Biologia Super)

8/4/2019 Biologia Super)

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NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

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UNIDAD 1

ADN COMO FUENTE DE INFORMACIN

1.1 DESCUBRIMIENTO DEL ADNEl cido desoxiribunucleico fue identificado inicialmente en 1868 por FriedrichMiescher, en los ncleos de las clulas del pus y en esperma de salmn. La llamonuclena, observ la presencia de fsforo.

Robert Feulgen, en 1914, describi un mtodo para revelar por tincin el ADN,basado en el colorante fucsina. Se encontr la presencia de ADN en el ncleo detodas las clulas eucariotas, especficamente en los cromosomas.

El bioquimico P.A. Levene en los 20s analiz los componentes del ADN yencontr que contena cuatro bases nitrogenadas: citosina y timina (pirimidinas),adenina y guanina (purinas); el azcar desoxirribosa; y un grupo fosfato. Fosfato.

La virtud del material gentico es su habilidad para especificar una larga variedadde protenas. Un error inicial fue el pensar que la estructura del material genticodebera ser tan compleja como la variedad de protenas producidas, ya que, sepensaba, que nicamente las protenas posean la suficiente diversidad paraespecificar otras protenas, sin embargo, se aclar esta cuestin cuando se sugirique el material gentico produca protenas siguiendo un cdigo basado en ladiversidad de combinaciones que se podan obtener de los nucletidos, tomadosde tres en tres.

El descubrimiento del principio de transformacin en los ncleo celulares porGriffth (1928), dio la base para pensar que el cido nucleico era el materialgentico.

La bacteria del gnero Pneumococusprovoca la muerte enratones producindolesneumona, la virulencia de las bacterias estn determinadas por los polisacridoscapsulares, componentes de la superficie de diferentes tipos de Pneumococos,estos pueden ser tres diferentes tipos (I, II y III) de polisacridos capsulares, todoscon apariencia algodonosa (S) en la pared y por lo tanto en la colonias formadas.

La bacteria S, con apariencia lisa, muerta puede transformar a las bacterias vivasR. A esta capacidad de transformacin se le aisl, como un principio detransformacin, en cultivo por Avery y colaboradores en 1944 y demostraron queera el cido desoxiribonucleico (ADN), que se encontraba en abundancia en losncleos de las clulas (Figura 1).


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Figura 1.1 Experimento de transformacin de Avery y colaboradores

El papel del ADN luego fue confirmado con el descubrimiento de las enzimasADNasas, pues al degradar los cidos la capacidad transformante se perda, lo queno suceda se empleaba la tripsina que degrada protenas lo cual no influa en latransformacin, se desech entonces la idea de que las protenas posean lacapacidad de trasmitir la informacin gnica.

1.2 ADN MATERIAL GENETICO UNIVERSALDespus de demostrar que el principio transformante consista de ADN, eranecesario probar que este era el material gentico en todos los sistemasbiolgicos.

Procariotas: Cuando el fago T2 infecta a clulas de E. coli, cuando estas seaplican a la bacteria son absorbidos y 20 minutos mas tarde las bacterias sonlisadas, liberando una gran cantidad de fagos. Hershey y Chase (1952), infectaronbacterias E. coli, con fagos T2 marcados radiactivamente ya sea con P32 en el ADNo bien con S35 en las protenas. Las bacterias infectadas fueron centrifugadas

separndose en dos capas. La capa superficial consista de las envolturas de losfagos liberados de la superficie bacteriana y por lo tanto marcados con S35. La otrafraccin consista de las bacterias infectadas, la mayora de P32 se present en lasbacterias infectadas. La progenie de fagos producidos por la infeccin contena un30% del P32 marcado, y muy poco (1%) de S35 marcado.

Este experimento demuestra que el ADN del fago interno entra a la bacteria yforma parte de la progenie de fagos, exactamente el patrn de herencia esperado

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del material gentico.

Aunque se demostr claramente que el ADN es el material gentico, elexperimento de infeccin con fagos no es tan preciso como la transformacinbacteriana para excluir protenas contaminantes del ADN.

Figura 1.2 Experimento de Hershey y Chase

Eucariontes: La discusin de los resultados de transmisin de Avery, sonaplicados a un amplio rango de organismos tanto procariontes como eucariontes.

Cuando el ADN es aplicado a poblaciones de clulas eucariticas simples crecidosen cultivos, los cidos nucleicos entran a la clula y en algunas resulta en laproduccin de protenas nuevas. Al inicio la extraccin se realizaba en masa, peroahora el ADN se puede purificar para incorporar secuencias que producen unaprotena particular.

Como en el caso de clulas mutantes (TK-) para la produccin de Timidina kinasa(TK) y que pueden obtener esta capacidad cuando se le aplica una secuencia de

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ADN que poseea el gen que la sintetiza

Los experimentos de transformacin en clulas eucariotas se denominan comotransfeccin, sin embargo es similar a la transformacin bacteriana. El ADNintroducido se convierte en parte del material gentico de la clula que ha sido

transfectada.Al inicio la tcnica se realizaba nicamente en cultivos de clulas, pero msrecientemente el ADN puede ser introducido en huevos de mamferos pormicroinyecciones. Estos experimentos demuestran no solamente que el ADN es elmaterial gentico, sino que, puede ser transferido entre especies diferentes ypermanecer funcional.

El materia gentico de todos los seres vivos y algunos virus es el ADN. Sinembargo algunos virus poseen ARN como material gentico, no obstante ansiguen siendo los cidos nucleicos los encargados de dirigir los cambios yperpetuaciones gnicas.

1.3 COMPONENTES DEL ADNLa observacin de que las bases estn presentes en diferentes cantidades en elADN de las diferentes especies dio como conclusin el concepto de que lassecuencias de bases debe ser la forma en que la informacin gentica esalmacenada.

Figura 1.3 Componentes del ADN.

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Figura 1.4 Cada nucletido contiene un anillo heterocclico de carbono con tomosde nitrgeno (base nitrogenada), un azcar con cinco carbonos en forma de anillode pentosa y un grupo fosfato.

Figura 1.5 Las bases nitrogenadas pueden ser pirimidinas: con anillos de seismiembros. Purinas: con dos anillos formados de cinco y seis miembros cada uno.

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Las bases purnicas son: adenina y guanina tanto en molculas de ADN como enlas molculas de ARN. Por otro lado, se encuentran 2 pirimidinas en ADN, citosina


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y timina, mientras que en el ARN se encuentran la citosina y el uracilo. La timinadifiere del uracilo por la presencia de un sustituto del metilo en la posicin C5.

Las pentosas tambin son diferentes entre las molculas de ADN y de ARN, dedonde proviene su nombre: ADN = 2 desoxyribosa y ARN = ribosa.

Figura 1.6 Esquemas de los azcares presentes en las molculas de ARN(iquierda) y ADN (derecha).

Son diferentes por ausencia o presencia del grupo hidroxil en la posicin dos. Lasbases nitrogenadas se unen a la posicin uno de pentosa por una uninglucosidica en la posicin N1 de la primidina y en la N9 de las purinas. Una baseligada a un azcar es llamado nucleosido y cuando se une a un grupo fosfato sellama nucletido.

Los nucletidos proveen de bloques, los cuales se unen para construir los cidosnucleicos. Los nucletidos se unen en una cadena de polinucletidos por unacolumna que consiste de series alternadas de azcar y residuos de fosfato.

Los nucletidos pueden existir en formas en las cuales ms de un grupo fosfato seune a la posicin 5. Son enlaces de alta energa, la cual es proveda paraactividades celulares. NTP nuclecido trifosfato, NDP nuclecido difosfato (verfigura 1.4).

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Figura 1.7 La posicin nmero 5 de una pentosa se conecta con la posicin 3 delsiguiente anillo de pentosa, por un grupo fosfato. Por lo que la columna defosfodiesterazcar se dice que consiste en uniones 53, las bases nitrogenadasse pegan en la periferia de la columna azcar fosfato. 5 izquierda y 3 derecha.

1.4 LA DOBLE HLICE DEL ADNTres puntos claves sirvieron de base para que Watson y Crick propusieran elmodelo de doble hlice del ADN en 1953:

1. Los datos de las fotografas de los rayos X,que mostraban que el ADN tena una forma dehlice regular, dando una vuelta completacada 34 A (3.4 nm) con un dimetro de 20 A(2 nm) aproximadamente.

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2. La distancia entre nucletidos adyacentes es 3.4 A, 10 nucletidos por vuelta.La densidad del ADN sugera que la hlice debera contener dos cadenas depolinucletidos. El dimetro constante se explica si las bases de cada cadena seunen de manera restringida por lo que las purinas siempre son opuestas a laspirimidinas.

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Pirimidina con pirimidina,muy delgado

Purina con purina, muy

grueso

20 A

3. Independientemente de la cantidad de cada base, la proporcin G y C essiempre la misma en el ADN al igual que la proporcin A y T. la composicin decualquier ADN se describe por la proporcin G + C que tiene un rango de entre 26a 74 % para las diferentes especies.

Watson y Crick propusieron que las dos cadenas estn unidas no por enlacescovalentes, sino por uniones de hidrogeno entre las bases nitrogenadas por lo queG pasa puentes de hidrogeno que la unen con C, y A con T de igual manera estasreacciones se conocen como bases pareadas. Estas bases pareadas se dice queson complementarias.

Figura 1.8 Para que se pareen las bases, estas deben de estar en su formaTautomerica, es decir NH en lugar de NH2 y COH en lugar de C=O.

El modelo tambin requiere de que las cadenas corran en direcciones opuestasantiparalelas. Una cadena corre en direccin 5- 3 y su contraparte 3- 5.


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La cadena azcar- fosfato se presenta en la parte exterior por fosfato cargadonegativamente, los cuales in vitro se neutralizan usualmente con Na+ y in vivoprotenas positivamente cargadas neutralizan estos grupos, los cuales juegan unpapel importante para determinar la organizacin del ADN en la clula.

Las bases se encuentran en la parte anterior, forman los escalones de la escaleraen hlice (figura 1.7). Estas bases intervienen en la estabilidad termodinmica de ladoble hlice, de dos formas:

a). Puentes de hidrogeno entre las basesb). Uniones hidrofbicas, resultando en intervenciones entre los sistemas deelectrones de los pares de bases.

Cada par de bases rota 36 alrededor del eje central relativo al siguiente par, por loque 10 pares de bases dan un giro completo de 360. El giro completo de unahlice doble con surcos angostos (12 A) y surcos amplios (22 A), esta es laforma del ADN.

