Biotecnologia Médica I

Aula teórica IV

Biotecnologia

• “Qualquer aplicação tecnológica que usa sistemas biológicos, organismos vivos ou derivados destes, produzindo ou modificando processos para um uso específico”. – CDB 92.

Conhecimento

– Genética;– Bioquímica;– Microbiologia;– Biologia Molecular;– Fisiologia;– Imunologia;– Ciências do materiais;– Ciências da computação;– Engenharia química.

Técnicas

– Engenharia de proteínas;– Engenharia de tecidos;– Engenharia genética;– Tecnologia do bioprocessamento;– Tecnologia de biosensores;– Tecnologia do antisenso;– Tecnologia dos anticorpos monoclonais;– Tecnologia de chip de DNA;– Tecnologia de cultura de tecidos e células;

Aplicações:

– Monitoramento ambiental– Biorremediação– Prevenção da poluição

– Rendimento de safras– Qualidade de alimentos– Saúde animal

– Diagnósticos– Terapias– Vacinas

Meio ambiente

Agricultura

Medicina

Biotecnologia Industrial e ambiental – Escalas comerciais e industriais

Biotecnologia Agrícola – Produção e saúde animal e vegetal

Biotecnologia Médica – Saúde humana

Biotecnologia e a importância mundial

• Índice de desenvolvimento humano – 2001;

• HIV/AIDS, tuberculose e malária, revolução verde;

• Bio-economia– Produção de colheita, produção animal, silvicultura etc;– Agroquímicos, sementes, energia, alimentos, farmacêutica e assistência médica.

• Impacto ambiental;

• 2001 – US$ 34,8 bilhões – 200 mil empregos;

• P&D e inovação tecnológica;

• 97 % - EUA, Canadá e Europa. Principalmente área médica.

Histórico• 1797: Jenner e a vacina da varíola;• 1857: Pasteur propões que micróbios fermentam;• 1928: Flemming e a penicilina;• 1944: DNA carrega a informação;• 1953: Dupla hélice do DNA;• 1967: Primeira sequencia proteica;• 1970: Enzimas de restrição;• 1973: Bacteria com DNA recombinante;• 1977: Expressão de proteína humana em bactéria;• 1980: Pedido de patente para clonagem;• 1982: FDA aprova primeira droga recombinante;• 1983: PCR;• 1986: Vacina recombinante;• 1988: Animal modificado geneticamente;• 1990: Início do projeto genoma humano;• 1994: Dnase para fibrose cística;• 1997: Animal clonado de uma célula adulta – Dolly;• 2002: Genoma humano publicado.

Biotecnologia Médica

• Entendendo a causa de doenças;

• Identificando marcadores diagnósticos;

• Identificando potenciais alvos para intervenção médica;

• Provendo novas formas de terapias.

Entendendo a causa da doença

• Utilizações:

– Papel do gene em indivíduos saudáveis: ex. camundongos nocauteados para enzimas de reparo de DNA no estudo de câncer;

– Papel do gene nos patógenos: ex. proteínas de membrana envolvidas na invasão de células.

Nocaute gênico: ruptura direcionada de genes específicos.

Identificando marcadores diagnósticos

• Conhecimento das características de uma doença para fazer um prognóstico sobre a evolução e possibilitar uma intervenção.

• Diagnóstico molecular – técnicas de biologia molecular para o estudo do DNA/proteínas de:– Gravidez;– Doenças infecciosas;– Câncer;– Doenças Genéticas.

Doenças infecciosas

Detecção do microrganismo

X

Detecção da resposta imune

Detecção do microrganismo

• Genoma

– PCR, Hibridização;– H1N1, Helycobacter etc.

Detecção do microrganismo

• Proteínas

– Aglutinação, ELISA;– HIV/AIDS, leptospirose.

Detecção do microrganismo

• Visualização direta

– Técnicas de coloração, imunofluorescência;

– Tuberculose etc.

Detecção do microrganismo

• Isolamento em cultura:

– Cultura direta– Cultura de células– Doenças virais – efeito citotóxico, tuberculose etc.

DIAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 21 30 60 90 120 130 140 150 160 170 180 210 240 270 300

0

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20

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IgM

IgG

Detecção da resposta Imune

• Fase da infecção;• Primária ou secundária;• HIV/AIDS, toxoplasmose, sífilis etc.

