Danusa Menegaz, Ph.D CCB/BQM/UFSC

Patch-Clamp:Bioeletricidade como alvo terapêutico

Universidade Federal de Santa CatarinaDepartamento de Bioquímica e Eletrofisiologia

NUBIOCEL (Núcleo de Bioeletricidade Celular)

Eletrofisiologia, princípios básicos e aplicações;

Membrana plasmática, canais iônicos, gradiente eletroquímico e o potencial de ação;

Técnica de patch-clamp: equipamentos, circuito elétrico, e configurações;

Canais iônicos como alvos terapêuticos para desordens neurológicas, musculares e metabólicas;

Exemplos de registros laboratoriais em tempo-real (voltage e current-clamp);

Conteúdo Programático

1660 (Jam Swammerdam) estímulo elétrico com fio de prata observou contração muscular em sapos;

1790 (Luigi Galvani) descobriu os canais iônicos e observou o impulso nervoso entre neurônio motor e músculo em rãs;

1850 (Hermann Helmholtz) velocidade de propagação do impulso nervoso em milisegundos;

1952 (Hodkin; Huxley), primeiro registro com eletrodos intracelulares - potencial de ação em neurônio de lula gigante 0.5 mm; prêmio nobel em 1963;

1976 (Neher; Sakmann), descoberta patch-clamp, single-channel, prêmio nobel em 1991;

História da eletrofisiologia ao Patch-Clamp

Patch-Clamp Voltage-clamp (mV) e Current-clamp (pA)

Permite a investigação de um único canal iônico ou de múltiplos canais iônicos numa célula individual;

Possibilita que a voltagem seja “fixada” (mV) para registro das correntes e que a corrente seja “fixada” (pA) para registro da voltagem (potencial de ação);

O princípio do método é isolar uma parte da membrana eletricamente do meio extracelular e registrar o fluxo de correntes através dos canais com o uso de um microeletrodo de alta condutância;

Canais iônicos estão envolvidos em diversas funções fisiológicas como sinais neuronais, contração muscular, ritmo cardíaco, secreção hormonal e regulação do volume celular;

Transporte através da membrana plasmática

Tipos de canais Iônicos e fatores de ativação

Gradiente eletroquímico

Potencial de ação em células excitáveis

Preparação de soluções fisiológicas para prática experimental

Meio extracelular Meio intracelular

Osmolaridade das soluções experimentais

OSMÔMETRO

Equipamentos para técnica de patch-clamp

Plataforma: Mesas anti-vibratórias;

Mecânica e Óptica: Microscópio; Micromanipuladores; Pipetas; Sistema de Perfusão;

Eletrônica: Gaiolas de Faraday; Amplificadores; Digitalização e Aquisição de Dados; Ruído;

Patch-Clamp Set-Up

Células Isoladas Fatias de Tecidos

Circuito Elétrico

Microeletrodo - Estirador de Pipetas

Passos para atingir a configuração cell-attached para medição de single-channel

Configurações da técnica de Patch-Clamp

Modelos de Single-channel

Modelos de Whole-cell

Pulso de voltagem (Voltage-clamp) para medição das correntes

Canais de K+ e Cl-

Canais de Na+ e Ca++

Canais de Sódio e Potássio – soluções experimentais para anular correntes interferentes

Canal de K+ Canal de Na+

Pulso de corrente (current-clamp) para medição da voltagem (potencial de ação)

Doenças envolvendo Canais iônicos

Mudanças patológicas na frequência de potenciais de ação elétricos em neurônios

Kv

Atividade Elétrica da Célula β-pancreática do pâncreas

Configuração Whole-cell (current-clamp)

Biologia Molecular e Eletrofisiologia

Muito Obrigada