1.5 REPLICACIN SEMICONSERVATIVA DEL ADNUn experimento crucial del material gentico es que este debe reproducirse demanera adecuada. Debido a que las fibras de polinucletidos estn unidos

sible que se separen.

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nicamente por puentes de hidrogeno, es po

Figura 1.9 Cada cadena sirve como

ste modo de replicacin produce que la cadena doble materna origine dos

replicacin es SEMICONSERVATIVA.

templete para la sntesis de la cadenacomplementaria. Por lo que laestructura del ADN lleva la informacinnecesaria para perpetuar susecuencia.

Ecadenas fijas y cada una con una cadena materna y otra hija nueva, por lo tanto la


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nitrogenadas de las cadenas de ADN y sercilmente reconocibles en las cadenas, resultado de la replicacin, observndose

perimento con 3 generaciones continuase E. coli. La disrupcin es solamente transitoria y localizada en una pequea zona

igura 1.10. Experimento de M.Meselson y F. Stahl para demostrar la hiptesise la replicacin semiconservativa. Cultivos de E. colien un medio cuya fuente de

Marcas con istopo (N15) en las basesfque en la primera generacin se obtienen dos cadenas dobles, con una cadenaoriginal y una nueva cada una, en la segunda generacin se obtienen cuatro

cadenas dobles y dos totalmente nuevas.Menselson y Stahl (1958) realizaron el exdde la cadena doble, por lo que apenas se forme la cadena hija, la cadena originalse acopla a sta, esta regin se denomina horqueta de replicacin, la cual semueve sobre el templete.

Fdnitrgeno era un istopo pesado, el N15 que se incorporaba al ADN sintetizado. Elcultivo se mantuvo durante varias generaciones para que el N15 formara parte detodo el ADN. Se extrajo a continuacin el ADN marcado y se transfiri a un mediocon N14. Las incubaron el tiempo suficiente para que se dividieran una sola vez. Se

someti la mezcla aultracentrifugacin para distinguir las molculas que contenanN15 y N14.


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1

GGGGG

AGly

GGlu

GAla

GVal

G

CGGGGUGl

yGAs

pGAl

aGVa

lGG

GAAAIA

AArg

ALys

AThr

AIleA

CAAAA

USer

AAsn

AThr

AIle

AAGCCCC

AArg

CGln

CPro

CLeu

CCCCCC

UArg

CHis

CPro

CLeu

CCGTrUUUU

AAUAlto

USer

ULeu

U

CUUUU

UCys

UTyr

USer

UPhe

U

3*Se unda base1*

.6 CDIGO GENTICO: TRIPLETESebe sintetizarse al menos 20 aminocidos distintos con la del ADN y debido a que

igo debe de ser de ms de una base.

cficos, mientras que otros aminocidosueden ser originados por ms de una combinacin de tripletes. Solo una de las

= codn

protena comprende a laecuencia de aminocidos de la protena escrita en direccin N hacia terminacin

igura 1.11. Cuadro con elodigo gentico casi

Dste solo posee 4 bases distintas, el cd

42 = 16 combinaciones posibles43 = 64 combinaciones posibles

Por lo que algunos tripletes deben ser espepdos cadenas codifica para protenas, por lo que el cdigo gentico es unasecuencia de bases (no de pares de bases ).

Tres nucletidos = 1 aa trinucletidoLedo de 5 3, los nucletidos que codifican para unasC.

Fcuniversal. Los cuadros rojosrepresentan los codones quesignifican alto en el procesode sntesis. El cuadro verdecon la letra I, representa elcodn de inicio universal.


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El cdigo gentico es degenerado: un mismo aminocido puede estar determinadopor ms de un triplete o codn. Debido a que existen 64 tripletes distintos y hay

del ARN mensajero es continua, sin interrupciones. Cualquier prdida oanancia de un slo ribonucletido produce a partir de ese punto una modificacin

iniciacin suele serAUG que codifica para Formil-Metionina. Tambinueden actuar como tripletes de iniciacin GUG (Val) y UGG (Leu) aunque con

l anlisis gentico deutantes del fago T4. En 1961 Crick y colaboradores demostraron que el cdigo

ACG ACG ACG ACG

inicio de la lectura y por lo tanto del aminocido loue produce un cambio en la regin de lectura. El colorante Acridina puede

uadro 1.1 Excepciones a la universalidad del cdigo en eucariontesORGANISMO CODN SIGNIFICADO EN SIGNIFICADO EN

O

solamente 20 aminocidos diferentes. Es un cdigo sin superposicin o sinsolapamientos: dos aminocidos sucesivos no comparten nucletidos de sustripletes.

La lecturagde la pauta de lectura, cambiando todos los aminocidos desde el lugar de laalteracin.

El triplete depmenor eficacia. Existen tres tripletes sin sentido o de terminacin que no codificanpara ningn aminocido: UAA (ocre), UAG (mbar) y UGA.

Las bases generales del cdigo fueron descubiertas por emdebe de leerse en tripletes que no se traslapan a partir de un punto de inicio.

Tres posibles maneras de leerse, lo que se conoce como Regin de lectura.

CGA CGA CGA CGAGAC GAC GAC GAC

Una mutacin cambian el sitio deqprovocar esta mutacin.

C

CODIGO CODIGNUCLEAR MITOCONDRIAL

TodosLevadura

hilaovinovino

UGACUX

GCinicio)inicio)

DrosopHumano, bHumano, boRatn

AGAAGA,AAUAAUU,AUC,AUA

FINLeuArgArgIleIle

TrpThrSerFINMet (Met (


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.7 MUTACIONES PUNTUALES CAMBIAN PARES DE BASES SENCILLASodos los organismos sufren de un cierto nmero de mutaciones como resultado

ste

mpuestos pueden aumentar la ocurrencia deutaciones, estos compuestos son llamados MUTAGENOS y los cambios

ue cambianicamente un par de bases simples, se conoce como MUTACIN PUNTUAL, la

igura 1.12. Esquem un cambion en unaase, o bien a una adicin o a una supresin (corte) de una base.

1Tde las operaciones celulares normales o por interacciones con el ambiente. Etipo es llamado ESPONTNEO.

El tratamiento con ciertos comprovocados por estos son referidos como MUTACIONES INDUCIDAS.

Cualquier par de base del ADN puede ser mutado. Una mutacin qcual se puede deber por:un mal funcionamiento del sistema celular que se encarga de replicar y reparar elADN.Interferencia qumica directa con una de las bases en el ADN.

F a de una mutacin, puede deberse ab


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RANSICIN: mutacin puntual ms comn, se presenta por una sustitucin deases del mismo grupo o familia (purina por purina; pirimidina por pirimidina).

e une a Guanina o a Adenina.

RANSVERSIN: esta mutacin es menos comn, se presenta por sustitucin deases de familias distintas. Ejemplo: cuando una base anormal se introduce en la

eneralmente poseen algunasnciones residuales. Luego entonces, se sustituye un aminocido pero no

igura 1.14. Cuando el colorante naranja de acridina cambia la regin de lectura elambio provoca una alteracin completa de la protenay en la estructura de la

TbEjemplo: conversin qumica directa de una base a otra

Figura 1.13. Ejemplo de una transversin, por sustitucin de bases, el bromutoacils

Tbcadena: BrdU (bromouracil) en lugar de T (timina).

Las mutaciones por sustituciones de bases, gfunecesariamente cambia la funcin de la protena.

Fcmolecula de ADN.


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TACINutacin espontnea que inactivan la funcin de un gen en una bacteria ocurre

on una tasa de 10-5 a 10-6 eventos por locus por generacin. Se estima que lasimilar.

cambio de nucletidos individuales es de 10por generacin. Sin embargo no todas las mutaciones del ADN provocan

DN no cambian los aminocidos presentes enprotena, o bien el cambio en los aminocidos no afectan la funcin de la

UTACINPOR GENERACIN

1.8 TASAS DE MUMctasa en eucariontes debe ser

En un gen bacteriano de 1200 pares de bases, que codifica para 400 aminocidosla tasa de mutacin promedio para un -

-109 a 10cambios observables en el fenotipo.

Las mutaciones silenciosas: no tienen un efecto aparente en el fenotipo. Se puededeber a: el cambio de bases en el Alaprotena, por lo que se dice que se presentan substituciones neutrales.

Cuadro 1.2 Algunos valores de tasas de mutaciones puntuales en los organismos ORGANISMO GEN TASA DE M

Bacteriofago Rango de hospederos 2.5 x 10Escherichia coliZea mays

melanogaster

encia a fagosFactor de color (R)

2.6 x 10

Drosophila

Resist

Color de semillas (Y)

Letalidad

-9

2.0 x 10-8

2.9 x 10-4

2.0 x 10-6

-5

de un gen, puede ser reversible por otramutacin llamada MUTACIN REVERSA, que posee una probabilidad muy bajade presentarse en el mismo sitio.

1 NUCLEICOSa cadena de ADN es ms que una secuencia de bases ordenadas, posee ciertasaractersticas fisiolgicas que son de crucial importancia para su actividad.

doble

lice no existe de manera estirada y recta, sino que se enrolla para ocupar un

erente a la configuracin beta del ADN. Para que el ADN seplique o se exprese, las bandas de la doble hlice deben separarse.

Mutacin directa: afecta la actividad

.9 TOPOLOGA DE LOS CIDOSLcEl nmero de pares de bases por cada vuelta en la molcula de ADN no esnecesariamente fijo, sino que puede variar segn las circunstancias. La

hespacio menor.

Ciertas secuencias tienen la propiedad de adoptar una confirmacin alterna dedoble banda difreEste ltimo punto es de mucha importancia, desde la perspectiva de su funcin en


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los enlacesovalentes. Es posible que las bandas se separen y se vuelvan a reponer bajo

uy pequeo de temperatura (8593C)sultando en un cambio amplio de sus propiedades fsicas.

de fusin, esta temperatura se ve afectada por laomposicin de bases del ADN y las condiciones de desnaturalizacin. En

, siendo as, ms estable que A T. Mientrass pares de base G C en el ADN ms E se necesita para separar las bandas.

ADN con 60% G C (aves) requiere 95C en condiciones similares.

e en la Tm.

a desnaturalizacin del ADN es reversible bajo condiciones apropiadas. Estace como

ENATURALIZACIN.

ncias son complementarias se aparean formando regionese hlices dobles.

ecto similar a la cremallera, formando una molcula doble msrga. La renaturalizacin provoca la restauracin de las propiedades originales del

la replicacin y expresin como protena, para lo cual no se rompenccondiciones fisiolgicas y a las tasas (rpidas) necesarias para sostener lasfunciones genticas. La especificidad del proceso se determina por lacomplementacin de los pares de bases.

