BioCel - Métodos de Estudo Da Célula

No sculo 17, o cientista Robert Hooke foi a primeira pessoa a usar a palavra clula para

identificar estruturas microscpicas em uma fatia de rolha:

" . . . Estes poros, ou clulas, no so muito profundos, mas constituem vrias pequenas caixas.

Imagem extrada do livro Micrographia.

Robert Hooke

Livro publicado pelo microscopista Ingls Robert Hooke, em 1665.

Em 1665, Robert Hooke publicou um livro intitulado Micrographia, contendo desenhos de

praticamente tudo que podia se ver com a mais nova inveno, o microscpio.

Microscpios:

O microscpio ilustrado na figura um microscpio composto

simples utilizado pelo microscopista ingls Robert Hooke em

1660.

produzem imagem ampliada de um espcime

(objeto)

separam detalhes de uma imagem

O microscpio simples era considerado o mais elevado estado de perfeio em 1600.

Como estudamos as clulas em Biologia Celular?

Microscopia: Microscopia de Luz (ptica)

Evoluo dos Microscpios

Microscopia ptica (microscopia de luz)

Microscpio de campo claro

Microscpio de campo escuro

Microscpio de contraste de fase

Microscpio de contraste de interferncia diferencial DIC (Nomarski)

Microscpio de fluorescncia

Microscpio confocal de varrredura a laser

Tipos de microscopia ptica

Microscpio ptico

Elodea - Microscopia de luz

Corantes podem ser usados para corar clulas e aumentar

contraste de maneira que elas possam ser mais facilmente

visualizadas e identificadas ao microscpio de campo claro.

Colorao

Clulas do sangue (microscpio de campo claro)

Trichinella spiralis

encistado em msulo

esqueltico - colorao HE

(hematoxilina-eosina)

Esporos de mofo

(Lycopodium) corados com

safranina

(microscpio de campo claro)

(microscpio de campo claro)

Microscpio de contraste de interferncia

diferencial DIC (Nomarski)

Microscpio de campo claro

Microscpio de campo escuro

Microscpio de contraste de fase

Cell Biology interactive

Fig. 23.8 Megacaricito - Contraste de fase Fig. 16.11 Clula muscular cardaca - Contraste de fase Fig. 23.9 Cicatrizao de feridas - Contraste de fase Fig. 24.4 Clula T citotxica - Contraste de fase Fig. 16.2 Caa e fagocitose de bactrias por neutrfilos - Contraste de fase Fig. 20.1 Clulas de cncer de mama - Contraste de fase Fig. 16.2 - Quimiotaxia de neutrfilos vs. bactrias - Contraste de fase

Fig. 15.2 Quimiotaxia de neutrfilos - DIC Fig. 19.2 Rolagem de linfcitos - Contraste de fase Fig. 23.10 Homing de linfcitos - DIC Fig. 21.5 Clulas precursoras de de neurnios do hipocampo do crebro de embrio de roedor - Contraste de fase + DIC

Fig. 1.1 Dana do queratcito - DIC

Microscpio de fluorescncia

Sondas de fluorescncia


Fig. 17.7 Fuso mittico / diviso de clula animal Fluorescncia

Tcnica de imunofluorescncia indireta (uso de anticorpos como ferramentas de estudo)

Anticorpos podem ser

acoplados a sondas

fluorescentes

Microscopia de fluorescncia

Microscpio de

contraste de

interferncia diferencial

DIC (Nomarski)

Microscpio confocal

de varrredura a laser

Microscpio de

fluorescncia

Microscpio de

fluorescncia (tcnica

de deconvoluo da

imagem)


Fig. 13.5 Fagocitose Fluorescncia Fig. 13.6 Exocitose Fluorescncia Fig. 15.1 Sinalizao de clcio / Gap junction Fluorescncia Fig. 17.4 Fuso mittico / diviso de clula animal DIC Fig. 17.6 Fuso mittico / diviso de clulas de embrio de mosca Fluorescncia Fig. 18.1 Apoptose / blebbing de membrana e fragmentao do ncleo - Contraste de fase e fluorescncia

Microscpio ptico confocal de varredura a laser

Microscpio de

fluorescncia

Microscpio confocal

de varrredura a laser

(a) Sperm triple-labeled with FITC-Pisum sativum lectin (acrosome - green); TOTO-3 iodide for

DNA (blue) and Nile red for membrane lipid (red). (b) Complete loss of the acrosome following

spermicidal treatment. Staining as in the image above. (c) Cultured epithelial cells triple

stained for the nucleus (blue), microtubules (green), and actin (red). Images were acquired

with a 20X objective (c) and a 100X objective (d).

