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FAGOS LAMBDA: comporta fragmentos maiores que plasmdeo. Limite de tamanho relacionado comcapacidade de empacotamento para encaps. Propagam genoma dentro de bactrias. Dentro do DNAviram so mantidas informa!es para infeco e replicao do genoma. "lula hospedeira norteia ocomportamento# replicao r$pida reprodu% vrus mais r$pido. &nfectam de modo hori%intal. ' genoma dofago (tem cerca de )* +b. Na e,tremidade esquerda esto locali%ados os genes que codificamas protenasda cabea e cauda- os genes que codificamprotenas envolvidasno ciclo ltico mapeiam na e,tremidadedireita. A regio central do genomapode ser removida ou substitudapor DNAe,geno sem afectara

capacidade de replicao do fago# permitindo a inserode DNA e,geno at/0) +b.BIBLIOTECA GENMICA: fragmentao permite amplificao dos genes individuais# produ%indo massaclonada. 1ma amostra do DNA gen2mico total primeiro separada mec3nicamente ou parcialmentedigerida por en%imas de restrio em grandes fragmentos. 4ssa populao quase aleatria de fragmentosde DNA superpostos # ento# separada por eletroforese em gel para isolar trechos com de 5) 6b decomprimento. Ligantes sintticos so unidos 7s pontas desses fragmentos# so formadas pontas adesivas#eos fragmentos so# ento# inseridos em um vetor# tal como o DNA do fagol# preparado com as mesmaspontas adesivas. As 4.coli so# ento# infectadas com esses fagos recombinates. ' lisado resultantecontm fragmentos de DNA humano abrigados em um n8mero suficientemente grande de vrus paragarantir que quase todo o genoma este9a representado. 4stes fagos constituem uma biblioteca gen2mica.DNA POLIMERASE REPLICATIVA: fidelidade com a replicao# as outras geral conseq;ncias compa ouincompatveis com a clula por introduo de altera!es nos caracteres heredit$rios.REPARO DE DNA: no possui compromisso com a informao. "omple,o replicativo interrompido atreparar. ENDOreparam no meio. EXONUCLEASESreparam falhas nas pontas.FOTORREATIVAO ENZIMTICA: remove dmeros de pirimidina formados por e,posio do DNA ao1ocorre na correo da desaminao da citosina a uracila ?remove a base# uma endo cliva em regio ad9acente# DNApol preenche e ligase liga@. EXCISO DE

NUCLEOTDEOS: inciso endonucleotidica dos dois lados da leso seguida de preenchimento pelaDNApol# reparo de regi!es curtas ocorre constitutivamente e de longas depende de induo por ocorr;nciade leso.PROTENA-TUS: interrompe movimento da forquilha# desencadeia sistema de reparo. e liga 7 sequ;nciaconsenso# funcionando como um terminador para a helicase.'corr;ncia de erros: RADICAIS LIVRES >atuam sobre fita dupla@# RADIAO, ELEMENTOS MVEIS>insero de sequ;ncia heterloga ? geralmente no detect$veis@. NATURAIS: aumento significativo deuma das bases# indu% erros. BCPA: base mutante aceitada e qualquer base com pareamento inserida# gerando um mutante. requ;ncia de muta!es geralmente identificadas por surgimento decol2nias diferentes. MENOR n!"#$ %" !&'n&"( ()*n)+)' #"'#$ POUCO '&).$. Eeparo F1&G' ativo

perpetua muta!es. Futao em sequ;ncias conservadas levam em geral a morte celular# no havendocontabilidade de mutantes nas col2nias. BA4 FAL PAE4ADA: responsabilidade do sistema decorreo de erro so ptnas codificadas pelos GENES mut. Eemove segmentos de fita simples contendomal pareamento. 1m sinal especfico direciona o sistema de e,ciso do erro para a fita recm sinteti%ada>reconhecimento das sequ;ncias HAG" pr,imas ao erro@. itas com HAG" metiladas so as parentais# aoutra a recm. Gb reconhece adi!es# dele!es e substitui!es. E4PAE' P'E 4"'FB&NAIJ': fitacomplementar no danificada utili%ada como molde na substituio do fragmento lesado. e o molde noestiver disponvel fica uma lacuna# em organismos diplides h$ a mesma ou quase a mesma sequ;ncianos cromossomos homlogos. 4m E/C$0) ' RecA pareia as duas molculas de DNA homlogas e catalisarea!es de troca de fita. &G4FA ': e,presso indu%ida por erros graves capa%es de impedir a