Este proceso de separacin de las bandas es llamado DESNATURALIZACIN.Este fenmeno ocurre en un rango mreLa densidad ptica cambia, ya que la absorcin de luz del ADN disminuye en un 40% de lo que se observa en una mezcla de nucletidos de la misma composicin.EFECTO HIPOCRMICO

HIPOCROMICIDAD: se da por desnaturalizacin.Tm= es la temperaturaccondiciones fisiolgicas 85 95C.

El valor exacto de Tm depende de la proporcin de pares de bases G C ya queestas poseen un triple enlace de Hm

Esta relacin entre Tm y la composicin en pares de bases es lineal.ADN con 40% G C (mamferos) requieren 87C.

La fuerza inica de la solucin tiene tambin un efecto fuertLhabilidad de las bandas separadas de ADN se conoRLas hebras simples de ADN entran en contacto con su hebra complementaria porcasualidad, si sus secuedLa regin de complementacin de pares de bases se extiende a lo largo de lamolcula con un eflaADN.


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ROSETN

CROMOSOMA

CROMATIDAS

DOBLE HLICEDE ADN

NUCLEOSOMAS

BUCLE

ESPIRAL DEROSETONES

SOLENOIDE

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de la molcula de ADN, loual le confiere la topologa clsica.

uando los cidos nucleicos provenientes deentes distintas, o bien ADN y RNA.

se relaciona algunos aspectos de suncionamiento.

Figura 1.15. Grado de empaquetamiento y organizacincEsta propiedad de los cidos nucleicos de complementarse entre bandas sencillasse conoce como HIBRIDACIN, cfuEl ADN se organiza de tal manera que posee un cierto grado de arreglo oempaquetamiento. Con el quefuLa cromatina (ADN + protenas) puede ser dividida en dos tipos:Eucromatina: Menos densa que en el cromosoma mittico su radio de

mpaquetamiento es aproximadamente de 1000 2000 durante la interfase.eHeterocromatina: Muy densa cromosomas en mitosis, durante el ciclo celular nocambian su densidad. En esta forma el ADN no es transcripto. Heterocromatina es

iferente a la Eucromatina solo por el grado de condensacin.d


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Heterocromatina constitutiva: Regiones particulares que nunca son expresadasincluyendo secuencias satlites de ADN

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igura 1.16. Cambio en la topologa (a diferentes niveles) de la molcula de ADN,omo respuesta a los procesos celulares. A) Molecula en proceso de replicacin,) Molecula en proceso de transcripcin.

.10 AISLAMIENTO DE GENES

)Aislamiento a partir de protenas

A B

FcB

1A

nocidos de una protena, podemos deducir laecuencia del ADN que la codifica, utilizando el cdigo gentico (aunque de

minocido puede ser codificado por ms de

A partir de la secuencia de amismanera imperfecta), pues un mismo aun tripleteo codn).


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amente generando una sonda o detector que mediante unaibridizacin nos permite detectar su secuencia complementaria.

RNmTACCAXTTT(C)CC(X)CTT(G)TACTTA(G) ADNsonda

Cuan las deo

de una sonda con base en la secuencia de un gen de rata para intentar detectar

Figura 1.17 teriano empleando

Se sintetiza una cadena de oligonucleotidos con la aproximacin de la secuenciay se marca radiactivhEjemplo: Met-Val-Lys-Gly-Glu-Met-Asn Protena

AUGGUXAAA(G)GGXGAA(G)AUGAAU(C) A

do se emplea una sonda, se puede analizar el contenido de las clulas colonias derivadas de una genoteca, las aplicaciones pueden ser: el dise

el gen en humano.

. Esquema del proceso de aislamiento de un gen bacuna sonda marcada con isotopos radiactivos.


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B) Aislamiento de genes utilizando anticuerposEn ocasiones las protenas cuyo gen correspondiente queremos aislar no sepueden purificar en gran cantidad y los mtodos para determinar la secuencia deaminocidos de una protena son bastante laboriosos. El sistema inmunolgico nos

lecular para localizar genes.

nimal, inducen en ste la produccin de anticuerpos. Estas molculas son, a su

suero sanguneo del conejoodemos obtener anticuerpos dirigidos contra dicha protena. Estos anticuerpos, se

permite utilizar otro fenmeno de reconocimiento mo

Desde hace muchos aos, los investigadores del campo de la inmunologa hanutilizado animales de laboratorio para obtener anticuerpos especficos contrasustancias de inters. Las protenas, en particular; cuando son extraas a uanvez, protenas con caractersticas muy interesantes.

Los anticuerpos pueden ser usados como reactivos que reconocen, en medio demezclas complejas, las sustancias especficas que indujeron su produccin. Si seinyecta una protena en un conejo, a partir delpusan de manera anloga a como se usaron los oligonucletidos o sonda de ADN,para detectar las clonas que contengan el gen que codifica para la protena deinters lo que se conoce tambin como "inmunobsquedao inmunodeteccin.

C) Aislamiento de genes utilizando sus ARN mensajerosA finales de los aos setenta, los trabajos pioneros de Phillip Sharp y Richard

oberts sorprendieron a la comunidad cientfica con un asombroso descubrimiento:trasncriptasa reversa.

nscripcin acelerada). Por ejemplo: si se purifica ARNmensajero del oviducto de gallina, la mayor parte de esta preparacin estar

(codificada en laecuencia) esta en la molcula de ARN. Lo que se requiere es una enzima que

Rla

En los tejidos que presentan una abundante cantidad de una protena especfica,por lo general poseen abundantes copias del gene en forma de ARN mensajero(como resultado de la tra

constituida por el mensajero que codifica para la ovoalbmina.

Se hace necesario utilizar un procedimiento que convierta la informacin de ARN aADN. Es decir, que copie una hebra de ARN y la "transcriba", de manera reversahacia ADN. Esto es, en principio, posible: la informacinsrealice la copia, pero que acepte como molde al ARN, y nucletidos para incorporara los del ADN. Tal enzima existe en la naturaleza: en los retrovirus. Usando unapreparacin que contenga esta enzima, la transcriptasa reversa, sobre el ARN, seobtiene el llamado ADNc, o ADN complementario. El ADNc puede ser clonado igualque cualquier otro ADN.


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igura acin de ADNc aartir de una molecula de ARN.

F 1.18. Esquema que representa la reaccin de amplificp


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UNIDAD 2

PERPETUACION Y EMPAQUETAMIENTO DEL ADN

2.1 PERPETUACIN DEL ADN2.1.1 RReplicacin

in posterior. Cuando se inicia laocurre hasta que sta halla finalizado. Puede

ontrolarse en la iniciacin, una vez que esto ocurre se replica todo lo comprendidode replicacin es regulada por ciertas

n eucariontes: El genoma se encuentra organizado en un gran nmero de

a misma del ADN. Las protenas que prevn estasctividades enzimticas no funcionan de modo independiente, y son contenidos enna estructura multiprotica.

zimas capaces de sintetizar nuevas hebras de ADN aartir de un templete. Una enzima posee la funcin de replicacin las otras poseen

oxirribonucletidos, todas lasnzimas requieren de una cadena previamente iniciada por lo que un paso

eplicn: unidad de replicacin: La replicacin del ADN es necesaria para perpetuar la informacin

gentica y prepara a la clula para una divisreplicacin, la divisin celularcentre origen y termino, la frecuenciaprotenas. La replicacin puede ser Unidireccional o bidireccional, formando un ojoque crece hasta que se replique el replicn entero. En molculas de ADN circular,por lo general, se forma una estructura en forma de letra griega teta ().

Replicn: El material gentico est organizado en unidades denamonidasreplicones, las cuales se confromoan de un sitio de Origen y un sitio de trmino,toda la secuencia de ADN que se encuentre entre estos puntos ser replicado unavez que comience el proceso.

En procarintes: Todo el genoma se encuentra organizado en un solo replicn, siposeen plsmido, stos no son considerados como parte del genoma y cada unorepresenta un replicn autnomo. Cada fgo o virus de ADN constituye un replicn.

E

replicones. Cada replicn se activa una sola vez por ciclo celular, aunque no lohacen simultneamente.

2.1.2 Horquilla de replicacinTodas las actividades de replicacin son reguladas por un conglomerado deenzmas y por la topologauReplisoma: Es un conjunto de enzimas y protenas, que se ensamblan en una sola

unidad antes de la replicacin, esta compuesto de:ADN Polimerasa: Que son enpvarios subsidiarios en la replicacin o participa en la reparacin del ADN. NingunaADN polimerasa puede iniciar una cadena de deeesencial, es la presencia de una actividad "primaria" para comenzar la cadena de


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ADN. Esta actividad involucra la sntesis de una secuencia corta deribonucletidos que luego es removido PRIMER (primario).

Creacin de la horquilla de replicacin en el origen

Se requiere dos tipos de funciones para convertir una cadena doble de ADN a unacadena sencilla.I

sando la hidrlisis de ATP pararoveer la energa necesaria.

de unin a hebras.sencillas se une a la hebra sencilla del ADNreviniendo la formacin del estado doble.

iento se mueve sobre el ADN lo que marca laeneracin de la orquilla de replicacin, que contina movindose durante la

I) El primer nucletido de la cadena nueva debe ser sintetizado en el primer, esta

ocurren unicamente en el origen, y otros al inicio de cada fragmentoe Okazaki durante la elongacin.

) Una enzima Helicasa separa las hebras de ADN up

II) Una protenap

III) Un punto de desenrrollamgelongacin.

Vaccin es requerida una vez en la hebra lider pero es repetida al inicio de cadafragmento de Okasaki en la hebra convicta. Algunos eventos que se requieren parala iniciacind

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F

24

igura 2.1 Esquema de la horquilla de replicacin de un eucariota.

n EucariontesE : Existen cinco clases de ADN polimerasas con diferentes

nciones, como se preenta en el siguiente cuadro 2.1.

replicacin delADN mitocondrial. Se replica de una

pero cada cadena de ADNosee su propio origen de

peucariontes.

