UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CINCIAS RURAIS PROGRAMA DE PS-GRADUAO CINCIA DO SOLO

CARACTERIZAO DE BACTRIA FIXADORA DE NITROGNIO EM LUPINUS ALBESCENS

DISSERTAO DE MESTRADO

Marcos Roberto Dobler Stroschein

Santa Maria, RS, Brasil 2007

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CARACTERIZAO DE BACTRIA FIXADORA DE NITROGNIO EM Lupinus albescens

por

Marcos Roberto Dobler Stroschein

Dissertao apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de PsGraduao em Cincia do Solo, rea de Concentrao em Biodinmica e Manejo do Solo, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obteno do grau de Mestre em Cincia do Solo

Orientador: Prof. PhD Flvio Luiz Foletto Eltz

Santa Maria, RS, Brasil 2007

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Universidade Federal de Santa Maria Centro de Cincias Rurais Programa de Ps-Graduao em Cincia do Solo

A Comisso Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertao de Mestrado

CARACTERIZAO DE BACTRIA FIXADORA DE NITROGNIO EM Lupinus albescens elaborada por Marcos Roberto Dobler Stroschein

como requisito parcial para obteno do grau de Mestre em Cincia do SoloCOMISSO EXAMINADORA:

Flvio Luiz Foletto Eltz, PhD (Presidente/Orientador)

Zaida Ins Antoniolli, Dr. (UFSM)

Luciano Kayser Vargas, Dr. (Fepagro)

Santa Maria, 22 de fevereiro de 2007.

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minha famlia EU DEDICO

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AGRADECIMENTOSA Universidade Federal de Santa Maria e ao Programa de Ps-Graduao em Cincia do Solo, pelo conhecimento e formao. Aos professores Flvio Luiz Foletto Eltz e Zaida Ins Antoniolli, pela ateno dispensada e pelo conhecimento compartilhado durante a realizao deste trabalho. Aos bolsistas Manoeli Lupatini, Matheus Pontelli e Marta R. da Rocha, pelo auxlio responsvel nos trabalhos de laboratrio, Aos colegas de laboratrio de Biologia e Microbiologia do Solo e do Ambiente, pela convivncia e amizade. A Adriana Giongo e o Dr. Luciano Kayser Vargas, pelos conselhos dados durante toda a execuo do projeto. Aos funcionrios Antnio Bassaco, Flvio Vieira da Silva, Gladis Uberti e Tarcsio Uberti, pelo auxlio sempre prestado. A minha namorada Cardine Martins dos Reis, pelo seu apoio e compreenso. Aos amigos, Andr Paulo Hbner, Janete Baumgardt e Stefen Barbosa Pujol, membros do Grupo das Diazotrficas, pela amizade durante todos estes anos. A todos os colegas do Programa de Ps-Graduao em Cincia do Solo da UFSM, pelos dois anos de amizade e convivncia.

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Se tiveres de empreender uma luta, cuida-te para que, vencendo a ti mesmo, no haja vencidos em tua caminhada. Luta sem fazer inimigos e persevera na lio que a vida te concede, pois lutar no significa guerrear. Alex Zarth, psicografado por Robson Pinheiro

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RESUMO Dissertao de Mestrado Programa de Ps-Graduao em Cincia do Solo Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil CARACTERIZAO DE BACTRIA FIXADORA DE NITROGNIO EM Lupinus albescens AUTOR: Marcos Roberto Dobler Stroschein ORIENTADOR: Flvio Luiz Foletto Eltz Data e Local de Defesa: Santa Maria, 22 de fevereiro de 2007.O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar populaes promissoras de rizbio de L. albescens na fixao biolgica de nitrognio. Duzentos e quatro isolados foram obtidos a partir de trs espcies de tremoo (L. albescens, L. lanatus e Lupinus sp.). Trinta e oito isolados escolhidos aps a purificao foram caracterizados fenotipicamente e submetidos a um teste de autenticao, realizado em casa de vegetao. Estes testes objetivaram selecionar estirpes simbiontes formadoras de leghemoglobina. Os isolados promissores foram identificados com base nas caractersticas fenotpicas atravs da comparao com vinte e duas estirpes de rizbio. Determinou-se as caractersticas fisiolgicas dos isolados promissores, sendo avaliado a capacidade de crescer em: diferentes temperaturas, concentraes de NaCl e pH, e a uma caracterizao molecular com base em reao de polimerase em cadeia (PCR) utilizando o oligonucleotdeo BOX A1-R. Foi realizada a determinao da eficincia simbintica com base no teor de nitrognio total da parte area, a massa seca da parte area e das razes, e nmero de ndulos. A caracterizao fenotpica dos trinta e oito isolados possibilitou a formao de 11 grupos com caractersticas distintas. O isolado UFSM L1.3 formou ndulos e leghemoglobina quando associado a L. albescens, tendo sido identificado no gnero Bradyrhizobium. A estirpe UFSM L1.3 apresentou crescimento em temperatura de 28 e 32C, na concentrao de NaCl de 0,1% e na faixa de pH 4,0 a 8,0. O padro de polimorfismo gerado pelo primer BOX-PCR permitiu diferenciar o isolado UFSM L1.3 dos demais estudados. A eficincia simbintica do isolado de rizbio UFSM L1.3 foi de 94,2% em comparao com a testemunha nitrogenada.

Palavras-chave: tremoo, rizbio, Bradyrhizobium

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ABSTRACT Master Dissertation in Soil Science Graduate Programme in Soil Science Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brazil CHARACTERIZATION OF BACTERIUM THAT FIXES NITROGEN IN Lupinus albescens Author: Marcos Roberto Dobler Stroschein Advisor: Flvio Luiz Foletto Eltz Date and Place of Defense: Santa Maria, February 22th ,2007.The objective of this work was to characterize promising isolated rhizobium of L. albescens in the nitrogen biological fixation. Two hundred and four isolates were obtained from three species of lupine (L. albescens, L. lanatos e Lupinus sp.). Thirty-eight isolates chosen randomly were characterized through their phenotype and submitted to an authenticity test done in the greenhouse. In order to select symbiotic strains that synthesizes leghaemoglobin. The promising isolates were identified by their phenotypic characteristics by comparing twenty-one strains of rhizobium. The physiological characteristics of the promising isolated were determined and evaluated about the growing capacity in different temperatures, NaCl concentrations and pH, and a molecular characterization by polymerase chain reaction (PCR) using the primer BOX. An experiment, in the greenhouse, was made to determine the symbiosis efficiency by the total nitrogen, and the dried mass in the aerial part and in the roots, and the number of nodules. The phenotypic characterization of the thirtyeight isolated enabled the development of 11 groups with distinct characteristics. The UFSM L1.3 strain developed nodules and leghaemoglobin when associated to L. Albescens and was identified in the genus Bradyrhizobium. The UFSM L1.3 strain presented growing in the temperature from 28 to 32C, in a NaCl concentration of 0,1% and in a pH from 4,0 to 8,0. The standard of polymorphism generated by the primer BOX-PCR enabled to distinguish the UFSM L1.3 isolated from the others. The symbiosis efficiency of the UFSM L1.3 isolated was of 94,2% when compared to the without nitrogen.

Key-words: lupine, rhizobium, Bradyrhizobium.

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LISTA DE FIGURASFigura 1 Ocorrncia de areais no sudoeste do Rio Grande do Sul (SUERTEGARAY et al., 2001). .................................................................................. 19 Figura 2 Espcie de Lupinus albescens em rea de arenizao. Santa Maria, 2007. .......................................................................................................................... 20 Figura 3 Etapas da execuo do trabalho com rizbio em Lupinus. Santa Maria, 2007. ............................................................................................................... 35 Figura 4 Isolamento de bactrias a partir de ndulos de Lupinus albescens: a) amostragem de material do interior do ndulo; b) inoculao em meio LMA......... 37 Figura 5 Meio de cultura LMA com vermelho congo (a) e azul de bromotimol (b), utilizados na caracterizao cultural dos isolados. Santa Maria, 2007. ............... 40 Figura 6 Padres utilizados na caracterizao fisiolgica dos rizbio. a) UFSM L1.3; b) SEMIA 938; c) Sem inoculao. Santa Maria, 2007. ......................... 44 Figura 7 Dendograma de similaridade baseado nas caractersticas culturais de 38 isolados de Lupinus (UFSM L1.1, UFSM L1.2, UFSM L1.3, UFSM L1.4, UFSM L1.5, UFSM L1.6, UFSM L1.7, UFSM L1.8, UFSM L 1.9, UFSM L1.10, UFSM L1.11, UFSM L1.12, UFSM L1.13, UFSM L1.14, UFSM L2.1, UFSM L2.2, UFSM L2.3, UFSM L2.4, UFSM L2.5, UFSM L2.6, UFSM L2.7, UFSM L2.8, UFSM L2.9, UFSM L2.10, UFSM L2.11, UFSM L2.12, UFSM L3.1, UFSM L3.2, UFSM L3.3, UFSM L3.4, UFSM L3.5, UFSM L3.6, UFSM L3.8, UFSM L4.1, UFSM L4.2, UFSM L4.3, UFSM L4.4) e estirpe recomendada para Lupinus (SEMIA 938). Santa Maria, 2007. ................................................................. 51 Figura 8 Ndulo em Lupinus albescens (isolado UFSM L1.3) aos 60 dias. a) Nodulao positiva; b) Produo de leghemoglobina. ............................................... 55

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Figura 9 Dendograma de similaridade baseado em caractersticas culturais entre um isolado de Lupinus albescens (UFSM L1.3), uma estirpe recomendada para Lupinus (SEMIA 938) e 21 estirpes-tipo de rizbio (Tabela 6). ............................................................................................................................... 57 Figura 10 Padro de polimorfismo gerado por BOX-PCR. 1. Bradyrhizobium sp. (SEMIA 938). 2. Bradyrhizobium sp. (SEMIA 928). 3. UFSM L1. 3. 4. 1p. 5. 2p. 6. Rhizobium sp. 7. Sem DNA. M. Marcador: DNA de Lambda clivado com EcoRI + HindIII. .......................................................................................................... 62 Figura 11 Dendograma gentico de trs isolados de Lupinus albescens comparados a duas estirpes de Bradyrhizobium sp recomendadas para tremoo e uma estirpe de Rhizobium sp., aps anlise de agrupamento dos fragmentos obtidos pela amplificao do DNA por PCR com o oligonucleotdeo especfico BOX-A1R. Anlise realizada com o algoritmo UPGMA e o coeficiente de Pearson. Santa Maria, 2007................................................................ 63 Figura 12 Eficincia simbitica relativa de isolado de rizbio de Lupinus albescens (UFSM L1.3) e de estirpe comercial recomendada para Lupinus (SEMIA 938). Santa Maria, 2007................................................................................ 65

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LISTA DE TABELASTabela 1 Diferentes famlias e gneros de rizbio fixadores de nitrognio descritos. .................................................................................................................... 26 Tabela 2 Locais de coleta de trs espcies de tremoo nos municpios de Alegrete, Maambar e So Francisco de Assis. Santa Maria, 2007......................... 36 Tabela 3 Valores relativos s caractersticas culturais dos isolados utilizados na construo do dendograma. Santa Maria, 2007.................................................... 42 Tabela 4 Espcies e estirpes tipo de rizbio utilizadas na comparao dos isolados de Lupinus.................................................................................................... 46 Tabela 5 Relao do nmero de isolados nos quatro locais e nas trs

espcies de Lupinus estudadas. Santa Maria, 2007. ................................................. 50 Tabela 6 Caractersticas culturais fenotpicas dos isolados bacterianos pertencentes aos grupos formados a partir de cinco caractersticas bsicas. Santa Maria, 2007. ..................................................................................................... 53 Tabela 7 Caractersticas culturais de um isolado de Lupinus albescens e de 22 estirpes de rizbio, Santa Maria, 2007. ................................................................. 58 Tabela 8 Crescimento de duas estirpes de rizbio em diferentes pH, concentraes de NaCl e temperatura em meio lquido LMA. Santa Maria, 2007. .......................................................................................................................... 60 Tabela 9 Massa seca da parte area (MSPA), nitrognio na parte area (NPA), eficincia simbintica (Efra), massa seca das razes (MSR) e nmero de ndulos (NN) do isolado UFSM L1.3 e da estirpe SEMIA 938. Santa Maria, 2007. .......................................................................................................................... 65

