Bifidobacterium lactis “IN VIVO” EM PACIENTES COM … · Prof. Dr. Isaías Dichi. ... avaliados...

Londrina

2014

LUCIANA JESUS BERNINI

CENTRO DE CIENCIAS AGRÁRIAS

MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO LEITE E DERIVADOS

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL IMUNOMODULADOR DE

Bifidobacterium lactis “IN VIVO” EM PACIENTES

COM SÍNDROME METABÓLICA

i





Dissertação apresentada como requisito parcial

para obtenção do título de mestre em Ciência e

Tecnologia do Leite e Derivados.

Orientadora: Profa. Dra. Giselle A. Nobre Costa

Co-orientadora: Profa. Dra. Cínthia Hoch Batista

de Souza

Londrina

2014

ii

AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Dados Internacionais de catalogação-na-publicação Universidade Norte do Paraná

Biblioteca Central

Setor de Tratamento da Informação

Bernini, Luciana Jesus.

B448a Avaliação do potencial imunomodulador do Bifidobacterium

lactis “in vivo” em pacientes com síndrome metabólica / Luciana

Jesus Bernini. Londrina : [s.n], 2014.

viii; 55f.

Dissertação (Mestrado). Ciência e Tecnologia do Leite.

Universidade Norte do Paraná.

Orientador: Profº. Drª Giselle A. Nobre Costa

1- Ciência e tecnologia do leite e derivados - dissertação de

mestrado - UNOPAR 2- Probiótico 3- Bifidobactéria 4-

Trato gastrointestinal 5- Imunomodulação 6- Obesidade I- Costa,

Giselle A. Nobre, orient. II- Universidade Norte do Paraná.

CDU 637.1

iii





Dissertação apresentada à UNOPAR – Unidade Piza, Centro de Pesquisa em Ciências

Agrárias como requisito parcial para a obtenção do título de mestre em Ciência e Tecnologia do Leite e Derivados, conferido pela banca examinadora constituída pelos

professores:

Profª. Drª. Giselle A. Nobre Costa

Universidade Norte do Paraná - Orientadora

Profª. Drª. Elsa Helena Walter de Santana

Universidade Norte do Paraná - Membro

Prof. Dr. Isaías Dichi.

Universidade Estadual de Londrina - Membro

Londrina, 25 de Agosto de 2014.

iv

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus por me impulsionar a trilhar novos caminhos, por cuidar de

mim com tanto carinho e ser presença viva em minha vida.

Ao meu esposo Paulo Vinícius pelo amor, compreensão, paciência, por acreditar

em mim, por estar sempre ao meu lado me incentivando e principalmente por me ajudar a

chegar até aqui. Obrigado por aguentar comigo todo sofrimento, todas as renúncias...

Valeu a pena esperar... Hoje estamos colhendo, juntos, os frutos do nosso empenho! Esta

vitória também é sua!!! Te amo.

Aos meus filhos Maria Fernanda e Vinícius que me fazem esquecer qualquer

problema e dificuldade. É por vocês que procuro ser melhor a cada dia.

Aos meus pais Mauricio e Maria de Lourdes por me ensinarem a cada dia ser uma

pessoa melhor e pelo apoio incondicional neste e em todos os momentos da minha vida.

Além da ajuda incansável da minha mãe em me ajudar a cuidar da minha filha. Mãe te amo

e obrigado por tudo.

A minha irmã Luana e cunhado Victor pela amizade única e suporte indispensável

para eu alcançar meus sonhos.

A minha orientadora, Profa. Dr

a. Giselle Nobre Costa, pela orientação, incentivo,

ensinamento, paciência, amizade, disponibilidade e confiança em mim.

A minha co-orientadora, Profa. Dr

a.Cinthia H. B. de Souza, pela orientação,

disponibilidade, carinho, amizade e atenção.

A todos que contribuíram para o desenvolvimento deste projeto, em especial,

Profa Dr

a. Andréa Name pela colaboração fundamental em disponibilizar o Laboratório de

Imunologia e Análises Clínicas do Hospital Universitário da Universidade Estadual de

Londrina (HU/UEL).

Ao Dr. Isaías Dichi e Dra. Elsa H. W. de Santana pelas valiosas correções e

sugestões neste trabalho.

A todos os funcionários do Posto de Saúde central da cidade de Jatazinho, em

especial ao secretário de saúde Ricardo Alexandre Corsino e a técnica de enfermagem

Wilma Batista, obrigado pelo carinho e colaboração.

Aos amigos do Laboratório, pelos bons momentos, convivência agradável e

auxilio durante estes anos.

A todos os professores que foram muito importantes para o meu aprendizado no

decorrer dessa trajetória acadêmica e conclusão desse curso.

v

Aos participantes do grupo voluntario da pesquisa que, com dedicação e carinho,

contribuíram para o sucesso desse estudo.

vi

A felicidade nos mantêm doces.

Dores nos mantêm humanos.

Quedas nos mantêm humildes.

Sucessos nos mantêm brilhando.

Provações nos mantêm fortes.

Mas somente Deus nos mantêm prosseguindo...

(Autor desconhecido)

vii

BERNINI, Luciana Jesus. Avaliação do potencial imunomodulador do Bifidobacterium

lactis “in vivo” em pacientes com síndrome metabólica. 2014. 56 f. Dissertação

(Mestrado Acadêmico em Ciência e Tecnologia do Leite e Derivados) – Centro de

Ciências Agrárias, Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2014.

RESUMO

A literatura científica relata muitos estudos tratando do benefício de microrganismos

probióticos sobre o organismo humano e animal. Dentre esses efeitos, a capacidade de

modular o sistema imunológico e incrementos no tratamento de várias disbioses são

relatados. Este projeto teve como objetivo, produzir um leite probiótico contendo

Bifidobacterium lactis HN019, introduzi-lo na dieta de um grupo de 26 voluntários

humanos caracterizados como portadores de síndrome metabólica (SM). Posteriormente,

os efeitos do probiótico foram avaliados durante o consumo por 0 e 45 dias do tratamento e

comparados à dados de um grupo controle não tratado (25 indivíduos) com síndrome

metabólica (SM). O leite probiótico foi produzido com 8% (P/V) de leite em pó desnatado

reconstituído, 6% (P/V) sacarose, esterilizado a 121ºC/15 min., resfriado à 42°C e

adicionado de 10% (V/V) de inóculo. O produto foi caracterizado físico-quimica e

microbiologicamente de acordo com a Legislação vigente. Paralelamente, a vida de

prateleira do produto pronto para consumo foi avaliada durante 30 dias sob armazenamento

refrigerado (5ºC). Todas as análises físico-químicas e microbiológicas foram efetuadas em

triplicata. Após o cultivo durante 18 h, o produto foi resfriado lentamente à 5ºC,

adicionado de 0,01% (V/V) de aroma de laranja e/ou baunilha e envasado assepticamente.

Os voluntários do grupo tratado receberam diariamente 80 mL do leite probiótico,

contendo em média 3,4 x108 UFC/mL de B. lactis. O produto pronto para o consumo

apresentou acidez titulável de 0,4% de ácido láctico, pH de 5.2, ausência de coliformes

totais e/ou termotolerantes e de bolores e leveduras. Os efeitos do probiótico foram

avaliados em amostras de sangue do grupo controle e do grupo tratado a partir de dados

antropométricos: Índice de massa corporal, Circunferência abdominal, Pressão Arterial

sistólica e Diastólica, triacilglicerídeos, Colesterol, glicose, Insulina e Índice de resistência

à Insulina (HOMA) nos tempos zero e 45 dias de consumo. Dentre os parâmetros

avaliados foi observado redução significativa (p<0,05) do índice de massa corporal (IMC),

colesterol total e LDL (Low Density Lipoprotein), evidenciando o efeito de HN019 sobre

parâmetros da SM. Adicionalmente, também ocorreu a redução das citocinas TNF- (Fator de Necrose Tumoral Alfa) e de interleucina IL-6, ambos mediadores da imunidade inata,

um efeito sobre o sistema imunomodulador. Os dados obtidos, embora preliminares,

sugerem que intervenções clínicas com o uso de algumas linhagens probióticas, podem

alterar positivamente a saúde da população em estudo e evidenciam a importância da

compreensão destes efeitos na evolução da SM.

Palavras-Chave: Probiótico. Bifidobactéria. Trato gastrointestinal. Imunomodulação.

Obesidade.

viii

BERNINI, Luciana Jesus. Avaliação do potencial imunomodulador do Bifidobacterium

lactis “in vivo” em pacientes com síndrome metabólica. 2014. 56 p. Dissertação

(Mestrado Acadêmico em Ciência e Tecnologia do Leite e Derivados) – Centro de

Ciências Agrárias, Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2014.

ABSTRACT

The scientific literature has reported many studies relating the beneficial role of probiotic

on human and animal organisms such as the ability to modulate the immune system and to

improve the treatment of various disbioses. This project aimed to produce a probiotic milk

containing Bifidobacterium lactis HN019 and to introduce it in the diet of 26 human

volunteers characterized as having metabolic syndrome (MetS). Then the effects of

probiotic were evaluated during consumption for 0 and 45 days. The data were compared

to those of untreated control group (25 subjects) with MetS. The probiotic milk was

produced with 8% (w / v) skimmed milk powder, 6% (W/V) sucrose, sterilized at 121 ° C /

15 min. Cooled to 42°C and added with 10% inoculum (V/V). The product was

characterized physico-chemically as well and microbiologically in accordance with current

Brazilian Laws. The shelf-life of the product was evaluated for 30 days under refrigerated

storage (5 ° C). All the physicochemical and microbiological analyzes were performed in

triplicate. After culturing for 18 h, the product was slowly cooled to 5° C, added with

0.01% (v / v) of orange and/or vanilla flavor and packed aseptically. Volunteers treated

group received daily 80 mL of probiotic milk containing on average 3.4 x108 CFU/mL of

B. lactis. The final product showed titratable acidity of 0.4% (lactic acid), pH of 5.2,

absence of total and / or fecal coliforms as well yeasts and molds. The effects of the

probiotic were assessed in blood samples from the control group and the group treated

based on anthropometric data: Body mass index, Waist circumference, Systolic and

Diastolic blood pressure, Triglycerides, Cholesterol, Glucose, Insulin and Insulin

resistance index (HOMA) in zero and 45 days of consumption. It has been observed

significant reduction (p <0.05) in body mass index (BMI), total cholesterol and LDL (Low

Density Lipoprotein) showing the effect of HN019 on the MetS parameters. Additionally,

there was a reduction of mediators of innate immunity, cytokines TNF- (Tumor Necrosis

Factor alpha) and interleukin IL-6, indicating a effect on the immune modulatory system.

These data, although preliminary, suggest that clinical interventions such as the use of

probiotic strains could positively change the health of the population under study and

demonstrate the importance of understanding these effects in the evolution of MetS.

Keywords: Probiotic. Bifidobacteria. Gastrointestinal tract. Immunomodulation. Obesity.

ix

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1

1.1 OBJETIVOS .................................................................................................................. 2

1.1.1 Objetivo Geral............................................................................................................ 2

1.1.2 Objetivos Específicos ................................................................................................ 2

2 FUNDAMENTAÇAO TEÓRICA .......................................................................... 3

2.1 MICRORGANISMOS PROBIÓTICOS ................................................................................ 3

2.1.1 Gênero Bifidobacterium ............................................................................................. 4

2.1.2 Bifidobacterium lactis ................................................................................................ 6

2.2 APLICAÇÃO EM ALIMENTOS ....................................................................................... 6

2.3 LEITE PROBIÓTICO X LEITE FERMENTADO ................................................................. 7

2.4 TRATO GASTROINTESTINAL (TGI) ................................................................................ 8

2.5 SÍNDROME METABÓLICA (SM) ................................................................................. 10

2.5.1 Efeito de Microrganismos Probióticos Sobre o Sistema Cardiocirculatório ........... 11

2.5.2 Efeitos de Microrganismos Probióticos no Sistema Imunomodulador .................. 12

REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 15

3 ARTIGO 1 - PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO LEITE

PROBIÓTICO ....................................................................................................... 22

4 ARTIGO 2 - EFEITOS DE Bifidobacterium lactis HN019 NA MASSA

CORPORAL, METABOLISMO GLICÍDICO, LIPIDICO E MARCADORES

INFLAMATÓRIOS EM PACIENTES COM SINDROME METABÓLICA . 32

5 CONLUSÕES GERAIS E ÉRSPECTIVAS ............................................................... 46

ANEXOS ................................................................................................................. 47

Anexo 1 - Aprovação do Comitê de Ética .............................................................. 48

1

1. INTRODUÇÃO

O interesse pelo tema probiótico, assim como pelos alimentos funcionais de

maneira geral, está diretamente relacionado à crescente valorização da qualidade de vida e da

prevenção de doenças. Estudos visando a avaliação e comprovação dos efeitos de

microrganismos probióticos em humanos tornam-se um importante alvo de pesquisas, pois

permite, tanto à área de ciência e tecnologia de alimentos como às áreas clínicas, fornecerem

ao consumidor alimentos que aliam a saúde aos hábitos alimentares.

A síndrome metabólica (SM), bem como as doenças ocasionadas em

decorrência desta patologia, é cada vez mais frequente na sociedade atual e é caracterizada

por um conjunto de desordens que incluem fatores de risco metabólicos como a dislipidemia

aterogênica (hipertrigliceridemia, níveis elevados de apolipoproteína B, partículas pequenas e

densas de LDL-colesterol e níveis baixos de HDL-colesterol), hipertensão arterial,

hiperglicemia e um estado pró-inflamatório e pró-trombótico (GRUNDY, et al., 2005). As

características desta doença são diversas e refletem diretamente na qualidade de vida do

indivíduo portador.

A prevenção ou o tratamento dos sintomas da SM utilizando alimentos

funcionais, como aqueles adicionados de microrganismos probióticos, podem ser uma

alternativa viável, já que cada vez mais estudos da modulação da microbiota intestinal são

associados ao metabolismo lipídico, a redução de risco de doenças cardiovasculares e

portanto, à redução e/ou prevenção de SM.

Culturas probióticas têm sido adicionadas em alimentos para conferir

propriedades funcionais e tecnológicas. Bactérias pertencentes aos gêneros Lactobacillus e

Bifidobacterium são mais frequentemente empregadas como suplementos probióticos para

alimentos, uma vez que elas têm sido isoladas do trato gastrintestinal humano saudável

(SAAD, 2006). Pode-se afirmar que, uma linhagem probiótica irá desempenhar melhor seu

efeito benéfico quando estiver em ambiente similar àquele no qual foi isolado, visto que é

geralmente hospedeiro-específica. Portanto, as linhagens probióticas que devem ser

empregadas em produtos lácteos são de origem humana, em função da boa capacidade de

adaptação as necessidades fisiológicas do hospedeiro comparadas com linhagens isoladas de

outros ambientes.