(1) (II) (I

fu

2.2 Esquema de la

manera particular, ya que escircular,preplicacin, pero no se encunatrasituado en sitios cercanos. El origen(OL) se encuentra en la cadena deADN externa, y el origen (OH) enla cadena interna, por lo que elinicio de la replicacin acontece atiempos diferentes en cada una,dirigida por la ADN polimerasa .

roceso de replicacin del ADN en

II)

Cuadro 2.1 Enzimas que intervienen en el

Localizacin

Funcin Sntesis de Sntesis de ReparacinReparacin Replicacin

Sub-unidades

xonucleasa- 5

Ncleo

hebra cautivaing

Desconocida

Ncleo

hebra lider

DesconocidequiereCNA

Ncleo

atalitico.Sinncin

onocida

Ncleo

ataltico

o

Mitocondria

ataltico.Sinncin

onocida

Actividad

E3

y prim

I)Ncleocataltico2)PrimasasI)

No

I) NcleocataliticoI)RP

Si

I) Ncleoc1fuc

Si

1.Ncleoc

N

1.Ncleoc1fuc

Si

En procariontes: Las enzimas poseen actividad exonucleoltica que procede enireccin reversa, 3'-5', a partir de la sntesis de ADN ejecuta una funcind


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ostsinttica de prueba de lectura.

sa I ADN polimerasa II ADN polimerasa III

p

Cuadro 2.2 Enzimas implicadas en la relicacin del material gentico deprocariotas.

ADN polimeraFuncin principal Elongacin Reparacin Replicacin

Nmero/clula 400 Desconocido 10-20

Actividad3-5

xonucleasa 5-33-5 3-5enzimtica

Elongacin5-3ExonucleasaE

Elongacin5-3Exonucleasa

Elongacin5-3Exonucleasa

Subunidades 1) Fragmentoda)

equeo (35,000

mueve 10 pares,

, sintetiza ADN

, Factor II, Exonucleasa 3-

Klenow (68,000

2) Fragmentopda) actividad deexonucleasa 5'-3'reinicia la replicacinen un corte, "NickTraslatin

, sintetiza ADN

, Factor I

5

Locus Pol B

N, dna x , dna q,dna t.

Pol A dna E (Pol C), dna

igura 2.3 Horquilla de replicacin donde se muestran los componentes quetervienen en el proceso de incio de la replicacin en procariotas.

Fin

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26

.1.3 Mecanismo de replicacin: eucariotas, procariotas y virus

eplicacin en procariotas

2R

eucariontes, su

ucen muchasorquillas de replicacin al mismo tiempo, y que se conocen menos las protenass que en procariontes.

Desenrrollamiento y apertura de la doble hlice

El proceso de replicacin en procariontes y eucariontes es similar, las diferenciasentre uno y otro son el mayor tamao del material gentico en

empaquetamiento con histonas, que en los eucariontes se prodhque intervienen en eucarionteAl igual que en eucariontes, los procariontes replican su DNA de forma continua enla hebra 5' - 3' (conductora) y de forma discontinua en la hebra 3' - 5' (retardada).ElDNA en las bacterias suele ser circular y su replicacin ocurre en tres etapas,empezando por un nico punto:

1. Desenrollamiento y apertura de la doble hlice2. Sntesis de dos nuevas hebras de ADN3. Correccin de errores

. Intervienen un grupo de enzimas y protenas, a cuyoco licasas que facilitan en

e A y asas que eliminan la tensinenerada por la torsin en el desenrrollamiento y actan las protenas SSB que se

u

njunto se denomina replisoma.Primero intervienen las hee es un lugar con gran contenidodesenrrollamiento en el punto ORIo de orgen qu

irasas y topoisomerd T. Despus actan las gg

nen a las hebras molde para que no vuelva a enrollarse.

Sntesis de dos nuevas hebras de ADN. Actan las ADN polimerasas para sintetizar lasnuevas hebras en sentido 5-3, ya que la lectura se hace en el sentido 3-5. Intervienen las ADNpolimerasas I y III, que se encargan de la replicacin y correccin de errores.

a que lleva la mayor parte del trabajo es la ADN polimerasa III. ActaL la ADN polimerasa II,

starde se unen. A

a copia como sieran ADN, entre los fragmentos de Okazaki, hasta que se alcanza el RNA

ragmentos de Okazaki, cada unoe unos 1000-2000 nucletidos(en eucariotes es de 100-200). Hace falta un RNA

cebador por cada fragmento de Okazaki.

corrigiendo daos causados por agentes fsicos.La cadena 3-5es leda por la ADNpolimerasa III sin ningn tipo de problemas (cadena conductora). La cadena 5-3no puede ser leda directamente, esto se soluciona leyendo pequeos fragmentofragmentos de Okazaki) que crecen en el sentido 5-3y que ms(

esta hebra se le llama retardada porque su sntesis es ms lenta.

La ADN polimerasa III es incapaz de iniciar la sntesis por s sola, para estonecesita un cebador (ARN) que es sintetizado por una ARN polimerasa (primasa).Este cebador es eliminado posteriormente. La ARN primasa, va sintetizando aintervalos los ARN cebadores que van siendo incorporados a lfucebador del fragmento de Okazaki ya terminado.

La ARN primasa se une directamente a la ADN helicasa, formando un complejollamada primosoma, que se va desplazando con la cadena en formacin. Conformevan existiendo fragmentos de cadena abiertos de suficiente longitud, se vasintetizando la cadena discontinua formando los Fd


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Correccin de errrores. La enzima principal en esta fase es la ADN polimerasa I,que corrige todos los errores cometidos en la replicacin o duplicacin. Tambinintervienen otros enzimas como: endonucleasas que cortan el segmento errneo;ADN polimerasa II que rellenan correctamente el hueco y ADN ligasas que unen

los extremos corregidos.

La labor de la ADN polimerasa I es de exonucleasa, puede poner bases comosacar bases, con esto puede reparar la hebra. El dominio de esta protenaencargado de incluir bases a la hebra se llama Fragmento Klenow.En E. coli la replicacin e

27

s bidireccional y se inicia a partir de un solo origen, ques conocido como Ori C: Sitio en la molcula de ADN en el que se Inicia el ciclo de

l origen de la replicacin contiene muchos sitios de unin de las protenas, PBS

o la molcula de ADN que se replica es circular, y la

mino provoca el cese de movimiento, debidoque en esta zona se adhieren unas protenas que

igura 2.4 Replicacin bidireccional del genoma circular de E. coli. La horquilla seueve a una velocidad de 500 nucletidos por segundo, la hlice debe rotar a 50voluciones por segundo

ereplicacin, en este sitio se controla la frecuencia de los eventos de iniciacin, estedebe segregarse a los cromosomas replicados que se dirigen hacia las clulashijas.

E(por sus siglas en ingls), que son secuencias relativamente cortas de ADN y quefuncionan como un sitio de anclaje para protenas que regulan el proceso dereplicacn.

Cuandreplicacin es bidireccional, los dos ejes de replicacin semueven alrededor del genoma hasta el punto deencuentro, el cual por lo general no se ubica en medio, laregin de tera

detienen el avance de la horquilla de replicacin y por lotanto el proceso.

Fmre


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as bacterias por lo general poseen dos puntos de unin entre la replicacin y elrecimiento celular. La frecuencia de iniciacin de los ciclos de replicacin se ajustaara coincidir y dirigir la tasa de crecimiento celular y por lo tanto la

entre la replicacin completa y la divisin celular, es deproximadamente 20 min. En este perdo se da el ensamblaminto de los

Lcpcomplementacin del ciclo de replicacin se conecta con la divisin de la clula.

En trminos de:C = Replicacin del genoma bacteriano entero. El proceso tarda aproximadamente40 minutos, el movimiento de la horquilla de replicacin se da a 50,000 pb porminuto, esta velocidad es no variable a temperatura constante.

D = Periodoacomponentes necesarios para la divisin.

Replicacin en virusAeucariotas y procariotas (incluyendo en stos a los virus), se describe en esteapartado el modo de replicacin de los los virus que poseen su material genticoen forma circular. En el cuadro 2.1 se pr

unque, el proceso de replicacin, como ya se menciono, es similar para

esentan los diferentes tipos de materialentico que poseen los virus, asi como la forma de su arreglo (cadena simple,

ndonucleasa hace un corte en la cadena positiva (+). (c) La ADN polimerasaade nucletidos en el extremo 3 de la cadena abierta, de manera que produceesplazamiento del extremo 5. (d) El desplazamiento del extremo 5 se hace msxtenso en la medida que la enzima polimerasa recorre el templado de ADNircular (cadena negativa). El resultado es la formacin de un ADN con longitud

gcircular, etc.).

Figura 2.5 Mecanismo de replicacin del crculo rodante. (a) ADN circular. (b) Unaeadecmayor a la normal. Ejemplo: fago l el fago XI74.


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todo el ciclo celular, y cuando laoncentracin aumenta se dispara la iniciacin. Esta es la hiptesis mas aceptadan trminos de que la sntesis proteica es necesaria para disparar la iniciacin. El

lulas

iferentes ciclinas en la fase1. En levaduras, el tamao de la clula regula la velocidad a la cual se dar el

esta estrategia sea usada por otras clulas.

de

ualquier segmento de ADN con un origen puede replicarse, a estas regiones se le conoce como

a velocidad de replicacin ADN en clulas de mamferos es de 50 nucletidos por segundo. El

Cmo se regula el inicio de la replicacin en procariotas?

Una protena iniciadora puede sintetizarse durantecegen FtsZ juega un papel importante, una mutacin en este gen provoca cmltinucleadas con filamentos. Este gen es el blanco de otra protena (Sol A) quebloquea la divisin celular bajo ciertas condiciones. Una sobreexpresin de estegen FtsZ provoca e induce mini-clulas, que carecen de ADN y sonmorfolgicamente normales. Por lo tanto la expresin del gen FtsZ determina lafrecuencia de la divisin, actuando como una protena iniciadora.

Otra hiptesis relaciona una protena inhibidora que puede sintetizarse a una velocidad fija, cuandoel volumen celular aumenta, esta se diluye y permite la iniciacin.

Replicacin en Eucariotasa sntesis de ADN est ligada con el ciclo celular, el inicio de la replicacin y suLcoordinacin con el ciclo celular parecen estar regulados por acciones deacelerado y frenado controladas por la produccin de dGinicio de la replicacin, quizsLa clulas que inician G1 siendo anormalmente pequeas tardarn mas en llegar al punto de iniciomientras que clulas anormalmente grandes llegarn a esta etapa ms pronto. Los mecanismos porlos cuales los factores ambientales regulan el inicio se relacionan con el efecto que una disminucinde nutrimentos tiene sobre la tasa de produccin de ciclinas, las cuales reducen su concentracinen las clulas y por lo tanto la concentracin no es la suficiente para disparar la explosin

uinasa (Ver figura 2.6)qLa sntesis de ADN se lleva al cabo en la fase S del ciclo celular, por lo tanto las clulas en G2 sonclulas con una contenido de ADN tetraploide. La mitosis reduce a un nmero diplide de ADN encada clula hija. En los eucariotes, cada replicn se activa en un momento especfico durante elperodo S. Puede existir una replicacin bidireccional y cuando la horquilla de replicacin llega alpunto de trmino se detiene la replicacin.

