de

16

inativação e ativação. Já em 2011, o mesmo grupo relatou uma exopoliposfatase de

membrana mitocondrial sendo modulada e desempenhando uma função no

metabolismo energético de embriões de Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

Diferentes grupos de enzimas participam do metabolismo de PoliP, levando a

manutenção de um equilíbrio dinâmico entre síntese e degradação, de forma que

qualquer interferência nesse balanço pode resultar em um acúmulo ou mesmo na

degradação total deste poliânion pela célula (BROWN e KORNBERG, 2008).

Os polifosfatos inorgânicos podem ser divididos em dois grupos: pirofosfatos

(PPi) e polifosfatos (PoliP) de alto peso molecular.

Os Pirofosfatos foram descobertos pela primeira vez em tecidos de animais

(KAY, 1928) sendo sugeridose como antecessores da ATP e como alternativa para

fornecer energia para algumas células (PEREZ-CASTIÑEIRA, et al. 2001). A

pirofosfatase inorgânica (PPase) é uma hidrolase dependente de metal, que catalisa

a hidrólise de moléculas de pirofosfato (PPi) produzindo ortofosfato (Pi) (MACHADO

e NOME, 1999). Sendo assim, PPases catalisam a reação de transferência de fosfato

mais simples possível, a hidrólise do pirofosfato simétrico (PPi) em duas moléculas de

fosfato inorgânico (Pi) (TOMMI, et al. 2013), numa reação altamente exergônica, ou

seja, com grande liberação de energia.

As PPases atuam controlando as concentrações de PPi intracelular, além de

balancear termodinamicamente reações de síntese de DNA, RNA, hormônios e

proteínas, reações biossinteticamente desfavoráveis (KORNBERG, 1962).

Acreditava-se que apesar da similaridade entre as enzimas, as afinidades por

seus substratos eram bem distintas, sendo que a exopolifosfatase parecia não

hidrolisar pirofosfatos e a pirofosfatase parecia ter apenas uma pequena atividade

para polifosfatos (LORENZ, et al. 1994; PARFENYEV, et al. 2001). Os pirofosfatos,

bem como as enzimas relacionadas ao seu metabolismo vêm sendo desde então

criteriosamente estudados (KULAEV, et al. 2004). Pirofosfatases solúveis sãos

essenciais para reações metabólicas de bactérias e leveduras CHEN, et al (1990) e

LUNDIN, et al (1991). Entretanto, pesquisas recentes têm demonstrado uma possível

atuação da pirofosfatase no metabolismo de polifosfatos (COSTA, 2013). CARVALHO

et al., (2015), descreveram uma pirofosfatase solúvel sendo essencial para a

17

oogênese e necessária para o metabolismo de polifosfatos no besouro (Tribolium

castaneum).

As ATPases ou adenosinotrifosfatases constituem uma classe de enzimas que

catalisam a decomposição do trifosfato de adenosina (ATP) em adenosina difosfato

(ADP) e um íon de fosfato livre (GEIDER e HOFMANN-BERLING, 1981; KIELLEY,

1961; MARTIN e SENIOR, 1980; NJUS, et al. 1981; RILEY e PETERS, 1981; TJIAN,

1981). A ATP sintase é uma enzima funcionalmente reversível que pode catalisar

tanto a síntese quanto a hidrólise de ATP (SARASTE, 1990ª,b) e emprega um

mecanismo rotativo intrigante para a geração de ATP de ADP e Pi, usando energia

armazenada em um gradiente de prótons transmembranar. O fluxo de prótons leva à

condensação do ADP e de fosfato inorgânico em ATP (SARASTE, 1990a,b;

WALLACE, 1999a,b). É composta por dois componentes separáveis: F1 (fator 1) e Fo

(fator que confere sensibilidade à oligomicina) funcionando como motor molecular

reversível composto por duas partes: uma turbina de prótons (dentro de Fo) e uma

máquina molecular (F1) que usa energia rotacional para formar ATP a partir de ADP

e fosfato.

MICHELANGELO, 2008, relata que quando a respiração mitocondrial é

comprometida, a F1Fo-ATPsintase investe e consome ATP, servindo para manter o

potencial da membrana mitocondrial (Δψm).

18

2. JUSTIFICATIVA:

O estudo do metabolismo de polifosfatos em Tribolium castaneum é estratégico

para ampliar o conhecimento da bioenergética mitocondrial em artrópodes, indivíduos

que são desenvolvidos em um sistema fechado, quase autossuficiente, como é o caso

dos artrópodes, répteis e aves – onde a quantidade de energia e nutrientes é limitada

e possuem seu metabolismo energético fortemente regulado (ROMBOUGH, 2011). A

possível confirmação da hipótese do envolvimento de polifosfatos na prevenção da

formação de espécies reativas de oxigênio seria de grande significância não somente

para o campo de estudo dos polifosfatos, mas para a bioenergética mitocondrial em

geral, abrindo novas perspectivas para esta área do conhecimento, podendo inclusive

ser uma alternativa para controle, tal qual já é feito atualmente para microorganismos.

Existe um crescente interesse na pesquisa de funções e características de

polifosfatos em eucariontes superiores (KULAEV, et al. 1999, 2000; PAVLOV, et al.

2010). Nosso estudo permitirá conhecer e analisar o possível papel dos polifosfatos

mitocondriais no suporte energético do Tribolium castaneum bem como a prevenção

a Espécies Reativas de Oxigênio através de algumas das enzimas antioxidantes

presentes no metabolismo desse artrópode.

19

3. OBJETIVO GERAL:

Conhecer o metabolismo mitocondrial dos polifosfatos e sua possível relação

com o suporte energético e no combate às espécies reativas de oxigênio do besouro

adulto Tribolium castaneum.

3.1. Objetivos Específicos:

Analisar o possível papel dos polifosfatos mitocondriais no suporte energético

do besouro Tribolium castaneum:

• Determinar a atividade da exopolifosfatase durante a respiração mitocondrial;

• Analisar a possível influência do ADP/ATP, NAD+/NADH, Glicose 6-fosfato e

Acetil-CoA nas atividades exopolifosfatásicas mitocondriais;

• Determinar se a exopolifosfatase mitocondrial é estimulada pelo gradiente de

prótons e/ou fluxo de elétrons;

• Determinar a influência dos polifosfatos na atividade da F1Fo-ATPase.

Analisar a relação entre os metabolismos de pirofosfatos e polifosfatos e sua

possível relação com a atividade mitocondrial:

• Determinar a atividade da exopolifosfatase durante a respiração mitocondrial

em besouros silenciados para o gene da pirofosfatase;

• Determinar a influência dos polifosfatos na atividade da F1Fo-ATPase em

besouros silenciados para o gene da pirofosfatase.

Determinar os efeitos do polifosfato de cadeia curta e longa sobre as atividades

das enzimas antioxidantes: Catalase, Glutationa redutase, Superóxido

dismutase.

20

4. METODOLOGIA:

4.1. Animais:

Besouros da espécie Tribolium castaneum em todas as suas fases de vida

foram cultivados em colônias e mantidos no Laboratório Integrado de Bioquímica

Hatsaburo Masuda (LIBHM) em estufa a temperatura de 30°C. Para alimentação e

manutenção de todos os ciclos de vida dos besouros os mesmos foram mantidos em

farinha de trigo estéril. As colônias foram mantidas em caixas plásticas de

aproximadamente 15x15 cm, segregadas por fases do ciclo de vida – ovo, larva, pupa

e adulto – sendo estes últimos separados por tempo de vida, em meses. Para o

processo de esterilização, a farinha é mantida no freezer a -20°C durante 24h e então

é colocada em estufa a 50°C por outras 24h. Antes de ser adicionada às colônias, a

farinha é peneirada em malhas de 710 μM, sendo esta farinha trocada semanalmente,

juntamente com a troca das caixas plásticas por outras limpas. A farinha retirada das

colônias, bem como os animais mortos são descartados. Pupas foram segregadas por

gênero, diferenciação facilmente identificada por análise morfológica, e

acondicionadas a fim de que as fêmeas adultas recebessem a injeção de dsRNA para

pirofosfatase.

