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BIANCA MARIA CERVO ROSSATO EFEITO DA LEDTERAPIA NO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS EM RATOS Londrina 2016
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BIANCA MARIA CERVO ROSSATO
EFEITO DA LEDTERAPIA NO PROCESSO DE
CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS EM RATOS
Londrina
2016
BIANCA MARIA CERVO ROSSATO
EFEITO DA LEDTERAPIA NO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS EM
RATOS
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado ao Colegiado de Odontologia
da Universidade Estadual de Londrina
Orientadora: Prof. Dra. Gislaine Garcia Pelosi Gomes
Londrina
2016
BIANCA MARIA CERVO ROSSATO
EFEITO DA LEDTERAPIA NO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS EM
RATOS
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado ao Colegiado de Odontologia
da Universidade Estadual de Londrina
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________ Orientadora: Prof. Dra. Gislaine Garcia Pelosi Gomes
Universidade Estadual de Londrina – UEL
_______________________________________ Prof. Dra. Andressa de Freitas Mendes Dionisio
Universidade Estadual de Londrina – UEL
Londrina, ______ de ___________ de _____.
AGRADECIMENTOS
Sou grata ao nosso Pai Celestial por sua proteção, por estar sempre comigo
e permitir que eu tivesse força e coragem para enfrentar todos os desafios que
encontrei no decorrer dos últimos cinco anos. Obrigada Deus!
Aos meus pais, Claudio e Clotilde, agradeço pela capacidade de acreditarem
e investirem em mim. Todo amor e carinho que vocês emitiram ao longo de minha
vida, se transformaram em perseverança para alcançar um sonho. O suporte de vocês
é imprescindível, espero, um dia, poder retribuir isso. Vocês são meus exemplos de
tudo o que há de bom no mundo!
Meus irmãos, Telton e Priscila, agradeço pelo apoio ao longo desta jornada.
Pelas visitas inesperadas, pelas conversas e conselhos. Vocês são pessoas
maravilhosas, em quem eu confio plenamente e desejo toda felicidade.
Douglas, amo partilhar a vida com você! Obrigada pela paciência e por seu
amor durante todo este período em que estivemos longe um do outro.
A minha super Orientadora, que me acolheu e me guiou ao longo deste
trabalho, obrigada pela sua dedicação, atenção e carinho para comigo. Assim como a
todo pessoal do “Lab da Gigi”, vocês são pessoas incríveis, foi um imenso prazer
trabalhar com vocês.
Amigos, vocês foram essenciais nas horas em que mais precisei, sou grata
pelas palavras de incentivo e pelos bons momentos juntos. Incluo aqui, as minhas
Irmãs, Tios e Tias da Ordem Internacional do Arco-Íris para Meninas, em especial da
Assembleia Rosa dos Ventos Nº 16, que me ajudaram a aprender que as tempestades
da vida chegarão, mas que com elas virá o Arco-Íris da vitória e todos os seus
ensinamentos baseados em fé, esperança e caridade.
Aos meus colegas e amigos da Turma 71, vocês se tornaram a minha família
de Londrina. Cada um com suas peculiaridades deixou algo de bom em minha vida.
Desejo sucesso para cada um de vocês.
Por fim, dedico esta conquista a minha Tia, Ruth Maria Cervo (in memorian),
que dedicou parte de sua vida para cuidar de mim e dos meus irmãos. De onde quer
que esteja, sei que sempre estará nos acompanhando e nos cuidando! Obrigada por
tudo.
“Não deixem que lhe façam pensar que você não é capaz de fazer algo porque essa
pessoa não consegue fazer. Se você deseja alguma coisa se quer realmente,
lute por isso e ponto final.” Will Smith, A Procura da Felicidade
ROSSATO, Bianca Maria Cervo. Efeito da LEDterapia no processo de cicatrização
de feridas em ratos. 2016. 30. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em
Odontologia) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2016.