Csecuencias de replicacin autnoma, ARS(por sus siglas en ingls), conformada por una zona consecuencia consenso de nucletidos, que est formada por lo general de 11 pb y rodeada de unaregin de ADN rica en los nucletidos Adenina y Timina. Cada cadena o zona de ADN que sereplique necesita de su propia secuencia de origen.

Lproceso esta regulado por protenas que actan rpido y sincronizadamente. El complejomultienzimtico que lleva al cabo este proceso constituye una elaborada maquina de replicacin.


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irus con ARN ARN de cadena sencilla. Ej. TMV y Poliovirus.Cuadro 2.3 Tipos de genomas virales.V

ARN de cadena doble. Ej. Reovirus.

Virus con ADNADN de cadena sencilla Ej. Parvovirus.

ADN circular sencillo. Ej. M13 y bacterifago X174.

ADN de cadena doble. Ej. Bacterifago t4 y herpesvirus.

ADN circular de cadena doble. Ej. SV40 y polyoma.

ADN de cadena doble co terminaciones asociadas a protenasncovalentemente. Ej. Adenovirus.

ADN de cadena doble con terminaciones covalentes

Ej. Poxvirus.

selladas.

Quina

Ciclina

Factorromotor


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F

31

ORIGEN

ORIGEN

CrecimientoCrecimiento

igura 2.6 Control de la replicacin-ciclo celular. Esquema de las variacin de lasctividades de las ciclinas dependientes de quinasasa (cdc) a lo largo del cicloelular en una clula de mamfero. Diferentes ciclinas y diferentes quinasas,ueden unirse para formar los diferentes complejos, incrementando las opcionese combinaciones posibles de los complejos de ciclinas dependientes de quinasas

ue se forman en el transcurso de un ciclo celular.

igura 2.7 Esquema del proceso de replicacin bidireccio

ada uno de los cuales comienza la replicacin a diferente tiempo, pero se replicanolo una vez por ciclo celular. La horquilla de replicacin se mueve en una o en dosirecciones hasta llegar al sitio de termino de cada replicn.

acpd

q

F nal.

Inicio de lareplicacin

ADN de nuevasntesis

Horquilla modireccin co

vindose enntraria

Figura 2.8 El genoma de los eucariontes est organizado en muchos replicones,csd


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ntesis semidiscontinua del ADN

-3 esto se resuelve

intetizando la hebra que crece de 3-5 en una serie de fragmentos cortos, cadatizados de 5-3.

a iniciacin de la sntesis es acompaada por un complejo proteico llamado

e varias formas:

finalOH pueda ser usado por retrovirus para iniciar una transcripcin reversa de

por el duplex de ADN, el mecanismo mas comns la introduccin de un corte como el usado en la iniciacin de la replicacin del

) Una protena inicia la reaccin directamente por la presentacin de un nucletido

SLa estructura antiparalela del ADN posee un problema en la replicacin, la orquillade replicacin se mueve en direccin 5-3 en una hebra y 3-5 en la otra, y loscidos nucleicos son sintetizados unicamente en direccin 5

suno de los cuales realmente son sinteLa hebra que se sintetiza de 5-3 se conoce como hebra lider, la otra es la hebraconvicta o cautiva, cada segmento es sintetizado en una direccin contraria almovimiento de la horquilla, los fragmentos sin embargo se sintetizan de 5-3yluego son unidos conformando una replicacin discontinua.

LPrimosoma en E. coli. Las ADN polimerasas de Procariotas y Eucariotas nopueden iniciar la sntesis de una cadena de ADN a partir de nucletidos libres. Serequiere de un "primer" (primario) para proveer de un final libre 3-OH que puedaelongarse por la adicin de nuevos nucletidos, esto se da da) Una secuencia de ARN es sintetizada en el templete, por lo que la cadena deARN se extiende por la ADN polimerasa. Comunmente usado en la replicacin delADN celular y por algunos virus.

b) Unos pares de bases de ARN preformado con el templete, permite que su3ARN.

c) Un termino inicial es generadoecirculo rodante, en este caso la hebra preexistente es desplazada por una nuevahebra sintetizada (diferente de Nick Translation en la cual la hebra es degradada).

dpara la ADN polimerasa. Esta forma es utilizada por ciertos virus.


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squema de la derecha la formacin del fragmento de Okazaki en la hebra cautiva.

Cmo se regula la iniciacin de la replicacin? ) Metilacin: la replicacin ocurre unicamente en un origen metilado, lo cualucede en la secuencia palndroma: GATC/CTAG, y se metla la posicin N6 de la

Amet TC - MaternaCTAG-NuevaGATC NuevaCTAmetMaterna

jo de iniciacin de la replicacin no reconoce el origen.

n se ha iniciado,s orgenes de las nuevas cadenas formadas se unen a la membrana previniendo

directa por que losrgenes han sido ocupados o bien de manera directa por que algunos

Figura 2.9 Esquema del avance de una horquilla de replicacin, se observa en eleAsadenina por una enzima llamada DAM Metilasa.

GAmetT CCT Amet G

La replicacin sintetiza cadenas dobles hemimetiladas de ADN:

GPor lo tanto el compleB) Asociacin a la membrana: despus que el ciclo de replicaciloque se repliquen de nuevo, lo cual puede ser de manera inocomponentes de la membrana inhiben la reaccin.


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su modo de accin.

.- Mutgenos qumicose conocen varios productos qumicos que son mutagnicos, clasificndose segn su modo de

2.1.4 Mutaciones: mutgenosExisten una gran variedad de agentes fsicos y qumicos que pueden inducir mutaciones. Acontinuacin se presentan algunos de los principales grupos y1S

accin en:

Anlogos de bases: Debido a su similitud estructural los anlogos de bases como el 5-Bromo la 2-Aminopurina se incorporan en el ADN que se replica en lugar de las bases co

ouracilorrespondientes

mina y adenina. Cuando uno de estos anlogos de bases se incorpora en el ADN, la replicacinue ocasionalmente ocurren errores de lectura que resultan en la

eguanina (la timina se aparea con adenina) ocasionando la transicin de AT a GC (laparea con citosina). La 2-Aminopurina puede aparearse con citosina ocasionando la

iguolcula de 5-Bromouracilo

gentes que reaccionan con el DNA: Existen una serie de agentesumicos que reaccionan directamente sobre el ADN que no se esteplicando ocasionando cambios qumicos en las bases lo que provoca

citosina se aparea con adenina producindose transicionesC ----> AT.

tipuede ocurrir normalmente aunqincorporacin de bases errneas en la copia de ADN. As por ejemplo, el 5-Bromouracilo se puedaparear con

uanina se agtransicin de AT a GC.

F ra 2.10 Esquema que representa la sustitucin de las bases normales por unam

Aqrun apareamiento incorrecto.

Acido nitroso (HNO2), desamina la adenina a hipoxantina y la citosina a uracilo. Debido a lasdistintas propiedades de apareamiento de los productos de desaminacin (hipoxantina aparea concitosina; uracilo con adenina) se producen transiciones AT---->GC y/o GC---->AT.

Hidroxilamina (NH2OH), reacciona con la citosina donde el grupo amino es reemplazado por ungrupo hidroxilamino. Este derivado de laG

Agentes alquilantes: Grupo de productos qumicos que afectan al ADN que no sereplica. Junto con la luz ultravioleta son los sistemas mutagnicos

ms potentes

nte

oxi butano (DEB), N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), N-metil-N-itroso urea y gas mostaza.

para aplicaciones prcticas. Los compuestos utilizados ms frecuentemeincluyen el etil metano sulfonato (EMS), metil metano sulfonato (MMS), dietil sulfato(DES), diepn


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ando la transicin GC ----> AT.

igurlquilante etil metano sulfonato (EMS)

l N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), cancergeno, es uno de losutgenos qumicos ms efectivos. Se obtienen, en condiciones ptimas, un gran

todava.gentes intercalantes

La mutagnesis con agentes alquilantes se produce a travs de varias vas ya queoriginan la formacin de un espectro completo de bases alquiladas en el ADN loque origina transiciones y delecciones.El etil metano sulfonato (EMS) introduce un metilo en la guanina que ya no seaparea con la citosina provoc

F a 2.11 Esquema de una mutacin de la Guanina provocada por el agentea

Emnmero de mutantes con una tasa de muerte baja. El mecanismo molecular exactode la reaccin de la NTG no se conoceA : Un grupo interesante de sustancias como las acridinas y

romuro de etidio, son molculas planas que se insertan entre dos pares de bases

igur

bdel ADN, separndolas entre s. Durante la replicacin, esta conformacin anormalpuede conducir a microinserciones o microdelecciones en el DNA, originandomutaciones por corrimiento de lectura.

Aunque las acridinas son tiles en investigacin, no son muy adecuadas para el aislamientorutinario de mutantes durante el desarrollo de cepas ya que tienen poco o ningn efecto mutagnicoen bacterias.

F a 2.12 Esquema del modo de accin del agente intercalante Acridina.


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.- Mutgenos fsicos

uz ultravioleta: Uno de los agentes mutagnicos ms efectivos es laadiacin ultravioleta de longitud de onda corta. La longitud de onda

0 nmnm que es la absorcin mxima del ADN. Laadiacin a longitudes de onda entre 300 y 400 nm tiene menos efectos

-)

de un enzima de fotorreactivacin que corta los dmeros de timina. Enresencia de luz, el enzima corta los dmeros originando pirimidinas monomricas.

igu

rovocada por la radiacin UV.

adiacin ionizante: La radiacin ionizante es una forma de radiacins potente e incluye rayos de longitud de onda corta como los rayos

ias; producindose indirectamente efectosutagnicos debido a esta ionizacin.

2

Lr

efectiva para la mutagnesis est comprendida entre los 200 y 30con un ptimo a 254rletales y mutagnicos que la luz UV de longitud de onda corta.