4.2. Isolamento da fração mitocondrial:

Foram utilizados 500 mg de besouros adultos que foram macerados e

homogeneizados em 3 mL de tampão de isolamento Tris-HCl 50 mM, pH 7,2 contendo

sacarose 0,5 M, MgCl2 20 mM, inibidores de protease como a leupeptina 10 μM e a

pepstatina 1 μM, EGTA 10 mM e albumina livre de ácidos graxos 1%. O homogenato

foi mantido a 4 °C e após centrifugado a 200 x g por 5 minutos a 4°C, o precipitado foi

descartado e o sobrenadante formado adicionado em novo tubo e centrifugado a 2000

x g por 10 minutos a 4° C. Após esta segunda centrifugação, o precipitado foi

descartado e o sobrenadante formado adicionado em novo tubo e então foi novamente

centrifugado a 8000 x g por 15 minutos a 4° C. Nesta etapa, o sobrenadante formado

foi descartado e o precipitado contendo a porção mitocondrial foi reservado e utilizado.

(CAMPOS, et al. 2007).

21

4.3. Preparo da suspensão de mitocôndrias rompidas para determinação de

atividades enzimáticas mitocondriais:

Para determinar o perfil de atividade enzimática e os efeitos do polifosfato de

cadeia curta (Poli P3) e de cadeia longa (Poli P15) as mitocôndrias foram isoladas e

congeladas em nitrogênio líquido até o momento do seu uso. Para as enzimas

catalase, glutationa redutase e superóxido dismutase as amostras mitocondriais foram

rompidas por sonicação ultrasônica usando o equipamento UNIQUE modelo DES500

(todas as amostras mitocondriais foram mantidas em gelo e sonicadas por 3 vezes

usando a potência máxima durante 30 segundos com intervalo de 1 minuto) e

mantidas em banho de gelo durante o tempo dos ensaios. A partir dos maiores níveis

de atividade de cada enzima foram avaliadas a influência dos polifosfatos nas

concentrações de 5, 10 e 20 µM. Todas as atividades foram determinadas

espectrofotometricamente utilizando o espectrofotômetro Shimadzu UV.

4.4. Quantificação de fosfato inorgânico (Pi) liberado:

O fosfato inorgânico foi quantificado nas amostras das frações mitocondriais.

50 μL das amostras das frações mitocondriais obtidas conforme item 4.2 foram

acrescidas do mesmo volume de tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,2 contendo sacarose

0,5 M, MgCl2 20 mM. O Pi solúvel foi quantificado espectrofotometricamente

adicionando-se molibdato de amônio 0,5%, ácido sulfúrico 0,35 M, SDS 0,5 M e ácido

ascórbico 10% de acordo com o método de FISKE e SUBBAROW (1925). A

absorbância foi medida a 750 nm.

4.5. Atividade da mitoPPX durante a respiração mitocondrial:

A atividade exopolifosfatásica foi avaliada de acordo com CAMPOS e

colaboradores (2007). O ortofosfato liberado da reação foi quantificado de acordo

com FISKE e SUBBAROW (1927). Para avaliar o envolvimento dos polifosfatos com

a demanda energética, foi visto a influência de quantidades fisiológicas de ATP/ADP,

NADH/NAD+, Glicose 6-fosfato e Acetil-CoA na atividade exopolifosfatásica

mitocondrial. Para avaliar se o gradiente de prótons ou o fluxo de elétrons também

participa da regulação da exopolifosfatase mitocondrial foi analisada a atividade

durante a respiração mitocondrial utilizando piruvato e ADP como substratos oxidáveis

a 280C em 150 μL de meio de incubação com 0,5 mg de mitocôndria considerando a

22

quantidade de proteínas em mg/mL. O meio de reação contém PoliP3 ou 15, EGTA 1

mM, MgCl2 5 mM, piruvato 3 mM e ADP 0,2 mM em Tris-HCl 50 mM com pH 7,4. Foi

usado KCN 5 mM como inibidor da cadeia respiratória e FCCP como desacoplador

(PESTOV, et al. 2004). O Pi formado durante a reação foi determinado

espectrofotometricamente adicionando molibdato de amônio 0,5 %, ácido sulfúrico

0,35 M, SDS 0,5 M e ácido ascórbico 10 %. A absorbância foi medida a 750 nm após

15 minutos de incubação. Foi definido como 1 unidade de atividade enzimática a

quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmol de Pi por minuto.

4.6. Atividade da F1Fo-ATPase durante a respiração mitocondrial:

A atividade da F1Fo-ATPase foi determinada espectrofotometricamente de

acordo com LI e NEUFELD (2001). O ensaio foi realizado a 30º C em uma reação

contendo Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, MgSO4 2 mM, KCl 100 mM e ATP 2 mM. Foi

definido como 1 unidade de atividade enzimática a quantidade de enzima capaz de

liberar 1 µmol de Pi por minuto.

4.7. Silenciamento gênico da pirofosfatase por dsRNA:

O RNA dupla fita (dsRNA) foi produzido in vitro utilizando o kit Megascript T7

(Ambion Cat. No. AM1333M). A sequência molde para transcrição in vitro do gene da

pirofosfatase foi amplificada a partir do cDNA contendo adaptadores para primers com

sequências promotoras para T7 RNA polimerase. De acordo com a metodologia

publicada, RNAi parental foi realizado injetando-se a fêmea adulta (VAN DER ZEE, et

al. 2006). Para este procedimento, fêmeas sexualmente maduras do besouro foram

colocadas em placas de Petri sobre o gelo e resfriadas por 10 minutos para ficarem

anestesiadas. Usando-se uma pinça, o tórax do animal foi pressionado até que o

abdômen e genitália fossem expostos, possibilitando que o dsRNA do gene da

pirofosfatase fosse injetado na lateral do abdômen em uma concentração de 1 μg/μL.

Besouros adultos foram submetidos aos processos de fracionamento celular e usados

para análises de atividades enzimáticas, quantificação de proteínas e quantificação

de PoliP.

4.8. Atividade da enzima antioxidante Catalase mitocondrial:

A catalase é uma proteína que catalisa a decomposição de peróxido de

hidrogênio a oxigênio e água. Sua atividade é determinada pela velocidade de

23

consumo de H2O2 nos primeiros 5 minutos de reação a 240 nm. Cada reação terá a

fração mitocondrial com 30 μg de proteína incubada em meio 50 mM, Tris-HCl, pH 7,4

contendo MgCl2 20 mM a 37 °C por 10 minutos e como substrato iniciador utiliza-se

3,6 % de H2O2 em volume final de 1 mL (SANTIAGO, et al. 2008).

4.9. Atividade da enzima antioxidante Glutationa Redutase Mitocondrial:

Ao utilizar o seu substrato a glutationa oxidase (GSSG), a enzima mitoGR

consome NADPH, o processo que consome NADPH é determinado a 340 nm. A

velocidade de consumo de NADPH em condições de saturação expressa a atividade

enzimática. Desta velocidade é descontada a reação basal de consumo de NADPH

obtido pela leitura do ensaio enzimático sem a presença do substrato (GSSG). O

ensaio enzimático é acompanhado durante 5 minutos no espectrofotômetro. A reação

contém tampão fosfato de sódio 100 mM, pH 7,0, EDTA 1mM, 1 mM, NADPH 0,1 mM

e 30 μg de proteína mitocondrial em volume final de 1 mL incubados a 37 °C por 10

minutos e como substrato iniciador utiliza-se 1 mM GSSG (MIZUNO, 1984).