RESUMO
A pele é considerada a primeira barreira de proteção do organismo contra a
atuação de agentes externos e por isso está sujeita a constantes agressões,
necessitando assim, de um processo regenerativo eficiente. Como método de auxílio
na cicatrização, há um recente progresso nas terapias a base de luz, e entre elas, a
fototerapia com LED, tem demonstrado efeitos cicatrizantes satisfatórios. Este
trabalho tem o propósito de avaliar o efeito da LEDterapia nos aspectos histológicos
e dimensionais da lesão em modelo de cicatrização em ratos. Para tanto, utilizou-se
doze ratos Wistar, os quais foram submetidos à uma excisão epitelial, na região dorsal,
de cerca de 4cm², e divididos nos seguintes grupos experimentais: Grupo Controle
(CTR): animais com a lesão que não receberam LEDterapia; Grupo LED-4J: animais
com lesão que receberam irradiação diária de 4J/cm²; Grupo LED-8J: animais com
lesão que receberam irradiação diária de 8J/cm². As aplicações de LED ocorreram,
diariamente, pelo período de sete dias. Imagens digitais foram feitas no primeiro e no
último dia do tratamento para análises qualitativas, e no 8º dia também foram
coletados fragmentos da periferia da lesão, os quais passaram pelo processamento
histológico de rotina para fabricação de lâminas histológicas, as quais foram coradas
pela técnica hematoxilina-eosina. Não foram observadas diferenças significativas
entre os grupos CTR, LED-4J e LED-8J, quando das análises quantitativas para
verificar a variação da área da lesão, a média de tecido de reparo e a contagem de
células inflamatórias. No entanto, foi possível observar qualitativamente maior
reepitelização nas bordas da lesão, crescimento de anexos cutâneos e avanço no
processo de diferenciação do tecido conjuntivo, quando comparados os grupos LED-
4 e LED-8 com o grupo CTR. Desta forma, o trabalho realizado sugere que, apesar
da avaliação histológica não mostrar diferença significativa, os achados qualitativos
sugerem um efeito positivo da fototerapia com LED no processo de reparo.
Palavras chave: Fototerapia, Cicatrização, Diodo Emissor de Luz, Regeneração
ROSSATO, Bianca Maria Cervo. Efeito da LEDterapia no processo de cicatrização
de feridas em ratos. 2016. 30. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em
Odontologia) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2016.
ABSTRACT
The skin is considered a first protective barrier body against a performance of
external agents and therefore it is subject to constant aggression, requiring thus an
efficient regeneration process. As a wound healing method, there is recente progress
in light-based therapies, and among them, LED photherapy has shown satisfactory
healing effects.This study evalued the effect of LED therapy on the histological and
dimensional aspects of the wound healing model in rats. Twelve Wistar rats were
submitted to epitelial excision in the dorsal region of about 4cm² and dived into the
following experimental groups: Control Group (CTR): animals with lesion thtat did not
receive LED therapy. LED-4J group: animals with lesion that received daily irradiation
of 4J / cm²; LED-8J group: animals with lesions that received daily irradiation of 8J /
cm². LED applications occurred daily for a period of seven days. Digital images were
taken on the first and last day of the treatment for qualitative analyzes and at the end
of the treatment fragments were collected from the periphery of the lesion, which
underwent routine histological processing for the manufacture of histological slides,
which were stained by hematoxylin- Eosin. No significant differences were observed
between the CTR, LED-4J and LED-8J groups when quantitative analyzes were
performed to verify the variation of the lesion area, mean repair tissue, and
inflammatory cell count. However, it was possible to qualitatively observe greater
reepithelialization at the edges of the lesion, growth of cutaneous appendages and
progress in the differentiation process of connective tissue, when the groups LED-4
and LED-8 were compared with the CTR group. Thus, the work performed suggests
that, although the histological evaluation did not show positive results, the qualitative
findings suggest a positive effect of LED phototherapy in the repair process.
