Pontifícia Universidade Católica – PUC RIO

Departamento de Química

LABMAM – Laboratório de Estudos Marinhos e Ambientais

BIOMONITORAMENTO PASSIVO DE HIDROCARBONETOS

UTILIZANDO MEXILHÕES PERNA PERNA

Aluno: Larissa de Souza Pinto Nogueira

Orientador: Angela de Luca Rebello Wagener

Co-Orientadores: Adriana Haddad Nudi e Thaís Pedrete Massone

Introdução:

Biomonitoramento tornou-se uma importante ferramenta em programas de monitoramento

ambiental, uma vez que a biodisponibilidade dos contaminantes é medida diretamente nos

organismos bioindicadores.

Contaminante é todo elemento ou composto que ocorre em concentrações mais elevadas que

as naturais. Já a definição de poluente é a de qualquer matéria ou energia que interfira na saúde e

segurança da população, além de prejudicar suas atividades sociais e econômicas. Porém, a

presença de contaminantes pode qualitativa ou quantitativamente alterar as características naturais

do ambiente, e também sua utilização, gerando assim efeitos negativos e constituindo poluição. O

contaminante torna-se então, um poluente. (von RÜCKERT, 2010)

Devido à grande densidade demográfica das regiões costeiras, os ecossistemas litorâneos

estão sujeitos a vários impactos de origem antropogênica. De especial relevância são aqueles

derivados do despejo de compostos xenobióticos, que contaminam águas e sedimentos, e são fonte

de efeitos deletérios à biota aquática. (LIMA, 2005)

A contaminação ambiental por agentes químicos tem ocorrido de forma intencional ou

acidental em decorrência da ação antrópica. Os ecossistemas marinhos acabam, de uma forma ou de

outra, constituindo-se como receptáculos temporários ou finais de uma grande variedade e

quantidade de contaminantes. (MORAES et al., 2011)

A despeito da importância do ambiente marinho, o conhecimento para a proteção dos

ecossistemas marinhos brasileiros contra a poluição é relativamente recente. Medidas legislativas

para prevenir ou reduzir sua deterioração são escassas ou fracamente implementadas a nível

nacional. (MORAES et al., 2011)

O biomonitoramento é uma prática que avalia a saúde ambiental de ecossistemas aquáticos e,

consequentemente, a qualidade de suas águas. No biomonitoramento passivo, forma feita neste

estudo, utiliza-se animais coletados diretamente de seus habitats, onde a população natural existe.

(KOCK & KRAMER, 1994)

O objetivo do presente estudo foi realizar o biomonitoramento passivo na Baía de

Guanabara, utilizando mexilhões Perna perna como bioindicadores e monitorando os níveis de

Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs) e de n-alcanos presentes em amostras de água e

nos tecidos moles de mexilhão, a fim de estimar as suas concentrações e possíveis fontes e origens;

e ainda aplicando os ensaios de vermelho neutro e micronúcleo como biomarcadores para testar a

viabilidade celular. Os resultados foram correlacionados com dados anteriores realizados na mesma

área, para verificar se houve ou não um aumento desses contaminantes, e avaliar a bioacumulação

de HPAs nos tecidos, além disso objetivou-se comparar a concentração dos compostos pesquisados

em circunstâncias sazonais diferentes, marcadas por uma estação seca de junho a agosto, (KJERFV,

1997) e uma estação úmida, coleta realizada em janeiro. O intuito foi averiguar se os organismos

respondem de forma diferente in situ, quanto às particularidades de cada estação, uma vez que, em

períodos de maior quantidade de chuva (estação úmida) a quantidade de material particulado é

maior.

. Sendo assim, também será avaliada a água do local em que serão coletados os mexilhões, a

fim de quantificar as concentrações de hidrocarbonetos e calcular o fator de acumulação.

A biota tornou-se uma importante ferramenta em programas de monitoramento ambiental,

uma vez que a biodisponibilidade dos contaminantes é medida diretamente. Moluscos bivalves têm

sido extensivamente empregados na avaliação da contaminação de ambientes aquáticos. Esses

organismos são adequados como monitores biológicos de áreas contaminadas, pois eles são: sésseis,

filtradores, de fácil coleta, estão presente ao longo de todo o ano e respondem rapidamente às

variações das concentrações de contaminantes no meio.