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LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

g C h kg Kg ha L M m mg mL mg L mm min L % seg rcf V-1 -1

grama (s) grau (s) Celsius hora (s) quilograma (s) quilograma (s) por hectare litro (s) Molar metro (s) miligrama (s) mililitro (s) miligrama (s) por litro milmetro (s) minuto (s) microlitro percentagem segundo (s) fora centrifuga relativa volts

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LISTA DE ANEXOSANEXO A Meios de cultura e solues utilizados para o estudo da populao bacteriana oriunda de Lupinus albescens..................................................................82

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SUMRIO1 2 INTRODUO...................................................................................................16 REVISO DE LITERATURA .............................................................................18

2.1 reas arenizadas.............................................................................................18 2.2 Gnero Lupinus: ocorrncia e simbiose com rizbio..................................20 2.3 Fixao biolgica de nitrognio (FBN) ..........................................................23 2.4 Grupo rizbio...................................................................................................24 2.5 Taxonomia de rizbio .....................................................................................27 2.5.1 Caracterizao fenotpica de rizbio ................................................................28 2.5.1.1 Mtodos fenotpicos tradicionais ...................................................................28 2.5.1.2 Mtodos quimiotaxonmicos .........................................................................30 2.5.2 Caracterizao gentica de rizbio ..................................................................31 2.5.2.1 Hibridizao do DNA .....................................................................................32 2.5.2.2 Polimorfismo dos tamanhos dos fragmentos de restrio (RFLP) ................32 2.5.2.3 Anlises baseadas na reao em cadeia de polimerase...............................33 3 MATERIAL E MTODOS ..................................................................................35

3.1 Coleta das razes das plantas de Lupinus ....................................................36 3.2 Isolamento de rizbio .....................................................................................37 3.3 Autenticao dos isolados .............................................................................38 3.4 Caracterizao fenotpica ...............................................................................39 3.4.1 Caractersticas culturais ...................................................................................39 3.4.1.1 Colorao de Gram .......................................................................................39 3.4.1.2 Tempo de crescimento para a visualizao das colnias..............................39 3.4.1.3 Dimetro das colnias ...................................................................................40 3.4.1.4 Produo de goma ........................................................................................41 3.4.1.5 Colorao das colnias .................................................................................41

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3.4.1.6 Alterao do pH do meio ...............................................................................41 3.4.1.7 Agrupamento dos isolados ............................................................................42 3.4.2 Caracterizao fisiolgica.................................................................................43 3.4.2.1 Crescimento em diferentes temperaturas......................................................43 3.4.2.2 Crescimento em diferentes pH ......................................................................44 3.4.2.3 Crescimento em diferentes concentraes de NaCl .....................................45 3.5 Identificao dos isolados..............................................................................45 3.6 Caracterizao molecular ...............................................................................46 3.7 Teste de eficincia na Fixao Biolgica de Nitrognio..............................48 4 RESULTADOS E DISCUSSO .........................................................................50

4.1 Isolamento e caracterizao...........................................................................50 4.2 Autenticao dos isolados bacterianos nativos ..........................................54 4.3 Caracterizao do gnero de uma estirpe de rizbio isolada de Lupinus albescens .................................................................................................................55 4.4 Caracterizao fisiolgica ..............................................................................59 4.5 Caracterizao molecular ...............................................................................61 4.6 Avaliao da eficincia simbitica relativa ...................................................63 5 6 CONCLUSES..................................................................................................66 SUGESTES PARA O DESENVOLVIMENTO DE NOVAS PESQUISAS........67 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS..................................................................68

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INTRODUO

A regio sudoeste do Rio Grande do Sul apresenta 0,26 % de sua rea sujeitos ao processo de arenizao (SUERTEGARAY et al., 2001). Nesta regio, a formao de pradarias mistas sobre o substrato arentico constitui um dos ambientes mais frgeis da Amrica do Sul (ABSABER, 1995). O processo de degradao desses solos pode estar associado sua formao geolgica e ao uso intensivo destas reas com cultivo agricola e pecuria (SUERTEGARAY, 1998). Em funo do aumento da degradao do solo no sudoeste do Rio Grande do Sul proporcionado pela intensificao da agricultura, a partir da dcada de 70, vrios sistemas conservacionistas foram propostos, no entanto no atingiam os principais fatores do processo de arenizao: a chuva e o vento. Desta maneira o uso de plantas de coberturas apresenta-se como uma alternativa para a recuperao de reas degradadas, por diminuir os efeitos do impacto da gota da chuva e da eroso elica. A recuperao das reas em processo de arenizao vem sendo estudada, e uma das alternativas pode ser a utilizao de alguma leguminosa nativa como planta de cobertura. Lupinus albescens est sendo pesquisada devido sua alta rusticidade, adaptabilidade a solos arenosos, capacidade de reduo do processo de eroso elica, potencial produtivo de matria seca, cobertura do solo e fixao biolgica de nitrognio. No entanto poucos estudos vm dado ateno a identificao e seleo de estirpes de rizbio em associao com L. albescens. O estudo de plantas nativas de Lupinus albescens pode proporcionar o isolamento de novas estirpes de rizbio que apresentam caractersticas importantes de adaptao ecolgica e maior eficincia na fixao biolgica de nitrognio. Isto essencial para a compreenso da diversidade de espcies e aproveitamento deste recurso biolgico. O conhecimento das caractersticas fenotpicas e genticas vem sendo utilizados na distino de estirpes de rizbio e no processo de identificao dos isolados de espcies nativas de leguminosas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar isolados promissores de rizbio de L. albescens na fixao biolgica de nitrognio. Os objetivos especficos do estudo

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foram: a) caracterizar por mtodos fenotpicos estirpes bacterianas isoladas a partir de ndulos de L. albescens; b) avaliar a capacidade de formao de ndulos e produo de leghemoglobina; c) identificar o gnero dos rizbios promissores por mtodos fenotpicos; d) analisar as caractersticas genticas, fisiolgicas e eficincia simbitica dos rizbios promissores na fixao biolgica de nitrognio.

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REVISO DE LITERATURA

2.1 reas arenizadas

No estado do Rio Grande do Sul as reas arenizadas ocorrem entre as latitudes 2900 S e 3100' S e longitudes 5430 W Gr e 5845 W Gr, sendo caracterizadas por apresentar regies arenosas desprovidas de vegetao (SUERTEGARAY, 1998). Estes areais podem ser encontrados nos municpios de Alegrete, Cacequi, Itaqu, Maambar, Manuel Viana, Quara, Rosrio do Sul, So Borja, So Francisco de Assis e Unistalda, ocupando 0,26% da regio sudoeste do estado (Figura 1) (SUERTEGARAY, 1998; SUERTEGARAY, 2001). O termo arenizao foi proposto por Suertegaray (1987), para diferenciar o fenmeno de degradao e perda da produtividade que ocorre no sudoeste gacho, definindo-o como o processo de retrabalhamento de depsitos arenticos no consolidados, conferindo mobilidade aos sedimentos no protegidos pela vegetao, e distinguindo-o do fenmeno de desertificao. Embora o termo desertificao seja ainda utilizado de forma abrangente, h uma tendncia mundial de restringir este conceito aos processos de degradao do solo relacionados s condies climticas de regies ridas e semi-ridas. A ocorrncia destes areais tem como base a Formao Botucatu (datada do perodo Mesozico) sob o qual se assentaram depsitos arenosos hdricos e elicos durante o perodo Pleistoceno e Holoceno (SUERTEGARAY, 1998), originando solos extremamente arenosos e de baixa agregao e alta friabilidade. Aliam-se a isso chuvas que podem chegar a 1.400 mm por ano 1, que fornecem energia necessria para formao de sulcos que resultam em ravinas e, ao longo do tempo, essas ravinas se expandiro pela ao do escoamento superficial concentrado, formando voorocas. Os sedimentos transportados durante as chuvas torrenciais so depositados jusante das ravinas e voorocas, dando origem formao de1

O clima desta regio classificado por Kppen como Cfa, subtropical mido, sem estao seca, com uma precipitao mdia anual de 1400 mm (SOUTO, 1984).

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depsitos arenosos e que, com o tempo e a ao da eroso elica, iro formar os areais (SUERTEGARAY, 1998). Segundo AbSaber (1995) a ao dos ventos mais intensa nesta regio porque se alternam ventos gerais sul-norte, muito fortes no inverno, com aes de turbilhonamento, ocorrendo associao entre eroso hdrica e elica. Desta maneira, o material movimentado altera a vegetao ao redor do ncleo de degradao atravs do efeito abrasivo e do soterramento, quando da deposio das partculas Como o ecossistema nativo desta regio apresenta-se extremamente frgil, devido prpria natureza dos solos sobre os quais se desenvolveu, reduzindo a capacidade de resilncia destes solos, com a continuidade do processo de transporte, deposio, morte e soterramento da vegetao, h a intensificao do processo de degradao do solo, com a expanso da rea alterada (ROVEDDER et al., 2003). Desta maneira a arenizao considerado um processo natural, no entanto, a degradao destas reas acelerada pela atividade antrpica. Ou seja, podem ser resultado do pisoteio do gado, revolvimento do solo e do uso de maquinaria pesada na atividade agrcola, originando sulcos e desencadeando condies de escoamento concentrado.

Figura 1 Ocorrncia de areais no sudoeste do Rio Grande do Sul (SUERTEGARAY et al., 2001).

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2.2 Gnero Lupinus: ocorrncia e simbiose com rizbio

O gnero Lupinus pertence subfamlia Papilionoideae da famlia Leguminoseae, apresentando entre 300 a 500 espcies e estando estas espcies distribudas no Continente Americano e algumas regies da frica e Mediterrneo (CONTERATO, 2004). Nos trabalhos publicados por Santos (2000) e Pinheiro & Miotto (2001), estes autores relatam a existncia de 13 espcies de Lupinus, ocupando diferentes regies fisiogrficas do Rio Grande do Sul. O uso de algumas espcies de Lupinus como adubao verde vem sendo preconizada em vrias regies do mundo, principalmente na melhoria dos solos devido sua habilidade de crescer em solos pobres e sob condies adversas (WOLKO & WEEDEN, 1990). A espcie Lupinus albescens H. et Arn. (Figura 2) foi descrita ocorrendo no noroeste da Argentina, Uruguai, Paraguai e Brasil (PLANCHUELO & DUNN, 1984). No sudoeste do Rio Grande do Sul esta espcie ocorre naturalmente, tendo evoludo paralelamente aos processos pedogenticos e climticos que formaram a paisagem atual da Campanha Gacha (ROVEDDER et al., 2005).

Figura 2 Espcie de Lupinus albescens em rea de arenizao. Santa Maria, 2007.