No mercado mundial atual, os leites fermentados são os principais produtos

comercializados com alegação de promover a saúde, entretanto, sobremesas a base de leite,

2

leite em pó destinado a recém-nascidos, sorvetes, maionese, diversos tipos de queijos e

alimentos de origem vegetal fermentados também são utilizados (GOMES; MALCATA,

1999; SHAH, 2007).

Produtos diferenciados tecnológica e sensorialmente e com alta viabilidade

do probiótico utilizado podem ser uma inovação no mercado de produtos lácteos. A aplicação

destes em estudos clínicos é uma ferramenta bastante interessante e vem sendo utilizada com

frequência para comprovação dos efeitos de linhagens potencialmente probióticas. Os dados

oriundos destes estudos possibilitam o entendimento dos modos de ação destes

microrganismos e seus efeitos fisiológicos na saúde humana.

1.1 OBJETIVOS

1.1.1 Objetivo Geral

Avaliar os efeitos de um leite probiótico contendo Bifidobacterium lactis

sobre o metabolismo lipídico, glicídico e o sistema imunomodulador de um grupo de

voluntários humanos portadores de síndrome metabólica.

1.1.2 Objetivos Específicos

Produzir e caracterizar um leite probiótico contendo B. lactis e introduzí-lo

na dieta de grupos de voluntários humanos;

Avaliar a capacidade deste probiótico em incrementar o sistema

imunomodulador, via resposta inespecífica, humoral e celular em amostras sanguíneas;

Avaliar os efeitos deste probiótico sobre parâmetros característicos da

síndrome metabólica;

3

2. FUNDAMENTAÇAO TEÓRICA

2.1 MICRORGANISMOS PROBIÓTICOS

Fuller (1989) definiu probiótico como suplemento alimentar a base de

microrganismos vivos, com efeito benéfico ao hospedeiro por equilibrar a sua microbiota

intestinal.

Lactobacillus e Bifidobacterium são os gêneros mais frequentemente

empregadas como suplementos probióticos para alimentos. Estes microrganismos necessitam

possuir algumas características para serem classificados como probióticos, a saber: ausência

de toxicidade ou patogenicidade, propriedades adequadas a fim de que sejam produzidos e

incorporados em alimentos sem perder sua viabilidade e funcionalidade durante a vida útil do

produto, habilidade de sobreviver às defesas inatas no trato gastrintestinal, incluindo

sobrevivência à acidez gástrica e aos sais biliares; habilidade de colonizar a mucosa intestinal

e capacidade de exercer efeito de melhoria da saúde do hospedeiro (O’MAY;

MACFARLANE, 2005).

Para exercer um impacto benéfico à saúde, a concentração de probióticos no

produto deve atingir níveis adequados (DONKOR et al., 2007; LOURENS-HATTINGH;

VILJEON, 2001). Shah (2000) sugere um mínimo de 106

UFC/mL, mas recomenda 108

UFC/mL para compensar a redução que acontece no número de microrganismos viáveis

durante a passagem pelo trato gastrointestinal. De acordo com a legislação brasileira vigente,

a quantidade mínima viável para caracterização de um alimento como probióticos deve estar

na faixa de 108a 10

9 UFC na porção diária recomendada (BRASIL, 2008).

Microrganismos probióticos apresentam bons efeitos nas diarreias virais,

pois parecem aumentar a quantidade de IgA diminuindo a disseminação viral (BENCHIMOL;

MACK, 2004). Outra forma de ação é a sua ligação às células epiteliais do intestino, onde

competem por nutrientes e sitio de adesão com bactérias patogênicas e vírus impedindo-os de

se instalarem (DODD; GASSON, 1994; O’SULLIVAN et al.,1992).

Controle e estabilização da microbiota intestinal após o uso de antibióticos,

promoção da resistência gastrointestinal à colonização por patógenos, promoção da digestão

da lactose em indivíduos intolerantes são alguns dos benefícios à saúde do hospedeiro

atribuídos à ingestão de culturas probióticas. Outros efeitos atribuídos a essas culturas são a

diminuição do risco de câncer de cólon e de doença cardiovascular. É sugerida, também, a

4

diminuição das concentrações plasmáticas de colesterol, efeitos anti-hipertensivos, redução da

atividade ulcerativa de Helicobacter pylori, controle da colite induzida por rotavírus e por

Clostridium difficile, prevenção de infecções urogenitais, além de efeitos inibitórios sobre a

mutagenicidade (CHARTERIS; KELLY; MORELLI., 1998; JELEN; LUTZ, 1998; KAUR;

CHOPRA; SAINI, 2002; KLAENHAMMER, 2001; LYE et al., 2009; SHAH;

LANKAPUTHRA, 1997; TUOHY et al., 2003).

Atualmente, muitos estudos ilustram a efetividade de ação de alguns

microrganismos probióticos na saúde do hospedeiro, em geral estes benefícios são associados

primariamente à ingestão de microrganismos viáveis que induzem modificações e influências

positivas no intestino. Alguns dos benefícios estão devidamente documentados, enquanto

outros têm demonstrado resultados promissores em estudos com animais. Contudo, estudos

adicionais necessitam ser realizados com humanos para sustentar tais alegações (KWON et

al., 2010; LYE et al., 2009; SHAH, 2007).

Efeitos sobre o sistema imunomodulador e cardiovascular de probióticos em

humanos são alvos de estudos e, embora nem todos os mecanismos de ação sejam bem

esclarecidos, as evidências acumuladas sobre os benefícios decorrentes do uso dos probióticos

justificam o aprofundamento destes estudos (COPPOLA; TURNES, 2004; CROSS, 2002;

KWON et al., 2010). Adicionalmente, é importante salientar que nem todos os probióticos são

efetivos para todas as funções, e é necessário considerar as variações existentes entre as

diferentes espécies e linhagens com relação à funcionalidade (CRITTENDEN et al., 2005;

PINEIRO; STANTON, 2007).

2.1.1 Gênero Bifidobacterium

As bifidobactérias foram isoladas e descritas pela primeira vez, em 1899,

por Tissier, sendo denominadas de Bacillus bifidus communis. O gênero Bifidobacterium sp.

foi proposto originalmente por Orla-Jensen, em 1924, mas somente em 1986 foi aceito e

reconhecido como gênero independente na oitava edição do Manual Bergey’s (TESHIMA,

2001). Caracterizam-se, em geral, como microrganismos Gram-positivos, não formadores de

esporos, desprovidos de flagelos, catalase-negativos e anaeróbios, podem apresentar formas

variadas que incluem bacilos curtos e curvados a bacilos bifurcados (HOLT et al., 1994). A

temperatura ótima de crescimento abrange de 37ºC a 42ºC, não havendo crescimento em

temperaturas abaixo de 25-28ºC e acima de 43º-45ºC (SCARDOVI, 1986).

5

Diferem das bactérias lácticas homo e heterofermentativas na forma de

fermentação da glicose, que ocorre pela via frutose-6-fosfato, produzindo ácido acético e

ácido láctico na forma L(+) na proporção molar de 3:2, respectivamente, A presença de

frutose-6- fosfato- fosfocetolase (F6PPK) distingue o gênero de outros do grupo. Essa enzima

quebra a frutose-6- fosfato em acetil-fosfato e eritrose-4-fosfato, sendo o único gênero

bacteriano de origem intestinal que apresenta essa via fermentativa conhecida como “via

bífida” (MODLER; McKELLAR; YAGUCHI, 1990). Todas as espécies fermentam glicose,

galactose, frutose e lactose, com exceção de B. gallicum que não utiliza lactose. Mais de 30

espécies já foram identificadas, sendo 11 isoladas do trato gastrointestinal humano (WARD;

ROY, 2005).

Bifidobactérias são microrganismos benéficos e existe interesse na

manutenção da predominância desse gênero na microbiota intestinal. Essas bactérias estão

sendo amplamente utilizadas como probióticos (TESHIMA, 2001). É sabido que o TGI de

neonatos e crianças, sobretudo aquelas que recebem amamentação materna regular nos

primeiros dias de vida, é composto majoritariamente de bifidobactérias (BRICZINSKI et al.,

2009) e há comprovações também de que a manutenção desta microbiota ocasiona efeitos

positivos na saúde geral destes indivíduos em fase adulta.

Vários mecanismos são sugeridos para a ação inibitória de bifidobactérias

contra patógenos Gram negativos, incluindo o decréscimo do pH local pela produção de

ácidos orgânicos, a competição por nutrientes e por sítios de adesão, a estimulação da

imunidade intestinal e a produção de substâncias antibacterianas específicas (FULLER, 1989;

GOPAL et al., 2001; MAKRAS; DE VUYST, 2006; SANDERS, 2006; TOURÈ et al.,2003).

Quanto a efeitos clássicos comuns a probióticos, a produção de

bacteriocinas por cepas de bifidobactérias é pouco documentada. Porém, duas bacteriocinas,

bifidina e bifidocina B, produzidas por Bifidobacterium bifidum, foram relatadas, sendo que a

bifidocina B foi purificada, caracterizada e constatada como responsável pela inibição do

crescimento de espécies de Listeria, Enterococcus, Bacillus, Lactobacillus e Pediococcus

(YILDIRIM; WINTERS; JOHNSON, 1999).

As bifidobactérias, assim como quaisquer outros candidatos à probióticos,

devem seguir critérios de seleção, como possuir boa tolerância ao ácido, aos metabólitos

tóxicos e sais biliares, possuir atividade antimicrobiana e quando adicionadas em alimentos ou

fármacos devem ser capazes de gerar um produto final com sabor e textura aceitáveis, além da

6

manutenção de uma população mínima de 106 UFC/mL ou g de produto (GOMES;

MALCATA, 2002).

2.1.2 Bifidobacterium lactis

Muitas discussões à respeito da nomenclatura correta para Bifidobacterium

lactis têm sido disponibilizadas na literatura. De fato, a similaridade molecular entre as

espécies B. animalis e B. lactis evidenciam a inclusão da B. lactis como uma subespécie e não

mais como espécie (MASCO et al., 2004; PRASAD; GOPAL; GIL, 2003). Desta forma, a

linhagem HN019 mantém está denominação comercial, entretanto, sua nomenclatura foi

alterada para B. animalis subsp. Lactis (MASCO et al., 2004). Muitos efeitos são atribuídos à

linhagem HN019. Dentre estes efeitos o incremento no sistema imunomodulador, inibição de

bactérias patogênicas, alterações benéficas no balanço microbiano de adultos e idosos são

relatados (AHMED et al., 2007; PRASAD; GOPAL; GIL, 2003; SANDERS, 2006).

Bifidobacterium lactis HN019 é considerada um probiótico em potencial,

baseada na sua capacidade de resistir a bile e a pH bem ácidos in vitro, essa linhagem se

apresentou capaz de adesão em quantidade elevada em diferentes tipos de células do epitélio

intestinal (GOPAL et al., 2001).

2.2 APLICAÇÃO EM ALIMENTOS

O aumento do valor nutritivo e terapêutico dado pelas bifidobactérias gerou

interesse no sentido de incorporação das mesmas em determinados alimentos, sendo os

veículos mais usuais os alimentos infantis, os leites fermentados, outros produtos lácteos e

algumas preparações farmacêuticas (GOMES; MALCATA, 2002).

As bifidobactérias possuem relevante importância do ponto de vista

industrial, com grande potencial de mercado devido as suas propriedades tecnológicas e seus

efeitos em interação com os mecanismos metabólicos do organismo, por estarem associadas a

diversos efeitos a saúde como, incidências de alergias, melhor digestão da lactose entre outros

benefícios (GONÇALVES; EBERLE, 2009). Para uso em alimentos, as cepas devem ser

selecionadas com base nos processos tecnológicos, visto que as bactérias probióticas devem

exibir resistência às etapas da preparação do alimento (MORI et al., 1997). Muitas

bifidobactérias, adicionadas aos produtos lácteos, podem não resistir à exposição ao ácido

7

durante ou após a fermentação, ou ao oxigênio durante a distribuição e estocagem refrigerada,

e/ou ao ácido estomacal humano após ingestão (MAUS; INGHAM, 2003).

As espécies mais comumente usadas pela indústria de lácteos são

Bifidobacterium bifidum, B. breve, B. infantis, B. animalis e B. longum (DESJARDINS;

ROY; GOULET, 1990). O sucesso dos alimentos contendo bifidobactérias se dá pela sua

viabilidade no produto durante sua vida útil, bem como da sua resistência às condições do

sistema no trato gastrointestinal superior (GOPAL et al., 2001).

2.3 LEITE PROBIÓTICO X LEITE FERMENTADO

Leites fermentados são definidos (BRASIL, 2007) como “os produtos

adicionados ou não de outras substâncias alimentícias, obtidas por coagulação e diminuição

do pH do leite, ou leite reconstituído, adicionado ou não de produtos lácteos, por fermentação

láctica mediante ação de cultivos de microrganismos específicos. Esses microrganismos

devem ser viáveis, ativos e abundantes no produto final durante seu prazo de validade.

Na produção de leites fermentados, o pH final ideal é de aproximadamente

4,7. Este pH deve ser alcançado em no máximo 24 h para garantir a segurança microbiológica

do produto durante a estocagem e para evitar que o pH decresça a valores muito baixos

durante o armazenamento. As bifidobactérias têm baixa capacidade de acidificação, sendo

utilizadas em associação com culturas bioajustadoras, portanto as bifidobactérias são usadas

em fermentações de leite de modo limitado devido ao lento crescimento. Embora o leite seja

um meio satisfatório por conter nutrientes essenciais, aminoácidos e pequenos peptídios estão

presentes em quantidades insuficientes para o crescimento de bifidobactérias. Há, contudo,

relatos de casos de adaptação das bifidobactérias ao leite após sucessivas transferências

(HELLER, 2001).

Ferreira (2003) ressalta que, de um modo geral, as bifidobactérias não

crescem muito bem no leite; produzem pouco ácido, prolongando o tempo de fermentação, e

para iniciar o crescimento, exigem um meio com baixo potencial de oxi-redução, além de

fatores de crescimento. A taxa de produção de ácido é crítica para a qualidade e vida de

prateleira do produto lácteo fermentado, daí a importância desses produtos atingirem pH 4,7

num período máximo de 24 horas, o que geralmente não é possível com as culturas deste

gênero isoladamente.