Keywords: Phototherapy, Wound Healing, Light Emitting Diode, Regeneration.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C Graus célsius
µm Micrometro
cm Centímetro
cm² Centímetro quadrado
CTR Controle
DD Derme Diferenciada
DI Derme Indiferenciada
E Epitélio
EC Estrato Córneo
g Grama
HE Hematoxilina-Eosina
J Joule
Kg Quilograma
LASER Amplificação da Luz por Emissão Estimulada de Radiação
LED Diodo Emissor de Luz
mL Mililitro
mW Miliwatts
nm Nanômetro
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Fototerapia com LED. 16
Figura 2. Software ImageJ 1.50i. 18
Figura 3. Análise histológica qualitativa – HE. 19
Figura 4. Aspecto externo da lesão e da área circundante. 20
Figura 5. ∆ da área de lesão. 20
Figura 6. Média da área de tecido de reparo. 21
Figura 7. Contagem de células inflamatórias. 21
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 11
2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 15
3. METODOLOGIA ................................................................................................. 16
1.1 Animais .................................................................................................................. 16
1.2 Grupos Experimentais ........................................................................................... 16
1.3 Protocolo experimental .......................................................................................... 16
1.4 Fototerapia com LED ............................................................................................. 17
1.5 Coleta do material para análise: imagens digitais e fragmentos da lesão ............. 18
1.6 Preparação histológica .......................................................................................... 18
1.7 Análises e Softwares ............................................................................................. 18
4. RESULTADOS ................................................................................................... 20
1.8 Análise qualitativa .................................................................................................. 20
1.9 Análise quantitativa ................................................................................................ 21
5. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 24
6. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 27
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 28
ANEXOS ................................................................................................................... 30
11
1. INTRODUÇÃO
Responsável por revestir nosso corpo, a pele é composta por camadas distintas
em função e estrutura: epiderme, mais superficial, derme, subjacente a ela, e
hipoderme, responsável pela união aos órgãos adjacentes. Representa cerca de 16%
do nosso peso corporal, com variadas funções, atuando na termorregulação do
organismo, como órgão receptor sensitivo de calor, frio, dor e tato, impedindo a perda
de água e eletrólitos, agindo como isolante térmico e ainda é responsável pela
formação da vitamina D (SAMPAIO E RIVITTI, 2001; SILVERTHORN, 2010;
DALAGELO E FATTINI, 2002; JUNQUEIRA E CARNEIRO, 2013).
Além destas funções, é considerada como a primeira barreira de proteção do
organismo contra a atuação de agentes externos, devido a sua grande atividade
imunológica, e por isso está exposta a constantes agressões (DE OLIVEIRA; DIAS,
2012 ; SAMPAIO E RIVITTI, 2001) durante o decorrer da vida necessitando assim que
tenha a capacidade de efetuar um processo regenerativo eficiente (LINS et al., 2010).
As feridas são consideradas a interrupção da continuidade de um tecido, e
podem ser resultado de diversas eventualidades, como traumas e procedimentos
cirúrgicos. De acordo com Mandelbaum et al. (2003), elas podem atingir a espessura
parcial ou total da pele, acometendo apenas as camadas mais superficiais ou
estendendo-se ao tecido celular subcutâneo, respectivamente. Com o propósito de
restaurar o tecido lesado inicia-se o processo de reparo, que pode ocorrer por
reepitelização, no qual as células são substituídas por outras do mesmo tipo,
tornando-se imperceptível, ou então por reposição celular de outro tipo, que resulta
na cicatriz.
O processo de cicatrização é, didaticamente, dividido em fases, as quais levam
em consideração os aspectos macroscópicos e histológicos prevalentes em cada
uma. São elas: inflamação, proliferação e remodelagem. (BALBINO; PEREIRA; CURI,
2005; DE MENDONÇA; COUTINHO-NETTO, 2009; DE OLIVEIRA; DA CUNHA DIAS,
2012; MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003). É pertinente lembrar que
estas fases são interdependentes e temporais, fazendo com que este seja um
processo dinâmico.
12
Durante a primeira fase, inflamatória, ocorre a vasoconstrição e a hemostasia,
sendo esta dependente da atividade plaquetária e da cascata de coagulação. O dano
ao endotélio desencadeia uma sequência de eventos, que são responsáveis por
formar um tampão, rico em fibrina, que restabelece a hemostasia, atua como uma
matriz provisória para as células, e como barreira protetora. Ademais, são liberadas
substâncias que contribuem para a permeabilidade vascular, promovendo os típicos
sinais da inflamação, como dor, calor, rubor, edema e redução da função, e a migração
de células inflamatórias. (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005; DE MENDONÇA;
COUTINHO-NETTO, 2009; ISAAC et al., 2010)
Esta fase ainda se caracteriza, segundo De Oliveira et al. (2012), pela presença
de células inflamatórias, como leucócitos polimorfonucleares, macrófagos e linfócitos,
e a intensa migração celular. Essas células inflamatórias são responsáveis pela
fagocitose de bactérias e fragmentos presentes, bem como por produzir fatores de
crescimento que levam a fase proliferativa. (DE MENDONÇA; COUTINHO-NETTO,
2009).