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O L. albescens uma planta herbcea, de crescimento ereto, com hbito anual. As folhas apresentam forma digitada, inflorescncias racemosas com flores arroxeadas ou lilases terminais e frutos na forma de vagens, com at seis ou sete sementes. A semente desta espcie pode levar de 10 a 20 dias para germinar, contudo, a germinao abundante, formando banco de plntulas com alta densidade. Em teste de germinao realizado no Laboratrio de Sementes da UFSM, com um tratamento prvio de escarificao em cilindro rotativo, a espcie apresentou 100 % de germinao (ROVEDDER et al., 2004). A espcie apresenta fololos e ramos muito pilosos, alm de apresentar substncias resinferas, o que pode ser um mecanismo de adaptao s condies edafoclimticas da regio, comprovando a sua evoluo paralela a um paleoambiente xeromrfico. Estas caractersticas, alm de atriburem alta rusticidade espcie, possuem efeitos benficos quando do uso da espcie em estratgias de recuperao e a tornam inadequada ao consumo animal. Esta elevada pilosidade atua diminuindo a transpirao, fator importante em solos de baixa reteno hdrica (ROVEDDER et al., 2004). Outra caracterstica adaptativa desta espcie, relacionada s condies hdricas do solo, a formao de um vigoroso sistema radicular pivotante, com presena de razes em at 1,50 m de profundidade, proporcionando uma capacidade de buscar gua e nutrientes a elevadas profundidades. Alm disto, a espcie apresenta associao simbitica com bactrias fixadoras de nitrognio, com ndulos ativos no colo da raiz e prximo coifa (ROVEDDER et al., 2004). A capacidade de reduo do processo de transporte e deposio de areia foi estudado em L. albescens em consrcio com aveia preta, evidenciando uma reduo de 93 % de areia movimentada pela eroso elica em ncleo de arenizao quando comparada com uma rea no revegetada (ROVEDDER et al., 2003). Hickmann et al. (2005) compararam o L. albescens com Secale cereale L. (centeio) na eficincia como planta de cobertura do solo, constatando uma maior produo de massa seca e de ciclagem de nutrientes para o tremoo. Isto pode ser pelo fato desta espcie ser nativa da regio sudoeste e, portanto, tenha desenvolvido mecanismos genticos de adaptao, como capacidade de absoro de nutrientes em baixas concentraes e resistncia a dficit hdrico. Segundo Rovedder et al. (2005), esta espcie de tremoo apresentou um acmulo de massa seca de 6,42 Mg ha-1 e de nitrognio na parte area de at 158,3

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Kg ha-1 quando cultivado em rea degradada. Estes resultados so superiores aos 3,2 Mg ha-1 de massa seca e 81,38 Kg ha-1 de nitrognio encontrados para tremoo branco (Lupinus albus) (GOLVEIA & ALMEIDA, 1997), 3,0 Mg ha-1 de massa seca e 88 Kg ha-1 de nitrognio para nabo forrageiro (Raphanus sativus L.) (WIETHLTER, 2003) e aos 5,3 Mg ha-1 de massa seca e 65,4 Kg ha-1 de nitrognio para aveia preta (Avena strigosa Schieb.) (ROSSATO, 2004). Estes dados indicam que Lupinus albescens apresenta-se como uma espcie promissora ao uso como adubo verde, tendo elevado potencial para cobertura. Rovedder et al. (2005) tambm relacionou os acmulos de nitrognio encontrados na parte area das plantas de L. albescens eficincia dos microssimbiontes fixadores de nitrognio. No entanto ainda no se conhece o gnero de rizbio associado a esta espcie de tremoo. Uma das primeiras descries feitas de uma bactria isolada a partir de ndulos de uma espcie de Lupinus foi realizada por Eckhardt et al. (1930). Estes autores relatam a presena de bactrias de crescimento lento que no se enquadravam em outros grupos de nodulao cruzada, classificando-os com Rhizobium lupini. Aps a publicao de Jordan (1982), esta espcie foi alocada dentro de Bradyrhizobium japonicum por apresentar caractersticas culturais semelhantes. No entanto, estudos mais detalhados mostraram que as bactrias isoladas de Lupinus mostravam-se diferentes de B. japonicum, sendo ento alocadas em um novo taxa, Bradyrhizobium sp. (Lupinus) (WANG et al., 2006). Para o cultivo de tremoo no Brasil, existem duas estirpes de Bradyrhizobium sp. recomendadas, SEMIA 928 e 938, as quais podem ser obtidas na coleo de cultura da Fepagro (Brasil, 2006). Menna et al. (2006) avaliaram a filogenia das principais estirpes utilizadas em inoculantes comerciais e demonstraram que SEMIA 938 apresenta alta relao filogentica com Bradyrhizobium elkanii. Outra espcie descrita simbionte a Lupinus albus foi caracterizada por Trujillo et al. (2005). Os isolados apresentavam caractersticas culturais que se distinguem de Bradyrhizobium sp., e relao filogentica com Ochrobactrum, sugerindo uma nova espcie: Ochrobactrum lupini. No entanto ainda no se sabe da capacidade de nodulao e fixao biolgica de nitrognio das estirpes de Bradyrhizobium sp. recomendadas para tremoos em associao com L. albescens.

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2.3 Fixao biolgica de nitrognio (FBN)

A fixao biolgica de nitrognio caracterizada pela utilizao do nitrognio gasoso da atmosfera (N2) como fonte de nitrognio para o metabolismo de um grupo seleto de seres vivos, que inclui algumas espcies de microrganismos procariticos. Estes microrganismos possuem o complexo enzimtico chamado nitrogenase, necessrio para transformar o N2 em amnia, subseqentemente assimilada em aminocidos e protenas (NEVES & RUMJANEK, 1998). A capacidade diazotrfica est restrita a Bacteria e Archaea, incluindo cianobactrias e bactrias Gram positivas e Gram negativas (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). A observao de uma rvore filogentica contendo espcies procariticas mostra que os microrganismos diazotrficos ocorrem em um grande nmero de taxa e sua distribuio no obedece nenhum padro lgico. Esta caracterstica pode ser explicada por trs hipteses. A primeira que a capacidade diazotrfica teve origens mltiplas. A segunda que este carter diazotrfico estava presente num ancestral comum a todas as espcies, mas foi perdido durante o processo evolutivo que deu origem a diferentes ramos filogenticos. A terceira que o potencial diazotrfico teve uma nica origem, mas se estendeu outros ramos filogenticos por transferncia lateral de plasmdeos (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). As bactrias denominadas rizbio so consideradas o principal grupo de diazotrficos, por sua importnica agronmica e pela fixao de nitrognio. O segundo grupo economicamente mais importante composto pelas cianobactrias, que tm sido encontradas como fixadoras de vida-livre e em associaes com vrias plantas, dentre estas, a planta aqutica Azolla. O manejo desta espcie vegetal vem sendo estimulado junto ao sistema de arroz irrigado na China e Vietnam. Cianobactrias podem formar ainda associaes com vrios outros organismos, como fungos e algas (formando liquens) e angiospermas do gnero Gunnera. O terceiro grupo de organismos fixadores de N representado pela associao simbitica entre actinomicetos (Frankia, Nostoc) e plantas de vrias famlias, principalmente plantas arbreas pertencentes aos gneros Alnus e Casuarina (SPRENT & SPRENT, 1990).

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Outro grupo de diazotrficos apresenta uma associao menos profunda com plantas, no caracterizando uma interao simbitica. Este grupo inclui bactrias que colonizam o interior de plantas superiores. O quinto grupo de bactrias que contribui para o balano de N nos ecossistemas constitudo por bactrias de vidalivre. Organismos como Klebsiella sp. e Azotobacter sp. vivem no solo e fixam nitrognio quando outras formas de N no esto disponveis. Esta grande diversidade de espcies de procariotos que apresentam a capacidade de fixao biolgica de nitrognio demonstram a necessidade de estudos de novos microrganismos. Nos ltimos 10 anos, tcnicas de anlise molecular do DNA tm sido aplicadas para detectar e analisar bactrias sem a necessidade de nenhum procedimento de cultivo ou isolamento. Estas tcnicas confirmam, atravs da variabilidade gentica obtida de amostras ambientais, a existncia de um grande nmero de microrganismos do solo nunca antes detectado pelas tcnicas de cultivo (HUGENHOLTZ et al., 1998). Dessa forma, muitas espcies de organismos diazotrficos podem estar contribuindo no processo de fixao de N sem ainda terem sido isolados.

2.4 Grupo rizbio

As plantas da famlia Leguminoseae, composta por aproximadamente 750 gneros, destes 250 cultivveis (FREIRE, 1992), possuem uma interao simbintica com bactrias da ordem Rhizobiales, que se caracterizam pela formao de estruturas hipertrficas, nas razes e, excepcionalmente, no caule, denominadas ndulos. A capacidade de fixao biolgica de nitrognio destes microrganismos ocorre devido ao complexo enzimtico nitrogenase, que converte o N2 em amnia e assim disponibiliza nitrognio para as plantas (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). Estes microrganismos so bactrias Gram negativas, aerbicas no esporulantes, pertencentes ao filo alpha-Proteobacteria, os quais so genericamente identificados como rizbio (ZAKHIA & LAUJUDIE, 2001). A classificao destes

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microrganismos, nos ltimos vinte anos, esteve em constante alterao, sendo descobertos novos gneros, alterando a taxonomia (WANG et al., 2006). No estudo taxonmico inicial de rizbio, todas as bactrias formadoras de ndulos em leguminosas eram classificadas no gnero Rhizobium (FRANK, 1889 apud WANG et al., 2006), apresentando seis espcies: R. leguminosarum, R. meliloti, R. trifolii, R. phaseoli, R. lupini e R. japonicum. Nesta classificao, o crculo de hospedeiros era o fator mais importante na definio destas espcies, embora tenham sido descritas tambm caractersticas morfolgicas e fisiolgicas (FRED et al., 1932). Com o prosseguimento das pesquisas, o uso da especificidade do hospedeiro como principal critrio de classificao de rizbio foi abandonado por apresentar um grande nmero de excees dentro destes grupos (Wilson, 1944). Em seu trabalho, Jordan (1982) modificou a taxonomia de rizbio, dividindo-os em dois gneros: Bradyrhizobium e Rhizobium. O primeiro gnero correspondia s cepas de crescimento lento, de reao bsica em meio de cultura LMA (Levedura Manitol gar) (VINCENT, 1970), com dimetro menor ou igual a 1 mm e crescimento em 5 a 7 dias, designando somente uma espcie Bradyrhizobium japonicum, que incluiu tambm a espcie R. lupini por apresentar caractersticas semelhantes. No gnero Rhizobium alocaram-se trs espcies: R. leguminosarum, R. meliloti e R. loti. Na primeira espcie foram considerados trs biovares: R. leguminosarum bv. viciae, bv. trifolli e bv. phaseoli. Os trs biovares constituram o mesmo grupo na taxonomia numrica e na hibridizao DNA-DNA, mas corresponderam a diferentes grupos de nodulao cruzada (WANG et al., 2006). Em estudos posteriores, outro grupo de bactrias de crescimento rpido foi coletado em solos na China e identificado, tanto a partir do solo como de ndulos de soja, cujas caractersticas fisiolgicas e bioqumicas indicavam uma posio taxonmica intermediria entre Rhizobium e Bradyrhizobium (KEYSER et al., 1982, XU & GE, 1984). Desta maneira, se props a criao de uma nova espcie, Rhizobium fredii, baseados principalmente em experimentos de hibridizao de DNA (SCHOLLA & ELKAN, 1984). Atualmente, a taxonomia do grupo rizbio vem sendo modificada. A principal alterao ocorreu no gnero Rhizobium, ao qual foram includas todas as espcies de Agrobacterium (CONN, 1942) e Allorhizobium undicola (de LAJUDIE, 1998a), combinando as novas espcies: Rhizobium radiobacter, R. rhizogenes, R. rubi, R. undicola e R. vitis (YOUNG et al., 2001). Outra mudana aconteceu ao gnero

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Sinorhizobium, de acordo com Young (2003), os gneros Sinorhizobium e Ensifer so similares e segundo o Bacteriological Code o gnero Sinorhizobium deve ser transferido para Ensifer por ter sido descrito posteriormente. Assim, hoje so consideradas quatro famlias (Rhizobiaceae, Bradyrhizobiaceae, Phylobacteraceae e Xanthobacteraceae), cinco gneros (Rhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium/ Ensifer2 e Azorhizobium) e 46 espcies validadas pelo IJSEM3 (Tabela 1).