8

Do ponto de vista econômico, não é viável fermentar o leite usando apenas

bifidobacteria devido ao maior tempo de fermentação requerido para reduzir o pH do leite

para 4,7 e também ao sabor desagradável (DAVE; SHAH, 1997). Já que estas produzem,

durante a fermentação, ácidos acético e lático à taxa de 3:2, seu desenvolvimento excessivo

pode gerar produtos com sabor e aroma acético, dificultando a aceitação do produto pelos

consumidores (SAMONA; ROBINSON; MARAKIS, 1996).

2.4 TRATO GASTROINTESTINAL (TGI)

O intestino é um ecossistema complexo, no qual os componentes estão

permanentemente em contato e interação: as células do hospedeiro, os nutrientes e a

microbiota. As funções intestinais incluem o processo que leva à digestão dos alimentos, à

absorção dos nutrientes, e a uma série de atividades que objetivam a defesa contra agressores

externos. Esta última e importante função do intestino é baseada na microbiota, na barreira

constituída pela mucosa intestinal e no sistema imune local (BOURLIOUX et al., 2003).

O epitélio intestinal intacto e a microbiota normal do intestino representam

barreira a bactérias patogênicas, antígenos e outras substâncias do lúmen intestinal para o

sangue. Em indivíduos saudáveis, esta barreira é estável, protegendo o hospedeiro e

assegurando a função normal do intestino. A alteração na permeabilidade da barreira intestinal

facilita a invasão do sangue por patógenos, antígenos estranhos e outras substâncias nocivas

(GOMES; MALCATA, 1999). Esta alteração pode ocorrer em função do desequilíbrio

microbiano, quando microrganismos prejudiciais ou patógenos dominam o TGI. Segundo

Kwon et al. (2010), a ingestão de bactérias probióticas pode melhorar a resistência do

hospedeiro a microrganismos patogênicos, facilitando assim a exclusão destes no intestino. A

manutenção do equilíbrio microbiano pode ser assegurado com o uso de probióticos na dieta

(BIELECKA; BIEDRZYCKA; MAJKOWSKA, 2002).

A microbiota intestinal é muito diversificada e é responsável pelo

desenvolvimento do sistema imunológico do organismo. Os efeitos podem ser locais ou

sistêmicos, além disso, enzimas produzidas pelos microrganismos podem atuar

metabolicamente no intestino produzindo compostos benéficos ao hospedeiro, esses

compostos podem afetar a nutrição, fisiologia, assim como a resistência do hospedeiro a

infecções (MITSUOKA, 1992).

9

Estudos in vitro mostram que os probióticos competem com as bactérias

patogênicas porque estes se ligam nas células do intestino (enterócitos), onde estimulam a

produção de mucina, uma proteína produtora de muco que impede a aderência dos

microrganismos patogênicos (MACK; MICHAIL; WET, 2004).

Bifidobactérias e lactobacilos também degradam substâncias não

absorvíveis pelo organismo do hospedeiro, o que agrega benefícios à sua saúde (OWEHAND,

2007; SOUZA et al.,2009; CASE; FUNKE; TORTORA, 2005).

A microbiota intestinal está associada ao aumento significativo de

lipopolissacarídeos (LPS) no plasma, ganho de gordura e peso corporal, aumento de

triglicerídeos e aumento do estado inflamatório subclinico, pois os LPS são um fator

importante para o estimulo da imunidade inata, são produzidos no intestino devido a lise de

bactérias Gram negativas e podem desencadear processos inflamatórios e levar à obesidade

(Destacado no Esquema 1). Uma dieta com alto teor de gordura favorece o aumento de

bactérias Gram negativas, ocasionando um desbalanço microbiano, sendo assim, o tipo de

alimento, especialmente os com alto teor de gordura saturada pode ser um importante fator no

desenvolvimento de diabetes tipo 2, ou seja, aumento de risco à obesidade em função da

alteração da microbiota intestinal (BESTED; LOGAN; SELHUB, 2013; CANI et al., 2008).

Esquema1. Principais mecanismos envolvidos na relação entre microbiota intestinal e

doenças metabólicas. Em destaque o metabolismo de lipopolissacarídeos – LPS.

Fonte: Moraes et al., (2014) com adaptações da autora.

10

O equilíbrio intestinal favorecendo a microbiota benéfica por ingestão de

alimentos que contenham estes microrganismos adquirem especial atenção nas pesquisas

científicas quando o efeito destes pode ser observado sobre algumas patologias.

2.5 SÍNDROME METABÓLICA (SM)

A Síndrome metabólica (SM) pode ser definida como um grupo de fatores

de risco interrelacionados, de origem metabólica, que contribuem para o desenvolvimento de

doença cardiovascular e/ou diabetes do tipo 2 (PENALVA, 2008). São considerados como

fatores de risco metabólicos: dislipidemia aterogênica (hipertrigliceridemia, níveis elevados

de apolipoproteína B, partículas pequenas e densas de LDL-colesterol e níveis baixos de

HDL-colesterol), hipertensão arterial, hiperglicemia e um estado pró-inflamatório e pró-

trombótico (GRUNDY et al., 2005).

Existem muitas definições para a Síndrome Metabólica (OMS e IDF),

porém a definição do NCEP/ATP III (Adult Treatment Panel of the National Cholesterol

Education Program) é a mais amplamente usada, tanto na prática clínica como em estudos

epidemiológicos. Trata-se de um guideline com foco no risco cardiovascular, que não usa

como critério obrigatório a evidência de anormalidades na insulina ou na glicemia. Apesar

deste guia considerar a doença cardiovascular como desfecho primário da SM, muitos dos

portadores desta síndrome apresentam resistência à insulina, o que lhes confere um risco

aumentado para o desenvolvimento do diabetes do tipo 2 (NATIONAL CHOLESTEROL

EDUCATION PROGRAM, 2002).

Em 2005, a American Heart Association e o National Heart, Lung and

Blood Institute, revisaram os critérios para definição de SM e recomendaram que a obesidade

seja o alvo principal de tratamento. A perda de peso melhora o perfil lipídico, abaixa a

pressão arterial e a glicemia, além de melhorar a sensibilidade à insulina, reduzindo o risco de

doença aterosclerótica (GRUNDY et al., 2005).

A SM aumentou em proporções epidêmicas no mundo urbanizado

(CORNIER et al., 2008) e é alvo de muitos estudos. Ainda não se estabeleceu uma causa

única ou múltiplas causas para o desenvolvimento da SM, mas sabe-se que a obesidade

abdominal e a resistência à insulina parecem ter um papel fundamental na gênese desta

síndrome (PENALVA, 2008).

11

Dentre os efeitos estudados de microrganismos probióticos sobre o

organismo humano, a atividade sobre o sistema cardiocirculatório e as propriedades

imunomodulatórias adquirem especial atenção, se relacionadas a indivíduos portadores de

síndrome metabólica. Já que a síntese do colesterol ocorre principalmente no intestino.

Alguns estudos associaram a microbiota intestinal aos efeitos benéficos no metabolismo

lipídico, diminuindo os níveis do colesterol sanguíneo e aumentando a resistência da

lipoproteína de baixa densidade (LDL) à oxidação, levando a uma redução da pressão arterial

(GOEL et al., 2006).

2.5.1 Efeito de Microrganismos Probióticos Sobre o Sistema Cardiocirculatório

As doenças cardiovasculares representam grande problema para a saúde

pública, liderando o índice de mortalidade no Brasil e no mundo. De acordo com Barleta e

Braga (2007), o aumento da expectativa de vida de uma população está diretamente

relacionado à prevenção de doenças cardiovasculares (BARLETA; BRAGA, 2007). Deste

modo, a síntese de colesterol e a pressão arterial devem ser sempre observadas. Badaró et al.

(2008) reportaram que a hipercolesterolêmia está intimamente ligada às complicações de

doenças como infarto e aterosclerose. Níveis plasmáticos elevados de lipoproteína de baixa

densidade (LDL) são considerados um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento

de doença aterosclerótica cardiovascular (ROSS; GLONSET, 1976; BARLETA; BRAGA,

2007).

Estudos demonstraram que probióticos têm efeito benéfico sobre algumas

desordens metabólicas como a hipertensão e hipercolesterolemia (LYE et al., 2009). Alguns

relatos demonstraram que o consumo de produtos contendo Lactobacillus e Bifidobacterium

podem reduzir o colesterol sérico em humanos e animais. O primeiro relato científico

relacionando bactérias láticas e diminuição do colesterol sérico foi feito em 1974 por Mann e

Spoerry (MAHAN; ESCOTT-STUMP, 1998). Dietschy, Teixeira e Sleiman (2001)

observaram redução de 18% do nível de colesterol sérico total em guerreiros de uma tribo

africana que incluíam na dieta, leite fermentado com uma cepa de Lactobacillus. Outros

autores reportaram experimentos com lactobacilos e/ou bifidobactérias e evidenciaram a

diminuição dos níveis de colesterol sérico total e de lipoproteína de baixa densidade (LDL),

além do aumento da lipoproteína de alta densidade (HDL) (LIONG; SHAH, 2004).

12

Os mecanismos propostos para estes efeitos são associados à assimilação do

colesterol durante a multiplicação bacteriana ou a ligação do colesterol à superfície da parede

celular destas bactérias, tornando indisponível a absorção através do intestino para a corrente

sanguínea (BRASHEARS; GILLILAND; BUCK, 1998; DILMI-BOURAS, 2006; GREANY

et al.,2008; HYEONG-JUN et al., 2004; LIONG; SHAH, 2004; MANZONI et al., 2008).

Além disso, há hipóteses relacionadas à capacidade de alguns

microrganismos probióticos em produzirem hidrolases, enzimas que desconjugam ácidos

biliares. Estes compostos quando desconjugados são reabsorvidos com menor eficiência

quando comparados aos ácidos biliares conjugados, resultando em aumento da sua excreção

nas fezes. Como o colesterol é precursor da síntese de ácidos biliares, à medida que aumenta a

demanda para síntese destes ácidos que devem ser repostos, ocorre redução das concentrações

plasmáticas de colesterol, ou ainda esta redução se daria devido a uma menor absorção, à

medida que há uma co-precipitação do colesterol juntamente com os ácidos biliares

desconjugados, que nesta forma, são menos eficientes na solubilização e absorção de lipídeos

provenientes da dieta (BEGLEY; HILL; GAHAN, 2006).

2.5.2 Efeitos de Microrganismos Probióticos no Sistema Imunomodulador

A microbiota intestinal natural representa um importante modulador da

homeostase intestinal. As interações desta microbiota com a mucosa epitelial e o tecido

linfóide estimulam o sistema imune no hospedeiro (SHI; WALKER, 2004). A alta capacidade

de aderêcia às células do epitélio intestinal demonstrada por Bifidobacterium lactis HN019

tem sido apontada como o fator chave para o efeitos imunomodulatórios desta linhagem

(GILL; PRASAD, 2008; GOPAL et al., 2001; LIU et al., 2010 ).

Os probióticos podem influenciar diretamente na resposta imunológica

induzindo a produção de citocinas anti-inflamatórias ou direcionando o aumento da produção

de IgA secretora. Além disso, a degradação de patógenos por enzimas de probióticos irá

reduzir a taxa de exposição a antígenos. Estes e outros mecanismos contribuem para reduzir a

quantidade de bactérias não benéficas que venham a chegar no trato gastrintestinal

(OWEHAND, 2007).

Além disso, são demonstrados efeitos de probióticos sobre algumas

desordens metabólicas, como a hipertensão e a hipercolesterolemia (LYE et al., 2009).

Linhagens probióticas têm sido promissoramente avaliadas no tratamento clínico relacionado

13

a algumas doenças cardiovasculares e inflamatórias, como colite aguda. Esses

microrganismos podem ser usados como ingredientes funcionais e, quando aliados a

estratégias corretas de rastreamento da linhagem ou dos seus efeitos, resultam em bons

estudos clínicos (SALMINEM; OWEHAND; ISOLAURI, 1998).

Em um sistema imunológico com condições fisiológicas normais,

encontram-se vários tipos de linhagens de células TH ou TCD4+ com função de secreção de

citocinas, responsáveis pela ativação da resposta imunológica. Atualmente, sabe-se que dois

subtipos de células, TH1 e TH2, participam na atividade global do sistema imunológico. As

células TH1 são responsáveis pela imunidade celular e atuam na secreção de citocinas pró-

inflamatórias, tais como a interleucina (IL) 2, o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e o

interferon-gama (IFN-γ). As células TH2 produzem IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, regulando as

respostas imunitárias humorais, modulando a atividade das células TH1, e diminuindo a

inflamação local. Em geral, são associadas a resposta inflamatória excessiva, causando dano

tecidual como nas doenças autoimunes (TINOCO et al., 2007).

Citocinas produzidas pelas células TH1 reduzem a inflamação e estimulam

a tolerância a antígenos comuns (OWEHAND, 2007; SOUZA et al., 2009).

O efeito das interações entre microrganismos e o trato gastrointestinal é

observado em animais mantidos em ambientes isentos de contaminação e posteriormente

colonizados com probióticos. Imediatamente após a exposição aos microrganismos do lúmen,

o número de linfócitos intra-epiteliais aumenta muito. Os centros germinativos com células

produtoras de imunoglobulinas surgem rapidamente nos folículos e na lâmina própria, e as

concentrações de imunoglobulinas aumentam substancialmente no plasma (GUARNER;

MALAGELADA, 2003). Esse efeito também é relacionado à capacidade de microrganismos

probióticos interagirem com folículos linfóides intestinais (placas de Peyer), estimulando a

resposta imune das mucosas por ação das células B, produtoras de IgA, e a migração de

linfócitos ou células T do intestino, um dos principais responsáveis pela imunidade celular

(KWON et al., 2010).

Probióticos também favorecem a atividade fagocítica inespecífica dos

macrófagos alveolares, por ação sistêmica, devido à secreção de mediadores que estimulam o

sistema imuno modulador (CROSS, 2002).

A administração de probióticos ativa a produção de macrófagos que são

responsáveis pela fagocitose que desencadeia precocemente a resposta inflamatória, mesmo

14

antes da produção de anticorpos (ISOLAURI; OWEHAND; LAITINEN, 2001; KWON et al.,

2010).