Microscopia Confocal de Varredura a Laser

a b

c

d

Imagem Tridimensional

Microscopia Confocal de Varredura a Laser (reconstruo tridimensional de imagens confocais)

Hibridizao in situ de

RNA (Tcnica FISH

Fluorescent in situ

hybridization)


Nanopartculas

fluorescentes

(quantum dots)


Tcnica de

deconvoluo de

imagem (material

marcado com sonda

fluorescente que se liga

a DNA)



Fig. 25.6 Sinapse imunolgica / apresentao de antgeno Fluorescncia e processamento de imagem

Estrutura de GFP

(protena com

cromforo

autofluorescente ativo)

Gene de GFP acoplado

ao gene ativo em

neurnios de mosca

(Tcnica de DNA

recombinante)


Fig. 24.3 Listeria nvadindo clula hospedeira Contraste de fase e fluorescncia com marcao de GFP

Fig. 16.5 Dinmica de microtbulos in vivo - Fluorescncia com marcao de GFP Fig. 23.14 Clulas-tronco embrionrias Contraste de fase e fluorescncia com marcao de GFP


Fig. 10.6 FRAP / marcao com GFP de protenas de membrana de retculo endoplasmtico e de protenas ancoradas na membrana nuclear interna


Fig. 21.3 Ondas de Ca2+ aps fertilizao de ovos de ourio do mar - Fluorescncia


Fig. 9.1 Laser tweezer Esquema Fig. 10.1 Laser tweezer / Fluidez de membrana Fig. 23.2 Laser tweezer / estereoclios

Uso de radioistopos como marcadores de clulas

Microscopia ptica de campo claro (Tcnica de autoradiografia pelo uso de radioistopos)

Microscpio eletrnico de transmisso

Microscpio eletrnico de varredura

Microscpio eletrnico de transmisso

Microscopia Eletrnica

Microscopia Eletrnica de Transmisso

Processamento de material para observao ao microscpio

Moldeira para

emblocamento

de material

biolgico em

resina

Agentes qumicos fixadores para processamento de material biolgico para microscopia eletrnica

Agente qumico fixador:

- mata e preserva as

clulas

- fixa estruturas em sua

posio original

- permeabiliza membranas

das clulas para entrada

de novos agentes

qumicos usados no

processamento do

material biolgico

ULTRAMICROTOMIA

CORTES SERIADOS (ultrafinos 50 a 80 nanmetros de espessura)

Grade de suporte para recolher cortes ultrafinos para observao ao MET

Microscopia Eletrnica

Hexagonal 75 mesh

Quadrada 200 mesh

Grades de suporte para recolher cortes ultrafinos

para observao ao MET

Contrastao

Acetato de uranila e citrato de chumbo

CONTRASTAO POSITIVA

Objetivo:

impregnar o material biolgico com metais pesados (Exs.: chumbo - afinidade por

DNA; uranila - afinidade por membrana) para aumentar o contraste da imagem.

Normalmente, a contrastao positiva feita aplicando os agentes contrastantes de

metal pesado diretamente sobre cortes ultrafinos recolhidos em grades de suporte

para MET

Imagem de uma bactria por microscopia eletrnica de transmisso

(contrastao positiva de corte ultrafino)

Mitocndria

Ncleo Complexo de Golgi

Imagem de uma clula eucaritica por microscopia eletrnica de

transmisso (contrastao positiva de corte ultrafino)

Imagem de uma clula

de fungo por

microscopia eletrnica

de transmisso

(contrastao positiva de

corte ultrafino)


Figs. 4.4 / 4.5 Estrutura do ncleo Microscopia eletrnica de transmisso Figs. 9.2 / 9.3 / 9.4 / 12.8 Clula do fgado Microscopia eletrnica de transmisso Figs. 13.7 / 13.8 Clulas do pncreas - Microscopia eletrnica de transmisso Fig. 12.9 Clula secretora pancretica - Microscopia eletrnica de transmisso Fig. 16.12 Tecido cardaco - Microscopia eletrnica de transmisso Fig. 16.13 Clula muscular cardaca- Microscopia eletrnica de transmisso Fig. 19.3 Junes entre culas musculares - Microscopia eletrnica de transmisso Fig. 23.11 Epitlio da traquia - Microscopia eletrnica de transmisso Figs. 23.12 / 23.13 Clulas endoteliais do fgado - Microscopia eletrnica de transmisso Figs. 23.4 / 23.5 / 23.6 Epitlio do intestino - Microscopia eletrnica de transmisso Fig. 17.8 Cromossomos mitticos - Microscopia eletrnica de transmisso