4.10. Atividade da enzima antioxidante Superóxido dismutase:

Determinada na fração mitocondrial em meio de reação contendo tampão

fosfato de sódio pH 7,4 - 50 mM, 13 mM metionina, azul p-nitro tetrazólico (NBT) 75

µM, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 100 mM, riboflavina 2 µM, 30 μg de

proteína mitocondrial em volume final de 1 mL e este meio foi mantido protegido da

exposição a luz (DEL LONGO, et al. 1993). A reação foi conduzida a 25°C numa

câmara de reação sob a iluminação de uma lâmpada fluorescente de 15 W. A reação

foi iniciada com a exposição da reação a lâmpada fluorescente por 10 minutos e

interrompida com seu desligamento. A fotorredução do NBT resulta na formação do

formazana azul que foi medido pelo incremento da absorbância a 560 nm

(GIANNOPOLITIS e RIES, 1977), sendo subtraída de um “branco”, no qual a mistura

de reação foi mantida no escuro por 10 minutos. A fotorredução total (100%) do NBT

foi acompanhada e determinada a leitura a 560 nm utilizando um meio sem presença

da amostra mitocondrial. Uma unidade de SOD foi definida como a quantidade de

enzima necessária para inibir 50% a fotorredução do NBT (BEAUCHAMP e

FRIDOVICH, 1971).

24

4.11. Análises Estatísticas:

Os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão de três

experimentos independentes em triplicata. Para a análise estatística foi utilizado one

way ANOVA seguido de pós teste de Tukey para comparações múltiplas através do

programa GraphPad Prism 5.03. A significância foi estabelecida em p < 0,05 (*) e p <

0,001 (**).

25

5. RESULTADOS:

5.1.Atividade da Exopolifosfatase (PPX) durante a respiração mitocondrial em

besouros adultos:

Como experimento inicial, analisamos a atividade da enzima Exopolifosfatase

mitocondrial (mitoPPX) em besouros adultos de Tribolium castaneum, onde foi

avaliado o papel dessa enzima durante a respiração mitocondrial sendo o controle

representando a atividade basal da mitoPPX, utilizando o PoliP3 (5 mM) como fonte

de Pi. Com a adição de Piruvato (3 mM) e o aceptor de fosfato Adenosina Difosfato

(ADP), (0,2 mM) a atividade da mitoPPX foi maior quando comparada ao controle,

tendo como substrato o polifosfato de cadeia curta, PoliP3. Pode-se perceber que com

adição de ADP e Piruvato ocorreu aumento da atividade de mitoPPX, indicando que

esta enzima é estimulada durante o estado 3. Com o propósito de observar se haveria

inibição da cadeia transportadora de elétrons, foi usado cianeto de potássio (KCN)

como inibidor, onde verificamos que houve inibição da atividade enzimática. Já

utilizando o FCCP como desacoplador da cadeia respiratória, houve um aumento em

sua atividade sugerindo que a mitoPPX mitocondrial poderia ser modulada pelo fluxo

de elétrons (Figura 8).

26

Atividade da mitoPPX:

Figura 8. Análise da atividade da exopolifosfatase mitocondrial (mitoPPX) durante a

respiração mitocondrial em T. castaneum adultos. Em amostras de mitocôndrias ativas

com estímulo da respiração onde controle sem adição de Piruvato + ADP, KCN e FCCP

avaliamos a atividade da mitoPPX basal. Com a adição de Piruvato (3 mM) + ADP (0,2 mM).

KCN foi utilizado como inibidor da cadeia respiratória e FCCP como desacoplador. Como

substrato da enzima foi utilizado PoliP3 (5 mM). Os dados expressam a média ± desvio padrão

de 3 ensaios independentes em triplicata. A significância foi estabelecida em p < 0,05 (*) e p

< 0,001 (**).

5.2.Atividade da Exopolifosfatase (PPX) durante a respiração mitocondrial com

o gene da pirofosfatase silenciado por RNAi em besouros adultos:

Realizamos então o mesmo experimento, porém agora com silenciamento do

gene da pirofosfatase através da técnica de RNA de interferência. Nesse experimento

onde houve o silenciamento, a ativação da respiração mitocondrial por ADP e Piruvato

não alterou a atividade da mitoPPX, bem como a adição de KCN e FCCP, indicando

que o fluxo de elétrons também não foi capaz de regular atividade da mitoPPX,

27

(Figura 9). Esse resultado foi completamente distinto do que foi visto em besouros

sem o silenciamento gênico, indicando que alterações no metabolismo de pirofosfatos

afetam o metabolismo mitocondrial de polifosfatos em Tribolium castaneum.


Figura 9. Análise da atividade da exopolifosfatase mitocondrial (mitoPPX) durante a

respiração mitocondrial em T. castaneum adultos com o gene da pirofosfatase

silenciado. Em amostras de mitocôndrias ativas com gene da Pirofosfatase silenciado onde

controle sem adição de Piruvato + ADP, KCN e FCCP avaliamos a atividade da mitoPPX

basal. Com a adição de Piruvato (3 mM) e ADP (0,2 mM). KCN foi utilizado como inibidor da

cadeia respiratória e FCCP como desacoplador. Como substrato da enzima foi utilizado PoliP3

(5 mM). Os dados expressam a média ± desvio padrão de 3 ensaios independentes em

triplicata. A significância foi estabelecida em p < 0,05 (*) e p < 0,001 (**).

5.3.Atividade da F1Fo-ATPase no metabolismo mitocondrial utilizando PoliP3:

A ATP sintase é uma enzima funcionalmente reversível que pode catalisar tanto

a síntese quanto a hidrólise de ATP (SARASTE, 1990ª,b). O fluxo de prótons leva à

28

condensação do ADP e de fosfato inorgânico em ATP (SARASTE, 1990ª,b;

WALLACE, 1999a,b). Portanto, a detecção de Pi é útil para avaliar a taxa de produção

de polifosfato inorgânico por ATPases e a atividade enzimática relacionada, um

parâmetro extremamente importante no metabolismo energético celular. Na Figura

10, analisamos a atividade da F1Fo-ATPase utilizando como substrato o polifosfato de

cadeia curta, PoliP3 e observamos que a atividade da F1 Fo-ATPase foi estimulada por

PoliP3.

Atividade da F1Fo-ATPase:

Contr

ole M5

M10

M

20

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

**

***

U / m

g P

TN

Figura 10. Papel dos polifosfatos de cadeia curta na atividade da F1Fo-ATPase. As

concentrações de PoliP3 utilizadas foram de 5 µM, 10 µM e 20 µM. Controle sem adição de

polifosfato. Os dados expressam a média ± desvio padrão de 3 ensaios independentes em

triplicata. Como substrato da enzima foi utilizado PoliP3 (5 mM). Os dados expressam a média

± desvio padrão de 3 ensaios independentes em triplicata. A significância foi estabelecida em

p < 0,05 (*) e p < 0,001 (**).

29

5.4.Atividade da F1Fo-ATPase no metabolismo mitocondrial utilizando PoliP3

com o gene da pirofosfatase silenciado por RNAi:

Agora com o gene da pirofosfatase silenciado, verificamos a atividade da F1Fo-

ATPase utilizando como substrato também o polifosfato de cadeia curta PoliP3, que

assim como observado na figura 10, a atividade da F1Fo-ATPase também foi

estimulada por PoliP3 (Figura 11) demonstrando resultado similar sem o

silenciamento gênico.


Figura 11. Papel dos polifosfatos de cadeia curta na atividade da F1Fo-ATPase com

silenciamento gênico utilizando PoliP3. As concentrações de PoliP3 utilizadas foram de 5

µM, 10 µM e 20 µM. Controle sem adição de polifosfato. Como substrato da enzima foi

utilizado PoliP3 (5 mM). Os dados expressam a média ± desvio padrão de 3 ensaios

independentes em triplicata. A significância foi estabelecida em p < 0,05 (*) e p < 0,001 (**).

30

5.5.Atividade da F1Fo-ATPase no metabolismo mitocondrial utilizando PoliP15:

Quando analisamos a atividade da F1Fo-ATPase utilizando como substrato o

polifosfato de cadeia curta (Figura 11) o PoliP3, observamos anteriormente que a

atividade da F1Fo-ATPase foi estimulada por esse polifosfato, o que, antagonicamente

aconteceu quando o substrato para analisar a atividade da F1Fo-ATPase foi o

polifosfato de cadeia longa, o PoliP15, como demonstrado na Figura 12, cuja

atividade foi pouco alterada não demonstrando ativação significativa.


Figura 12. Papel dos polifosfatos de cadeia longa na atividade da F1Fo-ATPase

utilizando PoliP15. As concentrações de PoliP15 utilizadas foram de 5 µM, 10 µM e 20 µM.