A ação de probióticos sobre processos patológicos como a diarréia,

(principalmente causada por rotavírus e antibioticoterapia, processos alérgicos e a sua

influência na melhora da resposta imunológica em humanos é associada ao tecido linfóide,

isso eleva os níveis séricos de IgA secretora e a produção de macrófagos o suficiente para

prevenir infecções entéricas (ERICKSON; HUBBARD, 2000; ISOLAURI; OWEHAND;

LAITINEN, 2001; VANDERHOOF, 2001). Pessi et al. (2000) relataram a utilização de

Lactobacillus rhamnosus GG) no alívio dos sintomas de inflamações gastrointestinais e

dermatites atópicas por alergia a alimentos e associou este efeito ao estímulo de células IgA

secretoras e supressão do processo inflamatório (fator de necrose tumoral).

A interação do microrganismo probiótico com as células dendríticas é o

fator que promove a produção de citocinas, principais moléculas do complexo de histo-

compatibilidade principal para apresentação de antígenos, e moléculas co-estimulatórias que

polarizam células T em células T regulatórias e auxiliares tipo 1 e 2. Além disso, bactérias

probióticas podem atingir o tecido linfóide associado ao intestino atravessando células

intestinais chamadas células M, e interagir diretamente com as células dendríticas, modulando

a resposta imune (LEBEER; VANDERLEYDEN; KEERSMAECKER, 2010). A associação

do consumo de probiótico a incrementos do sistema imunomodulador têm sido suportado por

estudos clínicos, e há um consenso quanto ao equilíbrio da microbiota intestinal e estes efeitos

(GILL; PRASAD, 2008; ISOLAURI; OWEHAND; LAITINEN, 2001). Em contrapartida, o

desequílibrio desta interação é diretamente correlacionada à ocorrência de doenças (COSTA;

MIGLIORANZA, 2013). Neste cenário, a escolha do alvo de estudo, cujas características

sejam importantes à saúde pública e a escolha da forma de veiculação do componente a ser

ministrado são essenciais para suportar a obtençao de dados clínicos.

15

REFERÊNCIAS

BADARÓ, A. C. L. et al. Alimentos probióticos: aplicações como promotores da saúde

humana, parte 1. Nutrir Gerais: Revista Digital de Nutrição, Ipatinga, v. 3, n. 5, p. 396-416,

2008.

BARLETA, V. C. N.; BRAGA, A. D. A. Alimento funcional: uma nova abordagem

terapêutica das dislipidemias como prevenção da doença aterosclerótica. Cadernos UniFOA,

Volta Redonda, v. 2, n. 3, 2007.

BEGLEY, M.; HILL, C.; GAHAN, C. G. M. Bile salt hydrolase activity in probiotics.

Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 72, n. 3, p. 1729-1738, 2006.

BENCHIMOL, E. I.; MACK, D. R. Probiotics in relapsing and chronic diarrhea. Journal of

Pediatric Hematology/Oncology, New York, v. 26, n. 8, p. 515-517, 2004.

BESTED, A.C.; LOGAN, A.C.; SELHUB, E. M. Intestinal microbiota, probiotics and mental

health: from Metchnikoff to modern advances. Gut Pathogens, London, v. 5, p. 5-21, 2013.

BIELECKA, M.; BIEDRZYCKA, E.; MAJKOWSKA, A. Selection of probiotics and

prebiotics for synbiotics and confirmation of their in vivo effectiveness. Food Research

International, Barking, v. 35, n. 2, p. 125-131, 2002.

BOURLIOUX, P. et al. The intestine and its microflora are partners for the protection of the

host. American Journal Clinical Nutrition, Bethesda, v. 78, p. 675-683, 2003.

BRASHEARS, M. M.; GILLILAND, E.; BUCK, L. M. Bile salt deconjugation and

cholesterol removal from media by Lactobacillus casei. Journal of Dairy Science,

Champaign, v. 81, p. 2103-2110, 1998.

BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária.

Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal. Instrução Normativa Nº46.

Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Leites Fermentados. Diário Oficial da

União, Brasília, Seção 1, p. 5, 24 out. 2007.

BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº

278, de 22 de setembro de 2005, atualizada em Julho de 2008. Alimentos com alegações de

propriedades funcionais e ou de saúde, novos alimentos/ingredientes, substâncias bioativas e

probióticos. Disponível em: <http://www.anvisa.gov. br/alimentos/

comissoes/tecno_lista_alega.htm>. Acesso em: 02 agor. 2014.

BRICZINSKI, E. P. et al. Strain-specific genoptyping of Bifidobacterium animalis ssp. lactis

using SNPs and INDELs. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 75, p.

7501-7508, 2009.

CANI, P.D. et al. Role of gut microflora in the development of obesity and insulin resistance

following high-fat diet feeding. Pathologie Biologie, Paris, v. 56, p. 305-309, 2008.

CASE, C. L.; FUNKE, B. R.; TORTORA, G. J. Microbiologia. 8. ed. Porto Alegre: Artmed,

2005.

16

CHARTERIS, W. P.; KELLY, P. M.; MORELLI, L. Ingredient selection criteria for probiotic

microorganisms in functional dairy foods. International Journal of Dairy Technology,

Huntingdon, v. 51, n. 4, p. 123-136, 1998.

COPPOLA, M. M.; TURNES, G. C. Probiótico e resposta imune. Ciência Rural, Santa

Maria, v. 34, n. 4, p. 1297-1303, 2004.

CORNIER, M. A. et al. The metabolic syndrome. Endocrine Reviews, Chevy Chase, v. 29,

n. 7, p. 777-822, 2008.

COSTA, G. N.; MIGLIORANZA, L. H. S. Micro-organismos probióticos: caracterização de

linhagens e seus efeitos no hospedeiro. Boletim CEPPA, Curitiba, v. 31, n. 2, p. 196-205,

2013.

CRITTENDEN, R. et al. Probiotic research in Australia, New Zealand and the Asia-Pacific

region. Current Pharmaceutical Design, San Francisco, v. 11, n. 1, p. 37-53, 2005.

CROSS, M. L. Microbes versus microbes: Immune signals generated by probiotic lactobacilli

and their role in protection against microbial pathogens. FEMS Immunology and Medical

Microbiology, Amsterdam, v. 34, n. 4, p. 245-253, 2002.

DAVE, R. I.; SHAH, N. P. Effect of cysteine on the viability of yoghurt and probiotic

bacteria in yoghurt made with commercial starter cultures. International Dairy Journal,

Barking, v. 7, p. 537-545, 1997.

DESJARDINS, M. L.; ROY, D.; GOULET, J. Growth of Bifidobacteria in milk and their

enzyme profiles. Journal of Dairy Science, Champaign, v. 73, p. 299-315, 1990.

DIETSCHY, J. M.; TEIXEIRA, M.; SLEIMAN, J. Atualizações no tratamento dietoterápico

nas dislipidemias. Revista Nutrição Saúde e Performance: Anuário de Nutrição Clínica, v.

13, p. 17, 2001.

DILMI-BOURAS, A. Assimilation (in vitro) of cholesterol by yogurt bacteria. Annals

Agricultural and Environmental Medicine, Lublin, v. 13, p. 49-53, 2006.

DODD, H. M.; GASSON, M. J. Bacteriocins of lactic acid bacteria. In: GASSON, M. J.; DE

VOS, W. M. (Ed.). Genetics and biotechnology of lactic acid bacteria. London: Chapman

& Hall, 1994. p. 211-251.

DONKOR, O. N. et al. Survival and activity of selected probiotic organisms in set-type

yoghurt during cold storage. International Dairy Journal, Barking, v. 17, n. 6, p. 657-665,

2007.

ERICKSON, K. L.; HUBBARD, N, E. Probiotic Immunomodulation in health and disease.

Journal of the Nutrition, Rockville, v. 130, p. 403-409, 2000.

FERREIRA, C. L. L. F. Prebióticos e probióticos: atualização e prospecção. Viçosa: Editora

da Universidade Federal de Viçosa, 2003.

FULLER, R. Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology, Oxford, v.

66, n. 5, p. 365-378, 1989.

17

GILL, H.; PRASAD, J. Probiotics, immunomodulation, and health benefits. Advances in

Experimental Medicine and Biology, New york, v. 606, p. 423-454, 2008.

GOEL, A. K. et al. Probiotics: microbial therapy for health modulation. Defence Science

Journal, New Delhi, v. 56, p. 513-529, 2006.

GOMES, A. M. P.; MALCATA, F. X. Bifidobacterium spp. and Lactobacillus acidophilus:

biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as

probiotics. Trends in Food Science & Technology, Cambridge, v. 10, n. 4, p. 139-157, 1999.



probiotics. Trends in FoodScience & Technology, Cambridge, v. 10, n. 4-5, p. 139-157,

2002.

GONÇALVES, A. A.; ERBELE, I. R. Bactérias bifidas: o impacto na industria de laticínios.

Leite e Derivados, São Paulo, v. 18, n. 114, p. 34-41, 2009.

GOPAL, P. K. et al. In vitro adherence properties of Lactobacillus rhamnosus DR20 and

Bifidobacterium lactis DR10 strains and their antagonistic activity against an enterotoxigenic

Escherichia coli. International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v. 67, p. 207-

216, 2001.

GOPAL, P.K; PRASAD, J.; GILL, H. S. Effects of the consumption of Bifidobacterium lactis

HN019 and galacto-oligoccharides on the microflora of the gastrointestinal tract in human

subjects. Nutrition Research, Tarrytown, v. 23, p. 1313-1328, 2003.

GREANY, K. A. et al. Probiotic capsules do not lower plasma lipids in young women and

men. European Journal of Clinical Nutrition, London, v. 62, n. 3, p. 232-237, 2008.

GRUNDY, S. M. et al. Diagnosis and management of the metabolic syndrome: an American

Heart Association/National Heart, Lung, and Blood Institute Scientific Statement.

Circulation, Dallas, v. 112, n. 17, p. 2735-2752, 2005.

GUARNER, F.; MALANGELADA, J. R. Gut flora in health and disease. Lancet, New York,

v. 361, p. 512-519, 2003.

HELLER, K. J. Probiotic bacteria in fermented foods: product characteristic and starter

organisms. American Journal of Clinical Nutrition, New York, v. 73, p. 3745-3795, 2001.

HOLT, J. G. et al. Bergey’s manual of determinative bacteriology. 9. ed. Baltimore:

William e Wilkins, 1994.

HYEONG-JUN, L. et al. Isolation of cholesterollowering lactic acid bacteria from human

intestine for probiotic use. Journal of Veterinary Science, Suwon, v. 5, n. 4, p. 391-395,

2004.

ISOLAURI, E.; OWEHAND, A. C.; LAITINEN, K. Probiotics and Immunomodulation.

American Journal of Clinical Nutrition, New York, v. 73, p. 444S-50S, 2001.

18

JELEN, P.; LUTZ, S. Functional milk and dairy products. In: MAZZA, G. (Ed.). Functional

foods: biochemical and processing aspects. Lancaster: Technomic Publ., 1998. p. 357-381.

KAUR, I. P.; CHOPRA, K.; SAINI, A. Probiotics: potential pharmaceutical applications.

Europen Journal of Pharmaceutical Science, Amsterdam, v. 15, p. 1-9, 2002.

KLAENHAMMER, T. R. Probiotics and prebiotics. In: DOYLE, M. P.; BEUCHAT, L. R.;

MONTVILLE, T. J. Food microbiology: fundamentals and frontiers. 2. ed. Washington:

ASM, 2001. p. 797-811.

KWON, H. K. et al. Generation of regulatory dendritic cells and CD4+Foxp3+ T cells by

probiotics administration suppresses immune disorders. Proceedings of the National

Academy of Sciences, Washington, v. 107, n. 5, p. 2159-2164, 2010.

LEBEER, S.; VANDERLEYDEN, J.; DE KEERSMAECKER, S. C. J. Host interactions of

probiotic bacterial surface molecules: comparison with commensals and pathogens. Nature

Reviews Microbiology, London, v. 8, p. 171-184, 2010.

LIONG, M. T.; SHAH, N. P. Acid and bile tolerance and the cholesterol removal ability of

bifidobacteria strains. Bioscience and Microflora, v. 24, n. 1, p. 1-10, 2004.

LIU, C et al. 2010. Adhesion and immunomodulatory effects of Bifidobacterium lactis

HN019 on intestinal epithelial cells INT-407. World Journal of Gastroenterology, Beijing,

v.16, p. 2283-2290, 2010.

LOURENS-HATTINGH, A.; VILJOEN, B. C. Yogurt as probiotic carrier food.

International Dairy Journal, Barking, v. 11, n. 1, p. 11-17, 2001.

LYE, H. S. et al. The improvement of hypertension by probiotics: Effects on cholesterol,

diabetes, renin, and phytoestrogens. International Journal Molecular Science, Basel, v. 10,

n. 9, p. 3755-3775, 2009.

MACK, D. R.; MICHAIL, S.; WET, S. Probiotics inhibit enteropathogenic E. coli adherence

in vitro by inducing intestinal mucin gene expression. American Journal Physiology,

Washington, v. 276, p. G941-G950, 2004.

MAHAN, L. K.; ESCOTT-STUMP, L. Alimentos nutrição e dietoterapia. São Paulo: Roca,

1998.

MAKRAS, L.; DE VUYST, L. The in vitro inhibition of Gram-negative pathogenic bacteria

by bifidobacteria is caused by the production of organic acids. International Dairy Journal,

Barking, v. 16, p. 1049-1057, 2006.

MANZONI, M. S. et al. Fermented soy product supplemented with isoflavones affects

adipose tissue in a regional-specific manner and improves HDL cholesterol in rats fed on a

cholesterol-enriched diet. European Food Research and Technology, Berlin, v. 227, p.

1591-1597, 2008.

MASCO, L. et al. Polyphasic taxonomic analysis of Bifidobacterium animalis and

Bifidobacterium lactis reveals relatedness at the subspecies level: reclassification of

Bifidobacterium animalis as Bifidobacterium animalis subsp. animalis subsp. nov. and

19

Bifidobacterium lactis as Bifidobacterium animalis subsp. lactis subsp. nov. International

Journal Systematic Evolutionary Microbiology, Readingv, v. 54, n. 4, p. 1137-1143, 2004.

MAUS, J. E.; INGHAM, S. C. Employment of stressful conditions during culture production

to enhance subsequente cold- and acid-tolerance of bifidobacteria. Journal of Applied and

Microbiology, Oxford, v. 95, p. 146-154, 2003.

MITSUOKA, T. Intestinal flora and aging. Nutrition Reviews, Baltimore, v. 50, p. 438-446,

1992.