sntese do DNA# os genes ' do origem a en%imas de reparo# e,emplo: dmeros de pirimidina# h$e,ciso# ficam lacunas# EecA se liga# isso desativa o repressor dos genes '# le,A# cu9a regio possuium operador 'bo,. Logo R"A #"'#' #"$!1)n'n%$ 2$! $' %'( +)&'(3 " $# )n%45$ %" *"n"(SOS/ K usada EecA= em bactrias de laboratrio para que a mutao indu%ida se9a mais eficiente e nocorrigida# na clula viva ela necess$ria para redu%ir o efeito letal da mutao. EecA Gb cliva repressores

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de genes virais# permitindo sntese de unidades pteicas q vo compor o capsdeo e lisar a clula.R"BCD: atuam como topoisomerases# abrindo e clivando sequ;ncias defeituosas# agregando outrasptnas. A clivagem se d$ dentro do motivo chi# gerando fita simples com gap que pode ser reconhecida pelaEecA. 4la ento gera uma 9uno de ollidaM e um gap em outra fita. >'LAE D44N'@ R.AB6tambm catalisam troca de fitas# so como argola ao redor da fita dupla. REPARO SU7EITO A ERRO: *"n"( SOS !C " !D incorporam qualquer base com o fim deprosseguir a replicao# resgatando a viabilidade da clula. UNIO DE EXTREMIDADES NO-

8OMLOGAS: se ocorre quebra nas duas fitas >morte e c3ncer ? causado por radiao ioni%ante#quimioter$picos e radicais livres@. 4,tremidades so 9ustapostas para recombinar# o mesmo comple,o ligaas e,tremidades e acaba por resultar em DNA com sequ;ncia alterada. 8OMLOGAS: muito preciso embactrias e leveduras# cromossomo homlogo ao lesado fa% cpia da sequ;ncia perdida com quebra dadupla fita e transfere ela para o stio de quebra no cromossomo lesado# restaurando a seq original.TRANSIO: purina por purina. TRANSVERSO: purina por pirimidina/ MUTAO SINNIMA: cdonsde um mesmo AA. SENTIDO TROCADO: introdu% AA# conservada ou no# de acordo com assimilaridades dos aas. 4F SENTIDO: cdon de parada. FRAMES8IFT. AH4NG4 F1GAHN&"':causam altera!es conformacionais e qumicas sobre genoma.

TRANSPOSON: tipo de transfer;ncia hori%ontal# causa altera!es estruturais. &ncid;ncia em regi!es

regulatrias so menos destrutivas# na codificante interrompe transc da ptna. E4"'FB&NAIJ' OG&'4P4"O&"A: garantem mecanismo de insero de fagos e transposons. DNA mvel# no envolverecombinao homloga.

DNA RECOMBINANTE: ligar 0 ou mais segmentos de DNA gerando molcula capa% de auto=replicaono hospedeiro. DNApol usava in vitro permite amplificao do gene# sendo usadas Gb en%imas derestrio# ligases# quinases# fosfatases que introdu%em modifica!es sobre o DNA. N8mero de cpias doplasmdeo dentro da clula depende da ori de rep.