Los productos ms importantes de la accin de la luz UV son dmeros (timinatimina; timina-citosina; citosina-citosina) que se forman entre pirimidinas (T, Cadyacentes, lo que incrementa enormemente la probabilidad de que durante lareplicacin del ADN, la ADN polimerasa inserte un nucletido incorrecto en talposicin.

La radiacin UV es muy til en el aislamiento de mutantes de cultivos bacterianos.Cuando las poblaciones irradiadas con luz UV son expuestas subsecuentemente ala luz visible de una longitud de onda de 300 a 450 nm, la velocidad desupervivencia aumenta y la frecuencia de mutacin desciende. Esto se debe a laactivacinp

F ra 2.13 Esquema que representa la formacin de dimeros de Timina

p

RmX, rayos csmicos y rayos gamma. Esta radiacin causa la ionizacindel agua y de otras sustancm


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bajas dosis de radiacin ionizante slo ocurren unos cuantos impactos sobre elrte

igur bserva que la radiacin ionizante es de longitudes de onda muy pequeas..1.5 Sistema de proteccin del ADNespus de su incorporacin, las bases se metilan para marcar segmentos de

DN. Tanto procariotas como eucariotas contienen enzmas que metlan el ADN

N de nueva replicacin, porla adenina (involucrando el control de replicacin y marcaje de ADN

Entre las especies qumicas formadas por la radiacin ionizante se encuentran radicales libres,siendo el ms importante el radical hidroxilo (OH-). Los radicales libres reaccionan con el ADN, y loinactivan produciendo rupturas que dan lugar a cambios estructurales importantes como son lasmutaciones cromosomales.

AADN, pero a mayores dosis ocurren impactos mltiples que conducen a la muede la clula. Al contrario que la radiacin UV, la radiacin ionizante penetrafcilmente el vidrio y otros materiales

Fo

a 2.14 Diferentes tipos de radiaccin que se presentan en la naturaleza, se

2D

Aaunque sus funciones de metilacin son diferentes.

ProcariotasE. coli posee pequeas cantidades de 6-metil-adenina y 5-metil-citosina en suADN, estas bases se generan por accin de tres metilasas.a) Sistema hsd: que confiere especificidad del hospedero metilndo la adenina.b) Sistema dam: que distingue las hebras de ADmetilacin depara su reparacin).c) Sistema dcm: que metla citosina, su funcin es desconocida.

Las bacterias que poseen mutaciones en los tres sistemas carecen de basesmetiladas y siguen siendo viables, por lo que la metilacin no es un eventoescencial.


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a metilacin en este grupo tiene distinta funcin, es distinguir genes en lasiferentes condiciones funcionales. Los daos al ADN pueden ser minimizados porn sistema de contencin del dao, que reconoce la presencia de un cambio y loctifica. Los sistemas de reparacin son similares a los complejos de replicacin,

de su importancia en la sobrevivencia de la clula.

sual estructura deoble hlice, los cambios se pueden dividir en dos grupos.

.1.6 Reparacin del ADN: pre y postreplicativa

EucariotasLdure

un indicativoLa tasa de mutacin refleja un balance entre el nmero de eventos dainos queocurren en el ADN y el nmero que ha sido corregido (o mal corregido).

Un dao al ADN consiste en cualquier cambio que desve la ud

2

Mecanismos de reparacinA) Eliminacin directa del dao

Fotorreactivacinntre dos pirimidinas adyacentes

(normalmente dmeros de timina). La fotoliasa, mediante el proceso deendiente de luz, revierte la primera reaccin y deshace

La luz ultravioleta induce la formacin de dmeros e

fotorreactivacin, que es depel dmero.

AlquiltransferasasCiertos mutgenos (nitrosoguanidina, etilmetanosulfonato) aaden grupos alquilosen la posicin O-6 de las guaninas. Las alquiltransferasas eliminan esos gruposalquilos.B) Sistemas de reparacin dependientes de homologa

te y relleno Reparacin por cor

(12-13 nucletidos en procariotas, 27-29 en eucariotas). El hueco seliintervienen los genes

er en ese sitio.Esto inicia un proceso de reparacin por escisin mediadoor una exonucleasa, la ADN polimerasa I y la ligasa de ADN.

s. Los dmeros deirimidinas resultan de una reaccin inducida por la luz, y las fotoliasas usan

Sistema general: El sistema reconoce una base anormal. Rompe puentesfosfodister a una distancia de varias bases a ambos lados de la lesin. Elimina elfragmentorellena con ADN polimerasa I y se sella con ligasa. En E. couvrABC.

Sistema especfico: Una ADN glucosilasa libera la base daada al romper unpuente N-glucosdico (base-azcar). Esto da lugar a un sitio apurnico oapirimidnico (AP). Una AP endonucleasa reconoce el sitio AP y rompe un puentefosfodistpC) Sistema de reparacin directaVarios tipos de daos son reparados sin la remocin de bases. El ejemplo masestudiado es la fotoreactivacin directa de los dmeros de pirimidina ciclobutano,que es una a reaccin promovida por la ADN Fotoliasap


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ida para revertir este dao. Las Fotoliasas

igura 2.15

) Reparacin de emparejamientos errneos

l sistema reconoce dos bases mal emparejadas tras la replicacin. MutS es larotena encargada en E. coli. Determina qu base es la incorrecta, la base

dena viejase distingue porque est metilada en las adeninas que se encuentran dentro de las

es postrreplicativa y la lleva a cabo la

a, llevando a cabo la sntesis reparadora. Una exonucleasa eliminan trozo de la cadena nueva desde el sitio GATC hasta ms all del

energa derivada de la luz absorbgeneralmente contienen dos cofactores que sirven como agentes absorbentes deluz o cromoforos. Uno de los cromoforos es siempre FADH2. El otro es un folato enE. coliy levadura.

F Esquema de reparacin directa de un dimero de pirimidina.

D

Epincorrecta es la que se encuentra en la cadena recin sintetizada. La ca

secuencias 5'-GATC-3'. Esta metilacinmetilasa Dam.

La cadena nueva tarda de 1 a 2 minutos en re-metilarse tras la replicacin. MutL yMutH forman un complejo con MutS. MutH es un endonucleasa que corta lacadena nueva en el sitio GATC ms cercano al emparejamiento errneo y escindela base incorrectuemparejamiento errneo. Protenas de unin a ADN de cadena simple protegen elhueco. La ADN polimerasa III rellena el hueco y la ligasa lo sella.


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40

igura 2.16 Esquema del proceso deetilacin de las adeninas en la

adena de ADN recin sintetizada, este

El reguln SOS de E. colieplicacin del ADN est bloqueada por

na lesin y la reparacin no es posible por uno de los sistemas antes

sto atrae a las protenas de unin a cadena simple (SSB) y a RecA.

UmuC

in.

El sistparacin propenso a error.

REPLICACIN

Hebra vieja metilada yhebra nueva NO

Las adeninas de la hebranueva se metila pormedio de la Dam

Fmcproceso es necesario para que elsistema de reparacin de basesmalparedas reconozca la hebramaterna o vieja.

E) Reparacin sin hebra molde:Slo se induce en situaciones en que la rumencionados.Etapas:

1.La ADN polimerasa III se detiene ante una lesin, lo que genera ADN decadena simple.

2.E3. La presencia de filamentos de RecA es una seal para que la clula

sintetice UmuD y4. RecA corta UmuD para dar lugar a UmuD.5. El complejo UmuD' / UmuC permite que la polimerizacin de ADN

contine a pesar de la les

ema SOS permite continuar la replicacin pero introduciendo nucletidos alazar. Este es un sistema de re


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Cuadro 2.4 Genes inducidos por el sistema SOS

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IENTO DEL ADN

enoma bacterianotra organizado en cuerpos definidos, aunque si

morfolgicamente distintas como en eucariontes. El genoma

deas de un juego de genomas en ADN. En la divisin el material se separa en dos

2.2 EMPAQUETAM2.2.1 Genomas y cromosomasGEl genoma bacteriano se encuenbien no en estructuraspuede verse como un conglomerado que ocupa cerca del 35% del volumen de la

clula . El material gentico se condensa en un rea conocida como nucleoide.

Las bacterias que han replicado parcialmente su ADN presentan en el nucleomnucleodes los cuales se particionan entre las clulas hijas, la segregacininvolucra la adhesin del genoma bacteriano a la membrana interna. Mecanismosimilar al de los cromosomas de eucariontes. Un locus especfico es conectado aun sitio en la membrana.

FUNCIN DESCONOCIDAdinB

inDddinF

PARTICIPACIN EN REPARACIN POCO CLARAProtenas SSB.Codifica para Helicasa II.

unidad de factor de integracin a hospedero.reparacin por recombinacin.

Codifica para subProtena involucrada en la

sbvrD

suhimArecN

Codifica para protenas que detienen la divisin celular.

in porrueba y por recombinacin.

Codifica para la protena RecA involucrada en la reparacp

SulA

RecA

Codifica para la ADN polimerasa II, inv olucrada en reparar.

odifican para protenas involucradas en la reparacin por prueba yrror.

Codifican para la ABC exinucleasa.

Ce

PuvrA

muD

Papel el el sistema de reparacin po

olB (din A)

uvrBuvrC

umuCu

r SOSNombre del gen


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E.coli las fibras de ADN se liberan en forma de rizosnidos a la envoltura rota los rizos condensan al ADN gracias a unas proteinas,

enoma viralon respecto al empaquetamiento del genoma, existen diferencias entre el genoma

. El genoma viral se ve restringido por dos aspectos: a) la cantidad

cpsula se pueden encontrar otras

ntenga el cido nucleico?. La cubierta proteica puede ensamblarse alrededor del cido nucleico,

urante el

valentes eneucariotas

Si se rompe una bacteriaumuchas proteinas de union con el ADN han sido aisladas de E.coli.Cuadro 2.5 Protenas de unin al ADN en E. coli

Protena Composicin Nmero por clula Equi

Hu

1

des 9000 d

000

bunidad de 1500 dnocido

H

H1HLPP

y subunida

2 sbunidades idnticas 28dSuMonomero de 17000 d

Subunidad de 3000 d

40,000 dimeros

30,000 dimeros

10,000 copias

20,000 copias

desconocido

H2B

H2A

DescoDesconocido

protaminas

GCviral y el celularde cido nucleico est predeterminada por el genoma y b) el cido nucleico debeempaquetarse en una cpsula de protena.El genoma est contenido en una cpsula simtrica o cuasimtrica, ensamblada

por una o mas protenas. Junto con laestructuras proteicas. El volumen interno de la cpsula pocas veces es mayor queel volumen de cidos nucleicos que debe contener. La cpsula es construida conprotenas codificadas por el virus, por lo que se construye por un tipo simple desubunidades restringindose la forma de la cpsula a dos tipos:A. Filamentosas o forma de bastn.B. Pseudoesfricas o simetra icosaedrica

Cmo se construye una cpsula que co1condensando el ADN o ARN por interacciones cido protena d

ensamblaje. Un ejemplo es: el MTV, en el cual la cadena sencilla del ARN se vecubierta por el ensamblamiento de las protenas. El ensamble comienza en unpunto determinado del ARN y se dirige hacia ambos extremos de la cadena.Formndose una estructura cilndrica gracias a la interaccin con la forma helicaldel ARN. Estructuras semejantes se observan en cpsulas esfericas ejemplo:TYMV, la posicin del ARN en la cpsula es determinada directamente por suunin con la protena de la cubierta.


