23/07/12

1

Oximetria e a Bioenergética Mitocondrial

Instituto de Bioquímica Medica - IBqM Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ.

Programa de Biofísica e Bioquímica Celular.

Laboratório de Bioenergética e Fisiologia Mitocondrial Email: galina@bioqmed.ufrj.br  

C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + Calor “A respiração é portanto uma combustão, muito lenta é verdade, mas de qualquer forma perfeitamente semelhante à combustão do carvão ou de qualquer outra matéria orgânica. Ela ocorre no interior dos pulmões sem produzir luz perceptível, porque a matéria liberada pelo fogo é imediatamente absorvida pela umidade dos tecidos”. (Lavoisier, 1787, vol. II, 331)

Lavoisier (Tratado de Quimica Elementar, 1789)

Lei da conservação das massas:

“Matéria não se cria nem se destroi, se transforma”

O Respirômetro de Warburg

Otto Warburg

A vida se iniciou na água, e ela é fundamental para a vida na Terra atual.

A quantidade de oxigênio dissolvido na água seria então comparável a presente na Atm atual?

4 3 2 1 00

5

10

15

20

25 Dinossauros

1o metazoário ?

Explosão do Cambriano (animais e plantas)

Oxi

gê

nio

atm

osf

éric

o (

%)

Billhões de anos (passado)

Cianobactérias

Origem da vida na Terra?

Pre- cambriano

Baixo oxigênio é normóxia "Oxigênio molecular compreende cerca de 20% da nossa atmosfera, mas menos de 5% deste montante é dissolvido em equilíbrio na água. Como conseqüência dessa baixa solubilidade em água do mar, em água doce e em fluidos corporais aquosa, as células vivas são submetidos a um problema universal da disponibilidade de oxigênio." E. Gnaiger (1983) in Polarographic Oxygen Sensors. Aquatic and Physiological Applications. Springer, Berlin, Heidelberg, New York. “Os níveis de oxigênio atmosférico eram provavelmente 0,1% dos níveis atuais quando a mitocôndria se associou com as células eucarióticas cedo durante a evolução. Tais condições de baixo oxigênio persistem em ambientes extremos, e pressões de oxigênio tão baixas como 0,3-0,4 kPa (2-3 mmHg) são observados no microambiente intracelular de mitocôndrias nos tecidos sob normóxia. Mesmo assim, em estudos típicos com mitocôndrias isoladas, essas organelas são artificialmente expostas à alta pressão parcial de oxigênio na saturação do ar (cerca de 20 kPa), apesar do fato de que esta condição ser efetivamente uma hiperóxia rara em condições fisiológicas, e favorece o estresse oxidativo" Gnaiger E, Méndez G, Hand SC (2000) High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11080-11085.

Cascata respiratória dos

organismos

Sistema de Transporte de eléctrons

PO2≅ 21 kPa

PO2≅ 13 kPa

PO2≅ 10 kPa

PO2≅ 6 kPa

PO2≅ 0.3 kPa (cytoplasm)

PO2 50%≅ 0.05 kPa (cytochrome oxidase)

O eletrodo do tipo Clark consiste de uma Pt-(A) e uma referência Ag / AgCl-eletrodo (B) coberta por uma película de meia-KCl saturado electrólitos (C) dentro de uma membrana de Teflon (D), que é realizada no local por um anel de borracha (E). A tensão de alimentação (F) eo instrumento eletrônico para a medição da corrente de saída é mostrada (G).

Dr. Leland Clark

Clark, L.C. et al. (1953) J. Appl. Physiol. 6. 189-193

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Determinação da PO2 •  A concentração de oxigênio num líquido pode ser medida pela

técnica da polarografia. Faz-se a corrente elétrica fluir entre um pequeno eletrodo negativo (-) e a solução. Caso a voltagem do eletrodo apresente uma diferença maior que -0,6 volt em relação à voltagem da solução, o oxigênio irá reagir com o eletrodo.

•  Além disso, a taxa de fluxo da corrente pelo eletrodo será

diretamente proporcional à concentração do oxigênio (e, portanto, também à PO2).

O oxigênio dissolvido é reduzido no catôdo: O2 + 4H+ + 4e- → 2 H2O A prata é oxidada no anôdo: 4 Ag + 4 Cl- → 4AgCl + 4e-

A corrente gerada é proporcional a concentração de O2

The Clark or oxygen electrode.