TRANSFORMAO: introduo da quimera >plasmdeo@ dentro de hospedeiro competente >4."oli@everificao das col2nias. Plasmdeos: usado em insertos pequenos e que possuem pouca especificidade

para se ligarem ao vetor. "ontm um ou mais genes de resist;ncia a drogas > selecionar as bactriastransformadas@Gem tb um stio de clonagem m8ltipla que apresenta muitos stios=alvo de en%imas derestrio. K neste stio que so inseridos os fragmentos de DNA. Alguns tem o gene Lac >en%ima b ?galactosidase = facilita a seleo das bactrias transformadas@. ' gene Lac est$ em contiguidade com ostio de m8ltipla clonagem. Quando no plasmdeo inserido um fragmento de DNA# esse gene interrompido e no h$ produo da b =galactosidase. 4ssa en%ima age sobre um substrato incolorchamado R=gal que adicionado ao meio convertendo=o em um corante a%ul. A col2nia que apresenta oplasmdeo sem o gene Lac interrompido fica a%ul >do contr$rio fica branca@. agos: Para clonarfragmentos muito grandes. "osmdeos: Parecido com o fago# porm mais f$cil para manipular por nopossuir especificidade.

Fini=prep >T9CNICA DE LISE ALCALINA@: "entrifugao da culturaS Eessuspenso emtampoSadio de NA'T': lise bacteriana em p alcalinoS neutrali%ao do lisado >com acetato depot$ssio@S centrifugao e descarte do DNA cromoss2micoS DNA plasmidial no sobrenadante >comadio de isopropanol@. DNA plasmidial fica em soluo por renaturar mais f$cil# o gen2mico ppta.

STIOS M:LTIPLOS DE CLONAGEM: v$rios locais 8nicos de clivagem para endonucleases de restrio#os quais constituem o stio de insero. AUXOTRFICAS6dependem de nutrientes especficos.

COMPATIBILIDADE PLASMIDIAL: inserir mais de um plasmdeo com origens de replicao diferentes# aclula no v; como material duplicado e descarta um deles. A origem deve ser compatvel com a

plataforma usada. DEFOSFORILAO previne o plasmdeo de se ligar nele mesmo.

VETORES DE CLONAGEM: insertos de DNA gen2mico# transcrito reverso cDNA# de subclonagem ousinttico >em geral obtidos por recombinao homloga@. ATIVIDADE NO ESPECFICA: pode ocorrer

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por erro de tamponamento ou no mtodo de incubao. S$0."n&"( $#*;n)$(podem ser usados paraterminar reao.

LIGANTESESTERN: Nesta tcnica# submete=se a amostra 7 eletroforese em um gel de Dpoliacrilamida. Aps separadas no gel as protenas so transferidas por contato ou por um campo eltricopara a superfcie de uma l3mina de polmero. Adiciona=se um anticorpo especfico para a protena de

interesse. Adiciona=se um segundo anticorpo marcado radiativamente especfico para o primeiro. 1m auto=radiograma revela uma fai,a escura onde est$ a protena de interesse. "omo alternativa# o segundoanticorpo pode conter uma en%ima que gera um produto corado.

ENZIMAS DE RESTRIO TIPO ?: sequ;ncias de reconhecimento so# em geral# constitudas por quatroa seis pares de nucletidos# e palindrmicas. "livagem ocorre dentro ou pr,ima. Bactrias que produ%emendonucleases de restrio tambm cont;m as en%imas de modificao correspondentes que metilambases no local de reconhecimento das endonucleases.

MODIFICAO DAS EXTREMIDADES DO DNA: por preenchimento parcial das e,tremidades UVrecuadas# por preenchimento total# por remoo das UV pro9etadas >polimerase de DNA do fago GW#

polimerase 6lenoX# nuclease 5 e mung bean@ ? e,tremidades coesivas so convertidas em cegas.Adio de lin+ers ? cegas em coesivas# p min8sculo na frente. Adio de adaptadores ? coesivas emcoesivas diferentes. "auda de homopolmeros ? cegas em coesivas pela transferase terminal.

DESFOSFORILAO6 Eemoo dos grupos )VP das e,tremidades do DNA pela fosfatase alcalina paraimpedir a recirculari%ao do vector >aumenta a efici;ncia de clonagem@ ou a ligao intermolecular doDNA dador# em particular# a ligao de fragmentos de DNA de regi!es genmicas diferentes. Gratamentocom fosfatases diminuem o bac+gound.