A fase proliferativa evidencia a formação e proliferação do tecido de
granulação, o qual integra macrófagos, fibroblastos, colágeno, componentes
neovasculares e da matriz, e a deposição de nova matriz extracelular, pela deposição
de colágeno pelos fibroblastos. Após o fluxo sanguíneo e a oxigenação serem
restabelecidos, dá-se início a contração das bordas da ferida, realizada por
miofibroblastos, que fazem com que as fibras de colágenos entrelacem. (DE
MENDONÇA; COUTINHO-NETTO, 2009; DE OLIVEIRA; DA CUNHA DIAS, 2012;
ISAAC et al., 2010). Também durante a fase proliferativa ocorre a reepitelização, isto
é, queratinócitos migram em direção ao centro da lesão, separando tecido necrótico e
retomando a integridade epitelial (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005).
O último estágio, o de remodelação, acontece no colágeno e na matriz,
provê o aumento da resistência a tensão e pela diminuição do tamanho da cicatriz e
do eritema (MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003). A tentativa de
recuperação da estrutura é marcada pela maturação dos elementos, e alterações na
matriz extracelular. Há uma diminuição da atividade celular, e aumento da síntese do
colágeno tipo I. De forma gradual os feixes colágenos tornam-se espessos e mais
regulares. Com o andamento do processo, as células, em grande parte, desaparecem
13
e aumentam ainda mais a deposição de colágeno formando, então, o tecido cicatricial,
ou seja, a cicatriz. (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005; DE OLIVEIRA; DA CUNHA
DIAS, 2012)
O uso da LEDterapia, como método de auxílio na cicatrização, tem mostrado
progresso entre as terapias à base de luz (POSTEN et al., 2005). Os diodos emissores
de luz (LEDs) são dispositivos que convertem a corrente elétrica em espectro luminoso
e não coerente, e são utilizados com diferentes comprimentos de onda (DOURADO
et al., 2011; MEYER et al., 2010). Os aparelhos de LED vêm sendo utilizados em
substituição ao LASER (Amplificação da Luz por Emissão Estimulada de Radiação)
em decorrência do seu baixo custo e manuseio fácil, sendo a principal diferença entre
eles o fato da luz emitida pelo LED não ser colimada e nem coerente. (DOURADO et
al., 2011; MEYER et al., 2010; POSTEN et al., 2005). Sabe-se que a propriedade de
coerência é perdida durante a interação da luz com o tecido, não sendo este um fator
determinante para a fotoestimulação, sendo a luz LED tão eficiente quanto o LASER
(CHAVES et al., 2014).
Para que o LED promova um efeito biológico, é necessário que ocorra absorção
do seu feixe pelo tecido alvo, sendo as proteínas os componentes teciduais mais
relevantes para este processo (LINS et al., 2010). O mecanismo de ação da
fototerapia é baseado em reações fotobiológicas que envolvem a absorção de um
determinado comprimento de onda por moléculas fotorreceptoras específicas. Essas
reações são classificadas em primária, caracterizada pela interação da luz com a
molécula fotorreceptora, e secundária, que corresponde a fotorresposta, isto é, o
resultado fisiológico causado pela interação primária alterando a permeabilidade e o
metabolismo celular, a síntese DNA e RNA, a proliferação fibroblástica, entre outras
respostas a nível celular. (CHAVES et al., 2014)
Estudos têm sido realizados para melhorar a compreensão dos efeitos da
terapia com LED. Hoje, tem-se conhecimento de que ele atua na proliferação e
maturação celular, na quantidade de tecido de granulação, na proliferação de
fibroblastos e macrófagos, estimula uma maior taxa de produção de matriz extra
celular e promove a angiogênese. Além de possuir, de acordo com o comprimento de
onda utilizado, efeitos antimicrobianos, analgésicos e anti-inflamatórios (DE SOUSA
et al., 2013; DUNGEL et al., 2014; FERREIRA et al., 2013; NOGUEIRA et al., 2014;
14
POSTEN et al., 2005; SAMPAIO et al., 2013; SILVEIRA et al., 2009; SIQUEIRA et al.,
2009).