Tabela 1 Diferentes famlias e gneros de rizbio fixadores de nitrognio descritos.Nmero de Espcies 16 13

Famlia Rhizobiaceae

Gnero Rhizobium Sinorhizobium/ Ensifer

Autor(es) e ano Frank (1889) Chen et al. (1988); de Lajudie et al. (1994)

Bradyrhizobiaceae Phylobacteraceae

Bradyrhizobium Mesorhizobium

5 10 2

Jordan (1984) Jarvis et al. (1997) Dreyfus et al. (1988)

Xanthobacteraceae Azorhizobium

Outras espcies que apresentam a capacidade de formar ndulos e fixar nitrognio, no pertencentes ao grupo rizbio, vm sendo isoladas de diferentes leguminosas. Dentro do Filo -Proteobacteria foram descritos o gnero Blastobacter (B. denitrificants) isolado a partir de ndulos de Aeschynomene indica (van BERKUN et al., 2002), Methylobacterium (M. nodulans) de Crotalaria spp. (JOURAND et al., 2004), Devosia (D. neptuniea) de Neptunia natans (RIVAS et al., 2002) e Ochrobactrum (O. lupini) de Lupinus onoratus (TRUJILLO et al., 2005).2

Neste trabalho, o autor convencionou em utilizar somente Sinorhizobium para designao do gnero. IJSEM, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. A validao de um novo taxon deve vir acompanhada de uma publicao neste peridico ou que passe a integrar a lista de publicaes validas, aprovadas pelo ICSP (International Committee on Systematics of Prokaryotes).

3

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No Filo -Proteobacteria foi isolado o gnero Ralstonia (R. taiwanensis) a partir de ndulos de Mimosa spp. por Chen et al. (2001), enquanto Vandamme et al. (2002) reportaram o gnero Burkholderia, abrangendo quatro espcies (B. tuberum, B. phymatum, B. caribensis, B. cepacia) isoladas de cinco leguminosas tropicais. Essas descobertas indicam que a diversidade de procariotos capazes de estabelecer simbiose com leguminosas pode ser muito mais ampla que o previsto e certamente conduziro a avanos significativos no conhecimento da origem e evoluo da fixao biolgica de nitrognio, assim como sua manipulao pelo homem.

2.5 Taxonomia de rizbio

A sistemtica bacteriana definida com sendo o processo de caracterizao e arranjo da diversidade em uma maneira ordenada, reconhecendo grupos de organismos similares em uma hierarquia, cuja entidade bsica a espcie (DELLAGLIO et al., 2004). De acordo com Cowan (1968), a sistemtica inclui a taxonomia e aspectos da ecologia, bioqumica, gentica, patologia, biologia molecular e microscopia. No entanto, o termo sistemtica comumente utilizado como sinnimo de taxonomia. Segundo Vandamme et al. (1996), a taxonomia bacteriana tradicionalmente dividida em: a) classificao, isto , o arranjo ordenado dos organismos em grupos taxonmicos com base em sua similaridade; b) nomenclatura, ou seja, identificao das unidades definidas na classificao; c) identificao de organismos desconhecidos, que o processo de definir se um determinado organismo pertence a uma das unidades definidas na nomenclatura. De acordo com Holt et al. (1994, p. 03) Esquemas de identificao no so esquemas de classificao, apesar de poder existir certa similaridade. O processo de identificao envolve um numero reduzido de caracteres, facilmente determinado, que permitam uma alocao correta espcie, enquanto que na classificao busca-se uma ampla coleo de dados, envolvendo vrios aspectos fenotpicos e do gentipo, permitindo descrever as propriedades do microrganismo.

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A identificao de uma bactria se inicia na caracterizao fenotpica e gentica dos isolados e posterior alocao deste isolado caracterizado a uma espcie conhecida, aps a verificao de certo grau de similaridade.

2.5.1 Caracterizao fenotpica de rizbio

Esto includos nos mtodos fenotpicos todos aqueles no direcionados s molculas de DNA4

ou

RNA,

consequentemente

incluem

as

tcnicas

quimiotaxonmicas

(VANDAMME et al., 1996). Desta maneira os principais

mtodos fenotpicos so denominados de tradicionais e quimiotaxonmicos.

2.5.1.1 Mtodos fenotpicos tradicionais

Os mtodos fenotpicos tradicionais so usados nos protocolos de identificao da maioria dos Laboratrios de Microbiologia, compreendem dados morfolgicos, fisiolgicos e bioqumicos que permitem a distino de diferentes taxa. Os gneros de rizbio descritos at o momento podem ser diferenciados com base em caractersticas culturais e morfolgicas em meio LMA (VINCENT, 1970). Segundo Martins et al. (1997), os principais parmetros utilizados so: tempo de crescimento em meio de cultura LMA, reao cida ou bsica em meio de cultura, dimetro de colnia, produo de polissacardeos extracelulares (goma) e colorao da colnia. Com relao ao tempo de crescimento podem, ser formados cinco grupos: muito rpido, para aquelas colnias que podem ser visualizadas aps 1 dia de incubao; rpido, para aquelas que so visualizadas de 2 a 3 dias de incubao, intermedirias; com 4 a 5 dias; lentas, com 6 a 10 dias e muito lentas, so visualizadas aps 10 dias de incubao (MELLONI et al., 2006)

4

O termo quimiotaxonomia refere-se aplicao de mtodos analticos para a coleta de informaes sobre os vrios constituintes da clula visando classificao bacteriana (Vandamme et al., 1996)

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A alterao do pH do meio de cultura pode ser usada para dividir os isolados em trs classes: estirpes que apresentam reao cida, reao bsica ou reao neutra em meio de cultura. Placas com meio LMA recm preparadas com azul de bromotimol, possuem pH prximo a 6,8 e cor verde. Rizbios de crescimento lento tendem a alcalinizar, modificando a cor para azul, enquanto os rizbios de crescimento rpido tendem a acidificar o meio, alterando a cor para amarelo (MARTINS et al., 1997). Tan & Broughton (1981) sugerem que as mudanas de pH promovidas pelo rizbio no meio de cultura so devido utilizao preferencial de acares pelas estirpes de crescimento rpido, seguida da excreo de cidos orgnicos, e de compostos nitrogenados pelas estirpes de crescimento lento e conseqente liberao de ctions. O dimetro das colnias dos isolados que nodulam leguminosas um parmetro que apresenta correlao com outras caractersticas culturais. Colnias com dimetro menor que 1 mm possuem superfcie seca ou pouca produo de polissacardeos, e colnias maiores tendem a produzir mais goma (Martins et al., 1997). A produo de polissacardeos extracelulares, tambm denominada de muco ou goma, outra caracterstica utilizada na caracterizao de rizbio. As estirpes podem ser agrupadas em secas, quando no produzem goma, e quando ocorre formao de goma so classificadas quanto quantidade produzida em: alta, mdia e baixa. Estirpes de crescimento rpido tendem a produzir mais goma, ao contrrio de rizbios de crescimento lento que formam colnias secas ou com baixa produo de muco (MARTINS et al., 1997). A colorao da colnia varia dentro das diferentes estirpes de rizbio, sendo uma importante caracterstica no agrupamento de taxa. A colorao pode variar de incolor, branco a creme, sendo mais incomum a cor amarela (ARAJO, 1994). A avaliao das caractersticas culturais e morfolgicas o primeiro passo para a identificao de grupos taxonmicos de microrganismos, podendo prever uma boa aproximao em nvel de gnero. Estes descritores podem indicar diferenas fisiolgicas importantes entre microrganismos, que podem ser detectadas posteriormente mediante estudos mais refinados (PELCZAR et al., 1997). Um exemplo o gnero Mesorhizobium, no qual foram includos isolados que apresentavam algumas caractersticas fenotpicas diferenciadas do gnero

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Rhizobium, inclusive algumas estirpes que apresentam crescimento intermedirio, sugerindo a existncia de diferenas metablicas importantes (MOREIRA et al., 1993; JARVIS et al., 1997; de LAJUDIE et al., 1998b). Alguns descritores fenotpicos tradicionais avaliados tm como objetivo no somente a caracterizao, mas verificar a provvel adaptabilidade ecolgica dos diferentes isolados s condies ambientais predominantes no ecossistema para o qual se procede a seleo do rizbio. A capacidade de crescimento em diferentes pH, concentraes de sais, temperatura e antibitico so utilizados na caracterizao in vitro como tambm na correlao com condies ambientais (SWELLIM et al., 1997; S et al., 1993; XAVIER et al., 1998). A habilidade em utilizar diferentes fontes de carboidratos pode ser usada tambm na diferenciao das espcies de rizbio (GRAHAM et al., 1991). Esta caracterizao pode ser feita atravs do uso de kits para estudo de descritores bioqumicos, como o sistema API, Staph-Ident, Rapid E, Enterotubos, Oxi-ferm, Micro ID System e Biolog Nutritional System (HBNER et al., 2004).

2.5.1.2 Mtodos quimiotaxonmicos

As tcnicas quimiotaxonmicas visam avaliar a composio qumica de alguns constituintes da clula procaritica, sendo os principais mtodos SDS PAGE, anlise de isoenzima, sorologia e pirlese (avaliao do contedo de cidos graxos) (VANDAMME et al., 1996). A anlise de protenas totais por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sdio (SDS PAGE sodium dodecyl sulfato polyacrylamide gel electrophoresis) utilizada na caracterizao bacteriana por apresentar uma alta confiabilidade na distino de estirpes muito proximamente relacionadas (VANDAMME et al., 1996). Este mtodo foi empregado por Lima et al. (2005) no estudo da diversidade de estirpes de Bradyrhizobium spp. isoladas de diferentes solos da Amaznia. Este mtodo foi tambm utilizado na determinao das relaes filogenticas entre Mesorhizobium tianshanense e outros rizbios (TAN et al., 1997), e na caracterizao da espcie Methylobacterium nodulans (JOURAND et al., 2004).

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Outra tcnica que utiliza eletroforese a analise de isoenzima, que se baseia no diagnstico das mltiplas formas moleculares da mesma enzima que ocorre em uma determinada espcie, como resultado da presena de um ou mais genes codificando para cada uma destas formas (VANDAMME et al., 1996). Este mtodo foi utilizado por Barrera et al. (1997) na caracterizao de uma populao do gnero Bradyrhizobium. Os mtodos sorolgicos vm sendo empregados a mais de 70 anos na taxonomia de rizbio. O principio desta tcnica est baseada na presena de variabilidade nos constituintes antignicos das clulas bacterianas (NISCHI, 1994), sendo o mtodo de ELISA (Enzyme-Linked Imuno Sorbent Assay) considerado a principal prtica. No entanto, o seu uso no processo de identificao bacteriana limitado, uma vez que estirpes de rizbio que possuem propriedades antignicas similares podem ser bastante diversas com respeito a outras caractersticas fenotpicas e genotpicas. A anlise do teor de cidos graxos celulares constitui-se em um mtodo rpido e reproduzvel, quando realizada em condies controladas (JARVIS & TIGHE, 1994). Este mtodo foi utilizado para a discriminao entre estirpes de Bradyrhizobium e R. meliloti isoladas de diferentes solos da Itlia (KAY et al., 1994).