MODLER, H. W.; McKELLAR, R. C.; YAGUCHI, M. Bifidobacteria and bifidogenic

factors. Canadian Institute Food Science and Technology Journal, Ottawa, v. 23, p.

29041, 1990.

MORAES, A. C. F. et al. Microbiota intestinal e risco cardiometabólico: mecanismos e

modulação dietética. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabologia [online], São

Paulo, v. 58, n.4, p. 317-327, 2014.

MORI, H. et al. Isolation and structural identification of bifidogenic growth stimulator

produced by Propionibacterium freudenreichii. Journal of Dairy Science, Champaign, v. 80,

p. 1959-1964, 1997.

NATIONAL CHOLESTEROL EDUCATION PROGRAM (NCEP). Detection, evaluation,

and treatment of high blood cholesterol in adults (Adult Treatment Panel III): final

report. 3. ed. [S. l.: s. n.], 2002.

O´MAY, G. A.; MACFARLANE, G. T. Health claims associated with probiotics. In:

TAMIME, A. Y. (Ed.). Probiotic dairy products. Ames: Blackwell Publishing, 2005. p.

138-166.

O'SULLIVAN, M. G. et al. Probiotic bacteria: myth or reality. Trends Food Science

Technology, Cambridge, v. 3, p. 309-314, 1992.

OWEHAND, A. C. Antiallergic effects of probiotics. The Journal of Nutrition, Bethesda, v.

137, n. 3, p. 794-797, 2007.

PENALVA, D. Q. F. Síndrome metabólica: diagnóstico e tratamento. Revista de Medicina,

São Paulo, v. 87, n. 4, p. 245-250, 2008.

PESSI, T. et al. Interleukin-10 generation in atopic children following oral Lactobacillus

rhamnosus GG. Clinical and Experimental Allergy, Oxford, v. 30, n. 12, p. 1804-1808,

2000.

PINEIRO, M.; STANTON, C. Probiotic bacteria: legislative framework – requirements to

evidence basis. Journal of Nutrition, Philadelphia, v. 137, n. 3, p. 850-853, 2007.

ROSS, R.; GLONSET, J. A. The pathogenesis of atherosclerosis. New England Journal

Medicine, Boston, v. 295, p. 369-377, 1976.

20

SAAD, S. M. I. Probióticos e prebióticos: o estado da arte. Revista Brasileira de Ciências

Farmacêuticas, São Paulo, v. 42, n. 1, p. 1-16, 2006. Disponível em:

<http://www.scielo.br/pdf/rbcf/v42n1/29855.pdf >. Acesso em: 20 maio 2014.

SALMINEN, S.; OWEHAND, A. C.; ISOLAURI, E. Clinical applications of probiotic

bacteria. International Dairy Journal, Barking, v. 8, p. 563-572, 1998.

SAMONA, A.; ROBINSON, R. K.; MARAKIS, S. Acid production by bifidobacteria and

yoghurt bacteria during fermentation and storage of milk. Food of Microbiology, London, v.

13, n. 4, p. 275-280, 1996.

SANDERS, M. E. Probiotics: considerations for human health. Nutrition Review,

Washington, v. 61, n. 3, p. 91-99, 2006.

SCARDOVI, V. Genus bifidobacterium. In: BERGEY’S manual of systematic bacteriology.

Baltimore: Williams and Wilkins, 1986. p. 1418-1434.

SHAH, N. P. Functional cultures and health benefits. International Dairy Journal, Barking,

v. 17, p. 1262–1277, 2007.

SHAH, N. P. Probiotic bacteria: selective enumeration and survival in dairy foods. Journal of

Dairy Science, Champaign, v. 83, n. 4, p. 894-907, 2000

SHAH, N. P.; LANKAPUTHRA, W. E. V. Improving viability of Lactobacillus acidophilus

and Bifidobacterium spp. in yogurt. International Dairy Journal, Barking, v. 7, p. 349-356,

1997.

SHI, H. N.; WALKER, W. A. Bacterial colonization and the development of intestinal

defenses. Canadian Journal of Gastroenterology, Oakville, v. 18, n. 8, p. 493-500, 2004.

SOUZA, F. S. et al. Prebióticos, probióticos e simbióticos na prevenção e tratamento das

doenças alérgicas. Revista Paulista de Pediatria, São Paulo, v. 28, n. 1, p. 86-97, 2009.

TESHIMA, E. D. S. Seleção de bactérias bífidas isoladas de lactentes e modulação da

microbiota intestinal por meio de probióticos, prebióticos e simbióticos. 2001. 113 f. Tese

(Doutorado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) - Universidade Federal de Viçosa,

Viçosa, 2001.

TINOCO, S. M. B. et al. Importância dos ácidos graxos essenciais e os efeitos dos ácidos

graxos trans do leite materno para o desenvolvimento fetal e neonatal. Cadernos de Saúde

Pública, Rio de Janeiro, v. 23, n. 3, p. 525-534, 2007.

TOURÈ, R. et al. Production of antibacterial substances by bifidobacterial isolates from infant

stool active agains Listeria monocytogenes. Journal of Applied Microbiology, Oxford, v.

95, n. 5, p. 1058-1069, 2003.

TUOHY, K. M. et al. Using probiotics and prebiotics to improve gut health. Drug Discovery

Today, Oxford, v. 8, n. 15, p. 692-700, 2003.

VANDERHOOF, J. A. Probiotcs: future directions. American Journal of Clinical

Nutrition, New York, v. 73, p. 1152S-5S, 2001.

21

WARD, P.; ROY, D. Review of molecular methods for identification, characterization and

detection of bifidobacteria. Lait, Les Ulis Cedex, v. 85, n. 1, p. 23-32, 2005.

YILDIRIM, Z.; WINTERS, D.; JOHNSON, M. Purification, amino acid sequences and mode

of action of bifidocin B produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454. Journal of

Applied Microbiology, Oxford, v. 86, p. 45-54, 1999.

22

3. ARTIGO 1 - PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LEITE PROBIÓTICO

Luciana Jesus Bernini1, Cinthia H. Batista de Souza

1, , Gisele Nobre Costa*

1.

1 Universidade Norte do Paraná – UNOPAR – Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite e

Derivados, Rua Marselha, 591, Jardim Piza, 86041-140, Londrina, PR, Brasil.

* Corresponding author: Giselle Nobre Costa

E-mail: [email protected]

Tel.: +55 43 3371-7723

Fax: +55 43 3371-7834

Running headline: Leite Probiótico

23

RESUMO

Bifidobacterium lactis é uma bactéria probiótica, cujos efeitos benéficos à saúde do

hospedeiro têm sido muito bem documentada. Nesta investigação, B. lactis HN019 foi

utilizada para produzir um leite probiótico que foi caracterizado fisico-química e

microbiologicamente, conforme padrões da legislação Brasileira. O leite probiótico foi

produzido com 8% (P/V) de leite em pó desnatado, 6% (P/V) sacarose, esterilizado a

121ºC/15 min., resfriado à temperatura ambiente e adicionado de 10% (V/V) de inóculo

previamente ativado e cultivado a 42ºC/18 horas. pH, acidez e viabilidade (UFC/mL) do

probiótico no produto envasado foram observados durante 30 dias sob armazenamento

refrigerado (5ºC) para acompanhamento da vida de prateleira. O produto pronto para o

consumo apresentou alta contagem do microrganismo probiótico com 3,4 x 108

UFC/mL, teor

de acidez de 0.38%, pH 5.15, conteúdo proteico de 2.80%, carboidratos e extrato seco totais

com 7.54% e 12.08% respectivamente e, 0.48% de cinzas. Não foi detectada a presença de

coliformes totais e/ou termotolerantes, bem como bolores e leveduras. A contagem de B.

lactis variou de 8.5 a 10,4 ciclos logarítmicos, no início e final do armazenamento. Houve

aumento de um ciclo logarítmico na contagem de B. lactis aos 30 dias de armazenagem, e este

parâmetro culminou também na redução do pH e com um pequeno aumento de acidez no

produto. Embora esse dado não tenha apresentado diferença significativa no nível avaliado

(p 0,05), o sabor acético típico do metabolismo de bifidobactérias ao final de 30 dias de

armazenamento foi detectado. O produto atende aos parâmetros da legislação brasileira

vigente e pode ser considerado probiótico, contudo a baixa acidez não o caracteriza como leite

fermentado.

Palavras-chave: Bifidobacterium lactis. Vida de prateleira. Leite probiótico.

ABSTRACT

Bifidobacterium lactis is a probiotic bacteria whose beneficial health effects on the host have

been reported. In this investigation, B. lactis HN019 was used to produce a probiotic milk.

The product was physicochemical and microbiological characterized according the standards

of the Brazilian legislation. The probiotic milk was produced with 8% (w / v) skimmed milk

powder, 6% (w / v) sucrose, sterilized at 121 ° C / 15 min. Cooled to room temperature and

added with 10% (V/V) inoculum and grown at 42 ° C/18 hours. pH, acidity and viability

(CFU/mL) of the probiotic produced was observed for 30 days under refrigerated storage

(5°C) aiming to monitor of the shelf-life. The product ready for consumption showed high

counts of probiotic microorganism with 3.4x 108 CFU/mL, acidity 0.38%, pH 5.15, 2.80%

protein content, carbohydrates and total dry extract with 7.54% and 12.08% respectively and

0.48% ash. We did not detect the presence of total and/or fecal coliforms and yeasts and

molds. The B. lactis counts ranged from 8.5 to 10.4 log cycles at the beginning and end of

storage. There was an increase of one log cycle count of B. lactis after 30 days of storage, and

this parameter also resulted in lowering the pH and a small rise of acidity in the product.

Although these data showed no significant difference in the assessed level (p0.05), the acetic

flavor after 30 days of storage was detected. This is a typical occurrence of the bifidobacteria

metabolism. The product is in accordance with the parameters of the current Brazilian

legislation and can be considered probiotic, although the low acidity on the probiotic milk

does not characterize it as fermented milk.

Keywords: Bifidobacterium lactis. Shelf life. Probiotic milk.

24

INTRODUÇÃO

O interesse pelo tema probiótico, assim como pelos alimentos funcionais de

maneira geral, está diretamente relacionado à crescente valorização da qualidade de vida e da

prevenção de doenças. Atualmente muitos estudos ilustram a efetividade de ação de alguns

microrganismos probióticos na saúde do hospedeiro, dentre esses efeitos a capacidade de

influenciar direta ou indiretamente o sistema imunológico e ou prevenir doenças

cardiovasculares no hospedeiro são importantes alvos de investigações. O aumento do valor

nutritivo e terapêutico trazido pelas bifidobactérias gerou interesse no sentido de incorporação

destas em alimentos, sobretudo os alimentos infantis, os leites fermentados, outros produtos

lácteos e algumas preparações farmacêuticas (GOMES; MALCATA, 2002).

Para uso em alimentos, as linhagens devem ser selecionadas com base nos

processos tecnológicos, visto que as bactérias probióticas devem exibir resistência às etapas

da preparação do alimento (MORI et al., 1997).

Na produção de leites fermentados, o pH final ideal é de aproximadamente

4,7. Este pH deve ser alcançado em, no máximo 24 h para garantir a segurança

microbiológica do produto durante a estocagem e para evitar que o pH decresça a valores

muito baixos durante o armazenamento. De um modo geral, bifidobactérias não crescem

muito bem no leite, pois produzem pouco ácido, prolongando o tempo de fermentação e para

iniciar o crescimento, exigem um meio com baixo potencial de oxi-redução, além de fatores

de crescimento, portanto, estas bactérias são comumente associadas a culturas bioajustadoras

para produção de fermentados (FERREIRA, 2003; HELLER, 2001).

Há, contudo, relatos de casos de adaptação das bifidobactérias ao leite após

sucessivas transferências (HELLER, 2001).

Alguns autores questionam a viabilidade econômica de fermentar o leite

usando microrganismos probióticos sem culturas adjuntas, devido ao maior tempo de

fermentação ou à incapacidade de redução do pH do leite para 4,6. Além disso, a ocorrência

de sabor desagradável no produto final é comum quando se utiliza bifidobactérias (DAVE;

SHAH, 1997; THAMER; PENNA, 2006). Entretanto fórmulas infantis e outros formulados

comerciais ou para estudos clínicos têm sido desenvolvido com variadas espécies de

Bifidobacterium (CHIANG et al., 2000; DEKKER et al., 2009; LUGONJA et al., 2010;

SOUZA, 2011).

25

No Brasil, não há leites probióticos não fermentados (acidez inferior à 6%

ácido láctico) disponíveis no mercado, portanto, a legislação brasileira não preconiza

parâmetros para este tipo de produto, cujo teor de acidez seja inferior a 0,6% (ácido láctico),

já que a acidez característica dos lácteos fermentados ou cultivados é de 0,6 a 2% (BRASIL,

2000).

Os alimentos funcionais foram responsáveis por mais de 40% do mercado

mundial entre 2005 e 2010 (ÖZER; KIRMACI, 2010) e este mercado continua em expansão,

associado à valorização de alimentos versus qualidade de vida. Diante desta perspectiva, a

inserção de um leite probiótico de sabor suave, pouco acidificado, portanto, diferenciado do

que há disponível comercialmente, pode ser uma alternativa inovadora no mercado lácteo.

MATERIAL E MÉTODOS

Foi utilizada a linhagem comercial Bifido HOWARU®

- Bifidobacterium

lactis HN019® (Danisco, Cotia, Brasil- SP). O microrganismo liofilizado foi armazenado em

freezer a -18ºC e foi ativado em leite desnatado reconstituído (LDR) 10% (Molico®, Nestlé,

Araçatuba-SP), esterilizado a 121°C/15 minutos.

Leite Probiótico

Para produção do leite probiótico foram preparados uma base com LDR 8%

(P/V) (Molico®, Nestlé, Araçatuba-SP) e 6% (P/V) sacarose (União, São Paulo, SP) A mistura

foi esterilizada a 121ºC/15 min. e resfriado à temperatura ambiente. Foram previamente

preparados pré-inóculos com 0,25% (P/V) da cultura liofilizada de HN019® LDR 10% (V/V),

ativado durante 6 horas a 41ºC e, posteriormente utilizado para fermentação na proporção de

10% (V/V) para produção do leite probiótico (Esquema 1). Após 18 horas de cultivo, o leite

probiótico foi resfriado em câmara fria (5ºC), o coágulo foi quebrado e adicionado de aromas

idênticos aos naturais: 0,01 % (v/v) laranja (Duas Rodas Industrial, Jaraguá do Sul- SC).