15
2. OBJETIVOS
Avaliar os efeitos da fototerapia com LED com dosagem de 4J e 8J, sobre o
processo de cicatrização de feridas em pele de ratos Wistar, por meio de análise da
lesão e a área circundante e análise histológica através do grau de diferenciação do
tecido conjuntivo, média da área de reparo e contagem de células inflamatórias.
16
3. METODOLOGIA
1.1 Animais
Para a realização do presente estudo foram utilizados 12 ratos Wistar (Rattus
norvegicus albinus), adultos, com peso médio entre 250 a 270 gramas, provenientes
do Biotério Central da Universidade Estadual de Londrina. Os animais foram
transferidos para o biotério setorial do Departamento de Ciências Fisiológicas da
Universidade Estadual de Londrina, onde permaneceram em gaiolas plásticas
individuais, forradas com cepilho, mantidas em ambiente controlado com temperatura
de 25 ± 1°C, ciclo claro/escuro de 12 horas, recebendo ração e água ad libitum. Os
procedimentos experimentais foram submetidos à apreciação e aprovação prévia do
Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Estadual de Londrina
(Protocolo Nº 213/2015).
1.2 Grupos Experimentais
Os animais foram divididos em três grupos experimentais:
Grupo controle (CTR): Animais que passaram pelo procedimento cirúrgico e
não receberam LED terapia (n=5).
Grupo LED-4J: Animais que passaram pelo procedimento cirúrgico e
receberam irradiação diária de 4J/cm² (n=5).
Grupo LED-8J: Animais que passaram pelo procedimento cirúrgico e
receberam irradiação diária de 8J/cm² (n=5).
1.3 Protocolo experimental
Inicialmente, os animais foram pesados, com uma balança digital, e
anestesiados com tribromoetanol (0,25g/Kg), com aplicação intraperitonial. Fez-se
então a tricotomia, com o auxílio de uma navalha, na região dorsal e assepsia da
área exposta com iodopolividona 10%. Em seguida, uma região circular com cerca
de 2cm de diâmetro e 4cm² foi demarcada, na qual foi feita a excisão cutânea com
o auxílio de um bisturi até a exposição da fáscia muscular. Passado o efeito
17
anestésico, os animais receberam o analgésico paracetamol (100mg/Kg) via
gavagem.
1.4 Fototerapia com LED
Para a realização da fototerapia com LED, utilizou-se um dispositivo com 10mW
de potência, comprimento de onda de 680nm, emitindo a luz visível na cor vermelha.
Os animais foram anestesiados antes de cada irradiação, utilizando o anestésico
tribromoetanol (0,25g/Kg), para facilitar a aplicação do LED.
A fototerapia iniciou logo após o ato cirúrgico e ocorreu diariamente, pelo período
de 7 dias, totalizando 7 sessões, realizados sempre em um mesmo período diário. A
ponta do aparelho foi posicionada a 90°, isto é, paralela à zona de tratamento, ficando
a uma distância de 1cm da lesão (Figura 1.). As doses de 4J ou 8J foram obtidas de
acordo com o tempo de aplicação por cm², sendo de 170 segundos e 340 segundos,
respectivamente. Durante a irradiação, o pesquisador utilizou equipamentos de
proteção individual.
Figura 1. Fototerapia com LED.
18
1.5 Coleta do material para análise: imagens digitais e fragmentos da lesão
Imagens digitais foram feitas no primeiro e um dia após o tratamento para a
realização da análise dimensional da área da lesão. Passados 7 dias do procedimento
cirúrgico, realizou-se a coleta do tecido, mediante bisturi, da periferia da lesão. Os
fragmentos foram armazenados em frascos apropriados com solução de Bouin e
devidamente identificados, para a fabricação das lâminas.
1.6 Preparação histológica
Após as amostras serem fixadas em Bouin por 48 horas, passaram pelo
processamento histológico de rotina: emblocadas em parafina, cortados com
micrótomo, com 7μm de espessura, e corados pela técnica Hematoxilina-Eosina.