2.5.2 Caracterizao gentica de rizbio

Os mtodos genotpicos de taxonomia, direcionados para molculas de DNA ou RNA, so uma conseqncia do progresso tecnolgico experimentado pela biologia molecular nas dcadas recentes e atualmente dominam os estudos taxonmicos modernos (VANDAMME et al., 1996). A caracterizao gentica de procariotos pode ser baseada na quantidade total do DNA, pelas tcnicas de hibridizao de DNA e RFLP (Restrictions Fragment Length Polymorfhism), e por amplificao de seqncias do DNA e RNA, pelas diferentes metodologias de PCR (Polymerase Chain Reaction).

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2.5.2.1 Hibridizao do DNA

A definio de uma espcie bacteriana feita pela hibridizao DNA-DNA (VANDAMME et al., 1996). Este mtodo baseado na capacidade do DNA se desnaturar a altas temperaturas e recombinar-se em baixas temperaturas. Quando o percentual de recombinao DNA-DNA igual ou superior a 70% sugere ser a mesma espcie. Estirpes que possuem uma hibridizao variando entre 25 e 60% so consideradas espcies diferentes pertencentes ao mesmo gnero e percentuais inferiores a 10% compreendem gneros diferentes (WANG et al., 2006). A maior parte das espcies de rizbio hoje definidas obedece este critrio. No entanto Martinez-Romero (1994) relata alguns casos de muito baixa homologia de DNA dentro das espcies Sinorhizobium fredii, Rhizobium tropici, Mesorhizobium plurifarium. Nestes casos mtodos fenotpicos podem auxiliar na correta distino das estirpes.

2.5.2.2 Polimorfismo dos tamanhos dos fragmentos de restrio (RFLP)

A determinao do polimorfismo dos tamanhos de fragmentos de restrio (RFLP Restrictions Fragment Length Polymorfhism) um mtodo empregado em taxonomia de procariotos e nos estudos de diversidade para comparao de estirpes (WANG et al., 2006). A distino dos grupos bacterianos e feitos atravs do polimorfismo gerado no DNA total pela ao de enzimas de restrio. Esta anlise inclui a digesto do DNA total com o uso de enzimas especficas, sua separao por eletroforese e a hibridizao com fragmentos de seqncia homologa de DNA marcadas com radioatividade ou compostos que desencadeiam uma reao de luminescncia (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1995). Outra metodologia pode ser realizada pela clivagem do produto oriundo da reao de PCR com enzimas de restrio e visualizada em gel de agarose, na tcnica denominada PCR-RFLP.

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As anlises de RFLP e PCR-RFLP vm sendo muito utilizadas na caracterizao da diversidade entre diferentes populaes de rizbio, principalmente avaliado as regies 16S do RNAr e da regio intergnica 16S e 23S RNAr (FERNANDES et al..2003; TAN et al., 2001; CHUEIRE et al., 2000a; DOIGNONBOURCIER et al., 2000).

2.5.2.3 Anlises baseadas na reao em cadeia de polimerase

As tcnicas de PCR permitem a amplificao de seqncias definidas da molcula de DNA, diferenciando e identificando as estirpes de bactrias. Esta prtica contribuiu para os recentes avanos obtidos na taxonomia de rizbio. O uso de oligonucleotdeos especficos que amplificam seqncias repetidas do DNA, pela tcnica de PCR, proporcionando a formao de perfis eletroforticos que promovem a chamada impresso digital do organismo (fingerprinting). Os oligonucletdeos mais comumente utilizados so BOX, ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) e REP (Repetitive Extragenic Palindromic Sequences) que amplificam seqncias repetidas no genoma bacteriano (VERSALOVIC et al., 1994). Estes mtodos tm sido empregados no estudo da diversidade intra-especfica de rizbio, fazendo a distino de estirpes muito proximamente relacionadas (FERNANDES et al., 2003; CHUEIRE et al., 2000b). Para a distino de estirpes recomendadas para o cultivo de diferentes espcies de leguminosas vm sendo empregados os mtodos que utilizam os oligonucleotdeos ERIC, REP e BOX (CHUEIRE et al., 2000a; CHUEIRE et al., 2000b; BANGEL, 2000). Segundo Selenska-Pobell et al. (1996), a tcnica de BOXPCR foi eficiente para distinguir diferentes espcies de Rhizobium e as informaes geradas for auxiliaram na caracterizao realizada pela tcnica de RFLP do DNA. O estudo da diversidade de 29 isolados bacterianos de trs espcies arbreas de regies temperadas da China foi realizada pela tcnica de BOX-PCR e permitiram alocar estas estirpes no gnero Bradyrhizobium (LIU et al., 2005).

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Outra ferramenta de uso crescente na prtica de identificao de bactrias a amplificao de regies especficas do genoma e posterior seqenciamento de bases. A identificao determinada pela comparao das seqncias obtidas com a de outros organismos disponveis no banco de dados da National Center for Biotechnology Information (NCBI). As molculas de RNA 16S e 23S presentes no ribossomo so comumente empregadas na taxonomia de procariotos por serem regies conservadas e se enquadram nos conceitos que definem um marcador filogentico relatado por Piaza et al. (2006). A regio 23S bem maior do que a 16S, contendo mais informaes genticas teis em estudos de filogenia (LUDWING et al. 1992), no entanto o nmero de seqncias presentes nos bancos de dados pouco, limitando a comparao de novas seqncias5.

5

A comparao do numero de seqncias de 16S e 23S, disponveis para alinhamento, pode ser feita no banco de dados da NCBI (http//:www.ncbi.nlm.nih.gov/).

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3

MATERIAL E MTODOS

Para a execuo do trabalho foram coletadas amostras de razes em Alegrete, Maambar e So Francisco de Assis (Tabela 1) e o material foi analisado nos Laboratrios de Biologia e Microbiologia do Solo e do Ambiente do Departamento de Solos da Universidade Federal de Santa Maria/RS e no Ncleo de Microbiologia Agrcola do Departamento de Gentica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul/RS (Figura 3).Coleta de razes de L. albescens; L. lanatus e Lupinus sp. Municpios: - Alegrete - Maambar - So Francisco de Assis

Isolamento e autenticao dos rizbios Laboratrio e casa de vegetao do Departamento de Solos, UFSM

Caracterizao Fenotpica: Caractersticas culturais. Crescimento em diferentes temperaturas. Crescimento em diferentes concentraes de NaCl. Crescimento em diferentes pH. Laboratrio de Biologia e Microbiologia do Solo e do Ambiente, UFSM

Caracterizao Molecular: Extrao de DNA. BOX PCR. Eletroforese em Gel de Agarose. Departamento de Gentica, UFRGS.

Eficincia simbitica na FBN: Nitrognio total da parte area. Massa seca da parte area. Massa seca das razes. Nmero de ndulos Casa de vegetao do Departamento de Solos, UFSM.

Figura 3 Etapas da execuo do trabalho com rizbio em Lupinus. Santa Maria, 2007.

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3.1 Coleta das razes das plantas de Lupinus

Para escolha dos locais a serem coletadas as razes de Lupinus, foram selecionadas duas reas de ocorrncia natual de Lupinus albescens, no local denominado Ponte de Pedra e na Fazenda Santa Zlia, localizados nos municpios de Alegrete e Maambar. Foi escolhida tambm uma rea de arenizao onde as plantas de L. albescens esto sendo cultivadas aproximadamente a 5 anos, localizado na Fazenda Santo Anto no municpio de Alegrete. As razes das espcies L. lanatus e Lupinus sp. foram coletadas em uma vooroca no municpio de So Francisco de Assis (Tabela 2). O procedimento de coleta foi realizado de acordo com metodologia modificada proposta por Hungria (1994). Em cada local foram amostradas plantas em plena florao, tendo sido escolhidas de forma aleatria. Cavou-se ao redor da raiz para a retirada intacta do sistema radicular. Removeu-se o excesso de solo e foi retirada a parte area com auxilio de uma tesoura de poda. As razes foram colocadas em sacos plsticos e acondicionadas em uma caixa trmica.

Tabela 2 Locais de coleta de trs espcies de tremoo nos municpios de Alegrete, Maambar e So Francisco de Assis. Santa Maria, 2007.Local de Coleta Ponte de Pedra Fazenda Santo Anto Fazenda Santa Zlia Vooroca Nmero de Plantas 10

Espcie Lupinus albescens

Coordenadas Geogrficas 293958S e 552343W

Municpio Alegrete

10

Lupinus albescens

294058S e 551940W

Alegrete

10 10 2

Lupinus albescens Lupinus sp. Lupinus lanatus

285307S e 561701W 293123S e 551440W 293123S e 551440W

Maambar So Francisco de Assis So Francisco de Assis

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3.2 Isolamento de rizbio

O isolamento das bactrias foi realizado no Laboratrio de Biologia e Microbiologia do Solo e do Ambiente da Universidade Federal de Santa Maria. As razes coletadas foram lavadas com auxlio de uma peneira. As razes com os ndulos foram secos em papel toalha e as razes fragmentadas em pedaos menores com auxlio de uma tesoura de poda para facilitar a retirada do material do interior do ndulo. Para cada sistema radicular foram retirados de um a trs ndulos. Aps esta limpeza, os ndulos foram acondicionados em placas de Petri. A desinfestao dos ndulos foi feita de acordo com metodologia proposta por Hungria (1994). Cada ndulo foi submerso em lcool 95% por dez segundos, posteriormente em soluo de hipoclorito a 5% e seguido de oito lavagens em gua destilada e esterilizada. Os ndulos foram cortados ao meio com auxlio de bisturi e pina para raspagem do seu interior e posterior inoculao em meio de cultura LMA (Levedura Manitol Agar) (VINCENT, 1970). O material amostrado foi incubado no escuro a 28C por 10 dias (Figura 4).

a)

b)

Figura 4 Isolamento de bactrias a partir de ndulos de Lupinus albescens: a) amostragem de material do interior do ndulo; b) inoculao em meio LMA.

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Aps a inoculao, as colnias isoladas que apresentavam crescimento entre 2 a 10 dias e no absorviam o vermelho congo, eram marcadas e inoculadas novamente em meio de cultura LMA para purificao. A pureza do isolado foi determinada mediante teste de Colorao de Gram. Os trinta e oito isolados bacterianos inicialmente purificados foram utilizados para a realizao da autenticao e caracterizao fenotpica.

3.3 Autenticao dos isolados

A capacidade de nodulao e formao de leghemoglobina foi verificada pela autenticao dos isolados. O experimento foi realizado em casa de vegetao do Departamento de Solos da Universidade Federal de Santa Maria durante 60 dias. O experimento foi realizado em copos de plstico com capacidade de 500 mL, contendo uma mistura composta de vermiculita e areia na proporo 2:1, a qual foi acondicionada em sacos plsticos de polipropileno e esterilizada por uma hora em autoclave a 120C por trs dias consecutivos. Em cada recipiente foram colocados cinco sementes de L. albescens previamente escarificadas e desinfestadas em soluo de hipoclorito 5 % por 5 min. O inculo consistiu de caldo LM (VICENT, 1970), onde foram inoculados os tratamentos e incubado a 28C por seis dias sob agitao de 120 rpm. O experimento constou de 41 tratamentos com duas repeties, sendo 38 isolados, duas estirpes de Bradyrhizobium sp. recomendadas para Lupinus (SEMIA 928 e 938), um tratamento sem inoculao. A cada cinco dias era adicionado 10 mL de soluo nutritiva (SOMASEGARAN & HOBEN, 1985). A avaliao da presena dos ndulos foi feita em lupa esteroscpica no Laboratrio de Microbiologia e Biologia do Solo e do Ambiente.