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partir de sus componentes en forma de unaubierta vacia,despus de lo cual los cidos nucleicos pueden ser insertados

a fago posee su propio mecanismo

2. La cpsula puede ser construida acsiendo condensados cuando entran. Ejemplo: en los fagos lambda y T4 , cpsulasesfricas con ADN . Una cabeza vaca de la cpsula es ensamblada a partir de un

juego pequeo de protenas, luego el genoma dplex es insertado en la cabeza,

junto con un cambio estructural de la cpsula.El ADN insertado a la cabeza vaca de la cpsula tom una forma concatemrica.Genomas mltiples unidos final con final. Cadpara reconocer la cantidad apropiada de ADN que debe ser insertada.

Figura 2.17 Esquema de un virus icosahedrico, se observan los componenetes y elmaterial gentico (ADN) en el interior de la cabeza.Lambda: Los finales del genoma se encuentran marcados por sitios denominadosCOS. Este se corta a la izquierda del sitio COSque produce un final libre que es

igura 2. Esquema de replicacin y recircularizacin del ADN del fago lambda.

insertado dentro la cpsula. La insercin de ADN continua hasta que el sitio COSderecho se libera al cortarse para generar el otro fin. El ltimo final que entra en la

cpsula durante el ensamblaje es el primero en entrar a la clula infectada.Cualquier ADN contenido entre ambos sitios COS puede ser empaquetado. Elempaquetamiento no resulta si la distancia entre los sitios COSes muy grande oreducido. Solo un 15 % extra del ADN puede ser empaquetado.

F 18


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Fago T4: La insercin del genoma se inicia en un sitio al azar en el precursor

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oncatemrico. Continua hasta que un valor del genoma de ADN ha sido insertado

igura 2.19 Esquema de los ciclos reproductivos de los virus, se presenta la formae propagacin del material gentico, y el esamble.

os cromosomas eucarioticos individuales solo se observan durante un periodoisin celular y pueden observarse como una unidad

terial genticocupa un rea en el ncleo, por lo que los cromosomas individuales no pueden ser

oma contiene un dplex de ADN muy largo, por lo que la replicacine los cromosomas al igual que del ADN es semi-conservativa.

olos opuestos de lalula, el movimiento depende de la unin de los cromosomas a los microtbulos

clo que involucra la existencia de algunos mecanismos para medir la cantidad deADN (realmente la cantidad de ADN insertado es un poco mayor que el genoma)

creando una redundancia terminal.

FdCromosomas en eucariotasLcorto de tiempo, durante la divcompacta con un radio de empaquetaminto de 10,000. Una cromtida consiste deuna fibra de un diametro de aprox 30 Nm y de apariencia nebulosa.

Durante el ciclo de vida de la clula eucaritica, sin embargo, el maoobservados.

Cada cromosdDurante la mitosis las cromtidas hermanas se mueven hacia pcque se conectan en su otro final con los polos. El lugar al cual se unen loscromosomas en los microtbulos se le denomina: Centrmero, que tiene unsignificado funcional y estructural, el centromero es escencial para la segregacin.


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antidad considerable de heterocromatina constitutiva. En esta regin, puedeEl centromero posee una regin rica en ADN satlite y por lo tanto contiene unacobservarse una zona obscura fibrosa con un diametro o longitud de 400 nmaproximadamente. Esta regin es conocida como cinetocoro a la cual se unen

directamente los microtubulos. Se asme que una secuencia especfica de ADNdefine el stio en que el cinetocoro se establece.

Figura 2.20 Esquema de la integracin del ADN para formar un cromosoma enmamfero.

tra estructura importante en los cromosomas es el telmero, que sella el final delromosoma, es importante ya que se ha observado que cromosomas rotos sin esta

ples rotas que previene que la enzima ligasa los selle. La regin o

Ocestructura son inestables y tienden a pegarse a otros cromosomas. Se encuentra alfinal del cromosoma o al final de un ADN lineal. Confiere estabilidad a unamolcula lineal. Cada telmero consta de una serie larga de secuencias cortas yrepetitivas.En la regin telomrica se encuentran ciertas discontinuidades, en forma de

bandas simlongitud del telmero se encuentra bajo control gentico, diferentes cepas delevaduras presentan diferentes longitudes, algn mecansmo exste para prevenirlongitudes muy largas, removiendo algunas repeticiones, por lo cual la secuenciaexcta es irrelevante ya que la regin puede crecer al avanzar en lasgeneraciones.


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aractersticas necesarias para la existencia de los cromosomas:Telmeros propios para sobrevivir.

histonas y nucleosomas

Ci)ii)Centrmeros: para la segregacin.iii)Origen: inicio de la replicacin.

2.2.2 Estructura de la cromatina:HistonasLa masa de la cromatina contiene dos veces mas protena que ADN, las protenas

r histonas o no histonas, y el ARN es menos del 10% de la masa de

los eucariontes se pueden encontrar las

enas, por lo que una protena se encuentra en menor

tonas tienden a contaminarse con protenas nucleares.

ncin

pueden seADN, ste ARN, est formado por cadenas recin sintetizadas que an seencuentran unidas al templete de ADN.Las histonas conforman aproximadamente la misma cantidad de ADN. Y son lasprotenas mas importantes. En todosmismas histonas que son las siguientes: H2A Y H2B interactan directamente conel ADN son particulas de primer nivel en la cromatina. H1 muestra gran variacinentre tejidos y especies (ausente en levaduras) y una variante es la H5. Clulassanguneas rojas en aves.Las no histonas son mas variables entre tejidos y especies, menor masa que lashistonas, muchas mas protcantidad que una histona dada. Las protenas no histonicas incluyen funcionesrelacionadas con la expresin gnica. ARN Polimerasa es una no histona demucha relevancia.Protenas HMG (high moblity group), son un grupo de protenas no histnicas biendefinido. Las no hisCuadro 2.6 Protenas histonicas presentes en los mamferosNombre de la histona Lisina (%) Arginina (%) Peso molecular y fuH1 29 1 23,000

esobre el

Sella el ADN que senrrollanucleosoma.

H2A 11 9ctamente con

13,960Interacta direel ADN.

H2B 16 6a directamente con

13,774Interactel ADN.

H3 10 13

a directamente con

15,342

Interactel ADN.H4 11 14

a directamente con11,282Interactel ADN.


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ucleosomaNontiene aproximadamente 200 pb de ADN asociado a un octmero de histonas.

el ncleo del nucleosoma, est conformado por: 2 copias de H2A,

por 146 pb. Cortesnzimticos, demuestran que este ncleo permanece sin cortes despus de cierto

eslabn entre0 a 114 pb por nucleosoma.

observan unidos por ADN libre, pero in vivo, debexstir muy poco ADN libre (no asociado), por lo que todo o casi todo el ADN esta

igura 2.21 Esquema de un nucleosoma y losomponantes que lo forman. Se observan las

CEl octamero esH2B, H3 y H4. Asociada a cada nucleosoma una molcula sencilla de H1, la cualpuede ser removida sin alterar la estructura del nucleosoma.

El nucleosoma siempre posee un ncleo de ADN formadoetiempo, sin embargo, si contina la digestin se observan longitudes de ADN, lamayor de las cuales mide 146 pb y la menor, mide menos de 20 pb .

El ADN nucleosomal mide entre el ADN ncleo y el ADN de unin o8Los nucleosomas in vitro seeasociado en nucleosomas. Sin embargo, se pueden observar cambios endiferentes etapas embrionarias.

Fcprotenas histnicas disosiadas.


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o alctmero de histonas siendo protenas de ensamble sin formar parte estructural

une en la vecindad de los nucleosomas, en degradaciones con

60- 170 pb.de ADN, se encuentra H1 lo que sugiere que se encuentra en una

m deltura. Los 67 Nm (200 Pb) del ADN se encuentran rodeando dos veces al

os del nucleosoma pueden obtenerse por: Extraccin de la cromatina.vitro: dejando a las histonas en condiciones de alta salinidad.

rimer paso para lategracin del nucleosoma es la union de protenas no histnicas en sitios

ras: fibras de 10nm de dimetro y fibras de0 nm, la diferencia es la estructura y organizacin de los nucleosomas. 200 Pb =

La H1 y protenas no histnicas influyen en la longitud del ADN asociadodel nucleosoma.

La protena H1 se

1regin cercana al ncleo del nucleosoma . Cortes de 16 pb no lo presentan.

El nucleosoma es un disco o cilindro plano con un diametro de 11Nm y 6Naoctmero con un giro de 34Nm cada una. El ADN entra y sale del octmero en lamisma posicin o punto. Realmente el ADN gra alrededor del nucleosoma dando1.8 vueltas.

Los octamerIn

El ADN que se une al nucleosoma no lo hace al azar, pues un pinespecficos del ADN. Por lo que se dice que el ADN del nucleosoma se encuentrafraseado es decir siempre reconoce la misma regin para unirse al octamero, almenos en secuencias cortas de ADN.

La cromatina presenta dos tipos de fib3262,000. Daltons.

Figura 2.22 Esquema de una cadena de ADN asociada a nucleosomas

200 pb de

ADN

ProtenanoADN de unin

Ncleo del nucleosoma

HistonaH1

histnica


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urante la replicacin, cuando la cromatina se duplica, no se observa ningunadividida en dos tipos :

mittico su radio de

mpaquetamiento es aproximadamente de 1000 2000 durante la interfase .e los

romosomas en mitosis, durante el ciclo celular no cambian su densidad. En esta

or el grado deondensacin.

a constitutiva: Regiones particulares que nunca son expresadascluyendo secuencias satlites de ADN .

igura 2.23 Empaquetamientoe la cromatina a diferentes

2.2.3 Naturaleza de la cromatinaDdisrupcin. La cromatina puede serEucromatina: Menos densa que en el cromosoma

eHeterocromatina: Muy densa, el grado de empaquetamiento es similar al dcforma el ADN no se transcribe.Cromocentro: Varias heterocromatinas agregadas en una regin.