Fundamentos Teóricos:

Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs)

Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) são compostos químicos constituídos

unicamente de átomos de carbono e hidrogênio, arranjados na forma de dois ou mais anéis

aromáticos. Devido à possibilidade da fusão de um número variável de anéis e das várias posições

em que estes podem se ligar entre si, há atualmente mais de 100 HPAs reconhecidos pela IUPAC

(International Union of Pure and Applied Chemistry). Apesar disso, somente 16 HPAs são

considerados prioritários para USEPA (U.S. Environmental Protection Agency), em função de sua

importância industrial, ambiental e toxicológica. Desta classe de compostos são eles: Naftaleno;

Acenaftileno; Acenafteno; Fluoreno; Fenantreno; Antraceno; Fluoranteno; Pireno;

Benzo(a)antraceno; Criseno; Benzo(b)fluoranteno; Benzo(k)fluoranteno; Benzo(a)pireno;

Indeno(1,2,3-cd)pireno; Dibenzo(a,h)antraceno e Benzo(g,h,i)perileno (USEPA, Método 610; EC

166/2006).(POTIN et al., 2004)

São amplamente distribuídos no ambiente, devido às atividades relacionadas à extração, ao

transporte, à transformação e à utilização do petróleo e de seus derivados.

Estes compostos apresentam alta lipofilicidade, são absorvidos pelos seres vivos, e sua

análise pode revelar se provém de introdução direta de petróleo no ambiente (poluição,

derramamentos) ou de processos de combustão (uso do petróleo como combustível). Os HPAs são

metabolizados pelos órgãos internos dos seres vivos, transformados em compostos detectáveis que,

encontramos nos organismos, podem ser utilizados como biomarcadores da exposição ao petróleo e

seus derivados (NUDI, 2005).

Os HPAs podem ser produzidos, basicamente, por: pirólise de matéria orgânica em altas

temperaturas; diagênese de material orgânico sedimentar em temperaturas baixas ou moderadas;

biosíntese direta por microorganismos ou plantas (NEFF, 1979). Consideráveis quantidades de

HPAs lançados ao meio marinho são originarias de fontes antropogênicas. Dentre as quais, se

destacam como principais fontes os efluentes industriais, lançamento de esgotos (pluviais e

domésticos), incineração. de lixo, derrames de óleo, produção de asfalto, creosoto deposição

atmosférica, através da queima de combustíveis fosseis (CLARK, 1997). Porem, certas fontes

naturais como a síntese biológica, erupções vulcânicas, queima de florestas, formação de

combustíveis. fosseis e a extrusão natural do solo, também são responsáveis por quantidades

significativas destes compostos (McELROY et al., 1989).

A maioria destes HPAs que entram nos ambientes aquáticos permanece relativamente

próxima as suas fontes, decrescendo quase que logaritmicamente com a distância da origem. Desta

forma, a maior parte dos HPAs encontrados nos ambientes aquáticos esta localizada em rios,

estuários e águas costeiras (NEEF, 1979).

Mexilhão Perna perna (Linné, 1758)

Os organismos escolhidos para o estudo são os moluscos bivalves Perna perna (Linné,

1758), que pertencem à família Mytilidae. Trata-se de uma espécie que ocorre na costa oeste do

Atlântico, desde a Ilha Margarita e Cumaná (Venezuela) até a Ilha de Lobos e Punta del Este

(Uruguai), sendo abundante no mesolitoral até o infralitoral entre os estados do Espírito Santo e

Santa Catarina nos costões rochosos e abrigam uma grande quantidade de fauna e flora associada

(EPAGRI, 1994; TORRES, 1983).

Estes organismos são filtradores que, para a obtenção do alimento, dependem do batimento

dos cílios branquiais, os quais criam correntes de água no interior da concha, e de um sistema de

seleção das partículas que serão encaminhadas ao tubo digestivo (COSSA, 1989), conforme

esquematizado na figura 1. Esses moluscos filtradores selecionam o alimento através do tamanho da

partícula do material em suspensão, que varia desde bactérias de 1 µm até poliquetas e planárias

(invertebrados bentônicos) de 4 mm de comprimento (FERNANDES e MARTINS, 1978), A

respiração desses indivíduos é branquial e fatores como tamanho, etapa do ciclo reprodutivo,

presença de poluentes determinarão a taxa de oxigênio necessário. (LIMA, 2001).

Quanto a diferenciação sexual, esta pode ser observada através da coloração das gônadas. Os

machos apresentam cor creme ou esbranquiçada e as fêmeas possuem cor vermelho-tijolo ou

alanranjada (EPAGRI, 1994).

