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Danusa Menegaz, Ph.D CCB/BQM/UFSCPatch-Clamp Technique

Universidade Federal de Santa CatarinaDepartamento de Bioqumica e Eletrofisiologia

NUBIOCEL (Ncleo de Bioeletricidade Celular)

1660 (Jam Swammerdam) estmulo eltrico; fio de prata; contrao muscular em sapos;1790 (Luigi Galvani) canais inicos e impulso nervoso entre neurnio motor e msculo em rs;1850 (Hermann Helmholtz) velocidade de propagao do impulso nervoso em milisegundos;1952 (Hodkin; Huxley), primeiro registro com eletrodos intracelulares - potencial de ao em neurnio de lula gigante 0.5 mm; prmio nobel em 1963;1976 (Neher; Sakmann), descoberta patch-clamp, single-channel, prmio nobel em 1991;

Histria da eletrofisiologia ao Patch-Clamp

Patch-Clamp Voltage-clamp (mV) e Current-clamp (pA)

Permite a investigao de um nico canal inico ou de mltiplos canais inicos numa clula individual;

Possibilita que a voltagem seja fixada para registro das correntes (pA) e que a corrente seja fixada para registro da voltagem (mV) (potencial de ao);

O princpio do mtodo isolar uma parte da membrana eletricamente do meio extracelular e registrar o fluxo de correntes atravs dos canais com o uso de um microeletrodo de alta condutncia;

Canais inicos esto envolvidos em diversas funes fisiolgicas como sinais neuronais, contrao muscular, ritmo cardaco, secreo hormonal e regulao do volume celular;

Porque?

Para qu?

Como?

Onde?

Eletrofisiologia Patch-Clamp

Transporte atravs da membrana plasmtica

Tipos de canais Inicos e fatores de ativao

Potencial de ao em clulas excitveis

Pulso de corrente (current-clamp) para medio da voltagem (potencial de ao)

Doenas envolvendo Canais inicos

Dor fsica e emocional

Mudanas patolgicas na frequncia de potenciais de ao eltricos em neurnios

http://www.thelancet.com/cms/attachment/2001010892/2003793423/gr3.jpgBloqueador de canais de Ca++ em neurnios pr-sinpticos

Role of Cannabinoids in PainManagement

Kv Atividade Eltrica da Clula -pancretica do pncreas e DIABETES

Gradiente eletroqumico

Preparao de solues fisiolgicas para prtica experimental

Meio extracelular Meio intracelular

Osmolaridade das solues experimentais

OSMMETRO

Equipamentos para tcnica de patch-clamp

Plataforma:Mesas anti-vibratrias;

Mecnica e ptica:Microscpio;Micromanipuladores;Pipetas;Sistema de Perfuso;

Eletrnica:Gaiolas de Faraday;Amplificadores;Digitalizao e Aquisio de Dados;Rudo;

Patch-Clamp Set-Up

Clulas Isoladas Fatias de Tecidos

Circuito Eltrico

Microeletrodo - Estirador de Pipetas

Passos para atingir a configurao cell-attached para medio de single-channel

Configuraes da tcnica de Patch-Clamp

Modelos de Single-channelModelos de Whole-cell

Pulso de voltagem (Voltage-clamp) para medio das correntes Canais de K+ e Cl-Canais de Na+ e Ca++

Canais de Sdio e Potssio solues experimentais para anular correntes interferentes

Canal de K+Canal de Na+

Kv Atividade Eltrica da Clula -pancretica do pncreas e DIABETES

Gradiente eletroqumico

(A)(C)(B)100 pA25 ms200 pA25 msControl (1)Wash-out (3)Glucose (2)TEA (4)Control (1)Wash-out (3)TEA (4)DTEBS (2)Ilhotas pancreticas

Clulas beta-pancreticas real-time videos

Clulas HEK293 transfectadas com canais BK Configurao Whole-cell (voltage-clamp)

Guanosina 100 M

200 pA100 ms

ATP 1 mMControlWash out TEA 20 mM

100 pA50 ms

Efluxo de K+ estimulados por ATP em clulas de Sertoli

Eletroporao em clulas de Sertoli Pulso de 1000 uA durante 20 ms

Muito Obrigada