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3.4 Caracterizao fenotpica

3.4.1 Caractersticas culturais

3.4.1.1 Colorao de Gram

As culturas foram crescidas a 28C, por seis dias, em placas de Petri com meio de cultura LMA. Pequena amostra do crescimento foi ento transferida e esparramada em uma gota de gua em lmina de microscopia. O esfregao foi fixado na chama de lamparina e ento submetido ao mtodo de colorao de Gram de Hucker, de acordo com procedimento descrito por Murray et al. (1994) modificado pela substituio de etanol 95% por soluo alcolica de acetona a 5% como agente de descolorao. As solues de Gram esto descritas no Anexo A. A lmina preparada foi analisada sob objetiva de 100 x sob leo de imerso em microscpio ptico com aumento de 2.000 vezes. Culturas que apresentaram clulas de cor azul-violceo foram assumidas como sendo Gram positivas e aquelas de colorao vermelhorseo como Gram negativas.

3.4.1.2 Tempo de crescimento para a visualizao das colnias

Os isolados foram crescidos em placas de Petri contendo meio LMA (VINCENT, 1970) modificado pela a adio de 5 mL L-1 de soluo de Vermelho Congo (Figura 5). Foi considerado crescimento muito rpido, para aquelas colnias que podem ser visualizadas aps um dia de incubao; rpido, para aquelas que so visualizadas de dois a trs dias de incubao, intermedirias; com quatro a

40

cinco dias; lentas, com seis a dez dias e muito lentas, so visualizadas aps dez dias de incubao (MELLONI et al., 2006).

a)

b)

Figura 5 Meio de cultura LMA com vermelho congo (a) e azul de bromotimol (b), utilizados na caracterizao cultural dos isolados. Santa Maria, 2007.

3.4.1.3 Dimetro das colnias

O dimetro das colnias foi determinado juntamente com o tempo de crescimento. Aps sete dias de incubao, o dimetro das colnias foi medido com auxlio de um paqumetro, sendo o tamanho determinado em milmetro. Em cada uma das placas, foram medidas 10 colnias isoladas e os resultados obtidos foram submetidos mdia aritmtica e expressos em valores absolutos.

41

3.4.1.4 Produo de goma

A produo de goma (polissacardeos) foi determinada juntamente com o dimetro das colnias, aps sete dias de incubao. Esta caracterstica foi determinada visualmente em: sem produo de goma (s/goma), baixa, mdia e alta produo de goma (MELLONI et al., 2006).

3.4.1.5 Colorao das colnias

A colorao das colnias foi determinada visualmente durante a determinao do dimetro das colnias. Foram consideradas as cores: branca, creme, amarela e incolor (MELLONI et al., 2006).

3.4.1.6 Alterao do pH do meio

Os isolados foram inoculados em meio LMA (VINCENT, 1970) modificado pela a adio 10 mL L-1 de Azul de Bromotimol (Figura 5). A colorao azul do meio de cultura foi considerada alcalina, colorao amarela cido e a no alterao da cor original do meio neutro. Os isolados foram comparados com placas sem inoculao e inoculada com a estirpe de Bradyrhizobium sp. SEMIA 938.

42

3.4.1.7 Agrupamento dos isolados

Aps a caracterizao cultural dos isolados, foi construdo um dendograma de similaridade pelos mtodos Complete Linkage e Distncia Euclidiana (Everitt, 1993 apud Melloni et al., 2006) por meio do programa STATISTICA 4.5 (1993). Os valores obtidos na caracterizao foram estipulados de acordo com Melloni et al. (2006) (Tabela 3).

Tabela 3 Valores relativos s caractersticas culturais dos isolados utilizados na construo do dendograma. Santa Maria, 2007.Valor atribudo para a construo do dendogramas (1) 1 2 3 4 5 1 2 3 1 2 3 1 2 3 4

Caracterstica cultural A. Tempo, em dias para visualizao das colnias

Intervalo de observao 1 dia (muito rpido) 2 a 3 dias (rpido) 4 a 5 dias (intermedirio) 6 a 10 dias (lento) 10 dias (muito lento) < 1 mm 1 a 2 mm > 2 mm Acido Neutro Bsico s/goma Baixa Mdia Alta

B. Dimetro da colnia

C. Alterao do pH do meio

D. Produo de goma

E. Colorao da colnia

(1)

Branca 1 Creme 2 Amarela 3 Incolor 4 Os valores foram ponderados de acordo com a importncia atribuda s caractersticas culturais na construo do dendograma, sendo 100, 75, 100, 25 e 75% para as caractersticas A, B, C, D e E (MELLONI et al., 2006).

43

Os valores obtidos na caracterizao fenotpica foram ponderados de acordo com a importncia atribuda s caractersticas fenotpicas na construo do dendograma, sendo 100, 75, 100, 25 e 75% para as caractersticas tempo, em dias para visualizao das colnias; dimetro mdio das colnias; modificao do pH do meio LMA com Azul de Bromotimol; produo de goma e colorao das colnias, respectivamente, de acordo com Melloni et al. (2006) e Moreira et al. (1993).

3.4.2 Caracterizao fisiolgica

Os isolados que apresentaram formao de ndulos e produo de leghemoglobina e a estirpe SEMIA 938, foram submetidos aos testes de crescimento em diferentes temperaturas, concentraes de NaCl e pH.

3.4.2.1 Crescimento em diferentes temperaturas

A capacidade de crescimento em diferentes temperaturas foi determinada pela inoculao em tubos de ensaio contendo meio LM (Levedura Manitol) (VINCENT, 1970), onde os isolados foram incubados a temperatura de 28; 32; 37 e 40C. Tubos que apresentavam turbidez no caldo foram considerados como resultado positivo e no turvos foram considerados negativos. Foi utilizado na comparao um tratamento sem inoculao para confirmar a ausncia de crescimento (Figura 6).

44

3.4.2.2 Crescimento em diferentes pH

Para avaliar a capacidade de crescimento em diferentes pH, tubos de ensaio contendo 5 mL de caldo LM (VINCENT, 1970), tendo valores de pH de 4; 5; 6; 7; 8; 9 e 10, ajustados com NaOH e HCl 1M, foram incubados e crescidos a uma temperatura de 28C sob agitao de 120 rpm. A anlise de crescimento foi determinada sete dias aps a incubao. Tubos que apresentavam turbidez no caldo foram considerados como resultado positivo e no turvos foram considerados negativos. Foram inoculadas duas testemunhas que cresceram em caldo LM (VINCENT, 1970) com pH 6,8 e temperatura de 28C sob agitao de 120 rpm. Foi utilizado na comparao um tratamento sem inoculao para confirmar a ausncia de crescimento (Figura 6).

a)

b)

c)

Figura 6 Padres utilizados na caracterizao fisiolgica dos rizbio. a) UFSM L1.3; b) SEMIA 938; c) Sem inoculao. Santa Maria, 2007.

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3.4.2.3 Crescimento em diferentes concentraes de NaCl

A habilidade de crescer em diferentes concentraes de NaCl foi determinada pela incubao dos isolados em tubos de ensaio contendo 5 mL de caldo LM (VINCENT, 1970) acrescidos com 0,1; 0,5; 1,0; 5,0 e 10,0 % (m/v) de NaCl, incubados a 28C sob agitao de 120 rpm durante sete dias. Tubos com turbidez no caldo foram considerados com crescimento positivo e no turvos negativos. Duas testemunhas foram utilizadas na comparao, crescidas a pH 6.8 em temperatura de 28C sob agitao de 120 rpm no mesmo perodo de tempo. Um tratamento sem inoculao foi utilizado na comparao dos resultados negativos (Figura 6). Para o desenvolvimento dos testes de crescimento em diferentes pH e concentraes de NaCl, foram considerados duas repeties por tratamento, caso houvesse discordncia de resultado em cada repetio, os tratamentos seriam inoculados novamente.

3.5 Identificao dos isolados

A partir das caractersticas culturais dos isolados, foi realizada a identificao do gnero, comparando os dados obtidos dos isolados que apresentaram resultado positivo para formao de ndulos e leghemoglobina pelo teste de autenticao, com dados obtidos da literatura de 21 estirpes tipo de rizbio (Tabela 4). O agrupamento foi realizado mediante a construo de um dendograma de similaridade pelos mtodos Complete Linkage e Distncia Euclidiana (EVERITT, 1993) por meio do programa STATISTICA 4.5 (1993). Os valores obtidos na caracterizao e da literatura para construo do dendograma foram ponderados de maneira semelhante ao item 3.4.1.7 (Tabela 3).

46

Tabela 4 Espcies e estirpes tipo de rizbio utilizadas na comparao dos isolados de Lupinus. Espcie Azorhizobium caulinodans Azorhizobium dobereinerae Bradyrhizobium japonicum Bradyrhizobium liaoningense Bradyrhizobium yuanmingense Mesorhizobium amorphae Mesorhizobium chacoense Mesorhizobium loti Mesorhizobium plurifarum Mesorhizobium septentrionale Rhizobium huautlense Rhizobium mongolense Rhizobium gallicum Rhizobium giardinii Rhizobium hainanese Rhizobium lossense Rhizobium undicula Rhizobium yanglingense Sinorhizobium arboris Sinorhizobium kummerowiae Sinorhizobium morelense Estirpe-tipo ORS 571 UFLA 1-100 ATCC10324 2281 CCBAU 10071 ACCC 19665 CECT 5336 NZP2213 ORS 1032 SDW014 SO2 USDA 1844 R602sp H152 I66 CCBAU7190B ORS 992 CCBAU71623 HAMBI 1552 CCBAU71042 Lc57 Referncia Dreyfus et al. (1988) Moreira et al. (2006) Jordan et al. (1984) Xu et al. (1995) Yao et al. (2002) Wang et al. (1999) Velazquez et al. (2001) Jarvis et al. (1997) de Lajudie et al. (1998b) Gao et al. (2004) Wang et al. (1998) van Berkun et al. (1998) Armager et al. (1997) Armager et al. (1997) Chen et al. (1997) Wei et al. (2003) de Lajudie et al. (1998a) Tan et al. (2001) Nick et al. (1999) Wei et al. (2002) Wang et al. (2002)

3.6 Caracterizao molecular

A caracterizao por BOX - PCR foi realizada no Ncleo de Microbiologia Agrcola, do Departamento de Gentica da UFRGS. Foi utilizado na comparao o isolado de Lupinus L123B, SEMIA 938 e 928 e dois isolados de Lupinus descritos por Rovedder et al. (2005) de crescimento rpido e uma espcie de Rhizobium sp.

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Para a extrao de DNA foi seguido o protocolo modificado de Sambrook et al. (1998), onde as estirpes foram crescidas em meio lquido por sete dias. Uma alquota de 1,5 mL de cultura foi transferidas para microtubos de 2 mL e centrifugados por 3 minutos a 16099 rcf por duas vezes. Descartou-se o sobrenadante e adicionou-se 500 L de TE1, homogeneizando em vortex at que todo pellet tenha sido ressuspendido. Foram adicionadas 25 L de Lizoenzima e incubados a 37C por 1 hora. Posteriormente, as amostras foram mantidas a temperatura ambiente por cinco minutos e adicionou-se 200 L de acetato de amnia 7,5 M e mantidas em gelo por 15 min. Centrifugou-se por 10 min a 16099 rcf e o sobrenadante foi vertido para outro microtubo de 1,5 mL. A quantidade de 1 volume de fenol-clorofrmio foi adicionada e agitou-se por 10 minutos. O material foi centrifugado por 5 min a 2795 rcf aps foi adicionado 8 L de NaCl 5M e 0,6 volumes de isopropanol, e mantidas as amostras no gelo por 10 min. Centrifugou-se por 15 minutos a 12.000 rpm e o sobrenadante descartado. O pellet de DNA foi lavado com 500 L de Etanol 70% e centrifugado por 2 minutos a 12.000 rpm. O pellet foi ressuspendido em 30 L de TE. O DNA das bactrias foi amplificado pela tcnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) com o oligonucleotdeo BOX A1-R (5-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG3), que amplifica regies conservadas e repetitivas do DNA cromossmico. A amplificao foi realizada utilizando os seguintes ciclos: um ciclo de desnaturao inicial a 95C por 6 mim, 35 ciclos de desnaturao (30 seg a 90 C), anelamento (1 min a 52C) e extenso (8 min a 65C), um ciclo de extenso final a 65C por 16 min (MARTIN et al., 1992). Os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese a 80 V durante trs horas em gel de agarose a 1,5% e corado com brometo de etdeo e fotografado. O perfil de bandas no gel foi transformado em uma matriz binria bidimensional, onde 0 indicava a ausncia de banda e 1 a presena e o agrupamento realizado pelo programa STATISTICA 4.5 (1993) usando o algoritmo UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with arithmetic mean) e o coeficiente de Pearson.