Clark, L.C. et al. (1953) J. Appl. Physiol. 6. 189-193

H+ H+ H+ H+

I III IV V

ADP+Pi

ATP

II

NADH NAD+

SUCCINATE FUMARATE

O2 H2O

H+ H+ H+

4 H+

III IV V

ADP+Pi

ATP

II

NADH NAD+

SUCCINATO FUMARATO 2 O2 2 H2O

Matriz

Espaço Intermembranas

Cyt C

UbQH2

UbQ

UbQH2

UbQ

I

2 e-

4 e-

Potencial Elétrico ΔΨ

(Matriz negativa)

Síntese de ATP Impulsionada pela

Força Proton-motriz

(Δp = ΔΨ - Z ΔpH)

Potencial Químico ΔpH

(Matriz alcalina)

H+ H+ H+ H+

I III IV V

ADP+Pi

ATP

II

NADH NAD+

SUCCINATE FUMARATE

O2 H2O

H+ H+ H+ H+

NADH NAD+

O2 H2O

Matriz

Espaço Intermembranas

Cyt C

UbQH2 UbQ

UbQH2 UbQ

H+

H+ H+

+ +

(+)

+

-

(-)

-

+ +

SUCCINATO FUMARATO

O2•- H2O2

H2O + O2 SOD Cat

Alto ΔΨm

2 e- 2 e-

2 e-

O2

Δp

ATP

ADP + Pi

H2O + CO2 + Heat + NAD+ + FAD

Oxidative Phosphorylation: Coupling

CHO + NADH + FADH2

O2 Δp

ATP

ADP + Pi H2O + CO2 + Heat + NAD+ + FAD

Oxidative Phosphorylation: Inhibition of ATP synthesis (Oligomycin) – proton leak

CHO + NADH + FADH2

X O2

Δp

ATP

ADP + Pi

Oxidative Phosphorylation: Uncoupling (FCCP) – ETS capacity

CHO + NADH + FADH2

H2O + CO2 + Heat + NAD+ + FAD

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3

Electron Transport System

O2

aa3

H+

bc1

H+

Q c

F 1

H+ H+

II

S F

I

H+

NADH ADP ATP

III IV

A. Definition of ETS capacity. B. Measurement in mitochondria and

permeabilized cells. C. Measurement in intact cells.

Which metabolic state represents electron transport capacity?

Oxidative Phosphorylation in Top Gear

Gold standard to assess maximum aerobic capacity in cultured cells: → Uncoupled flux

•  Villani, Attardi (1997) PNAS 94: 1166

Res

pira

tion [p

mol·s

-1·1

0-6 ]

0

90

180

360

270

0 20 40 60 80 Time [min]

Routine Ama

Oligo-mycin

FCCP Rot

But intact cells do not have uncoupled mitochondria !

Range [h:min]: 1:301:301:151:000:450:300:150:00

O2

Con

cent

ratio

n (A

) [nm

ol/m

l] 250

200

150

100

50

0 O2

Flow

per

cel

ls (A

) [pm

ol/(s

*Mill

)]200

160

120

80

40

0

oligo oligo FCCP FCCP FCCP FCCP FCCP FCCPABERTURA AntiA AntiA cianeto

Range [h:min]: 1:301:301:151:000:450:300:15

O2

Con

cent

ratio

n (B

) [nm

ol/m

l] 200

160

120

80

40

0 O2

Flow

per

cel

ls (B

) [pm

ol/(s

*Mill

)]200

160

120

80

40

0

abertura Oligo oligo FCCP FCCP FCCP FCCP FCCP FCCP AntiA AntiA

Fibroblastos

iPS

Paulsen, B.; Santos, R e colaboradores Cell Transplantation 2011 in press.

Range [h:min]: 1:301:301:151:000:450:300:150:00

O2

Con

cent

ratio

n (A

) [nm

ol/m

l] 250

200

150

100

50

0 O2

Flow

per

cel

ls (A

) [pm

ol/(s

*Mill

)]200

160

120

80

40

0

oligo oligo FCCP FCCP FCCP FCCP FCCP FCCPABERTURA AntiA AntiA cianeto

Range [h:min]: 1:301:301:151:000:450:300:15

O2

Con

cent

ratio

n (B

) [nm

ol/m

l] 200

160

120

80

40

0 O2

Flow

per

cel

ls (B

) [pm

ol/(s

*Mill

)]50

40

30

20

10

0

abertura Oligo oligo FCCP FCCP FCCP FCCP FCCP FCCP AntiA AntiA

Fibroblastos

iPS 4x

Paulsen, B.; Santos, R e colaboradores Cell Transplantation 2011 in press.

1:10 1:00 0:50 0:40 0:30 0:20

O2 C

once

ntra

tion 200

160

120

80

40

0 O2 F

low

per

cel

ls 250

200

150

100

50

0

Time [h:min] endogen.

ROUTINE

+c

c

Cytochrome c test: Intact mitochondrial outer membrane

+uncoupler

F F

ETS

CI CI

+ADP

ADP

OXPHOS

GMN

GM

+Dig

CI

LEAK

Permeab.

CI Substrates

High-Resolution Respirometry in Permeabilized Cells

1:10 1:00 0:50 0:40 0:30 0:20

O2 C

once

ntra

tion 200

160

120

80

40

0 O2 F

low

per

cel

ls 250

200

150

100

50

0

Time [h:min]

CeR

endogen.