Foram então analisadas em microscópio óptico, com aumentos de 4x e 10x.
1.7 Análises e Softwares
O software Motic foi utilizado para realizar a captura das fotomicrografias das
lâminas histológicas. Para a análise quantitativa das imagens, fez-se o uso do
programa ImageJ 1.50i, aplicando o recurso de desenho livre para a análise
dimensional da área da lesão e da proporção de tecido de reparo (Figura 2). Para a
contagem de células inflamatórias empregou-se o programa Image-Pro Plus 4.5.0.29.
A análise histológica qualitativa buscou a observação da área de tecido de reparo,
identificando epitélio, estrato córneo, derme diferenciada e derme indiferenciada. A
presença ou ausência destes foi relacionada com o grau do processo de cicatrização,
sendo eles: leve, na presença apenas de epitélio e derme indiferenciada; moderado,
na presença de epitélio, derme indiferenciada e estrato córneo; e avançado, na
presença de epitélio, derme indiferenciada, estrato córneo e derme diferenciada.
Ainda, observou-se por meio das imagens digitais, os aspectos externos da lesão e
da área entorno dela.
19
A análise estatística dos dados foi feita com o auxílio do GraphPad Prism 6.0. Os
resultados foram submetidos a uma análise descritiva a qual avaliou a normalidade e
homogeneidade de variância dos dados, complementada com o pós-teste de
Bonferroni. Os testes estatísticos foram aplicados apenas para as análises
quantitativas.
Figura 2. Software ImageJ 1.50i, exemplificando o uso do recurso desenho livre para realizar a análise
dimensional da área da lesão.
20
4. RESULTADOS
1.8 Análise qualitativa
Na análise histológica qualitativa, em que buscou-se observar o grau do
processo de cicatrização, pode-se notar que no grupo CTR estavam presentes nos
cinco animais apenas o epitélio e a derme indiferenciada, indicando um leve avanço
no processo de cicatrização (Figura 3. A). No grupo LED-4J, encontrou-se a presença
de epitélio, derme indiferenciada e estrato córneo, em quatro dos cinco animais,
indicando que um moderado avanço do processo de cicatrização (Figura 3. B), e em
um dos animais verificou-se a presença apenas do epitélio e da derme indiferenciada,
indicando um avanço leve. No grupo LED-8J, o processo de cicatrização mostrou-se
avançado em três dos cinco animais, verificando-se a presença do epitélio, derme
indiferenciada, estrato córneo e derme diferenciada (Figura 3. C). Nos outros dois, foi
observada a presença de epitélio, derme indiferenciada e estrato córneo, indicado um
moderado avanço no processo de cicatrização. (Figura 3.).
Figura 3 . Análise histológica qualitativa – HE – Aumento 4X .A) Exemplar do grupo CTR, indicando leve
avanço no processo de cicatrização. B) Exemplar do grupo LED-4J, indicando moderado avanço no processo de
cicatrização. C) Exemplar do grupo LED-8J, indicando avançado processo de cicatrização. E= Epitélio, EC= Estrato
Córneo, DI= Derme Indiferenciada, DD= Derme Diferenciada.
Na avaliação dos aspectos externos da lesão e da área circundante, observou-
se a presença parcial ou total de crosta dos animais do grupo CTR e o não
crescimento de pelo, assim como a ausência de margem de reepitelização. De
maneira oposta, nos grupos LED-4J e LED-8J foi possível observar a presença da
21
crosta por toda área da lesão, o crescimento de pelos na área circundante e a
presença da margem de reepitelização (Figura 4.).
Figura 4. Aspecto externo da lesão e da área circundante. A) Exemplar do grupo CTR. B) Exemplar do grupo LED-
4J. C) Exemplar do grupo LED-8J. Seta amarela= margem de reepitelização.
1.9 Análise quantitativa
A partir das imagens digitais e da fotomicrografia das lâminas histológicas
(aumento de 4X), foram feitas as análises dimensionais da área de proporção de
tecido de reparo e da área da lesão, respectivamente. Não foram observadas
diferenças significativas na análise da área da lesão entre os grupos CTR, LED-4J e
LED-8J, p>0,05. (Figura 5).