Análises microbiológicas

26

O produto pronto para consumo foi avaliado microbiologicamente por

contagens de bolores e leveduras e determinação de coliformes a 35 e 45°C, conforme

determina a legislação vigente (BRASIL, 2001).

Foi determinada a viabilidade (UFC/mL) do probiótico no produto,

utilizando diluições seriadas em água peptonada tamponada 0,1 % (p/v) (Oxoid, Cambridge,

UK). Diluições de 10-1

a 10-8

plaqueamento em profundidade em ágar MRS LP (De Man

Rogosa e Sharpe) enriquecido com cloreto de lítio 2g/L e propionato de sódio 3g/L e

incubado a 37°C/72h em anaerobiose (LAPIERRE; UNDELAND; COX, 1992).

Paralelamente, para acompanhamento da vida de prateleira, o produto

envasado foi avaliado microbiologicamente nos tempos 01, 07,15, 21 e 30 dias de estocagem

a 5ºC. Todas as análises foram efetuadas em triplicata.

Esquema1 - Etapas de produção do leite probiótico

Fonte: Da autora.

27

Análises físico-químicas

O produto pronto para consumo foi avaliado físico-químicamente. Os

valores de pH foram determinados em potenciômetro digital (Tecnal, modelo Tec-5),

devidamente calibrados com soluções tampão de pH 7,0 e pH 4,0 (INSTITUTO ADOLFO

LUTZ, 2008).

A determinação da acidez total (% ácido lático) foi realizada medindo o teor

de ácido lático presente em 5 mL de amostra pela titulação com NaOH 0,1mol/L na presença

de fenolftaleína como indicador. O teor de cinzas, proteínas, carboidratos totais e extrato seco

total (EST), foram determinadas de acordo com as normas definidas pelo Instituto Adolfo

Lutz (2008). O teor de gordura determinado pelo método do butirômetro de Gerber.

Todas as análises foram efetuadas em triplicata.

Análise Estatística

Todos os resultados foram avaliados pelo teste de Hartley para verificar a

homogeneidade de variâncias seguidos da análise de variâncias (ANOVA) e as médias foram

comparadas entre si pelo teste de Tukey com nível de significância < 5% (p < 0,05), dado

pelo programa Statistica versão 6.0 (STATSOFT, 2001).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Caracterização do leite probiótico

Após testes preliminares as concentrações de ingredientes e tempo de

cultivo do B. lactis HN019 foi definido. Embora, o tempo de cultivo médio tenha sido de 18

horas, considerado longo do ponto de vista industrial, mesmo nestas condições não se obteve

acidificação suficiente para o produto ser considerado fermentado. O leite probiótico pronto

para o consumo apresentou pH de 5,2 e acidez titulável de 0,4 % (ácido láctico) em média.

Segundo Ferreira (2003), de um modo geral, as bifidobactérias não crescem muito bem no

leite; produzem pouco ácido, prolongando o tempo de fermentação. O tempo de fermentação

foi superior à produção de fermentados lácteos tradicionais, cujos processos ocorrem em

média de 3,5 a 6 h (DAVE; SHAH, 1997; THAMER; PENNA, 2006).

28

O pH do leite reconstituído foi em média 6,4; cujo pH foi reduzido para 5,2

no produto final, por ação do metabolismo de B. lactis HN019. O produto pronto para o

consumo apresentou características adequadas ao produto definido como Leite desnatado

adoçado probiótico, entretanto, o teor de ácido láctico não permite classificação como

fermentado, exigindo para tanto um teor de acidez entre 0,6 a 1,5% (BRASIL, 2000). Todos

os demais parâmetros (Tab. 1) se adéquam à legislação Brasileira e dos países do Mercosul

(BRASIL, 2000).

Tabela 1 - Características Físico-químicas e microbiológicas do leite probiótico pronto para o

consumo

Análises Valores

Log (UFC/mL) 8.53±0.11

pH 5.15±0.09

Acidez (%) 0.38±0.05

Proteínas (%) 2.80±0.09

Gordura (%) 0,0±0.00

Carboidratos (%) 7.54±0.05

EST (%) 12.08±0.15

Cinzas (%) 0.48±0.02

EST: Extrato seco total.

Os dados são médias de 3 repetições independentes do produto pronto para consumo após um dia de produção.

Fonte:Da autora.

A viabilidade de B. lactis foi de 2,72 x 1010

UFC/dose de 80 mL no produto

final. As concentrações de células das bifidobactérias mantiveram-se estáveis durante a

estocagem refrigerada (Tabela 2), não havendo variação durante o período de armazenamento

até de 21 dias. Aos 30 dias de armazenamento foi observado variação significativa da

contagem do probiótico, a contagem de células viáveis foi aumentado o que coincidiu com a

detecção de sabor acetificado perceptível ao paladar. Isso pode ser atribuído o metabolismo de

bifidobactérias que produzem ácido lático e ácido acético na proporção 2:3 (SAMONA;

ROBINSON; MARAKIS, 1996).

29

A alta viabilidade da cultura probiótica superior à determinada pela

legislação vigente (BRASIL, 2008), caracteriza o produto como probiótico.

Tabela 2 - pH, acidez do leite probiótico pronto para o consumo e viabilidade de B. lactis

HN019 ao longo de 30 dias estocado a 5°C

Tempo (dias)

Análises 1 7 14 21 30

Log UFC/mL 8.13±0.06a 8.33±0.06

a 8.30±0.05

a 8.29±0.01

a 9.20±0.04

b

pH 5.16±0.07a 5.07±0.09

a 5.23±0.04

a 5.21±0.01

b 4.3±0.30

b

Acidez (%) 0.38±0.02a 0.39±0.03

a 0.35±0.02

a 0.36±0.03

a 0.42±0.02

a

Os dados são médias de 3 repetições independentes

Médias numa linha seguidas pela mesma letra, não diferem estatisticamente entre si (p<0.05)

Fonte: Da autora.

O produto não apresentou coliformes totais e/ou fecais, bem como bolores e

leveduras, um indicativo de condições de manipulação e processamento adequados. Embora a

acidez apresentada no produto seja menor do que a prevista na legislação brasileira, todas as

demais características são adequadas às regulamentações técnicas vigentes.

A baixa acidez e sabor suave do leite probiótico o diferencia dos leites

fermentados disponíveis no mercado nacional, o que pode ser um atrativo para este produto.

30

REFERENCIAS

BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº

278, de 22 de setembro de 2005, atualizada em Julho de 2008. Alimentos com alegações de

propriedades funcionais e ou de saúde, novos alimentos/ingredientes, substâncias bioativas e

probióticos. Disponível em: < http://www.anvisa.gov. br/alimentos/

comissoes/tecno_lista_alega.htm>. Acesso em: 01 ago. 2014.

BRASIL. Resolução RDC nº. 12, de 2 de janeiro de 2001. Regulamento técnico sobre padrões

microbiológicos para alimentos. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 2001. Disponível em:

<http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/12_01rdc.htm>. Acesso em: 28 jun. 2014.

BRASIL. Resolução RDC nº. 5, de 13 novembro de 2000. Regulamento técnico sobre os

Padrões de identidade e qualidade de leites fermentados, constantes do anexo desta

Resolução. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 2000.

CHIANG, Y. J. et al. Cbl-b regulates the CD28 dependence of T-cell activation. Nature,

London, v. 403, n. 6766, p. 216-20, 2000.

DAVE, R. I.; SHAH, N. P. Effect of cysteine on the viability of yoghurt and probiotic

bacteria in yoghurt made with commercial starter cultures. International Dairy Journal,

Barking, v. 7, p. 537-545, 1997.

DEKKER, J. W. et al. Safety aspects of probiotic bacterial strains Lactobacillus rhamnosus

HN001 and Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019 in human infants aged 0–2 years.

International Dairy Journal, Barking, v. 19, p. 149-54, 2009.

FERREIRA, C. L. L. F. Prebióticos e probióticos: atualização e prospecção. Viçosa:

Universidade Federal de Viçosa, 2003.



probiotics. Trends in Food Science & Technology, Cambridge, v. 10, n. 4, p. 139-157, 2002.

HELLER, K. J. Probiotic bacteria in fermented foods: product characteristic and starter

organisms. American Journal of Clinical Nutrition, New York, v. 73, p. 3745-3795, 2001.

LUGONJA N. M. et al. Comparative investigation of an in vitro and clinical test of the

bifidogenic effect of an infant formula. Journal of Clinical Biochemistry Nutrition,

Minake, v. 47, n. 3, p. 208-216, 2010.

MORI, H. et al. Isolation and structural identification of bifidogenic growth stimulator

produced by Propionibacterium freudenreichii. Journal of Dairy Science, Champaign, v. 80,

p. 1959-1964, 1997.

ÖZER, B. H.; KIRMACI, H. A. Quality attributes of Yogurt and Functional Dairy Products.

In: YILDIZ, F. (ed.). Development and manufacture of yogurt and other functional dairy

products. UK: CRC Publish, 2010. p. 223-259.

31

SAMONA, A.; ROBINSON, R. K.; MARAKIS, S. Acid production by bifidobacteria and

yoghurt bacteria during fermentation and storage of milk. Food Microbiology, London, v. 13,

n. 4, p. 275-280. 1996.

SOUSA, A. L. O. Viabilidade de Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019 em

fórmulas infantis probióticas durante o armazenamento a 4 ºC. 2011. 68 f. Dissertação

(Mestrado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, São Paulo,

2011.

STATSOFT. Statistica for Window: computer programa manual. Versão 6.0. Tulsa: Statsoft

Inc., 2001.

THAMER, K. G.; PENNA, A. L. B. Caracterização de bebidas lácteas funcionais fermentadas

por probióticos e acrescidas de prebiótico. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v.

6, n. 3, p. 589-595, 2006.

32

4 ARTIGO 2 - EFEITOS DE Bifidobacterium lactis HN019 NA MASSA CORPORAL,

METABOLISMO GLICÍDICO, LIPIDICO E MARCADORES INFLAMATÓRIOS

EM PACIENTES COM SINDROME METABÓLICA

Luciana Jesus Bernini1, Andrea Name Colado Simao

2, Cinthia H. Batista de Souza

1,Isaías

Dichi3, Gisele Nobre Costa

1.

1 Universidade Norte do Paraná – UNOPAR – Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite e

Derivados, Rua Marselha, 591, Jardim Piza, 86041-140, Londrina, PR, Brasil.

2 Departamento de Patologia, Análises Clínicas e Toxicologia da Universidade de Londrina,

Av. Robert Koch, 60 - Vila Operária, Londrina - PR, 86038-350, Londrina, PR, Brasil

3 Departamento de Clínica Médica da Universidade de Londrina, Av. Robert Koch, 60 - Vila

Operária, Londrina - PR, 86038-350, Londrina, PR, Brasil

* Corresponding author: Giselle Nobre Costa

E-mail: [email protected]

Tel.: +55 43 3371-7723

Fax: +55 43 3371-7834

Running headline: Efeito B. lactis

33

RESUMO

A síndrome metabólica (SM) tem sido motivo de grande interesse nos últimos anos, ela

agrupa uma série de fatores de riscos cardiovasculares, dentre outros fatores, estão a

deposição de gordura visceral e resistência à insulina. Do ponto de vista clínico é

recomendado o tratamento da obesidade, assim como o tratamento específico dos outros

fatores de risco associados. Sendo assim, a adoção de um plano alimentar saudável é

fundamental no tratamento da SM. Atualmente, estudos em humanos evidenciam efeitos

benéficos de microrganismos probióticos sobre a saúde humana e estes efeitos sobre a SM

têm sido abordados. Compreendendo a importância do tema o objetivo deste estudo foi

avaliar o efeito do consumo de um leite probiótico contendo Bifidobacterium lactis HN019

nos parâmetros clássicos da SM. Para avaliar estes efeitos, cinquenta e um indivíduos com

SM foram selecionados e divididos em dois grupos: grupo controle (n = 25) não tratado e

grupo tratado (n = 26) que consumiu o leite probiótico durante 45 dias. Os efeitos de B. lactis

foram avaliados em amostras sanguíneas dos voluntários nos tempos zero, 45 e 15 dias pós-

consumo. Após ingestão diária de 80 mL do leite probiótico com 2,72 x 1010

UFC/dose de B.

lactis HN019, o grupo probiótico apresentou redução significativa do índice de massa

corporal (p = 0,0166), colesterol total (p = 0,0092) e de lipoproteína de baixa densidade (P =

0,0081) em relação aos valores basais e em comparação com o grupo controle. Além disso,

houve diminuição significativa nas citocinas pró-inflamatórias TNF-( p = 0,0327) e IL-6(p = 0,0438). Em conclusão, estes dados mostraram potenciais efeitos do B. lactis HN019 na

redução da obesidade, lipídeos, bem como em alguns marcadores inflamatórios, o que pode

levar à diminuição dos fatores de risco cardiovasculares e de resistência à insulina em

pacientes com SM.

Palavra Chave: Doenças metabólicas. Efeito de probióticos. Imunomodulação. Obesidade.

ABSTRACT

The metabolic syndrome (MetS) has been of great interest in recent years, it brings together a

number of cardiovascular risk factors, among other factors, are the deposition of visceral fat

and insulin resistance. From a clinical standpoint is the recommended treatment of obesity, as

well as the specific treatment of other associated risk factors. Thus, the adoption of a healthy

diet is essential in the treatment of MetS. Currently, human studies show beneficial effects of

probiotic microorganisms on the parameters of the MetS. Understanding the importance of the

topic the aim of this study was to evaluate the effect of consumption probiotic milk containing

Bifidobacterium lactis HN019 in the classical parameters of the MetS. To assess these effects,

fifty one subjects with MetS were selected and divided into two groups: control group (n =

25) untreated and treated group (n = 26) who consumed the probiotic milk for 0, 45 days of

the consumtion of the probiotic milk and 15 days post-cosumption. The effects of B. lactis,

were assessed in blood samples of subjects. Following daily ingestion of 80 mL of probiotic

milk with 2.72 x 1010

CFU/ daily of B. lactis HN019, the probiotic group showed significant

reduction in body mass index (P = 0.0166), total cholesterol (P = 0, 0092) and low-density

lipoprotein (p = 0.0081) compared to baseline and compared with the control group.

Furthermore, a significant decrease in TNF- (p = 0.0327) and IL-6 (p = 0.0438) pro-

inflammatory cytokines. In conclusion, these data showed potential effects of B. lactis HN019

in reducing obesity, lipids as well as certain inflammatory markers, which may reduce

cardiovascular risk and insulin resistance in patients with MetS.