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3.7 Teste de eficincia na Fixao Biolgica de Nitrognio

Neste experimento foram estudados os isolados que apresentaram resultado positivo para formao de ndulos e leghemoglobina pelo teste de autenticao e a estirpe SEMIA 938, recomendada para Lupinus sp., obtida da coleo de culturas da FEPAGRO (Fundao Estadual de Pesquisa Agropecuria). O experimento foi realizado em vasos de plstico com capacidade de 500g de substrato, contendo uma mistura composta de vermiculita e areia na proporo 2:1, a qual foi acondicionada em sacos plsticos de polipropileno e esterilizada por uma hora em autoclave a 120C por trs dias consecutivos. Em cada vaso foram semeados quatro plantas de Lupinus albescens previamente escarificadas e desinfestadas em soluo de hipoclorito 5 % (v/v) por 5 minutos. O inculo consistiu de caldo LM (Vicent, 1970), onde foram inoculados os isolados e incubado a 28C por seis dias sob agitao de 120 rpm. O numero de clulas foi determinado em Cmara de Neubauer e expressos em clulas mL-1. A cada sete dias era adicionado 10 mL de soluo nutritiva livre de nitrognio (SOMASEGARAN & HOBEN, 1985). Os tratamentos consistiram do isolado UFSM L1.3, SEMIA 938, um tratamento sem adio de nitrognio e outro com a adio de 400 mg de N, aplicados 50 mg na semeadura e por mais sete vezes via soluo nutritiva. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro repeties. O experimento foi conduzido por 45 dias, na casa de vegetao do Departamento de Solos da Universidade Federal de Santa Maria. Na colheita, a parte area da planta foi separada do sistema radicular, sendo acondicionados em sacos de papel e secados em estufa a 65C com ventilao forada durante trs dias. As avaliaes realizadas foram: a produo de matria seca da parte area, o acmulo de nitrognio na parte area, segundo metodologia descrita em Tedesco et al. (1995) nmero de ndulos e massa seca das razes. Os dados foram submetidos ao teste de Scott-Knott, a 5% de probabilidade de erro, realizados pelo programa Sisvar 4.6 (FERREIRA, 2000).

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A eficincia simbintica (Efra) foi determinada segundo a equao (1) proposta por Brockwell et al. (1966), apud S (2001): Efra% = N total fixado N total S/N x 100 N total C/N N total S/N Onde: N total fixado: nitrognio total do tratamento; N total S/N: nitrognio total da testemunha sem nitrognio; N total C/N: nitrognio total da testemunha com nitrognio. (1)

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4

RESULTADOS E DISCUSSO

4.1 Isolamento e caracterizao

O isolamento proporcionou a obteno de 204 isolados puros. Nas reas Ponte de Pedra e Fazenda Santa Zlia foram isolados os maiores nmeros de bactrias a partir de ndulos de Lupinus albescens (76 e 50 isolados, respectivamente). Na rea de arenizao foram obtidos 39 isolados bacterianos a partir de ndulos de Lupinus albescens. Estes resultados demonstram que os maiores nmeros de isolados foram encontrados nas reas de ocorrncia natural de L. albescens, em comparao a rea em processo de arenizao, onde foi introduzida esta espcie de tremoo. Na vooroca, a partir de duas plantas de Lupinus lanatus obtiveram-se seis isolados e 32 isolados de Lupinus sp. (Tabela 5).

Tabela 5 Relao do nmero de isolados nos quatro locais e nas espcies de Lupinus estudadas. Santa Maria, 2007.Local de Coleta Ponte de Pedra Fazenda Santo Anto Fazenda Santa Zlia Vooroca Vooroca Numero de Plantas 10 10 10 10 2 Espcie Lupinus albescens Lupinus albescens Lupinus albescens Lupinus sp. Lupinus lanatus Total Nmero de isolados 76 39 50 32 6 204

trs

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A caracterizao fenotpica dos isolados bacterianos possibilitou a formao de dois grupos com caractersticas culturais distintas (I e II). O grupo I se diferenciou por apresentar o maior nmero de isolados bacterianos, com 81,5% do total de organismos caracterizados e o grupo II com 18,5% (Figura 7), sendo que todas as estirpes apresentaram reao de Gram negativa. O grupo rizbio encontrado nas -Proteobactrias, tendo estes microrganismos reao de Gram negativa (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006).

A

B C D E

FG H I

J L

UFSM L1.1 UFSM L1.2 UFSM L1.5 UFSM L1.6 UFSM L1.7 UFSM L1.8 UFSM L1.9 UFSM L1.10 UFSM L1.11 UFSM L1.12 UFSM L2.2 UFSM L2.3 UFSM L2.4 UFSM L2.5 UFSM L2.6 UFSM L2.7 UFSM L2.8 UFSM L2.9 UFSM L3.8 UFSM L4.2 UFSM L4.4 UFSM L2.12 UFSM L3.1 UFSM L1.13 UFSM L1.14 UFSM L3.4 UFSM L3.2 UFSM L3.7 UFSM L2.1 UFSM L2.10 UFSM L2.11 UFSM L1.3 UFSM L1.4 UFSM L3.3 UFSM L3.5 UFSM L3.6 SEMIA 938 UFSM L4.3 UFSM L4.1

I = 20%

II = 54%Similaridade (%)100 80 60 40 20 0

Figura 7 Dendograma de similaridade baseado nas caractersticas culturais de 38 isolados de Lupinus (UFSM L1.1, UFSM L1.2, UFSM L1.3, UFSM L1.4, UFSM L1.5, UFSM L1.6, UFSM L1.7, UFSM L1.8, UFSM L 1.9, UFSM L1.10, UFSM L1.11, UFSM L1.12, UFSM L1.13, UFSM L1.14, UFSM L2.1, UFSM L2.2, UFSM L2.3, UFSM L2.4, UFSM L2.5, UFSM L2.6, UFSM L2.7, UFSM L2.8, UFSM L2.9, UFSM L2.10, UFSM L2.11, UFSM L2.12, UFSM L3.1, UFSM L3.2, UFSM L3.3, UFSM L3.4, UFSM L3.5, UFSM L3.6, UFSM L3.8, UFSM L4.1, UFSM L4.2, UFSM L4.3, UFSM L4.4) e estirpe recomendada para Lupinus (SEMIA 938). Santa Maria, 2007.

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Dos 38 isolados bacterianos avaliados, 28 apresentaram uma similaridade de aproximadamente 50%, os quais obtiveram crescimento rpido e intermedirio (Grupos A, B, C, D e E) e reao cida, com exceo do grupo C que teve reao neutra em meio de cultura (Tabela 5). Tambm dentro destes isolados bacterianos, o grupo E apresentou colorao de colnia branca, diferindo-se dos demais grupos que mostraram colorao incolor. Estes grupos variaram na intensidade de produo de goma, de baixa para o Grupo E, mdia para os grupos B, C e D e alta para o Grupo A (Tabela 6). A alta produo de goma, pela maioria dos isolados de crescimento rpido, pode ter influenciado a variao no dimetro de colnias encontradas no grupo A, possivelmente devido alta concentrao de nutrientes e de fontes de carbono do meio LMA. Por serem produtos extracelulares, os exopolissacardeos se acumulam na superfcie das clulas (CORONADO et al., 1996) e podem estar associados ao acmulo de nutrientes, adeso superficial e proteo a estresses ambientais. O baixo pH e presena de alumnio so fatores de estresse ambiental evidenciado nas reas em processo de arenizao (ROVEDDER, 2003), o que torna a produo de exopolissacardeos uma caracterstica importante na seleo de bactrias fixadoras de nitrognio em reas arenizadas. Com aproximadamente 55% de similaridade, sete isolados apresentaram crescimento lento (grupos H, I, L) e intermedirio (grupo J), variando o dimetro das colnias de 1 a 2 mm. Os grupos H e I apresentaram reao bsica em meio de cultura, baixa produo de goma, variando na colorao da colnia, creme para o grupo H e branca para o grupo I. A estirpe SEMIA 938 apresentou 100% de similaridade com os isolados do grupo I e 74% com o isolado do grupo H (Figura 7 e Tabela 6). Oito isolados bacterianos apresentaram crescimento lento e reao bsica em meio de cultura. Estas caractersticas so comuns em isolados de Lupinus (BARRERA et al., 1997), entretanto, Miller & Pepper (1988) relatam o isolamento de bactrias de crescimento rpido em tremoo.

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Tabela 6 Caractersticas culturais fenotpicas dos isolados bacterianos pertencentes aos grupos formados a partir de cinco caractersticas bsicas. Santa Maria, 2007.

Caractersticas Grupo 1 A B C D E F G H I J L 3 4 3 3 3 1 3 6 6 5 6 2 3-5 3 2 2 2 1 1 1 1 1 2 3 cida cida Neutra cida cida cida cida Bsica Bsica Neutra Neutra 4 Alta Mdia Mdia Mdia Baixa Mdia Sem goma Baixa Baixa Baixa Mdia 5 Incolor Incolor Incolor Incolor Branca Branca Amarela Creme Branca Incolor Branca

Nmero de Isolados 21 2 2 1 2 1 2 1 5 1 1

1: Tempo, em dias, para a visualizao das colnias; 2: Dimetro da colnia; 3: Alterao do pH do meio; 4: Produo de goma; 5: Colorao das colnias.

Os grupos F e G demonstraram ter caractersticas nicas, sendo F de crescimento muito rpido, com dimetro de 1 mm, reao cida em meio de cultura e colorao branca. Rovedder et al. (2005) relatam o isolamento de trs isolados bacterianos com crescimento muito rpido e caractersticas culturais semelhantes a este grupo. Os dois isolados do grupo G tiveram as caractersticas mais divergentes, por apresentar colnias sem goma e amarelas, com dimetro de 1 mm e apresentando tempo de crescimento rpido, diferenciando dos outros de crescimento rpido e lento.