Reconstruo tridimensional em microscopia eletrnica de transmisso

a partir de cortes seriados

Mtodos imunocitoqumicos em microscopia eletrnica de transmisso (MET) com a utilizao de

anticorpos acoplados a partculas de ouro coloidal (imunomarcao com ouro coloidal )

Mic

RA GD

GA

Anticorpos podem ser acoplados a esferas de ouro coloidal

(nano partculas eltron densas que variam de 5 a 40

nanmetros de dimetro)

MET

Imunomarcao de protenas por MET pelo uso anticorpos acoplados a esferas de ouro coloidal

Mtodo de preparao da rplica da

superfcie de um espcime (material

biolgico) por sombreamento com metal

Rplica sombreada com metal da

superfcie de um arranjo de protenas

filamentosas em um msculo de inseto

(rplica feita de material congelado

rapidamente em hlio lquido e submetido a

profundo descongelamento) e observada

em MET.

Agente qumico contrastante:

PTA-CIDO FOSFOTUNGSTICO

CONTRASTAO NEGATIVA

- Consiste no envolvimento

de partculas por metais

pesados e de fina

granulao, fornecendo

imagens de fundo escuro e

objeto claro

- Ideal para anlise de

suspenso viral, bactrias

e pureza de fracionamento

celular

Bacterifago

CONTRASTAO NEGATIVA em MET

Vrus da batata;

Vrus da influena Adenovrus

Adenovrus

(estudo de

forma e de

estrutura de

superfcie)

Ultraestrutura de macromolculas

- Macromolculas podem ser

observadas por microscopia

eletrnica de transmisso

atravs da tcnica de

contrastao negativa,

depositadas diretamente nas

grades.

- Sua visualizao depende

da preparao de grades

recobertas com uma fina

camada de carbono para

posterior adsoro das

molculas a serem

analisadas.

Adsoro das macromolculas superfcie das

grades revestidas por material colide,

contrastao negativa e observao ao

Microscpio Eletrnico de Transmisso

Molculas de 2M (nativa, quimiotripsina, plasmina e metilamina. Contrastao por

acetato de uranila. Aumentos - 200.000-600.000x. Delain et al. 1989.

Anlise por MET - Contrastao negativa de protenas

Anlise por MET - Contrastao negativa de filamentos de actina

Bactria endocitada por um macrfago

Bacterifago T4 Msculo estriado de gua-viva

MET

Contrastao

negativa

Contrastao positiva de cortes

ultrafinos

Microscpio eletrnico de varredura - MEV

PROCESSAMENTO DE MATERIAL BIOLGICO PARA

MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA - MERV

Imagem de uma bactria por

microscopia

eletrnica de

varredura (MEV)

Imagens (micrografias)

de estereoclios

de clula do

ouvido interno

Microscopia eletrnica

de varredura - MEV

Microscopia eletrnica

de transmisso - MET

Microscopia ptica DIC

Microscopia Eletrnica de Varredura

Formiga de fogo Lorryia formosa

Embrio de camundongo Diatomcea Pata de Centopia

Microscopia Eletrnica de Varredura

Bactrias aderidas ao arenito por estruturas semelhantes

a pednculos (a) e envolvidas por substncia amorfa -

possivelmente matriz extracelular (a e b, setas).

a

b

Bactria

Pednculo

Matriz extracelular Testemunho 02 (arenito)

TCNICA PARA PROCESASMENTO DE RPLICAS DE

CRIOFRATURA PARA ANLISE AO MICROSCPIO

ELETRNICO

TCNICA PARA

PROCESASMENTO

DE RPLICAS DE

CRIOFRATURA

PARA ANLISE AO

MICROSCPIO

ELETRNICO


Fig. 12.7 Criofratura de fungo - Microscopia eletrnica de transmisso

CRIOFRATURA

CRIOFRATURA:

FACE E

(EXTRACELULAR voltada para o meio

Extracelular aps a

fratura)

FACE P

(PROTOPLASMTICA voltada para o

citoplasma/Protoplasma

aps a fratura)

CRIOFRATURA:

MET (tcnica

de

contrastao

positiva) -

corte ultrafino

marcado com

esferas de

ouro coloidal

TOMOGRAFIA EM

MICROSCOPIA

ELETRNICA


Fig. 12.1 - Tomograma a partir de imagens de microscpio eletrnico de alta voltagem -

Compartimentos celulares / reconstruo tridimensional

Fig. 13.9 Vescula sinptica Tomograma de imagens de microscopia eletrnica de transmisso

Fig. 14.1 Mitocdria Tomograma de imagens de microscopia eletrnica de transmisso

RECONSTRUO DE PARTCULAS POR

TOMOGRAFIA EM MICROSCOPIA

ELETRNICADE MATERIAL CONGELADO

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