Keyword: Metabolic. Effectof probiotics. Immunomodulation. Obesity.

34

INTRODUÇÃO

A microbiota intestinal é cada vez mais associada às funções metabólicas de

proteção do organismo do hospedeiro (GUARNER; MALAGELADA, 2003; OWEHAND et

al., 2002). Atualmente, o estado de saúde geral de um indivíduo tem sido atribuído ao

equilíbrio ou a disbiose desta microbiota que é vista como um importante modulador da

homeostase intestinal. As interações desta microbiota com a mucosa epitelial e o tecido

linfóide, estimulam o sistema imunomodulador no hospedeiro (JANKOVIC et al., 2010; SHI;

WALKER, 2004). Além disso, a composição da microbiota do TGI vem sendo discutida e

considerada um importante fator na regulação do peso corporal e de doenças associadas à

obesidade (SANZ; SANTACRUZ; DALMAU, 2009).

A Síndrome Metabólica (SM) é descrita como um conjunto de desordens no

organismo, cujos fatores de risco metabólicos são a dislipidemia aterogênica (hiper-

trigliceridemia, níveis elevados de apolipoproteína B, partículas pequenas e densas de LDL-

colesterol e níveis baixos de HDL-colesterol), hipertensão arterial, hiperglicemia e um estado

pró-inflamatório e pró-trombótico (GRUNDY et al., 2005). A I Diretriz Brasileira de

Diagnóstico e Tratamento da Síndrome Metabólica acompanha as definições propostas pelo

Adult Treatment Panel of the National Cholesterol Education Program-NCEP/ATP III

(GRUNDY et al., 2004; NATIONAL CHOLESTEROL EDUCATION PROGRAM, 2002).

que caracteriza a SM como a combinação de pelo menos três componentes desses listados

anteriormente. As Pessoas portadoras da SM têm alto risco de desenvolver diabetes tipo 2 e

doença cardiovascular aterosclerótica (CORNIER et al., 2008).

A obesidade é uma das doenças que mais crescem no mundo (PISTELLI;

COSTA, 2010). Neste contexto, é considerada um problema de saúde pública, devido ao

aumento rápido da prevalência e sua alta correlação com doenças como síndrome metabólica,

diabetes e doenças cardiovasculares (MILLION et al., 2013; SANZ; SANTACRUZ;

DALMAU, 2009; SANTA CRUZ et al., 2010).

Há vários fatores genéticos e ambientais, tais como dieta, comportamento

cultural e status sócio-econômico, que influênciam a ocorrência de obesidade (SANTA CRUZ

et al., 2010). Além disso, a composição da microbiota do TGI tem sido fortemente associada

àobesidade (MILLION et al., 2013; SANZ; SANTACRUZ; DALMAU, 2009). A adoção de

uma dieta saudável é fundamental no tratamento da síndrome metabólica e segundo Pistelli e

Costa (2010), o desenvolvimento da obesidade nos seres humanos pode ser influenciado pelas

35

proporções relativas de alguns filos principais de bactérias da microbiota intestinal,

Bacteroidetes, Firmicutes e Actinobacterias, sugerindo que a atividade metabólica destes

microbióticos intestinais facilita a extração e/ou a estocagem das calorias ingeridas.Por outro

lado, o desequilíbrio neste ecossistema pode levar não só a obesidade, mas também ao

desenvolvimento da resistência à insulina (MILLION et al., 2013; SANZ; SANTACRUZ;

DALMAU, 2009; SANTA CRUZ et al., 2010).

Atualmente o TGI deixou de ser visto apenas como um tubo digestivo para

ser reconhecido como o principal alvo de respostas imunes, adicionalmente, a associação do

consumo de probiótico a incrementos do sistema imunomodulador têm sido bem suportado

por estudos clínicos (OWEHAND, 2007; PESSI et al., 2000) e há um consenso quanto ao

equilíbrio da microbiota intestinal e estes efeitos. Em contrapartida o desequílibrio desta

interação é diretamente correlacionada à ocorrência de doenças (COSTA; MIGLIORANZA,

2013).

A utilização de bifidobactérias relacionadas à incrementos no sistema

imunomodulador humano, inibição de bactérias patogênicas, alterações benéficas no balanço

microbiano de adultos e idosos são relatados (AHMED et al., 2007; GOPAL; PRASAD; GIL,

2003; SANDERS, 2006). A interação entre probióticos e enterócitostem sido descrito como

fator chave da imunomodulação e a alta capacidade de adesão de B. lactis HN019 pode ser

um dos fatores que associam seus efeitos benéficos no sistema imune(GOPAL et al., 2001).

Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a influência de um leite

probiótico com B. lactis HN019 nos parâmetros relacionados com a SM bem como fatores

relacionados a risco de doenças cardiovasculares.

MATERIAL E MÉTODOS

Seleção do grupo teste

O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com

Seres Humanos da Universidade Estadual de Londrina sob protocolo Nº 185/2013.

Os voluntários à pesquisa foram selecionados na cidade de Jataizinho,

Paraná. Foram convocados indivíduos portadores de Síndrome Metabólica (SM) de acordo

com os critérios propostos pelo NCEP/ATP III. (NATIONAL CHOLESTEROL

EDUCATION PROGRAM, 2002). Foram excluídos pacientes com doenças crônicas ou

36

indivíduos com uso de medicamentos que interfiram no perfil lipídico e/ou glicêmico,

antibióticos e anti-inflamatórios, vitaminas e suplementos alimentares e alimentos nos quais

contenham microrganismos probióticos. Após a avaliação, 51 indivíduos foram selecionados

para integrar o grupo clinico em avaliação. O grupo selecionado foi orientado a não modificar

seus hábitos alimentares e/ou atividades físicas durante a vigência do estudo.

Indivíduos e delineamento do estudo

O estudo teve um tempo de duração de 60 dias (Esquema 1). Os voluntários

foram divididos em dois grupos distintos. Grupo controle com 25 indivíduos (G1) que não

receberam tratamento e grupo tratado com 26 indivíduos que ingeriram, diariamente durante

45dias, 80 mL de leite probiótico com contagem (UFC/mL) não inferior a 2,72x1010

UFC/dose

de Bifidobacterium lactis HN019. Durante o tratamento foram coletadas amostras de sangue

aos 0 e 45 dias de tratamento, além de 15 dias pós- tratamento para avaliação dos efeitos do

probiótico.

Esquema 1 - Delineamento do estudo composto por 51 indivíduos voluntários e respectivos

tempos de coleta de amostras sanguíneas para o grupo controle (não tratado) e grupo

probiótico (tratado).

Fonte: Da autora.

Análises laboratoriais

Coleta e preparo das amostras sanguíneas

As amostras de sangue,controle de peso, pressão arteriale circunferência

abdominal foram obtidas nos tempos previamente determinados (Esquema 1), após 12 horas

de jejum, no posto de saúde Central da cidade de Jataizinho-PR. A coleta foi efetuada pela

equipe de saúde e bem estar social da cidade de Jataizinho com acompanhamento da

37

Farmacêutica/Bioquímica Luciana Jesus Bernini, discente do programa de mestrado em

Ciência e Tecnologia do Leite e Derivados da Unopar.

As amostras coletadas em cada período proposto, foram conduzidas ao

Laboratório de Imunologia Clínica do Hospital Universitário de Londrina para análises. O

plasma e soro foram aliquotados e armazenados em freezer a - 70ºC (Indrel) até a realização

das dosagens de citocinas. Para as demais análises as amostras seguiram o fluxo normal de

realização de exames no referido laboratório.

Parâmetros bioquímicos, imunológicos e hematológicos

O perfil lipídico e glicêmico foi obtido por análises de colesterol total e

frações, triacilglicerol, ácido úrico, - glutamil transferase (GGT), alanino amino transferase

(ALT), aspartato amino transferase (AST), glicose, proteínas totais e frações, efetuadas em

um auto-analisador bioquímico (Dade AR), utilizando-se kits Dade Behring

( Illinois, USA).

Dosagem de CD45, CD3, CD4 e CD8

Foi realizada a contagem por citometria de fluxo de leucócitos totais

(CD45), linfócitos totais (CD3), e a subpopulações de linfócitos auxiliares T CD4+ e

CD8+,utilizando citômetro de fluxo FACS Calibur (BD – Bioscience)

Dosagem de citocinas

As dosagens das citocinas, IL-1, IL-6 e TNF- foram realizadas por enzima

imunoensaio (ELISA), utilizando kit da R&D System.

Análise estatística

As análises estatísticas foram avaliadas utilizando o teste Wilcoxon para

verificar mudanças na linha de base (mudanças intra-grupos). O teste de Dunn (post-hoc) para

observar as diferenças entre os tratamentos (p<0,05). Os dados foram apresentados como

médias Todas as análises foram realizadas utilizando o programa estatístico GraphPadPrism

versão 4.0.

38

RESULTADO E DISCUSSÃO

O leite probiótico foi produzido e caracterizado no Laboratório do Mestrado

em Ciência e Tecnologia do Leite e Derivados, Jardim Piza. O produto pronto para o consumo

apresentou alta contagem do microrganismo probiótico com 3,4 x 108 UFC/mL, teor de acidez

de 0.38%, pH 5.15, conteúdo proteico de 2.80%, carboidratos e extrato seco totais com 7.54%

e 12.08% respectivamente e, 0.48% de cinzas. Não foi detectada microrganismos patogênicos,

conforme preconiza a legislação (BRASIL, 2001), portanto, o produto se caracteriza como

adequado para consumo. Após análises de rotina um lote com 7 frascos de 80 mL foi

distribuído a cada voluntário semanalmente até completarem 45 dias de ingestão.

Durante o período proposto para o estudo, apenas um dos voluntários do

grupo tratado deixou de participar do grupo, alegando efeitos típicos de intolerância à lactose.

Embora o questionário de recrutamento excluísse indivíduos com esta característica.

Neste período de avaliação não houve diferença significativa intra-grupos

ou inter-grupos para as medidas de circunferência abdominal, nos níveis de pressão arterial

sistólica, diastólica, níveis de triglicerídeos, HDL colesterol, glicose, insulina, bem como no

HOMA (Homeostatic Model Assessment) (Tabela 2). Entretanto, o IMC, colesterol total e

LDL colesterol apresentaram diferenças significativas (p<0,05) tanto intra quanto inter-grupos

se comparando ao grupo controle (não tratado). Esses dados são bastante importantes, pois

associam o efeito de B. lactis HN019 ao metabolismo lipídico do hospedeiro.

Alguns estudos associam filos e até especies da microbiota intestinal à

tendencia a obesidade ou perda de peso em humanos. Nestes estudos a presença de altos

níveis de bifidobacterias no trato gastrointestinal (TGI) é relacionada à perda de peso (LEY et

al., 2005; MILLION et al., 2013; SANTACRUZ et al., 2010). Embora neste estudo não

ocorra caracterização da microbiota fecal, a ingestão diária de alta contagem do

microrganismo B. lactis como microbiótoca alóctone, pode influenciar positivamente no

balanço microbiano (ISOLAURI; SALMINEN; OWEHAND, 2004; SAARELA, et al., 2000)

culminando na melhora do metabolismo lipidico bem como na perda de peso.

39

Tabela 2- Dados antropométricos, pressão sanguínea e parâmetros laboratoriais do grupo

controle e grupo tratado que consumiram leite probiótico durante 45 dias. Parâmetros Controles (n=25) Probiótico (n=26)

T0 T45 P T0 T45 p

IMC (kg/m2) * #

35.8

(33.4-44.5)

35.5

(32.2-40.7)

0.9658 30.8

(27.2-33.7)

29.5

(25.9-33.3)

0.0166

CA (cm) 107.0

(101.0-128.0)

109.0

(99.5-124.5)

0.0840 105.0

(98.5-112.5)

107.0

(98.5-115.0)

0.2077

PAS (mmHg) 125.0

(112.8-139.0)

121.0

(110.0-131.0)

0.1349 130.0

(120.0-150.0)

140.0

(127.5-150.0)

0.9739

PAD (mmHg) 77.5

(70.0-90.0)

72.5

(63.5-82.3)

0.1906 80.0

(80.0-97.5)

90.0

(80.0-100.0)

0.8422

Triacilglicerol

(mg/dL)

199.0

(103.3-251.3)

168.5

(113.5-221.3)

0.5971 163.0

(128.0-314.5)

174.0

(124.0-296.0)

0.8077

Colesterol

(mg/dL) # *

199.0

(166.5-208.5)

205.0

(173.0-220.5)

0.5056 209.0

(183.8-249.8)

194.0

(168.0-251.0)

0.0092

HDL (mg/dL) * 42,0

(35.0-47.5)

39.0

(35.5-47.0)

0.6165 40.5

(30.0-49.5)

38.5

(31.3-46.0)

0.8196

LDL (mg/dL) *# 117.0

(83.0-142.0)

115.0

(95.0-146.0)

0.8195 128.5

(103.0-152.8)

111.0

(93.6-134.6)

0.0081

Glicose (mg/dL) 98.0

(94.0-115.5)

99.0

(91.0-113.0)

1.0000 94.0

(82.5-115.5)

97.0

(88.3-124.3)

0.4236

Insulina (uU/mL) 13.90

(9.93-17.78)

13.65

(9.46-21.78)

0.1065 13.4

(8.18-17.3)

15.3

(10.2-17.4)

0.1711

HOMA 3.63

(2.09-4.44)

3.23

(2.33-5.55)

0.1194 3.43

(2.29-4.77)

4.09

(3.37-5.87)

0.1961

Teste de Wilcoxonem pares para verificar alterações da linha de base (variaçõesintra-grupo). Teste de Mann-

Whitney para comparar as diferenças entre as linhas de base e entre os grupos de tratamento (alterações inter-

grupo). Os dados são apresentados como média (25% -75%). CA: Circunferência abdominal; PAS: pressão

arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica. *Diferenças entre grupos controle (linha de base) p <0,05.

#

Diferença entre os grupos de tratamento (p <0,05).

Fonte: Da autora.

A redução do colestrol total e lipoproteína de baixa densidade (LDL) no

grupo probiótico, corrobora com alguns dados da literatura (DIETSCHY; TEIXEIRA;

SLEIMAN, 2001; LIONG; SHAH, 2004). Embora, o primeiro relato científico relacionando à

diminuição do colesterol sérico tenha sido reportado em 1974 (MAHAN; ESCOTT-STUMP,

1998) outros estudos têm focado nesta abordagem.