Embora tenha grande potencial econômico, sendo utilizado como alimento em todo o litoral

brasileiro, pouco se conhece sobre a distribuição e o significado patológico das doenças que mais

freqüentemente o acometem. O incremento das atividades em mitilicultura no Brasil coloca o País

como o principal produtor de mexilhões cultivados da América Latina, principalmente com a

criação de fazendas marinhas no Estado do Rio de Janeiro.

Área de estudo

A área escolhida para estudo e onde foram realizadas as coletas é um ambiente estuarino, no

qual situa-se o aporte da Baía de Guanabara localizada no Rio de Janeiro e engloba toda a região

Metropolitana da cidade. A área de coleta é próxima à região conhecida como “Quadrado da Urca”

(Fig.2), que possui embarcações em excesso e recebe muitos despejos de esgoto. Além de

derramamentos de óleo, aterramentos oficiais e clandestinos. (NAKASHIMA & PRANTERA, 2006)

Esta região apresenta estações chuvosas e secas bem definidas. O inverno corresponde aos

meses mais secos, que vão de junho a agosto, com médias mensais de 50mm. A estação chuvosa

corresponde ao verão e apresenta uma média mensal acima de 100mm (Kjerfve, 1997)

A primeira coleta foi realizada em Julho de 2013 e a segunda em Janeiro de 2014,

aproximadamente nos mesmos horários, entre 08:30 min e 09 horas, em uma área de costões

rochosos e que havia uma grande população de mexilhões Perna perna (Linné, 1758). Foram

coletados 10 indivíduos, além da coleta de água, que foi em triplicata em garrafas de 4 L. O ponto

escolhido foi aleatório, assim como os indivíduos coletados.

Figura 1: Representação de um mexilhão

Figura 2: Área de estudo, Quadrado da Urca, Baía de Guanabara.

Figura 3:(Quadrdado da Urca- Baía de Guanabara); Mexilhões no costão rochoso; Retirada de

mexilhões do costão.

Metodologia:

Os mexilhões foram coletados manualmente, de modo aleatório, no costão rochoso do

Quadrado da Urca, situado dentro da Baía de Guanabara (in situ). Foram selecionados 8 espécimes

adultos. Amostras de água também foram coletadas em triplicata, em garrafões de 4L, previamente

descontaminados. As amostras foram devidamente acondicionadas em caixas térmicas contendo

gelo. Ainda no local, foi mensurada a temperatura da água com um termômetro e esta era de 26°C.

Em laboratório, os animais foram limpos e livres de organismos incrustantes.

Posteriormente foi realizada a biometria dos animais, com auxílio de uma balança e paquímetro

(Fig.4), os organismos coletados para a estação úmido tinham o comprimento entre 7,3 e 5,5 cm e

peso total entre 53,4 e 25,4 g.

Figura 4: Procedimento de biometria, mensuração de tamanho e peso dos mexilhões, com auxílio de

paquímetro e balança.

Extração de hemolinfa

A hemolinfa foi extraída com auxílio de uma seringa hipodérmica (1 a 2,5 ml) com agulha

0,8 X 40 mm, contendo 100 µL de solução fisiológica. A agulha foi inserida cuidadosamente no

músculo adutor posterior do animal e cada amostra obtida foi depositada em um tubo de Eppendorf

de 2mL de volume (Fig. 5). Em alguns dos animais da primeira coleta, a extração foi bem

complicada e trabalhosa, gerando dúvidas quanto ao conteúdo extraído, sendo assim, optou-se por

não utilizar estas amostras, nos animais coletados para estação úmida (a retirada de hemolinfa

ocorreu em todos).

Figura 5:Extração de hemolinfa com auxílio de uma seringa de 1 mL e agulha de 0,8 X 40 mm

Biomarcadores

Primeiramente foi preparada uma solução salina fisiológica, a qual foi utilizada para os

ensaios de vermelho neutro e micronúcleo. Esta solução foi feita a partir de 4,77 g Hepes; 1,47 g

CaCl2; 13,06 g MgSO4; 25,48 g NaCl; 0,75 g KCl pesados em uma balança analítica.

Posteriormente foram diluídos em água destilada e avolumados a 1 ML em balão volumétrico. O

pH foi ajustado para 7,36 com 1 M de NaOH, com auxílio do aparelho Orion 3 Star da

ThermoFisher Scientific.