ROUTINE

CI

+D

D

OXPHOS

+c

c

CI+II

+S

S1

S

F

CII

+Rot

Rot

+u

F F

ETS

CI

High-Resolution Respirometry in Permeabilized Cells

Am

a

+Ama GMN

GM

+Dig

CI

LEAK

PC

ETS capacity with CI+II substrates

O2 c

once

ntra

tion

(50

nmol

/mL)

20 minutes

HepG2 Cells incubated with 150 µM 3BrPA by 30 min.

Control HepG2 Cells

FCCP

ADP, 50µΜSuc

oligo

Pyr/Mal ADP, 50µΜRot

750

500250

Oligo

ADP, 50µΜ

Succ

ADP, 50µΜRot

Pyr/Mal

10 min.

O2 F

low

10 p

mol

s/se

c.m

illio

n of

cel

ls FCCP, nM

JO2 = -dCo2/dt . 103 – (CO2.b0 + a0)

Pyr/Mal

+ADP

St4(PM)

Rot

Succ+

ADP

St4(Suc

)Olig

oFC

CP

0

20

40

60

80

100

120

*

Oxy

gen

Flow

(pm

ol/s

ec.m

illio

n ce

lls)

No Glucose No Glucose + 150 µM 3-BrPA

Pyr/Mal

+ADP

St4(PM)

Rot

Succ+

ADP

St4(Suc

)Olig

oFC

CP

0

20

40

60

80

100

120

*

*

*

Glucose Glucose + 150 µM 3-BrPA

*

Glutamine Glucose

X X X H+

Complex I Complex II Complex III Complex IV Complex V Complex I Complex II Complex III Complex VI Complex V

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Control

Control

NaB

NaB

Seahorse XF Cell Bioenergetics

XF96 Extracellular Flux Analyzer for 96-well microplate assays.

XF24 Extracellular Flux Analyzer for 24-well microplate assays.

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5

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6

O primeiro trabalho no Brasil a fazer uma análise Metabolômica.

● 30 min. ○ 60 min. ■ 90 min. Δ 180 min.

X Antimycin A

150 µM 3-BrPA 37oC

60 min.

○ Controle ● 3-BrPA

Δ Controle ▲3-BrPA

Glicose (Glicose + Glutamina)

Sem Glicose (Glutamina)

Remoção de meio DEMEN com soro

em uso .

Adição de DEMEN com 150 µM 3-BrPA e

5 mM glicose C13 37oC

60 min.

Adição de DEMEN controle

5 mM glicose C13 37oC

60 min.

HepG2 intactas adicionadas

ao tubo de RMN 400 MHz

3-BrPA

HepG2 intactas adicionadas

ao tubo de RMN 400 MHz

Controle

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3-BrPA

Controle

NMR spectrum of 13C-Glucose metabolism in intact HepG2 cells

1- F1,6BP 2- R5P 3- G6P 4- GA3P 5- DHAP 6- F6P 7- G1P 8- 6PGluconato 9- 2PG 10- L-Asp 11- L-Asn 12- L-Ala 13- L-Glu 14- Lactato 15- 2-acetolactato

http://www.hmdb.ca

Human Metabolome Database KEGG PATHWAY Database Wiring diagrams of molecular interactions, reactions, and relations

KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes A grand challenge in the post-genomic era is a complete computer representation of the cell, the organism, and the biosphere, which will enable computational prediction of higher-level complexity of cellular processes and organism behaviors from genomic and molecular information. Towards this end we have been developing a bioinformatics resource named KEGG as part of the research projects of the Kanehisa Laboratories in the Bioinformatics Center of Kyoto University and the Human Genome Center of the University of Tokyo.

http://www.genome.jp/kegg/

3-BrPA

3-BrPA

Glucose

GLUT 1 or 9

3-BrPA

Controle

1- F1,6BP 2- R5P 3- G6P 4- GA3P 5- DHAP 6- F6P 7- G1P 8- 6PGluconato 9- 2PG 10- L-Asp 11- L-Asn 12- L-Ala 13- L-Glu 14- Lactato 15- 2-acetolactato

-  Dra. Ana Paula Pereira da Silva - UFRRJ -  Dra.Tatiana EL-Bacha - IBqM -  Nattascha Kyaw - IBqM -  Reinaldo Sousa dos Santos - IBqM -  Dr Wagner Seixas Da-Silva - IBqM -  Dr Fabio C. L. Almeida – IBqM CNRMN -  Dr Andrea T. Da Poian – IBqM

-  Dr Nívea Dias Amoedo - IBqM -  Mariana Figueiredo Rodrigues - IBqM -  Paula Pezzuto - IBqM -  Rodrigo Madeiro da Costa - IBqM -  Franklin David Rumjanek – IBqM

-  Bruna da Silveira Paulsen - LaNCE -  Renata de Moraes Maciel - LaNCE -  Mariana Souza da Silveira - IBFCCF -  Stevens Kastrup Rehen – LaNCE.

-  CNPq -  FAPERJ -  INCTEN

Agradecimentos