Controle sem adição de polifosfato. Os dados expressam a média ± desvio padrão de 3

ensaios independentes em triplicata. A significância foi estabelecida em p < 0,05 (*) e p <

0,001 (**).

31

5.6.Atividade da F1Fo-ATPase no metabolismo mitocondrial utilizando PoliP15

com o gene da pirofosfatase silenciado por RNAi:

Já analisando a Figura 13, observamos que quando comparada a atividade da

F1Fo-ATPase utilizando como substrato o polifosfato de cadeia longa PoliP15, a

enzima não foi estimulada, ou seja, tanto na atividade da enzima sem o silenciamento

gênico quanto na silenciada, com adição de polifosfato de cadeia longa não houve

ativação enzimática da F1Fo-ATPase.


Figura 13. Papel dos polifosfatos de cadeia longa na atividade da F1Fo-ATPase com

silenciamento gênico. As concentrações de PoliP15 utilizadas foram de 5 µM, 10 µM e 20

µM. Controle sem adição de polifosfato. Os dados expressam a média ± desvio padrão de 3

ensaios independentes em triplicata. A significância foi estabelecida em p < 0,05 (*) e p <

0,001 (**).

32

5.7.Influência do ATP/ADP na atividade Exopolifosfatásica (PPX) mitocondrial:

Investigamos ainda a influência da Adenosina Trifosfato (ATP) e Adenosina

Difosfato (ADP) na razão ATP/ADP na atividade da mitoPPX, onde utilizamos

besouros adultos e como substrato enzimático, polifosfatos compostos por três

moléculas de fosfato (PoliP3), a uma concentração adequada de 5 mM, determinada

experimentalmente. Nas razões 1:50, 1:10, 1:5, 1:1, 5:1 e 10:1, utilizando-se como

substrato da enzima o PoliP3, a atividade da mitoPPX apresentou diminuição

significativa em relação ao controle conforme nota-se na Figura 14 quando a razão

ATP/ADP aumentava.


Figura 14. Influência do ATP/ADP na atividade da exopolifosfatase mitocondrial

(mitoPPX) em T.castaneum adultos. Em amostras de mitocôndrias ativas com estímulo da

respiração mitocondrial em besouros adultos, avaliamos a atividade da mitoPPX basal como

mostrado no controle, com a adição de ATP (5 mM) e ADP (5 mM). Como substrato da enzima

foi utilizado PoliP3 (5 mM). Os dados expressam a média ± desvio padrão de 3 ensaios


33

5.8.Influência do NADH/NAD+ na atividade Exopolifosfatásica (PPX)

mitocondrial:

Também foi analisada a razão NADH/NAD+ na atividade da mitoPPX do

besouro adulto, onde houve uma queda na atividade exopolifosfatásica mitocondrial

nas razões 1:50, 1:10, 1:5, 1:1, 5:1 e 10:1, utilizando-se como substrato da enzima o

PoliP3, como mostra a Figura 15, onde quanto maior a quantidade de NADH

(reduzido) em relação a quantidade de NAD+ (oxidado), a atividade enzimática reduziu

drasticamente quando a razão NADH/NAD+ aumentou.


Figura 15. Influência do NADH/NAD+ na atividade da exopolifosfatase mitocondrial



mostrado no controle, com a adição de NADH (5 mM) e NAD+ (5 mM). Como substrato da

enzima foi utilizado PoliP3 (5 mM). Os dados expressam a média ± desvio padrão de 3 ensaios


34

5.9.Influência da AcetilCoA na atividade Exopolifosfatásica (PPX) mitocondrial:

Analisamos também a possível influência da acetilcoenzima A (Acetil-CoA), que

é um composto intermediário no metabolismo celular, constituído por um grupo acetil

de dois carbonos, unidos de maneira covalente a coenzima A nas atividades

exopolifosfatásicas mitocondriais. Observamos um aumento da atividade na

concentração inicial quando comparada ao controle e posteriormente sua gradativa

diminuição, indicando que a mitoPPX foi influenciada pela AcetilCoA dependendo da

concentração utilizada. Para analisar a influência da AcetilCoA na atividade da

mitoPPX, utilizamos três diferentes concentrações 30 µM, 60 µM e 300 µM onde

PoliP3 foi o substrato enzimático (Figura 16).


Figura 16. Influência do AcetilCoA na atividade da exopolifosfatase mitocondrial



mostrado no controle, com a adição de 30 µM, 60 µM e 300 µM de Acetil-CoA. Como

substrato da enzima foi utilizado PoliP3 (5 mM). Os dados expressam a média ± desvio padrão

de 3 ensaios independentes em triplicata. A significância foi estabelecida em p < 0,05 (*) e p

< 0,001 (**).

35

5.10.Influência da Glicose 6-fosfato na atividade Exopolifosfatásica (PPX)

mitocondrial:

A Glicose 6-fosfato (G6P) é um composto muito comum nas células, sendo que

a vasta maioria da glicose que entra na célula fica fosforilada desta forma.

Investigamos então a influência da G6P no metabolismo de polifosfatos onde foi

avaliada a atividade da mitoPPX com as três crescentes concentrações de G6P, 0,5

mM, 1 mM e 2 mM, mostrando que os níveis de mitoPPX são maiores com o aumento

da concentração de G6P relacionando-se com o controle. O aumento das

concentrações de G6P ativou consideravelmente a ação da mitoPPX, conforme

podemos observar na Figura 17.

Segundo Da-Silva et al. (2004), a hexoquinase mitocondrial participa da

prevenção da formação de EROs através da reciclagem do ADP. Em 2008,

SANTIAGO, et al., sugeriu que a atividade da mitoHex complementa através de um

mecanismo alternativo a atividade das enzimas antioxidantes clássicas contra o

estresse oxidativo.


Figura 17. Análise da atividade da exopolifosfatase mitocondrial (mitoPPX) na presença

de Glicose 6-fosfato (G6P). Em amostras de mitocôndrias ativas com estímulo da respiração

https://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula

36

mitocondrial em besouros adultos, avaliamos a atividade da mitoPPX basal como mostrado

no controle, com a adição de 0,5 mM, 1 mM e 2 mM de G6P como modulador da reação.

Como substrato da enzima foi utilizado PoliP3 (5 mM). Os dados expressam a média ± desvio

padrão de 3 ensaios independentes em triplicata. A significância foi estabelecida em p < 0,05

(*) e p < 0,001 (**).

5.11.Atividade da enzima Catalase no metabolismo mitocondrial utilizando

PoliP3:

Avaliamos então a atividade das enzimas: catalase (mitoCAT), glutationa

redutase (mitoGR) e a superóxido dismutase (mitoSOD) durante a fase adulta do

besouro Tribolium castaneum e o papel dos polifosfatos de cadeia curta e longa sobre

cada uma destas enzimas a fim de verificar o possível papel dos polifosfatos na

prevenção da formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) nos eventos

mitocondriais as quais representam o sistema enzimático antioxidante do besouro

Tribolium castaneum.

Inicialmente, analisamos o papel dos polifosfatos sobre a enzima mitoCAT, que

é produzida por quase todos os organismos vivos e catalisa a decomposição do

peróxido de hidrogênio a oxigênio e água, verificando a atividade enzimática no

metabolismo mitocondrial utilizando o PoliP3, onde de acordo com a figura 18, PoliP3

conduziu um aumento significativo na atividade da mitoCAT nas concentrações 10 e

20 µM se comparado ao controle.

37

Atividade da Catalase:

Figura 18. Atividade da enzima Catalase no metabolismo mitocondrial (mitoCAT) em

adultos do besouro T.castaneum utilizando como substrato o PoliP3. O consumo de

peróxido de hidrogênio pela enzima mitoCAT foi definido a uma absorbância de 240 nm.

Foram utilizadas diferentes concentrações de polifosfato 5 µM, 10 µM e 20 µM em amostras

mitocondriais. Como substrato da enzima foi utilizado PoliP3 (5 mM). Os dados expressam a

média ± desvio padrão de 3 ensaios independentes em triplicata. A significância foi

estabelecida em p < 0,05 (*) e p < 0,001 (**).