Uma solução de estoque vermelho neutro foi confeccionada, dissolvendo 20 mg deste em 1

mL de DMSO, esta solução foi acondiocionada na geladeira. E no dia que foi realizado o teste de

vermelho neutro foi preparada a solução de trabalho, adicionando 5 µL da solução estoque em 995

µL de solução salina.

O teste de vermelho neutro foi realizado utilizando 100 µL da hemolinfa coletada,contendo

100 µL de solução fisiológica. Uma alíquota de 30 µL desta mistura foi colocada na lâmina e o

corante vermelho neutro foi adicionado. Para melhor visualização, as lâminas foram colocadas em

uma câmara escura úmida para incubação por 15 minutos. Após este período, foram colocadas as

lamínulas e feitas sucessivas visualizações das lâminas no microscópio (40x), anotando-se o tempo

de retenção do corante determinando o ponto em que há evidência da perda do corante dos

lisossomos para o citosol.

Considera-se que uma amostra saudável normalmente tem um tempo de retenção de 150-

180 minutos (DIERICKX, 1991).

No ensaio do micronúcleo, alíquotas de 50 µL de células em suspensão foram transferidas

para uma lâmina, previamente tratada com solução de Poly-L-lysine para adesão das células, e

posteriormente foram fixadas com solução de Carnoy (metanol/ácido acético 3:1) e coradas com

solução Giemsa 3%. As lâminas foram examinadas em microscópio óptico com aumento de 40x.

Material para análise de HPAs e n-alcano

Para análise de contaminação no tecido do mexilhão foi realizada a coleta da parte mole

encontrada dentro da concha. Após todos os procedimentos abordados acima, foi aberta a concha

com auxílio de espátula para não danificar a amostra e retirado todo o conteúdo do interior desta. As

amostras foram acondicionadas em potes de vidros descontaminados e congeladas a -80ºC e depois

liofilizadas durante 5 dias e posteriormente, submetidas pelos processos de extração, clean-up e

fracionamento, para a então análise dos compostos por cromatografia em fase gasosa (GCMS),

através da quantificação baseada na padronização interna.

As amostras de água foram acondicionadas em geladeira até início do processo de extração

dos hidrocarbonetos, quando esta foi retirada com antecedência para que ficasse em temperatura

ambiente. Antes da extração foi adicionado 100 mL de MeCl2 à amostra, além dos padrões

subrogados de F1 e F2, para análise de hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos. A adição destes

padrões tem como objetivo o acompanhamento do desempenho da metodologia empregada, que é

considerada adequada caso a recuperação situe-se na faixa entre 40 e 125%. (SAUER &BOEHM,

1995).

A metodologia utilizada na determinação de hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos descrita

acima é baseada no método EPA 8015C e EPA 8270C, respectivamente.

Resultados e discussão

Os biomarcadores escolhidos no presente estudo são ferramentas muitos importantes para o

biomonitoramento e que juntamente com as análises químicas, que estão sendo processadas no

LABMAM (Laboratório de Estudos Marinhos e Ambientais) compõem um resultado mais sólido e

justificável. Sendo assim, os valores obtidos no momento correspondem apenas ao ensaio de

vermelho neutro, micronúcleo e hidrocarbonetos aromáticos, uma vez que os outros resultados

referentes à presença de HPAs alifáticos nas amostras de água e tecido estão em andamento.

O ensaio de vermelho neutro apresentou um tempo de retenção de 90 minutos na primeira

coleta e 60 minutos na segunda e em comparação com estudos realizados em ambientes

semelhantes, também na Baía de Guanabara, mas em outros pontos de coleta (LIMA, 2001;

FRANCIONI, 2005 e 2007), também utilizando o mexilhão Perna perna, apresentou tempo de

retenção entre 25-82 minutos e que foram considerados ambientes impactados. Em ambientes

semelhantes, em uma célula saudável, o tempo de retenção do vermelho neutro é de 180 minutos

para o mexilhão Perna perna (FRANCIONI et al. (2005). Portanto, o resultado obtido no presente

estudo sugere um comprometimento da integridade lisossômica, não retendo o corante vermelho

neutro por menos tempo, espalhando-se pelo citosol, demonstrando o estresse causado ao

organismo utilizado para estudo devido à contaminação

Na primeira coleta não foi obtido êxito com o ensaio do micronúcleo devido à alta

associação das células, apesar das células terem sido extraídas com sucesso e as lâminas serem

confeccionadas de maneira correta, não sendo foi possível analisar claramente.