La heterocromatina se diferencia de la eucromatina solo pcHeterocromatinin

Fdniveles, hasta conformar uncromosoma en eucariotas.


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eterocromatina facultativa: Toma la forma de un cromosoma completo inactivo enna linea celular pero en otras circunstancias puede ser expresado.

de transcripcin y organizacinstructural. La condensacin del material gentico se asocia con su inactividad,

terfase y cromosomas mitticos posen grandes rizos debra constitutiva formando regiones o campos independientes, como en los

de bandeo G mostr que cada cromosoma pose unaltra estructura diferente y reproducible. El teir los cromosomas despus de un

HuEj: Cromosoma X en mamiferos, una copia elegida al azar es inactiva en una

hembra dada, lo que compensa la presencia de dos X en hembras.El cromosma X inactivo se perpeta como estado heterocromatido. El cromosomaX activo se perpeta como estado eucromtido.

Por lo tanto hay correlacin entre actividadepero lo contrario no necesariamente es cierto. Los genes activos son contenidos enla eucromatina, la localizacin en eucromatina es necesaria para la expresingnica pero no sufiiente.

In vitrola cromatina en infinuclesidos bacterianos.

El desarrollo de la tcnicautratamiento, con el colorante giemsa , genera una serie de bandas. Aunque estatcnica es muy ampliamente empleada aun no se reconoce por que se produce elbandeo.


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UNIDAD 3

EXPRESIN DE LA INFORMACIN DEL ADN

3.1 TRANSCRIPCIONUnidad de transcripcin: Se extiende del promotor al punto de trmino de un gen.

La transcripcin se divide en tres etapas:1. Iniciacin, en la cual se une el complejo enzimtico de transcripcin sobre unasecuencia de ADN conocida como promotor, y avanza hasta la secuencia quesignifica el punto de inicio, que es donde se une el primer ribonucletido.2. Elongacin, es el proceso de unin covalente de los ribonucletidos.3. Terminacin, cuando el complejo enzimtico de transcripcin llega a unasecuencia que significa el trmino de la transcripcin.

TRASNCRIPCININVERSA

Figura 1 Dogma central del flujo de informacin en los sistemas vivos.

3.1.1 Unidad de transcripcinARN polimerasa: enzima encargada de la sntesis de ARN a partir de templado deADN. La ARN polimerasa fue descubierta independientemente en 1960 por SamuelWeiss y Jerard Hurwits.

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La reaccin que cataliza consiste en:

(ARN)n-residuos + NTP (ARN)n-residuos + 1 + PPi.

NTP: nuclesido trifosfato (ATP, CTP, GTP y UTP); posteriormente, el bifosfato(PPi) se hidroliza

Todas las clulas contienen a la ARN polimerasa. En procariontes esta enzimasintetiza todo el ARN excepto el necesario para el cebador en la replicacin delADN (esta reaccin es catalizada por la primasa). Algunos bacteriofagos sintetizanuna ARN polimerasa que solo sintetiza ARN especfico del fago. En eucarionteshay 3 4 ARN polimerasas diferentes que sintetizan diferentes tipo de ARNs. LaARN polimerasa mejor caracterizada es la de E. coli.

Procariotas

Posee una sola enzima ARN polimerasa (encargada de pegar los ribonucletidos).Esta enzima sintetiza los tres diferentes tipos de ARN: mensajero, transferencia yribosomal. Esta enzima est conromada por varias subunidades, por lo que se leconoce como holoenzima o complejo enzimtico que tiene un tamao de 48,000Daltons (Da).

Cuadro 3.1 Componentes de la holoenzima ARN polimerasa de procariotasSubunidad Locus Nmero por holoenzima Funcin Rpo A 2 Unin al promotor Rpo B 1 Unin de nucletidos

Rpo C 1 Unin al templete Rpo D 1 Iniciacin

El ncleo enzimtico de la holoenzima (,,) puede iniciar el proceso detranscripcin pero no reconoce la secuencia de inicio. El complejo enzimtico cubre60 pares de bases (pb) de la molcula de ADN, sin embargo, slo desenrolla 17pb.

La velocidad de la reaccin de unin entre nucletidos es igual a 70 nucletidos porsegundo a una temperatura media de 37C.

El proceso de la trasncripcin en procariotas puede bloquearse por la accin deantibiticos, por ejemplo la Rimfacina acta bloqueando la actividad de lasubunidad del complejo. La Estreptomicina inhibe el proceso de elongacin.

La Heparina es un polianin que bloquea la transcripcin in vivo, unindose a lasubunidad .


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EucariotasEste proceso es mas complejo e involucra la actividad de 3 polimerasas de ARN enel ncleo, cada una con una estructura compleja de subunidades y con una funcindiferente.

Cuadro 3.2 Enzimas ARN polimerasas presentes en eucariotasNombre Ubicacin FuncinARN polimerasa I Nucleolo Transcribe ARNrARN polimerasa II Nucleoplasma Transcribe ARNm y ARN nuclear

heterogneo (ARN)ARN polimerasa III Nucleoplasma Transcribe ARNt y otras molculas de

ARN menores

La principal diferencia entre las enzimas eucarioticas es su respuesta al

octapeptido biciclico. Amanitina, la cual bloquea los ciclos de la ARN polimerasaII. Unindose a ella y no la de ARN polimerasa I.Cada enzma se compone de dos subunidades grandes, con untamao de 200,000y 140,000 Daltons y varias sbunidades con tamao de entre 10,000 a 90,0000Daltons.No existe especificidad ni entre tejidos ni entre especies en la actividad de laenzima ARN polimerasa II, in vitro, sin embargo muchos otros factores regulan latranscripcin en condiciones naturales.ARN polimerasa en mitocondrias y cloroplasto son menos activos y diferentes delos nucleares y su control parece ser mas simple.

3.1.2 Transcripcin en procariotas y eucariotasProcariotasEl factor sigma () en los procariotas juega un papel muy importante pues aseguraque la ARN polimerasa bacteriana se una al ADN de los promotores y no en otrossitios, ya que la holoenzima por si misma presenta una alta afinidad por el ADN.Permite a la holoenzma reconocer sitios especficos en el ADN y que en esemomento requieren de ser trasncritos a ARN.Se forma un complejo terciario ADN-ADN-ARN naciente, cuando se une el primerribonucletido a la secuencia de ADN que se trasncribe, lo que dispara la liberacindel factor sigma de toda la holoenzma. Este paso es el inicio de la trasncripcinpropiamente dicho, cuando ocurre la sntesis del primer enlace fosfodister entre

ribonucletidos.La proporcin entre el factor sigma bacteriano y el ncleo de la holoenzima es de1:3. Por lo que cuando finaliza la transcripcin el tetrmero (holoenzma) se libera ydebe unirse a otro factor sigma que dirija una nueva transcripcin.Se dan tres etapas en el movimiento de un sitio de unin a otro de la ARNpolimerasa, este movimiento est limitado por la velocidad de difusin en el medio.


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La afinidad de la holoenzma hacia el ADN es tan alto como la afinidad del factorhacia la secuencia del promotor. Sin embargo el factor solo no se une al ADN,nicamente se une si forma parte del complejo enzimtico.La iniciacin de la transcripcin es un punto crtico para controlar la expresingnica. Los promotores varan en su afinidad hacia la ARN polimerasa.

ARNPOLIMERAS

REGIN

UNIN DE LAARN

ARNPOLIMERAS

Figura 3.2 Esquema del proceso de transcripcin en procariotas.

3.1.3 Eventos de la transcripcinLa ARN polimerasa comienza a copiar cuando encuentra una secuencia promotorade ADN, y termina cuando alcanza una seal de terminacin. En el caso de losprocariontes el ARN transcrito se une desde el primer momento a protenas, debidoa que es muy inestable ya que no tiene el 7-metil-guanocina (CAP), ni la poliA, queestabilizan el ARNm eucaritico.En la transcripcin intervienen factores de naturaleza proteica de tres tipos:

Factores de transcripcin: Son diversas protenas que se unen al ADN promotor,convirtindolo en funcional, lo que atrae a las ARN polimerasas. Hay un factorespecifico para cada tipo de ARN polimerasa. - Factores de iniciacin: Es lasubunidad s de la ARN polimerasa y se libera tras la sntesis de los ocho primerosnucletidos.

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Factores de elongacin: Se incorpora a la polimerasa tras la liberacin del factor deiniciacin. Sirve para la elongacin y terminacin de la cadena de RNA.En eucariotas gran parte del ARNm de la clula es producido por un complejoproceso que empieza en el ncleo con la sntesis y procesamiento de un RNA muy

largo, denominado ARNm precursor, ARN nuclear heterogneo (ARNhn) otranscrito primario.

POR LOSSALIDA AL CITOSOL PARA SER

POLIADENIZACI

ESCISIN DE INTRONES Y UNIN DE EXONES

TRANSCRIPCION

Figura 3.3 Proceso de maduracin del ARN en eucariotas

Este transcrito tiene unos 8,000 nucletidos (llegando hasta 20,000) y contienesegmentos que se traducirn como aminocidos (exones) y segmentos nocodificantes (intrones o secuencias intercaladas) y, adems secuenciasreguladoras a las que se unirn las protenas de regulacin gnica. A continuacin,este transcrito sufre un proceso de maduracin, en el que se cortan y empalmanlargas secuencias de ARN (splicing), para eliminar los intrones y dar lugar al ARNmdefinitivo que es selectivamente transportado al citoplasma. En este proceso, lamayor parte del ARNhn (90%) se elimina y degrada en el ncleo.

El transcrito primario de ARN hn es producido por la accin de una ARNpolimerasa II. El ADN promotor contiene una secuencia llamada BLOQUETATA,porque consta de secuencias ricas en T y A, esta secuencia est situada a unos 25nucletidos por delante del nucletido de inicio de la transcripcin. En eucariotas(no en procariotas), al transcrito primario se le aaden dos seales, una en cadaextremo:

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CAP: Al extremo 5 del transcrito se le aade un nucletido especial la 7-metil-guanosina trifosfatada. Este nucletido (SELLO) se le aade cuando se llevan


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NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR J.

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