Os mecanismos propostos para estes efeitos são associados a assimilação do

40

colesterol durante a multiplicação bacteriana ou a ligação do colesterol à superfície da parede

celular destas bactérias, tornando indisponível a absorção através do intestino para a corrente

sanguínea (BRASHEARS; GILLILAND; BUCK, 1998; DILMI-BOURAS, 2006; GREANY

et al.,2008; HYEONG-JUN; KIM; LEE, 2004; LIONG; SHAH, 2004; MANZONI et al.,

2008). Há também mecanismos relacionados à capacidade de alguns microrganismos

probióticos em produzir hidrolases que desconjugam ácidos biliares. Estes compostos quando

desconjugados são reabsorvidos com menor eficiência resultando em aumento da sua

excreção nas fezes. Como o colesterol é precursor da síntese de ácidos biliares, à medida que

aumenta a demanda para síntese destes ácidos que devem ser repostos, ocorre redução das

concentrações plasmáticas de colesterol. Outra hipótese associa a redução do colesterol

plasmático a uma menor absorção de lipídeos devido à co-precipitação do colesterol

juntamente com os ácidos biliares desconjugados, menos eficientes na solubilização e

absorção de lipídeos provenientes da dieta (BEGLEY; HILL; GAHAN, 2006).

O consumo de probióticos tem sido associado ao aumento da concentração

de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) que melhoram o metabolismo dos lipídios, agindo

diretamente no fígado e inibindo a lipogênese (ZHAO; YANG, 2005).

No estudo de Diamant, Blaak e Vos (2010), os autores sugerem que a

atividade metabólica intestinal facilita a extração e estocagem de calorias ingeridas e

associam a ocorrência de respostas inflamatórias à dietas ricas em gorduras que atuariam

como gatilho desencadeando este processo. Lipopolissarídeos bacterianos derivados de

microrganismos intestinais podem atuar neste processo desencadeando resposta inflamatória e

consequentemente síndrome metabólica.

As citocinas TNF- e IL6, mediadores da imunidade inata, diminuíram

(p<0,05) com 45 dias de ingestão do probiótico (Figuras 1A e B). Estas citocinas são

comumente relacionadas a reações inflamatórias.

Dentre as principais citocinas relacionadas à obesidade, as adipocinas:

adiponectina, o TNF-α e a IL-6 vêm sendo largamente estudadas. O acúmulo de tecido

adiposo causado pela obesidade acarreta um aumento da produção destas adipocinas, que ao

estimular a produção de proteínas de fase aguda pelo fígado, conduzem a um estado

inflamatório subclínico, associado ao surgimento das comorbidades presentes na obesidade

como resistência à insulina (ORTIZ, 2007). Portanto, a redução dos níveis de TNF-α e IL-6

(Figuras 1 A e B), podem ser diretamente relacionadas à redução do IMC no grupo tratado

durante 45 dias de consumo do probiótico B. lactis HN019.

41

Figura1 - Concentração das citocinas Fator de necrose tumoral alfa (TNF-) e interleucina-6

(IL-6) no grupo controle e grupo probiótico avaliados nos tempos zero e 45 dias de

ingestão do probiótico.

A B Fonte: Da autora.

Em um sistema imunológico com condições fisiológicas normais,

encontram-se vários tipos de linhagens de células T com função de secreção de citocinas,

responsáveis pela ativação da resposta imunológica. Os dados de quantificação de CD3, CD4

e CD8 não apresentaram diferença significativa no nível avaliado em 45 dias de uso do leite

probiótico, embora CD4 e CD8 se mostrem aumentados com relação à linha de base (Figura

2).

Figura 2 - Dosagens dos linfócitos T (CD3, CD4 e CD8), associados à imunidade celular, nos

tempos 0 e 45 dias de tratamento no grupo probiótico.

CONT T

0

CONT T

45

PROB T

0

PROB T

45

0

1

2

3

4

5

p=0.0327

TN

F-a

lph

a (

pg

/mL

)

CO

NT T

0

CO

NT T

45

PRO

B T

0

PRO

B T

45

0

5

10

15

20

p=0.0438

IL-6

(p

g/m

L)

TO T

45

0

500

1000

1500

2000

CD

4 (

uL

)

TOT45

0

200

400

600

800

CD

8 (

uL

)

Fonte: Da autora

TO T

45

0

500

1000

1500

2000

2500

CD

3 (

uL

)

42

Os nosso dados evidenciam que o consumo regular de B. lactis HN019, pode ser

favorável à redução dos parâmentros característicos da SM e obesidade.

Estudos têm mostrado efeitos positivos do uso de probióticos nas desordens

metabólicas e regulação do peso corpóreo, Neste contexto, a relação entre microbiota,

obesidade, diabetes e SM são cada vez mais evidentes, entretanto, ainda existem muitos

efeitos e mecanismos a serem esclarecidos.

O principal desafio, atualmente, está em identificar bactérias benéficas que

ajudem no controle da obesidade e desordens metabólicas relacionadas.

43

REFERÊNCIAS

AHMED, M. et al. Impact of consumption of different levels of Bifidobacterium lactis

HN019 on the intestinal microflora of elderly human subjects. The Journal of Nutrition,

Health and Aging, Paris, v. 11, n. 1, p. 26-31, 2007.

BEGLEY, M.; HILL, C.; GAHAN, C. G. M. Bile salt hydrolase activity in probiotics.

Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 72, n. 3, p. 1729-1738, 2006.

BRASHEARS, M. M.; GILLILAND, E.; BUCK, L. M. Bile salt deconjugation and

cholesterol removal from media by Lactobacillus casei. Journal of Dairy Science,

Champaign, v. 81, p. 2103-2110, 1998.

BRASIL. Resolução RDC nº. 12, de 2 de janeiro de 2001. Regulamento técnico sobre padrões

microbiológicos para alimentos. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 2001. Disponível em:

<http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/12_01rdc.htm>. Acesso em: 28 jun. 2014.

CORNIER, M. A. et al. The metabolic syndrome. Endocrine Reviews, Chevy Chase, v. 29,

n. 7, p. 777-822, 2008.

COSTA, G. N.; MIGLIORANZA, L. H. S. Micro-organismos probióticos: caracterização de

linhagens e seus efeitos no hospedeiro. Boletim CEPPA, Curitiba, v. 31, n. 2, p. 196-205,

2013.

DIAMANT, M.; BLAAK, E. E.; VOS, W. M. Do nutrient gut microbiota interactions play a

role in human obesity, insulin resistance and type 2 diabetes? International Assoc for the

Study of Obesity, Europe, v. 797, p. 1-10, 2010.

DIETSCHY, J. M.; TEIXEIRA, M.; SLEIMAN, J. Atualizações no tratamento dietoterápico

nas dislipidemias. Revista Nutrição Saúde e Performance: Anuário de Nutrição Clínica,

São Paulo, v. 13, p. 17, 2001.

DILMI-BOURAS, A. Assimilation (in vitro) of cholesterol by yogurt bacteria. Annals of

Agricultural and Environmental Medicine, Lublin, v. 13, n. 1, p. 49-53, 2006.

GOPAL, P. K. et al. In vitro adherence properties of Lactobacillus rhamnosus DR20 and

Bifidobacterium lactis DR10 strains and their antagonistic activity against an enterotoxigenic

Escherichia coli. International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v. 67, p. 207-

216, 2001.

GOPAL, P.K; PRASAD, J.; GIL, H. S. Effects of the consumption of Bifidobacterium lactis

HN019 and galacto-oligoccharideson the microflora of the gastrointestinal tract in human

subjects. Nutrition Research, Tarrytown, v. 23, p. 1313-1328, 2003.

GREANY, K. A. et al. Probiotic capsules do not lower plasma lipids in young women and

men. European Journal of Clinical Nutrition, London, v. 62, n. 3, p. 232-237, 2008.

GRUNDY, S. M. et al. Definition of metabolic syndrome: report of the NIH/ AHA

conference on scientific issues related to definition. Circulation, Baltimore, v. 109, p. 433-8,

2004.

44

GRUNDY, S. M. et al. Diagnosis and management of the metabolic syndrome: an American

Heart Association/National Heart, Lung, and Blood Institute Scientific Statement.

Circulation, Dallas, v. 112, n. 17, p. 2735-2752, 2005.

GUARNER, F.; MALANGELADA, J. R. Gut flora in health and disease. Lancet, New York,

v. 361, p. 512-519, 2003.

HYEONG-JUN, L.; KIM, S. Y.; LEE, W. K. Isolation of cholesterol lowering lactic acid

bacteria from human intestine for probiotic use. Journal of Veterinary Science, Suwon, v. 5,

n. 4, p. 391-395, 2004.

ISOLAURI, E.; SALMINEN, S.; OWEHAND, A. C. Probiotics. Best Practice & Research

Clinical Gastroenterology, Netherlands, v. 18, n. 2, p. 299-313, 2004.

JANKOVIC, I. et al. Application of probiotics in food products—challenges and new

approaches. Current Opinion in Biotechnology, London, v. 21, p. 175–181, 2010.

LEY, R. E. et al. Obesity alters gut microbial ecology. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, Washington, v. 102, n. 31, p. 11070-

11075, 2005.

LIONG, M. T.; SHAH, N. P. Acid and bile tolerance and the cholesterol removal ability of

bifidobacteria strains. Bioscience and Microflora, v. 24, n. 1, p. 1-10, 2004.

MAHAN, L. K.; ESCOTT-STUMP, L. Alimentos nutrição e dietoterapia. São Paulo: Roca,

1998.

MANZONI, M. S. et al. Fermented soy product supplemented with isoflavones affects

adipose tissue in a regional-specific manner and improves HDL cholesterol in rats fed on a

cholesterol-enriched diet. European Food Research and Technology, Berlin, v. 227, p.

1591-1597, 2008.

MILLION, M. et al. Gut bacterial microbiota and obesity. Clinical Microbiology and

Infection, Paris, v. 19, n. 4, p. 305-313, 2013.

NATIONAL CHOLESTEROL EDUCATION PROGRAM (NCEP). Detection, evaluation,

and treatment of high blood cholesterol in adults (Adult Treatment Panel III): final

report. 3. ed. [S. l.: s. n.], 2002.

ORTIZ, J. N. M. Adiponectina, TNF-α e IL-6 em pacientes portadores de obesidade

grave: relação com a sensibilidade à insulina e com a tolerância à glicose. 2007. 94 f.

Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de

Campinas, Campinas, 2007.

OWEHAND, A. C. Antiallergic effects of probiotics. The Journal of Nutrition, Bethesda, v.

137, n. 3, p. 794-797, 2007.

OWEHAND, A.C. et al. Resected human colonic tissue: new model for characterizing

adhesion of lactic acid bacteria. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology.

Washington, v. 9, n. 1, p.184-186, 2002

45

PESSI, T. et al. Interleukin-10 generation in atopic children following oral Lactobacillus

rhamnosus GG. Clinical and Experimental Allergy, Oxford, v. 30, n. 12, p. 1804-1808,

2000.

PISTELLI, G. C.; COSTA, C. E. M. Bactérias intestinais e obesidade. Revista Saúde e

Pesquisa, São Paulo, v. 3, n. 1, p. 115-116, 2010.

SAARELA, M. et al. Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties.

Journal of Biotechnology, Amsterdam, v. 84, p. 197-215, 2000.

SANDERS, M. E. Probiotics: considerations for humanhealth. Nutrition Review,

Washington, v. 61, n. 3, p. 91-99, 2006.

SANTACRUZ, A. et al. Gut microbiota composition is associated with body weight, weight

gain and biochemical parameters in pregnant women. British Journal of Nutrition,

Cambridge, v. 104, p. 83-92, 2010.

SANZ, Y.; SANTACRUZ, A.; DALMAU, J. Influencia de la microbiota intestinal em la

obesidad y las alteraciones del metabolismo. Acta Pediatrica Espanhola, Madrid, v. 67, n. 9,

p. 437-442, 2009.

SHI, H. N.; WALKER, W. A. Bacterial colonization and the development of intestinal

defenses. Canadian Journal of Gastroenterology, Oakville, v. 18, n. 8, p. 493-500, 2004.

ZHAO, J.R.; YANG, H. Progress in the effect of probiotics on cholesterol and its mechanism.

Wei. Sheng. Wu. Xue. Bao, v. 45, n.2, p. 315-319, 2005.

46

5 CONCLUSÕES GERAIS E PERSPECTIVAS

Neste estudo, a formulação de um leite probiótico e introdução deste

produto na dieta de um grupo clinico cujos indivíduos são portadores de SM, possibilitou a

avaliação de alguns efeitos do probiótico na população em estudo.

O leite contendo B. lactis HN019, foi caracterizado como probiótico

devido à alta viabilidade, 3,4 x 108 UFC/mL, da linhagem no produto pronto

para consumo e durante 30 dias de estocagem refrigerada;

O leite probiótico não apresentou crescimento de microrganismos

potencialmente patogênicos ou deteriorantes, como bolores e leveduras,

portanto, se mostrou seguro para consumo humano, nas condições

estabelecidas;

Do ponto de vista físico- químico o produto se adéqua como um leite

desnatado adoçado, probiótico, entretanto a legislação Brasileira não

preconiza padrões de identidade para este tipo de produto com acidez

inferior à 0,6% de ácido láctico;

Quanto aos efeitos do probiótico na população em estudo:

Foi observado o efeito de B. lactis HN019 na redução da massa

corporal no grupo tratado após 45 dias de consumo;

Ocorreu redução nos níveis de colesterol total e LDL colesterol no

grupo tratado, indicando o potencial do produto no controle de desordens

metabólicas como a SM;

A redução nos índices de TNF- e IL6 podem ser relacionadas à

redução do IMC no grupo tratado durante 45 dias de consumo do probiótico

B. lactis HN019.

Até o momento os nossos dados, sugerem que intervenções clínicas como o

uso de algumas linhagens probióticas, podem alterar positivamente a saúde da população em

estudo e ilustram a importância da compreensão destes efeitos na evolução da SM.

O principal desafio, atualmente, está em identificar bactérias benéficas que

ajudem no controle da obesidade e desordens metabólicas relacionadas. Os resultados obtidos

nesse estudo mostram que o consumo regular de B. lactis HN019, pode ser favorável à

redução de alguns parâmentros característicos da SM e obesidade.

47

ANEXO

48

Anexo 1 – Aprovação do Comitê de Ética

Bifidobacterium lactis “IN VIVO” EM PACIENTES COM … · Prof. Dr. Isaías Dichi. ... avaliados...

Documents

Transcript of Bifidobacterium lactis “IN VIVO” EM PACIENTES COM … · Prof. Dr. Isaías Dichi. ... avaliados...