5.12.Atividade da enzima Catalase no metabolismo mitocondrial utilizando

PoliP15:

Ainda objetivando avaliar o papel dos polifosfatos sobre a enzima mitoCAT,

analisamos a atividade desta enzima no metabolismo mitocondrial utilizando agora o

PoliP15 como substrato enzimático onde, de acordo com a figura 19, o resultado

apresentou aumento na atividade da catalase em todas as concentrações testadas se

comparado ao controle.

38

Atividade da Catalase:

Figura 19. Atividade da enzima Catalase no metabolismo mitocondrial (mitoCAT) em

adultos do besouro T.castaneum utilizando como substrato o PoliP15. O consumo de

peróxido de hidrogênio pela enzima mitoCAT foi definido a uma absorbância de 240 nm.

Foram utilizadas diferentes concentrações de polifosfato 5 µM, 10 µM e 20 µM em amostras

mitocondriais. Como substrato da enzima foi utilizado PoliP15 (5 mM). Os dados expressam

a média ± desvio padrão de 3 ensaios independentes em triplicata. A significância foi



utilizando PoliP3:

A glutationa redutase (GR) é a enzima que regenera a glutationa reduzida

(GSH) pela redução da glutationa oxidada (GSSG) na presença do NADPH. Neste

experimento avaliamos o papel dos polifosfatos sobre a enzima mitoGR, utilizando o

PoliP3, que como verificamos na figura 20, não houve alteração na atividade

enzimática em nenhuma das concentrações 5 µM, 10 µM e 20 µM se comparado ao

controle.

39

Atividade da Glutationa Redutase:

Figura 20. Análise da atividade da Glutationa redutase mitocondrial (mitoGR) do

besouro T.castaneum utilizando PoliP3. O consumo de NADPH é acompanhado em 340

nm. Foram utilizadas diferentes concentrações de polifosfato 5 µM, 10 µM e 20 µM em

amostras mitocondriais. Como substrato da enzima foi utilizado PoliP3 (5 mM). Os dados

expressam a média ± desvio padrão de 3 ensaios independentes em triplicata. A significância

foi estabelecida em p < 0,05 (*) e p < 0,001 (**).

5.14.Atividade da enzima Glutationa Redutase no metabolismo mitocondrial

utilizando PoliP15:

De igual maneira, avaliamos o papel dos polifosfatos sobre a enzima mitoGR

no metabolismo mitocondrial utilizando agora o PoliP15, onde os resultados

observados foram os mesmos do obervado na figura anterior, que de acordo com a

Figura 21, também não demonstrou alteração na atividade enzimática nas

concentrações 5 µM, 10 µM e 20 µM se comparado ao controle.

40

Atividade da Glutationa Redutase:

Figura 21. Análise da atividade da Glutationa redutase mitocondrial (mitoGR) do

besouro T.castaneum utilizando PoliP15. O consumo de NADPH é acompanhado em 340

nm. Foram utilizadas diferentes concentrações de polifosfato 5 µM, 10 µM e 20 µM. Foram

utilizadas diferentes concentrações de polifosfato 5 µM, 10 µM e 20 µM em amostras

mitocondriais. Como substrato da enzima foi utilizado PoliP15 (5 mM). Os dados expressam

a média ± desvio padrão de 3 ensaios independentes em triplicata. A significância foi


5.15.Atividade da enzima Superóxido dismutase no metabolismo mitocondrial

utilizando PoliP3:

Como última enzima antioxidante a ser investigada, verificamos o papel dos

polifosfatos sobre a superóxido dismutase (SOD), que catalisa a dismutação do

superóxido em oxigênio e peróxido de hidrogênio. Devido a isto, é uma importante

defesa antioxidante na maioria das células expostas ao oxigênio. Primeiramente

utilizamos o PoliP3, que de acordo com a Figura 22, conduziu um aumento

https://pt.wikipedia.org/wiki/Dismuta%C3%A7%C3%A3o

https://pt.wikipedia.org/wiki/Super%C3%B3xido

https://pt.wikipedia.org/wiki/Oxig%C3%A9nio

https://pt.wikipedia.org/wiki/Per%C3%B3xido_de_hidrog%C3%A9nio

https://pt.wikipedia.org/wiki/Antioxidante

41

significativo na atividade enzimática da mitoSOD nas concentrações 5, 10 e 20 µM se

comparado ao controle.

Atividade da Superóxido Dismutase:

Figura 22. Análise da atividade da Superóxido dismutase mitocondrial (mitoSOD) do

besouro T. castaneum utilizando PoliP3. As concentrações de PoliP3 usadas foram 5, 10,

e 20 µM. Foram utilizadas diferentes concentrações de polifosfato 5 µM, 10 µM e 20 µM em

amostras mitocondriais. Como substrato da enzima foi utilizado PoliP3 (5 mM). Os dados



5.16.Atividade da enzima Superóxido dismutase no metabolismo mitocondrial

utilizando PoliP15:

Analisamos por fim a atividade da mitoSOD utilizando PoliP15 como substrato

enzimático nas concentrações 5 µM, 10 µM e 20 µM, onde mitoSOD não demonstrou

atividade em nenhuma das concentrações testadas (Figura 23).

42

Atividade da Superóxido Dismutase:

Figura 23. Análise da atividade da Superóxido dismutase mitocondrial (mitoSOD) do

besouro T. castaneum utilizando PoliP15. As concentrações de PoliP15 usadas foram 5,

10, e 20 µM. Foram utilizadas diferentes concentrações de polifosfato 5 µM, 10 µM e 20 µM

em amostras mitocondriais. Como substrato da enzima foi utilizado PoliP15 (5 mM). Os dados



43

6.DISCUSSÃO:

Em besouros adultos de Tribolium castaneum, após o fracionamento celular,

analisamos a atividade da enzima Exopolifosfatase mitocondrial (mitoPPX) durante a

respiração adicionando Piruvato (3mM) como substrato oxidável e Adenosina

Difosfato (ADP) (2mM) como aceptor de fosfato, cuja atividade da mitoPPX foi maior

quando comparada ao controle, tendo o polifosfato (PoliP3) como única fonte de Pi

que estimulou a atividade da mitoPPX. De fato, o efeito estimulador foi antagonizado

por KCN, um dos inibidores específicos da cadeia de transporte de elétrons inibindo

especificamente o complexo IV da cadeia transportadora. Uma última classe de

agentes, exemplificada pelo carboxicianeto-4-(trifluorometoxi)-fenilhidrazona (FCCP)

é capaz de provocar a inibição da fosforilação num fenômeno designado por

desacoplamento. Após adição de um desacoplador a um sistema no qual consumo de

O2 e síntese de ATP foram inibidos, observa-se um rápido aumento na taxa de

consumo de O2. Como captação de O2 ou transporte de elétrons está desacoplado da

síntese de ATP, o transporte de elétrons pode continuar, mas sem síntese de ATP.

Desacopladores são ácidos fracos hidrofóbicos, que são protonados no espaço

intermembranas, onde uma concentração mais alta de prótons resulta da ativa

transferência de elétrons. Esses desacopladores protonados, sendo lipofílicos,

rapidamente se difundem para a matriz mitocondrial, onde são desprotonados, devido

a uma concentração mais baixa de prótons. Desta forma, o gradiente de prótons pode

ser completamente dissipado. Utilizando o desacoplador da cadeia respiratória FCCP,

observamos um aumento na atividade enzimática sugerindo que a mitoPPX poderia

ser modulada pelo fluxo de elétrons (Figura 8). Costa (2013), demonstrou que a

pirofosfatase do R. microplus é uma enzima multifuncional, que pode desempenhar

também um importante papel no metabolismo de polifosfatos, atuando na sua

degradação. Para auxiliarmos os estudos da função da pirofosfatase em T.

castaneum, bem como seu envolvimento no metabolismo de PoliP, efetuamos

inicialmente injeções de RNA dupla fita, buscando o silenciamento gênico parental

desta enzima no modelo. O besouro T. castaneum responde muito bem a tal técnica,

pois possui genes ortólogos a maquinaria de endocitose, que são importantes para a

sua resposta de RNAi sistêmica (TOMOYASU, et al. 2008). Após a identificação de

sequências homólogas de Pyr em T. castaneum, foram realizados experimentos que

culminaram na transcrição para síntese de RNA dupla fita para Tc-Pyr. Com o método

44

de hibridização in situ foi possível revelar o padrão de expressão de Tc-Pyr no

Tribolium, que se mostrou presente em todos os estágios de desenvolvimento. Foi

também utilizada a medida de expressão relativa do gene por PCR em tempo real,

que demonstrou que o gene para pirofosfatase foi 99,77% inibido, confirmando a

eficácia do experimento de injeção dsPyr (CARVALHO, 2014). As análises foram

posteriormente procedidas nos besouros adultos, duas semanas após a injeção.