ISOLAMENTO DE RNA!: A cromatografia de afinidade em coluna oligo=dG utili%ada no isolamento demENA eucaritico. ' ENA citopl$smico constitudo fundamentalmente por ENAs ribossmicos >rENAs@ e

ENAs de transfer;ncia >tENAs@. 's ENAs mensageiros >mENAs@# so muito menos abundantes# mas t;mcaudas poli=A que hibridam com oligo=dGs covalentemente ligados 7matri% da coluna. Aps hibridao# osrENAs e tENAs so removidos da coluna por lavagem# sendoos mENAs depois eludos com um tampode bai,a concentrao salina. A preparao de mENA purificado resultante contm muitas molculas demENA diferentes que codificam diferentes protenas.

ETAPAS DA CLONAGEM: preparaoTescolha do vetor Y ligao do vetor e incerto Y transformao nohospedeiro Y seleo de clones >a partir do fentipo observado na clula ? por isso importante usar umgene reprter na cepa@.

PREPARAO: digesto do plasmdeo# dirigida com 0 en%imas de restrio# no dirigida com 5. 6lenoXou GW=DNApol preenche e,tremidades )V proeminentes resultado da digesto. Lin+ers podem seradicionados nas e,tremidades com o stio de restrio dese9ado. Purificao do vetor pode ser feita porELETROFORESE. ' controle feito com os plasmdeos>ta,a de reali%ao@ e os incertospuros>contaminao@.

T'@ $0)!"#'(": coloca A amais que pode ser usado a favor. Apresenta resist;ncia a temperatura e usada no P"E.

P"E: o controle da temperatura permite que o primer anele no lugar correto. Para replicar fragmentocompreendido entre dois primers# alvo inicial o ENAm# primers de m8ltiplas timinas anelam na cauda

poli=A que s e,iste nos ENA processados# por transcriptase reversa se fa% o cDNA. cDNA denaturado>Z[\"@ para primers anelarem e haver ampliao. "iclos consecutivos vo fornecer fragmento amplificadocom enriquecimento de determinadas sequ;ncias.

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's clones genmicos podem ser obtidos por PCRa partir de DNA cromossmico e,trado das clulas.o adicionados primers que ladeiam a regio de DNA que se pretende clonar# sendo amplificado apenaso DNA entre os primers>incluindo os primers@. 4sta tcnica permite obter selectivamente uma curtae,tenso de DNA cromossmico.

's clones de cDNA podem ser obtidos por RT-PCRa partir de mENA e,trado das clulas# e purificadopor cromatografia de afinidade em coluna oligo=dG. ' primeiro primer >oligo=dG@ depois adicionado 7populao de mENAs# sendo utili%ada a transcritase reversa para produ%ir a cadeia de cDNA

complementar. Pode ser em tempo real ou no# permitindo monitoramento da progesso# permite ver apartir de qual ciclo h$ p sinal de interesse# por fluoresc;ncia.

CURVA DE DISSOCIAO: garante se no ocorreram rea!es secund$rias e no h$ sequ;nciasinespecficas amplificadas. $ picos de fluoresc;ncia quando o fluorforo for liberado pela temperatura. Apolimerase passa em cima da ($n%'liberando ela# oq d$ a fluoresc;ncia.

NOCOUT: Deleo de um gene especfico >ou uma famlia de genes@ de um genoma funcional. Pode=se inviabili%ar a protena do produto# deletar determinada regio# marcar ponto de deleo com 6] parasaber que ocorreu# grande# ento tem q ver viabilidade.