Ex. dignóstico molecular de AIDS/HIV

1. Placa com anticorpos anti-proteína da cápsula do vírus HIV;

2. Amostra de soro do paciente é adicionada;

3. Incubação e lavagem – complexo Ac-vírus;

4. Adição de Ac anti-proteína da cápsula do vírus conjugados com uma enzima – complexo Ac-vírus-Ac;

5. Adição do substrato para a enzima – emissão de cor, luz;

6. Detecção da intensidade desta luz/cor (espectofotômetria) e resultado final.

00

ELISA (enzyme-lynked immunosorbant assay)

00

Reação enzima-substarto

Câncer

• Tradicional:– radiografia, tomografia, biópsia etc;

• Problemas:– Estágio avançado;– Testes Invasivos. – exame de próstata, colo do

útero, leucemia.

Câncer

• Molecular:

– Sequenciamento de DNA: oncogenes e supressores de tumor;

– Citogenética: rearranjos cromossomais - FISH;

– Imunohistoquímica – identificação tecidual;

– Proteômica – marcadores tumorais.

Ex. diagnóstico molecular de câncer

FISH (fluorescent in situ hybridization)

1. Lâmina com cromossomo na metáfase fixado;

2. Adição de formamida – desnatura mas mantém a forma;

3. Adição da sonda – sequencia de DNA complementar a uma região do cromossomo marcada com fluorescência;

4. Hibridização da sonda-cromossomo – emissão de fluorescência e visualização do local físico onde hibridizou.

5. Interpretação:- Posição esperada = sem mutação- Posição não esperada = mutação por recombinação e câncer

Doenças genéticas

• Intolerância a lactose, albinismo, predisposição a doenças cardíacas, hemofilia, síndromes etc;

• Aconselhamento genético;

• Testes:– Citogenético: FISH;– DNA: PCR, sequenciamento;– Metabólico: Eletroforese de proteínas.

Ex. diagnóstico de doenças genéticas

SNP (single nucleotide polymorphisms)• Único nucleotídeo mutado altera a proteína;

1. Sequenciamento do gene;

2. Comparação com banco de dados;

3. Identificação do local da mutação e da doença .

Ciência forense• Impressão genética – identificar indivíduos

com base no DNA.• Como?– TR: tandem repeats ou sequencias satélites –

sequencias repetitivas similares entre humanos relacionados mas diferentes entre não relacionados.

PCR Sequenciamento de DNA RFLP AFLP Eletroforese capilar

Fármacos naturais

• Top 5: US$ 37, 3 bilhões – 2006;

• Câncer, HIV/AIDS, cardiovasculares, respiratórias, doenças infecciosas;

• Geralmente moléculas pequenas (63%);

• De onde vem?Digitalis purpurea – doenças cardíacas;

Teixo – câncer de ovário e de mama;

Saliva de carrapatos – anticoagulantes;

Veneno de rãs – analgésico;

Bactérias ambientais – antibióticos.

• Genômica, bioinformática- identificação de potenciais alvos;

• Técnicas de cromatografia - separação e extração de moléculas;

• Eletroforese e HPLC - identificação do peso molecular e da sequencia

proteica;

• Cristalografia, difração de raio-X ou ressonância nuclear magnética

- identificação da estrutura química e espacial da molécula;

• Testes celulares - identificação de propriedades terapêuticas;

Fármacos naturais – como descobrir?

Fármacos naturais – como produzir?

• Pesquisadores coletaram 2400 kg de esponjas para obter 1 mg de droga anti-câncer = desastre ecológico.

• Solução I: cultura de células de esponja.

• Solução II: clonagem dos genes necessários para produzir o composto em uma bactéria/levedura e fazer fermentação desta cultura.

Fármacos endógenos

• Diabetes mellitus, albinismo, hemofilia etc – falta de um metabólito próprio do corpo – erros inatos do metabolismo.

Insulina

Clonagem molecular

Biopolímeros de uso médico

• Polímeros produzidos por organismos.• Superiores aos inôrgânicos – compatibilidade e absorção.

– Articulações e tendões;– Ossos;– Implantes dentários;– Próteses de vasos sanguíneos;– Implantes de seios;– Lentes de contato;– Tratamento de artrite – hialuronato;– Cicatrização;– Antimicrobianos – quitina.

Biopolímeros de uso médico• Vantagens:

– Derivados de fontes de energia renováveis;

– Diminui a emissão de poluentes;– Menor custo;– Biodegradáveis e absorvidos;– Biocompatíveis;

- PLA, PHBV e amidos termoestáveis

Alcaligenes euthrofus

Saccharum

Xenotransplantes• 250 mil transplantes anualmente;

• 1:4 - doadores:pacientes;

• 1963: rim de chimpanzé em humanos;

• Suínos – tamanho, fisiologia, anatomia, baixo custo, crescem rapidamente e técnicas estabelecidas;

• Células bovinas e o Mal de Parkinson;

• Suínos para regeneração de medula óssea.

Problema: rejeição – HAR e AVR.

Alternativa: Transgênese com proteínas inibitórias humanas, retirada de antígenos;