HPAs, n-alcanos e Biota:

Testes estatísticos não paramétricos foram realizados utilizando o Programa STATISTICA®,

empregando os testes U de Mann-Whitney nas amostras independentes e o teste de Kruskal-Wallis,

para as amostras de mesmo setor.

Na análise dos HPAs houve diferença significativa apenas para as amostras de água no Kruskal-

Wallis, no teste U de Mann-Whitney, não houveram diferenças, assumindo que não há diferença

significativa entre as amostras quanto à concentração dos compostos analisados entre as estações

seca e úmida.

Analisando os boxplots a seguir observa-se que as concentrações foram maiores na estação

seca para água e na estação úmida, os maiores valores ocorreram nos mexilhões. Esta distribuição

pode ser observada no histograma da Figura 8.

Figura 6: Boxplot de HPAs em água

16HPAs

Outliers

Extremos

38HPAs

Outliers

ExtremosÁgua - S Água - U0

10

20

30

40

50

60

ng

mL

-1

16HPAs

Outliers

Extremos

38HPAs

Outliers

ExtremosMexilhão - S Mexilhão - U0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

g

kg

-1

Na primeira coleta a faixa de HPAs totais (Ʃ38HPAs) em água foi de 139,26 ± 31,03 ng L-,

enquanto que para os mexilhões foi de 1400,25 ± 308,16 μg kg-1 HPAs acumulados em mexilhões

Figura 7: Boxplot de HPAs em mexilhão

Figura 8: Histograma de HPAs no período seco e úmido

são similares aos níveis encontrados em estudos anteriores na Baía de Guanabara, sendo a soma

média dos HPAs totais de 500 μg kg-1 e de 1409,86, sendo este último realizado na Urca, mesmo

local de amostragem. Na segunda coleta, estação úmida, a faixa de HPAs totais (Ʃ38HPAs) variou

de 72,65 ± 7,16 ng L- em água e em mexilhões variou de 3397,17 ± 613,93μg kg-1.

Para diferenciar HPAs originados em combustão daqueles de origem petrogênica, aplica-se

razões diagnósticas (Fig.9). Há mistura de fontes no Quadrado da Urca, com maior influência de

compostos de origem pirolítica, de dois tipos de combustão (madeira e petróleo). Entretanto,

amostras de água e mexilhão apresentaram séries alquiladas, como a do dibenzotiofeno e fenantreno,

indicando uma típica degradação de óleo caracterizada com a distribuição C0<C1<C2<C3.

Os dados dos compostos alifáticos ainda não foram totalmente processados até o momento.

Figura 9.2: Razões diagnósticas para origem de HPAs

Figura 9.1: Razões diagnósticas para origem de HPAs

Conclusão:

O uso de biomarcadores como o vermelho neutro e micronúcleo para o biomonitoramento, e

de mexilhões Perna perna como bioindicadores é importante como ferramenta para a avaliação da

contaminação por hidrocarbonetos em ambientes estuarinos. A resposta do biomarcador vermelho

neutro reflete o efeito dos HPAs nas células e um possível.impacto no ambiente.

Em termos do impacto sobre a saúde dos organismos e do homem como consumidor do

mexilhão, a acumulação de HPAs de alto peso molecular e de caráter acentuadamente lipofílico é

preocupante, pois estas substâncias são consideradas potecialmente carcinogênicas e mutagênicas

(FRANCIONI et al. (2005)..

Biometria (07/07/2013)

Indivíduo Peso (g) Tamanho (cm) Sexo Hemolinfa

Retirada

Mexilhão Perna perna

1 31,5 6,5 F NÃO

2 35,0 7,0 M SIM

3 23,5 6,5 M NÃO

4 24,5 7,0 F NÃO

Figura 9.3: Razões diagnósticas para origem de HPAs

5 27,0 6,3 F SIM

6 22,0 6,0 M SIM

7 20,5 5,7 M SIM

8 21,5 6,1 F SIM

Biometria da segunda coleta- 30/01/2014

Indivíduo Peso (g) Tamanho (cm) Sexo Hemolinfa

Retirada

Mexilhão Perna perna

1 53,4 7,3 F SIM

2 34,8 6,4 F SIM

3 29,5 6,0 M SIM

4 31,5 6,3 F SIM

5 35,0 5,8 F SIM

6 29,0 6,4 F SIM

7 25,6 5,5 M SIM

8 25,4 5,7 F SIM

9 19,5 5,5 F SIM

10 41,0 7,2 M SIM

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