ANTI-SENSE6 uno: modular a e,presso g;nica por hibridi%ao seletiva a seq;ncia complementardo mENA ou pre=mENA alvo. abilidade de atingir a e,presso de genes especficos-Pode ser usado paramodificar a forma de splicing. &nibio ou impedimento do transporte# splicing# )^capping# U^polMadenMlatione traduo do ENA pela inibio da interao do ENA com outras molculas comoprotenas e outros $cidos nuclicos. &nibir a ligao do ribossomo >)^regio@- bloquear a traduo >regiocodificante@ ou &nibir o splicing >stio splicing@.

ANTI-GENE: ob certas circunst3ncias o DNA pode adotar uma conformao de TRIPLA 89LICE# quepode ser inter ou intramolecular. Gripla hlice intermolecular so formadas pela adio de uma terceira fitaseq;ncia especfica ao sulco maior da dupla hlice de DNA. o molculas de polipurinas ou

polipirimidinas que se unem a fita rica em purina do alvo. o ligantes especficos para dupla fita de DNA.Na regio PE'F'G'EA causa competio com fatores de transcrio# impedindo estericamente. Nointerior da regio a ser transcrita provoca bloqueio.

IRNA DE INTERFER=NCIA: Futag;nese direcionada baseada na observao de que em muitos sistemasa e,presso de um ENA dupla fita causa a degradao do mENA correspondente. $cil sntese emanipulao. imples aplicao. Eesistente 7 ao de nucleases.Bai,o custo. Eesposta r$pida. Permiteestudar ao de genes em organismos de difcil manipulao em laboratrio. Necessidade deconhecimento prvio da seq;ncia alvo. 'ptimi%ao da aplicao e do dsENA >fita dupla deENA@.D&"4E: picota a fita de ENA# uma ENase U. 4sses fragmentos vo se ligar a comple,os proticos

formando os E&" >ver

desenho@.

VERIFICAR SE O DNA 9 DEUM MESMO ORGANISMO:fa%er o sequenciamento dogenoma afim de verificar seh$ compatibilidade comorganismos similares# ver se euca ou proca. e no houversimilaridade no nvelgen2mico# ver se tem no nvelprotico.

1ma en%ima de restrioparticular reconhece somente

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uma seq;ncia 8nica de bases. DNAs de origens diferentes sob a ao da mesma en%ima de restrioprodu%em fragmentos com o mesmo con9unto de e,tremidades fitas simples. Portanto# fragmentos de doisdiferentes organismos >por e,emplo# bactria e homem@ podem ser ligados por renaturao das regi!es defita simples. e os fragmentos de DNA humano so misturados com o DNA plasmidial lineari%ado#permitindo a ligao entre eles# uma molcula de DNA plasmidial contendo DNA humano pode ser gerada.4ste plasmdeo hbrido pode ser inserido numa bactria atravs de transformao e ento o inserto ser$replicado como parte do plasmdeo.

MICROC8IPS: 's micro=chips de DNA so fabricados por m$quinas robticas com m8ltiplas pontas deimpresso# que liberam gotculas de soluo de DNA em posi!es especficas numa placa de vidro# que do tamanho de lamnula de microscpio. A disposio de cada molcula de DNA no chip deve serrelacionada com um gene especfico. Por tcnicas de hibridi%ao# cDNA preparado de ENA=m e,tradode um determinado tecido apontar$ no micro=chip quais genes esto ativos e quais esto inativos nessetecido.

GFP6Para a locali%ao intra=celular de uma protena# o mtodo mais empregado atualmente o da

protena de fluoresc;ncia verde# ou HP >_green fluorescent protein_@. Por esse mtodo# uma pequena

seq;ncia de DNA que codifica para uma peptdeo fluorescente ligado a uma das e,tremidades de um

gene alvo. ' gene alvo codificar$# portanto# uma protena recombinante# ou protena de fuso. A maior

parte dela continuar$ a codificar a sua seq;ncia nativa# mas uma pequena poro ter$ atividade

fluorescente e assim a protena poder$ ser detectada no interior da clula. 4m que compartimento celular

seu produto g;nico atua >ou se9a# a protena que ele codifica@# "om quais protenas ele interage# Quais

fun!es bioqumicas especficas ele coordena.