No experimento onde houve o silenciamento, a ativação da respiração

mitocondrial por ADP e Piruvato não alterou a atividade da mitoPPX, bem como a

adição de KCN e FCCP, indicando que o fluxo de elétrons também não foi capaz de

regular atividade da mitoPPX. Estes resultados, juntamente com os resultados da

atividade da PPX no grupo com inibição da pirofosfatase, confirmam, em maior

proporção, que provavelmente na ausência da pirofosfatase, a PPX deve estar

atuando clivando pirofosfato, resultando no grande aumento de Pi formado. Estes

resultados evidenciam, que não só a pirofosfatase é uma enzima multifuncional, como

demonstrado por COSTA (2013), mas a exopolifosfatase também apresenta

multifuncionalidade, podendo atuar na degradação de pirofosfatos. Assim, novos

estudos no campo da bioquímica de polifosfatos e suas enzimas regulatórias,

oferecem grandes perspectivas e podem trazer resultados inesperados para elucidar

os mecanismos de regulação mais importantes da célula viva (KULAEV, et al. 2004).

Algumas enzimas de S. cerevisiae e Leishmania major mostraram resultados

consideráveis a PPX solúvel, hidrolisando polifosfatos de cadeia curta, como o PoliP3

(KUMBLE e KORNBERG, 1996; RODRIGUES, et al. 2002), bem como foi mostrado

na fração mitocondrial em R. microplus (CAMPOS, 2007). CAMPOS et al., 2008,

também demonstraram que em mitocôndrias de R. microplus o acúmulo de polifosfato

de cadeia curta estimula a atividade da mitoPPX e foi visto que a mitoPPX tem maior

afinidade por PoliP3 do que por polifosfatos de cadeia longa corroborando com nossos

resultados, onde o PoliP3 a partir de 5µM foi capaz de alterar os níveis da enzima

antioxidante e da cadeia transportadora de elétrons. O tamanho da cadeia de

polifosfato determina diferentes características entre procariotos e eucariotos

(KULAEV e KULAKOVSKAYA, 2000). Baseados nesses estudos anteriores,

utilizamos PoliP3 como substrato da mitoPPX quando verificamos a regulação dessa

atividade enzimática (Figuras 8 e 9).

45

Sendo a detecção de Pi útil para avaliar a taxa de produção de fosfato

inorgânico por ATPases e a atividade enzimática relacionada um parâmetro

extremamente importante no metabolismo energético celular, avaliamos na Figura 10

a atividade da F1Fo-ATPase utilizando como substrato o polifosfato de cadeia curta,

PoliP3 e observamos que a atividade da F1Fo-ATPase foi estimulada conforme

aumento da concentração. O mesmo experimento foi testado agora com o gene da

pirofosfatase silenciado (Figura 11) onde pudemos observar que a atividade da F1Fo-

ATPase foi ativada com aumento da concentração, assim como o resultado anterior

sem o silenciamento gênico para o gene da pirofosfatase mostrando que

independente do silenciamento a atividade da F1Fo-ATPase foi estimulada pelo

PoliP3. Assim pudemos verificar que quando o substrato enzimático utilizado para a

atividade da F1Fo-ATPase foi um polifosfato de cadeia curta, a enzima foi prontamente

ativada confirmando que o silenciamento da pirofosfatase não foi capaz de alterar a

atividade enzimática. Analisamos ainda a atividade da F1Fo-ATPase agora com o

substrato de cadeia longa, PoliP15 onde de acordo com a Figura 12, verificamos

resultado antogônico ao observado na figura 3. A enzima F1Fo-ATPase não foi

significativamente estimulada por esse polifosfato demonstrando que a afinidade foi

observada somente com polifosfato de cadeia curta. Afim de concluirmos a etapa de

análise da atividade enzimática da F1Fo-ATPase, analisamos sua atividade enzimática

com silenciamento gênico para a pirofosfatase (Figura 13) onde da mesma forma, a

enzima também não sofreu ativação significativa quando o polifosfato utilizado no

experimento foi o PoliP15, em determinadas concentrações a atividade enzimática foi

até mesmo reduzida. Informação importante que necessita de maior aprofundamento

em pesquisas futuras afim de compreender melhor o o porquê da maior afinidade por

polifosfato de cadeia curta PoliP3, e não pelo polifosfato de cadeia longa, o PoliP15.

Um dado relevante foi obtido através de um estudo que analisou o tamanho das

moléculas de PoliP no besouro T. castaneum que apresenta, principalmente, PoliP de

cadeia curta em suas células (CARVALHO, et al. 2014). Resultado semelhante foi

apresentado em Rhodnius prolixus, organismo no qual foi demonstrado predomínio

de PoliP de cadeia curta (GOMES, et al., 2010).

Analisamos ainda o possível papel dos polifosfatos mitocondriais no suporte

energético do besouro T. castaneum adulto, e para isso verificamos a influência do

ADP/ATP, NAD+/NADH, Glicose 6-fosfato e AcetilCoA nas atividades

46

exopolifosfatásicas mitocondriais. Como experimento inicial, alternamos as razões de

ATP/ADP observadas na Figura 14. Nossa análise mostrou que quando a razão

ATP/ADP é alta, a disponibilidade de ADP é baixa fazendo com que provavelmente o

complexo V da cadeia transportadora de elétrons trabalhe mais lentamente (sendo

ADP substrato do complexo V), consequentemente, menos prótons retornaram à

matriz mitocondrial e o potencial eletroquímico (acúmulo de prótons no espaço

intermembranoso) estava alto. Com isso, os complexos I, III e IV não bombearam

tantos prótons para o espaço intermembranoso, já que este estaria saturado com

prótons, o que possivelmente diminuiu drasticamente a oxidação do NADH e do

FADH2 e o transporte de seus elétrons através dos complexos até a quebra de O2.

Assim, a atividade da mitoPPX nas razões 1:50, 1:10, 1:5, 1:1, 5:1 e 10:1, sendo esta

proporcional à ATP/ADP utilizando-se como substrato da enzima o PoliP3, apresentou

diminuição significativa, ou seja, quando a quantidade de ATP foi maior em relação à

quantidade de ADP, pois provavelmente tendo muita disponibilidade de ATP formado

menor a quantidade de ADP livre, consequentemente a atividade da mitoPPX foi

reduzida.