22
Figura 5. ∆ da área da lesão, expressa em cm². Dados expressos em média ± erro padrão. (ANOVA de uma via,
p>0,05).
Também não se encontrou diferença significativa na média da área do tecido de
reparo entre os grupos CTR, LED-4J e LED-8J, p>0,05. (Figura 6.)
Figura 6. Média da área de tecido de reparo dos grupos CTR, LED-4J e LED-8J. Dados expressos em média ±
erro padrão.(ANOVA de uma via, p>0,05).
Na contagem de células inflamatórias também não foi possível verificar
diferença significativa entre os grupos CTR, LED-4J e LED-8J (Figura 7.).
23
Figura 7. Contagem de células inflamatórias em animais dos grupos CTR, LED-4J e LED-8J. Dados expressos
em média ± erro padrão. (ANOVA de uma via, p>0,05).
24
5. DISCUSSÃO
O resultado da análise histológica qualitativa mostrou que a fototerapia com LED,
nos grupos LED-4J e LED-8J, repercutiu de maneira positiva na diferenciação do
tecido conjuntivo na derme. Os LED são capazes de promover alterações
bioquímicas, bioelétricas e bioenergéticas, aumentando o metabolismo, a proliferação
e a maturação celular, bem como na quantidade de tecido de granulação e na
diminuição de mediadores inflamatórios, impulsionando o processo de cicatrização
(LINS et al., 2010). Conforme Junqueira e Carneiro (2013), a derme é basicamente
constituída por elementos fibrilares, como o colágeno e a elastina, elementos da
matriz extracelular, pequenos vasos sanguíneos e anexos cutâneos. Nogueira et al.
(2014), observaram o remodelamento inicial das fibras colágenas nos grupos tratados
com a fototerapia após 7 dias de irradiação, enquanto no grupo controle, este ainda
estava ausente. Resultado semelhante foi encontrado no estudo de Ferreira et al.
(2013), no qual no grupo de animais que receberam a fototerapia foi observada uma
maior densidade do tecido conjuntivo, isto é, um aumento da síntese de colágeno.
Da mesma forma, na observação dos aspectos externos da lesão, foi possível
verificar um resultado positivo na existência da margem de reepitelização e da crosta,
como também o crescimento de pelos dos grupos que receberam a fototerapia. As
células do epitélio começam a proliferar-se rapidamente a partir das bordas da ferida,
estimuladas por fatores de crescimento liberados, principalmente, por macrófagos
(ABREU et al., 2011). Meyer et al. (2010), após realizarem o fototerapia com LED de
luz visível vermelha, mesmo espectro utilizado no presente estudo, observou uma
maior área de reepitelização nas margens da ferida quando comparado aos grupos
controle, animais que não receberam fototerapia, e LED verde, animais que
receberam LEDterapia com luz visível verde, corroborando nossos resultados.
Em conformidade com os dados apresentados por Borges (2000) a crosta sero-
hemática se forma de maneira natural em feridas expostas, isto é, sem o uso de
membranas sintéticas e atua como uma barreira física de proteção. Contudo, a sua
presença é questionável visto que ela impede que seja mantida a umidade fisiológica
da lesão, a qual favorece o processo de reepitelização, pois feridas ressecadas
acabam por perder o fluido rico em fatores de crescimento responsáveis por estimular
este processo. Nogueira et al. (2014), concluiram que a utilização de um curativo
25
semipermeável, que impede a formação da crosta, associado a fototerapia com LED
foi mais eficaz para otimizar a cicatrização de feridas cutâneas em rato quando
comparado a apenas a fototerapia com LED.
Ainda, em um trabalho de Endre Mestes, da década de 1960, citado por
Dourado et al. (2011) no qual se desejava verificar o potencial carcinogênico do laser
de baixa potência em ratos, observou apenas o aumento do crescimento de pelos
cortados, sendo essa a primeira evidência da fotobioestimulação por meio de
fototerapia. Isto entra em concordância com os resultados que obtivemos.