Muitos processos catabólicos são de natureza oxidativa, porque os carbonos

do substrato – carboidratos, gorduras e proteínas - estão em estado parcialmente ou

altamente reduzidos. Equivalentes de redução são liberados de substratos como

prótons e elétrons, que são transferidos para nicotinamida adenina dinucleotídeo

(NAD+) por enzimas com formação de NADH. Os equivalentes de redução do NADH

são transportados para dentro das mitocôndrias e transferidos pela cadeia de

transporte de elétrons para O2 como aceptor final de elétrons. As reações oxidativas

em mitocôndrias são exergônicas, com a energia produzida sendo usada pela síntese

de ATP, no processo de fosforilação oxidativa. A energia é fornecida por ATP,

enquanto o poder redutor é fornecido pela oxidação do NAD(P)H, e o complexo I está

diretamente implicado no fornecimento de ambos. Como o principal ponto de entrada

de NADH para o sistema de transporte de elétrons é via complexo I, este auxiliaria na

determinação do número de moléculas de ATP disponíveis para o transporte para fora

da mitocôndria. Assim, o complexo I regula a quantidade de energia redutora

disponível e, portanto, regula os níveis de NAD + e NADH (STEFANATOS e SANZ,

2011). Utilizando a mesma proporção do experimento anterior, agora analisamos a

influência do NADH/NAD+ na atividade da mitoPPX. Sendo as reações redutoras e

47

oxidativas no ciclo NAD+ e NADH centrais na conversão de energia química de

compostos de carbono dos alimentos em ligações fosfoanidrido de ATP, a adição de

NADH provavelmente levou a saturação do Complexo I, que transferiu elétrons para

o Complexo III e depois IV. Este último é o responsável pelo consumo de oxigênio

molecular. Os complexos I, III e IV, durante a transferência de elétrons, bombearam

prótons para o espaço intermembranas, criando o potencial eletroquímico fazendo

com que a atividade da mitoPPX fosse diminuída mostrando que quanto maior a

quantidade de NADH (reduzido) em relação ao NAD+ (oxidado), a atividade

enzimática da mitoPPX é menor (Figura 15). De forma proporcional, quando a

concentração de NADH foi maior em relação à NAD+, a atividade da mitoPPX

apresentou níveis menores de atividade enzimática, corroborando os resultados

observados anteriormente relacionados à proporção ATP/ADP (Figura 14), pois em

ambos os experimentos, a capacidade energética mitocondrial já estaria

possivelmente em altos níveis celulares. A redução específica de PoliP mitocondrial

por superexpressão da exopolifosfatase, modula significativamente a bioenergética

mitocondrial, tal como indicado pela redução do potencial de membrana interior e

aumento dos níveis de NADH (ABRAMOV, et al. 2007)

Outro fator importante e que serve de fonte de combustível para o ciclo dos

ácidos tricarboxílicos (TCA) é derivado das principais vias metabólicas geradoras de

energia das células, o grupo acetato. Essas vias, por sua vez, resultam no final em

produção da unidade de dois carbonos acetilcoenzima A (CoA). A acetil-CoA é

produzida em vias catabólicas geradoras de energia da maioria das células sendo

completamente oxidada a CO2 no ciclo dos ácidos tricarboxílico (TCA). A localização

primária das enzimas do ciclo TCA é mitocondrial, embora isoenzimas de algumas

enzimas estejam presentes no citosol. Esta localização é apropriada, uma vez que o

complexo piruvato desidrogenase e a sequência de b-oxidação de ácidos graxos, as

duas fontes primárias de Acetil-CoA, também estão localizadas em mitocôndrias. Na

primeira etapa do TCA, o resíduo acetil do Acetil-CoA é condensado com oxaloacetato

para formar citrato. Sabe-se que o acúmulo excessivo de acetil-CoA intracelular pode

ser tóxico, promover o estresse mitocondrial e aumentar a produção de radicais livres

prejudiciais. (PRENTKI e CORKEY, 1996; MITCHELL, et al. 2008). Analisamos então

a influência da acetil-CoA na atividade exopolifosfatásica mitocondrial mitoPPX

(Figura 16) tendo como substrato o PoliP3 (5mM). Em menor concentração, a enzima

48

obteve maior atividade tendo sua ação reduzida com o aumento da concentração,

mostrando que a atividade da mitoPPX é influenciada pela adição de Acetil-CoA

dependendo da concentração, mostrando que quanto menor a concentração de Acetil-

CoA de acordo com o controle, maior será a atividade da mitoPPX liberando Pi.

A PPX tem sido relacionada à demanda energética mitocondrial durante o

desenvolvimento do embrião de R. microplus, onde sua atividade foi totalmente inibida

a 2mM de Pi e ligeiramente estimulada por ADP (CAMPOS, et al. 2007) e, enquanto

nossos resultados mostraram que o aumento da concentração de G6P a estimulou,

(Figura 17). Outra enzima importante no metabolismo energético, é a hexoquinase.

Embora a reação da hexoquinase consuma ATP, ela representa um bom início da

glicólise porque transforma glicose em glicose 6-fosfato (G6P) no citosol, onde todas

as enzimas glicolíticas estão localizadas. Ésteres de fosfato são carregados e

hidrofílicos e, portanto, não podem atravessar membranas celulares. A fosforilação da

glicose por ATP é uma reação termodinamicamente favorável, irreversível em

condições celulares. A hexoquinase então transfere fosfato do ATP para a glicose,

formando a glicose 6-fosfato. A hexoquinase (Hex) em mamíferos apresenta quatro

isoformas (Hex-I a Hex-IV) (GALINA, et al. 1995), assim como na mosca da fruta a

Drosophila melanogaster (DUVERNELL e EANES, 2000). Estas diferem na sua

afinidade pela glicose e na inibição por G6P e Pi, bem como na sua distribuição nos

compartimentos celulares (GALINA, et al. 1995; WILSON, 2003). A glicose é um

composto muito comum nas células, sendo a vasta maioria que entra na célula

apresenta-se fosforilada como glicose 6-Fosfato. No caso da mitoHex, sob condições

de normoglicemia, o equilíbrio entre a taxa de absorção celular de glicose e a taxa de

remoção de G6P pelo metabolismo celular, garante o fluxo contínuo da fosforilação

por mitoHex in vivo (RODEN E SHULMAN, 1999; FEHR, et al. 2003). Uma proporção

de respiração das células basais é resultado da ativação do consumo mitocondrial de

O2 pela reciclagem do ADP via reação da mitoHex nas células que expressam esta

isoforma de hexoquinase (DA-SILVA, et al. 2004). Analisamos a influência da G6P na

atividade da mitoPPX, onde com o aumento da concentração a atividade enzimática

foi ativada, sugerindo que na presença de crescentes concentrações de G6P houve

aumento dos níveis da atividade da mitoPPX, sugerindo que o acúmulo de G6P

estimula a atividade dessa enzima e, consequentemente, a liberação de Pi pela

hidrólise do PoliP como observamos na Figura 17. Nossos resultados sugerem uma

https://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula

49

relação entre as enzimas mitocondriais hexoquinase e PPX e a molécula de polifosfato

com as espécies reativas de oxigênio (EROs). Com a formação de G6P, ocorre

estímulo da atividade da mitoPPX liberando Pi com a hidrólise de PoliP, podendo

servir como doador para a produção de ATP que consequentemente será substrato

para a reação da hexoquinase. DA-SILVA, et al. (2004) propôs o mecanismo pelo qual

a hexoquinase mitocondrial (mitoHex) participa da prevenção de formação de

espécies reativas de oxigênio (EROs), que se baseia na manutenção do potencial de

membrana mitocondrial (Δψ) ligeiramente baixo e da reciclagem do ADP através do

acoplamento da fosforilação oxidativa com a G6P. O acúmulo de G6P inibe a atividade

da mitoHex e dificulta a fosforilação da glicose modulando o estado fisiológico celular

em células humanas (FEHR, et al. 2003). A atividade da mitoPPX é estimulada

hidrolisando PoliP, evitando assim o acúmulo do polifosfato e liberando Pi, que na

presença de ADP forma o ATP. O ATP gerado será utilizado nas reações de

fosforilação ou em outras reações liberando ADP que juntamente com o equilíbrio do

transporte de elétrons através das membranas mitocondriais pela atividade das

enzimas da cadeia respiratória mitocondrial mantém o potencial de membrana

relativamente baixo e a capacidade do sistema antioxidante funcionando como um

processo preventivo na geração de EROs. No entanto, a cadeia de transporte de

elétrons mitocondrial também é uma fonte importante de produção de espécies

reativas de oxigênio (ERO) (COURT e COLEMAN, 2012; BROOKES, 2004).

O principal sítio de produção de energia na forma de ATP dentro das células

eucarióticas é a mitocôndria onde estão localizadas as enzimas da β-oxidação, ciclo

de Krebs, cadeia transportadora de elétrons e o complexo F1Fo-ATPsintase. Portanto,

radicais livres e EROs são constantemente formados em células vivas podendo

participar de funções fisiológicas fundamentais, tais como transdução de sinal e

resposta a patógenos (TONKS, 2005; SEGAL, 2005). Eles também podem ser

altamente tóxicos quando gerados em excesso, e têm sido implicados numa grande

variedade de condições patológicas. Aos mecanismos antioxidantes, tais como

eliminadores de radicais e enzimas antioxidantes têm sido atribuído um papel

essencial na proteção celular contra os danos dos radicais (GUTTERIDGE e

MITCHELL, 1999; MCCORD, 2002). Células que vivem em ambiente aeróbico

desenvolveram múltiplas formas de remover espécies reativas de oxigênio e, assim,

protegerem contra seus efeitos deletérios. Muitos destes mecanismos de proteção

50

contra EROs estão sendo caracterizados em artrópodes. Foi demonstrado em

diferentes espécies de insetos que a atividade antioxidante aumenta nos ovários para

proteger o embrião do dano oxidativo (PAES e OLIVEIRA, 2001; AHMED, et al. 2002;

FREITAS, et al. 2006, 2007).

Para manter o equilíbrio redox celular ideal, as células implementam uma

variedade de enzimas antioxidantes, incluindo catalase, glutationa peroxidase (GSH)

e superóxido dismutase (SOD) que eliminam o excesso de ERO (SON, Y. et al. 2013).

Primeiramente analisamos a atividade da enzima catalase no metabolismo

mitocondrial (mitoCAT) em adultos do T. castaneum, sabendo-se que a presença da

CAT em mitocôndrias é de grande importância, uma vez que a decomposição de H2O2

protege esta organela do H2O2 gerado no meio intra e extra mitocondrial (SALVI, et al.

2007). Avaliamos o papel dos polifosfatos de cadeia curta e longa sobre a mitoCAT,

(Figura 18) onde o PoliP3 conduziu um aumento significativo na atividade enzimática

nas concentrações 5, 10 e 15 mM se comparado ao controle, mostrando que a enzima

mitoCAT é ativada na presença de PoliP3 em maior quantidade com aumento da

concentração. A ação de enzimas que geram ADP manteria o ΔΨ menor e diminuiria

os níveis de EROs na mitocôndria. Sabe-se que a proporção de mitoHex que está

ligada a membrana mitocondrial externa é específica de cada tecido e

metabolicamente regulada (WILSON, 1997, 2003). Há uma tendência em aumentar

as quinases mitocondriais quando os níveis de atividade das peroxidases são baixos

indicando um mecanismo compensatório direcionado para evitar acúmulo de H2O2 na

mitocôndria, portanto, potencialmente prejudicando a geração de radicais hidroxil que

são altamente reativos e ainda uma afinidade aparente da mitocondrial pelo ADP em

bloquear a geração de H2O2, então a mitocôndria seria dependente da reciclagem do

ADP endógeno induzida por quinases (SANTIAGO, et al. 2008).

Da mesma forma, verificamos o papel da enzima mitoCAT no metabolismo

mitocondrial agora com adição de PoliP15, onde de acordo com a Figura 19, a

atividade enzimática demonstrou um pico de ativação na concentração específica de

15 mM se comparado ao controle, mostrando que polifosfato de cadeia longa também

foi capaz de gerar atividade da enzima antioxidante catalase se comparado ao

resultado quando o polifosfato utilizado foi o PoliP3 (Figura 18) ou seja, o tamanho do

polímero não influenciou na atividade da mitoCAT que mostrou afinidade por ambos

os polifosfatos.

51

Em mitocôndrias, a glutationa é reduzida na presença do NADPH. Assim, os

níveis de NADPH estão intimamente relacionados com a capacidade antioxidante

mitocondrial (KOWALTOWSKI, 2009). Com o objetivo de avaliar a atividade da enzima

antioxidante Glutationa redutase mitocondrial (mitoGR), realizamos o mesmo

experimento do realizado com a catalase mitocondrial, onde na Figura 20, utilizamos

como substrato da enzima, o PoliP3 que não foi capaz de ativar a ação enzimática

mostrando-se instável em relação ao controle. Seguindo a mesma linha de pesquisa,

utilizamos o PoliP15 como substrato da mitoGR e da mesma forma, o substrato de

cadeia longa não foi capaz também de ativar a ação enzimática comparando-se ao

controle (Figura 21). Nossos resultados indicam que a enzima antioxidante glutationa

redutase não apresenta função específica no metabolismo mitocondrial de polifosfatos

em adultos do besouro T. castaneum.

Em mitocôndrias de Drosophila por exemplo, o complexo I foi o ponto crítico da

produção de EROs e um nível relativamente pequeno de inibição é suficiente para

induzir uma maior geração de EROs, sugerindo que as mitocôndrias com uma parcial

deficiência do complexo I tendem a aumentar a geração do estresse oxidativo e a

sensibilidade a danos oxidativos ao mesmo tempo, levando ao desenvolvimento de

uma incompetência bioenergética (SIPOS, et al. 2003). Estudos recentes mostraram

que o complexo I foi inibido na presença do polifosfato em amostras mitocondriais do

R. microplus sugerindo que o complexo I seria o principal gerador de EROs do

carrapato bovino (FRAGA, 2013).

Como última enzima antioxidante testada, verificamos a atividade da mitoSOD,

que por meio da reação de dismutação, a superóxido dismutase (SOD) catalisa a

geração de peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio a partir do radical superóxido

(O2•). Assim, os níveis de NADPH estão intimamente relacionadas com a capacidade

antioxidante mitocondrial (KOWALTOWSKI, 2009). Essa enzima localiza-se na matriz

mitocondrial e sua ação permite a eliminação do O2• mesmo em baixas concentrações

e sua atividade aumenta com o estresse oxidativo. Ao analisarmos a atividade da

mitoSOD, nossos resultados foram completamente distintos dependendo do tamanho

do polifosfato. Quando o substrato enzimático utilizado foi PoliP3, a mitoSOD

demonstrou atividade em todas as concentrações testadas (Figura 22), mas quando

a mesma enzima foi analisada utilizando PoliP15 como substrato enzimático, nossos

resultados mostraram que não houve atividade da mitoSOD (Figura 23). A enzima

52

antioxidante mitoSOD foi modulada na presenta de PoliP3 mas não de PoliP15,

mostrando capacidade de atuar no sistema antioxidante funcionando como um

importante modulador prevenindo a geração de espécies reativas de oxigênio em

adultos do besouro T. castaneum através do polifosfato de cadeia curta.

53

7.CONCLUSÕES:

▪ A atividade da mitoPPX é regulada durante a respiração mitocondrial na

presença de ADP + Piruvato.

▪ KCN inibiu a atividade da mitoPPX, porém o efeito não foi observado quando

o gene da pirofosfatase foi silenciado. FCCP estimulou a atividade da

mitoPPX, o que antagonicamente aconteceu quando houve silenciamento.

▪ PoliP3 ativou a atividade da F1Fo-ATPase e também com o silenciamento

gênico. Já PoliP15 não ativou a F1Fo-ATPase sem e com silenciamento.

▪ Tanto a razão ATP/ADP quanto a razão NADH/NAD+ influenciaram a atividade

da mitoPPX.

▪ Acetil-CoA reduziu gradativamente a mitoPPX, já Glicose 6-P estimulou a

atividade da mitoPPX.

▪ Catalase demonstrou ativação por PoliP3 e 15.

▪ Glutationa Redutase não foi capaz de ser regulada por ambos polifosfatos.

▪ Superóxido Dismutase foi ativada somente por PoliP3.

Nossos resultados destacam a co-regulação no metabolismo de piro e

polifosfatos na atividade da PPX e F1Fo-ATPase sugerindo que não só a pirofosfatase

é uma enzima multifuncional, mas que a exopolifosfatase também apresenta

multifuncionalidade podendo atuar na degradação de pirofosfatos. Outro fator

considerável em nossa pesquisa foi o fato da enzima Catalase estar atuando

provavelmente como principal enzima antioxidante importante na prevenção de

espécies reativas de oxigênio no metabolismo mitocondrial do besouro adulto, praga

de grãos secundário, o Tribolium castaneum.

54

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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BIANCA FERNANDES MIRRA METABOLISMO ENERGÉTICO DE … · 2019. 8. 15. · iii Mirra, Bianca...

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