Em nosso estudo, não foi possível verificar alterações estatísticas significativas
na variação da área da lesão e a média da área de tecido de reparo entre os grupos
CTR, LED-4J e LED-8J, o que diverge dos resultados encontrados no experimento
realizado por Gomes et al. 2016, o qual demonstrou que 7 dias de fototerapia com
LED induziram uma significativa redução na área da ferida, utilizando uma dosagem
de 1,6J/cm². A proliferação epitelial e fibroblástica e a alta síntese de colágeno, são
as principais alterações a nível histológico observadas em feridas que recebem a
fototerapia; contudo, para que a camada tecidual a ser atingida pela luz exerça o efeito
biológico desejado dependerá do tipo de luz, da sua potência, do comprimento de
onda e do tempo de exposição (LINS et al., 2010). Em outro estudo, Nogueira et al.
(2014) constataram que a fototerapia com LED (640± 20nm), com uma dose de
16J/cm², reduziu significativamente a área da lesão após 7, 14 e 21 dias de
tratamento. Na cicatrização de feridas, a proliferação celular se inicia a partir das
bordas da lesão com direção ao centro, contudo, com o uso do LED altera-se a
disponibilidade de oxigênio e de nutrientes no centro da lesão, favorecendo a
neovascularização, e a proliferação de fibroblastos, responsáveis pela produção do
colágeno. (NOGUEIRA, et al., 2014)
Os neutrófilos são os primeiros a chegarem ao local da lesão, além da função
fagocitária, liberam enzimas que atrairão outras células inflamatórias para formar o
tecido de granulação. A inflamação pode ser dividida em padrões crônico e agudo. No
primeiro, a caracterização é feita pela presença de linfócitos e macrófagos,
proliferação de vasos sanguíneos e de tecido conjuntivo e tem uma maior duração. O
segundo é resposta imediata, onde há alteração no calibre e permeabilidade vascular
(CONRADO, 2010). A maior contagem de células inflamatórias aponta um maior
26
tempo de inflamação, significando maior o tempo para passar para as próximas etapas
do processo de cicatrização (MEYER et al., 2010). Nos resultados obtidos em nosso
experimento não obtivemos diferenças significativas da contagem de células
inflamatórias entre os grupos CTR, LED-4J e LED-8J. Os resultados de Ferreira et al.,
2013, coincidem com os resultados de nosso estudo, pois também não observaram
diferenças significativas na contagem de células inflamatórias entre os grupos LED e
controle, em 3 e 7 dias. Em contrapartida, no estudo supracitado de Nogueira et al.
(2014) a análise da população de células inflamatórias na área da lesão após 7 dias
de irradiação, mostrou diferenças significativas entre os grupos irradiados com LED
com e sem o uso do curativo semipermeável, onde o grupo com o curativo apresentou
menor número de células inflamatórias. Após 14 dias, foi possível verificar a
diminuição do número de células inflamatórias também no grupo tratado com LED em
relação ao grupo controle. Além da avaliação dos aspectos neste trabalho citados,
estudos tem demonstrado a efetividade do uso da terapia LED na promoção da
angiogênese, como mostra De Sousa et al. (2013) em que o uso de três comprimentos
de onda diferentes, entre eles o LED vermelho, aumentou significativamente a
angiogênese quando comparado ao grupo controle.
Os estudos presentes na literatura demonstravam que a fototeparia com LED
tem efetividade no processo de cicatrização, sendo benéfica em todas as fases.
Apesar do comprimento de onda, tempo e dose de aplicação serem controversos,
assim como os achados histológicos, os achados clínicos são certamente favoráveis
a cicatrização. Sendo assim, estudos mais aprofundados, devem ser realizados para
que seja possível estabelecer um protocolo padrão para a aplicação do LED, visando
a sua aplicabilidade clínica no auxílio da cicatrização de feridas.
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6. CONCLUSÃO
Baseando-se nos resultados encontrados com a realização deste trabalho,
conclui-se que a fototerapia com LED apresenta efeito sobre o processo de
cicatrização no que tange a diferenciação do tecido conjuntivo, a reepitelização das
bordas da ferida e a fotobioestimulação da área circundante a lesão, caracterizada
pelo crescimento de pelos. Assim, podemos sugerir que a aplicação da LEDterapia
pode auxiliar o processo de cicatrização de maneira benéfica.
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ANEXOS
Anexo A
Parecer do Comitê de ética em Pesquisa Animal