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4.2 Autenticao dos isolados bacterianos nativos

A capacidade de formao de ndulos e produo de leghemoglobina prrequisito para definir o grupo rizbio. Desta maneira, em trabalhos de rizobiologia, este conhecimento importante para reduzir o nmero de organismos a serem estudados e selecionar estirpes mais eficientes. Dos trinta e oito isolados bacterianos submetidos caracterizao cultural, foram testadas a capacidade de formao de ndulos e produo de leghemoglobina. Trinta e sete isolados bacterianos no apresentaram formao de ndulos e somente com o isolado UFSM L1.3 foram observados ndulos vermelhos, tendo formado 5 ndulos grandes prximos ao colo das razes, com tamanho variado entre 3 a 4 mm (Figura 6). A colorao vermelha no interior do ndulo formado por UFSM L1.3, em L. albescens, indica a produo de leghemoglobina (Figura 8). Esta substncia responsvel pelo transporte de oxignio no interior do ndulo, impedindo a inativao da nitrogenase (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). As estirpes SEMIA 938 e SEMIA 928 no foram simbiontes a L. albescens, demonstrando a necessidade de se isolar estirpes de rizbios nativos que sejam eficientes para esta espcie vegetal. Relatos encontrados na literatura correlacionam o tamanho do ndulo com a sua eficincia na fixao biolgica de nitrognio. Anyango et al. (1995), avaliaram a capacidade de formao de ndulos de isolados obtidos a partir de feijoeiro no Qunia. Estes autores constataram que os ndulos ineficientes eram brancos, pequenos, com aproximadamente 1mm de dimetro e em grande quantidade, enquanto que os isolados eficientes eram os que formavam ndulos vermelhos, maiores, em torno de 3 mm e em menor nmero. Em trabalho com a variedade de feijoeiro Limburgse vroege, em solos tropicais brasileiros, os ndulos grandes, esfricos e pigmentados apresentaram maior capacidade de fixao biolgica de nitrognio em comparao com ndulos brancos que variaram em tamanho e forma (Michiels et al. 1998). Os isolados UFSM L3.3, UFSM L3.5 e UFSM L3.6 foram obtidos a partir de Lupinus sp. e sua inoculao em Lupinus albescens no proporcionou a formao

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de ndulos. Este resultado pode indicar uma especificidade entre os isolados bacterianos e Lupinus sp. No entanto testes de inoculao so necessrios para confirmar a simbiose entre os isolados UFSM L3.3, UFSM L3.5 e UFSM L3.6 e esta espcie de tremoo. Os demais isolados que no foram simbiontes a L. albescens devem ser inodulados em outras espcies de leguminosas e estudos taxonmicos mais aprofundados.

a)

b)

Figura 8 Ndulo em Lupinus albescens (isolado UFSM L1.3) aos 60 dias. a) Nodulao positiva; b) Produo de leghemoglobina.

4.3 Caracterizao do gnero de uma estirpe de rizbio isolada de Lupinus albescens

A caracterizao cultural apresenta informaes relevantes para a alocao de uma estirpe em determinado gnero de rizbio (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). Para uma aproximao do gnero, as caractersticas culturais do isolado UFSM L1.3 e SEMIA 938 foram comparadas com 21 estirpes tipo de rizbio atravs de anlise de similaridade (Figura 9). O isolado de rizbio UFSM L1.3 apresentou aproximadamente 95% de similaridade com o grupo formado por estirpes de Bradyrhizobium (Bradyrhizobium japonicum ATCC10324, Bradyrhizobium liaoningense 2281, Bradyrhizobium

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yuanmingense CCBAU 10071 e Bradyrhizobium sp. 938), tendo a colorao de colnia creme como sendo a caracterstica que divergiu deste grupo (Tabela 7). As duas estirpes tipo de Azorhizobium (Azorhizobium caulinodans ORS 571 e Azorhizobium dobereinerae UFLA 1-100) apresentaram 78% de similaridade com o grupo formado por Bradyrhizobium e UFSM L1.3, tendo como diferena o tempo de crescimento rpido a intermedirio (3 a 4 dias). As estirpes de Rhizobium e Sinorhizobium apresentaram agrupamento distintos com o grupo Bradyrhizobium e UFSM L1.3, tendo muito baixa similaridade. O comportamento das estirpes de Mesorhizobium foi intermediria aos grupos de estirpes tipo Bradyrhizobium (considerando UFSM L1.3) e Rhizobium, onde Mesorhizobium amorphae ACCC 19665, Mesorhizobium septentrionale SDW 014, Mesorhizobium loti NZP 2213 e Mesorhizobium chacoense CECT 5336 foram mais similares aos grupos de Bradyrhizobium e Azorhizobium, e Mesorhizobium plurifarum ORS 1032 apresentou maior similaridade com Rhizobium e Sinorhizobium (Figura 8). O gnero Mesorhizobium foi proposto para agrupar bactrias que apresentavam caractersticas que eram comuns aos gneros Rhizobium e Bradyrhizobium (YOUNG, 1996). Todas as estirpes tipo do gnero Rhizobium apresentaram 95% de similaridade com Sinorhizobium, com exceo de Rhizobium undicula ORS 992. A distino destes dois gneros s possvel com testes de taxonomia polifsica, como os realizados por Chen et al. (1988) e por de Lajudie et al. (1994). A colorao creme apresentada pelo isolado de rizbio UFSM L1.3 no caracterstico do gnero Bradyrhizobium. Segundo o Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, o gnero Bradyrhizobium apresenta colnias opacas, eventualmente translcidas ou brancas (HOLT et al., 1994). No entanto, esta colorao j foi descrita para estirpes de Bradyrhizobium isoladas de Sitrato na Amaznia e de Accia no Kenia (LIMA et al., 2005; ODEE et al., 1997). O gnero Bradyrhizobium vem sendo relatado como sendo simbionte a Lupinus. Barrera et al. (1997), estudando a diversidade de 41 bactrias que nodulam quatro espcies de Lupinus, encontraram alta relao filogentica com Bradyrhizobium elkanii. Vielma et al. (1999) caracterizaram fenotipicamente e a capacidade de nodulao e determinaram a produo de matria seca de 5 estirpes nativas de Bradyrhizobium sp. (Lupinus), isoladas de L. mutabilis e L. meridanus.

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Bottomley et al. (1994) estudaram a composio da populao de rizbio em pastagens nos Estados Unidos, avaliaram duas espcies de Lupinus. Estes autores encontraram trs grupos que apresentaram relao filogentica com B. japonicum e B. elkanii. Desta maneira, a estirpe de rizbio UFSM L1.3 pode ser alocada em Bradyrhizobium, por apresentar caractersticas culturais semelhantes a este gnero.

UFSM L1.3 Semia 938 CCBAU 10071 ATCC10324 2281 UFLA 1-100 ORS 571 ACCC 19665 SDW014 NZP2213 CECT 5336 ORS 992 ORS 1032 Lc57 HAMBI 1552 CCBAU71042 I66 SO2 CCBAU7190B H152 R602sp USDA 1844 CCBAU71623 100 80 60 40 20 0

Similaridade (%) Figura 9 Dendograma de similaridade baseado em caractersticas culturais entre um isolado de Lupinus albescens (UFSM L1.3), uma estirpe recomendada para Lupinus (SEMIA 938) e 21 estirpes-tipo de rizbio (Tabela 4).

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Tabela 7 Caractersticas culturais de um isolado de Lupinus albescens e de 22 estirpes de rizbio, Santa Maria, 2007.

Espcie UFSM L1.3 Bradyrhizobium sp. (SEMIA 938) Azorhizobium caulinodans Azorhizobium dobereinerae Bradyrhizobium japonicum Bradyrhizobium liaoningense Bradyrhizobium yuanmingense Mesorhizobium amorphae Mesorhizobium chacoense Mesorhizobium loti Mesorhizobium plurifarum Mesorhizobium septentrionale Rhizobium huautlense Rhizobium gallicum Rhizobium giardinii Rhizobium hainanese Rhizobium lossense Rhizobium mongolense Rhizobium undicula Rhizobium yanglingense Sinorhizobium arboris Sinorhizobium kostiense Sinorhizobium kummerowiae Sinorhizobium morelense

Caractersticas Culturais 1 6 6 3a4 3a4 7 7 a 10 7 7 7 3a5 2a3 7 a 10 2a4 2a3 2a3 3 3 3 1a2 3 2a4 2a4 2 3 2 Bsico Bsico Bsico Bsico Bsico Bsico Bsico cido cido cido cido cido cido cido cido cido cido cido cido cido cido cido cido cido 3 1 1 0,5 1 < 1,0 < 1,0 < 1,0 1 1a3 2a4 0,5 a 2 1 3 3 3 2,5 2,5 2,5 0,5 - 3 2,5 3 3 2,5 2 4 Creme Branca Creme Incolor Branca Branca Branca Incolor Branca Branca Branca Incolor Creme Branca Branca Creme Creme Branca Creme Branca Creme Creme Creme Creme 5 Baixa Baixa Baixa Baixa Baixa/Seca Baixa Baixa Mdia Mdia Mdia Mdia Mdia Alta Alta Alta Alta Alta Alta Alta Alta Alta Alta Alta Alta

1: Tempo, em dias, para a visualizao das colnias; 2: Alterao do pH do meio; 3: Dimetro da colnia (mm); 4: Colorao das colnias; 5: Produo de goma. ORS 571: Azorhizobium caulinodans (DREYFUS et al.; 1988); UFLA 1-100: Azorhizobium dobereinerae (MOREIRA et al.; 2006); ATCC10324: Bradyrhizobium japonicum (JORDAN et al.; 1984); 2281: Bradyrhizobium liaoningense ( XU et al.; 1995); CCBAU 10071: Bradyrhizobium yuanmingense (YAO et al.; 2002); ACCC 19665: Mesorhizobium amorphae (WANG et al.; 1999); CECT 5336: Mesorhizobium chacoense (VELAZQUEZ et al.; 2001); NZP2213: Mesorhizobium loti (JARVIS et al.; 1997); ORS 1032: Mesorhizobium plurifarum (de LAJUDIE et al.; 1998b); SDW014: Mesorhizobium septentrionale (GAO et al.; 2004); R602sp: Rhizobium gallicum (ARMAGER et al.; 1997); H152: Rhizobium giardinii (ARMAGER et al.; 1997); I66: Rhizobium hainanese (CHEN et al.; 1997); CCBAU7190B: Rhizobium lossense (WEI et al.; 2003); CCBAU71623: Rhizobium yanglingense (TAN et al.; 2001); SO2: Rhizoibum huautlense (WANG et al.; 1998); USDA 1844: Rhizoibum mongolense (van BERKUN et al.; 1998); ORS 992: Rhizobium undicula (de LAJUDIE et al.; 1998);HAMBI 1552: Sinorhizobium arboris (NICK et al.; 1999); CCBAU71042: Sinorhizobium kummerowiae (WEI et al.; 2002); LC57: Sinorhizobium morelense (WANG et al.; 2002).

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4.4 Caracterizao fisiolgica

A capacidade de crescer em diferentes pH, concentraes de NaCl e temperatura permitiu a diferenciao das estirpe de rizbio UFSM L1.3 e SEMIA 938 (Tabela 8). As duas estirpes avaliadas apresentaram crescimento em meio lquido entre os pH 4,0 a 8,0, no entanto, uma menor turbidez no meio de cultura foi observado para UFSM L1.3 quando inoculado em meio mais cido (pH 4,0) e mais alcalino (pH 8,0), no ocorrendo crescimento em pH 9,0 e 10,0. Segundo Moreira et al. (1994), estirpes isoladas de solos cidos mostram-se mais adaptadas a condies de pH mais baixo em meio de cultura do que isolados de solos mais bsicos. No entanto, alguns autores vm relatando que a concentrao de Alumnio nos solos pode ser um fator mais significante na sobrevivncia dos rizbios em solos cidos (HARA & OLIVEIRA, 2004). Os solos em processo de arenizao apresentam pH prximo a 5,0 tendo teores de alumnio de at 0,5 cmolc L-1 e com uma saturao por Al de 70% (ROVEDDER, 2003). Desta maneira, indicado que as estirpes de rizbio selecionadas sejam adaptadas a esta condio de meio. As duas estirpes diferiram na capacidade de crescer em diferentes concentraes de NaCl, onde UFSM L1.3 apresentou resultado positivo somente na concentrao de 0,1%. A capacidade de crescer em concentraes mais altas de NaCl observada geralmente para estirpes de crescimento rpido, devido a maior produo de polissacardeos extracelulares que envolvem as clulas bacterianas, diminuindo o contato com o meio e proporcionando maior resistncia da clula ao efeito osmtico (El SHEIKH, 1988; ODEE et al, 1997). O efeito de salinidade no relatado nos ncleos de arenizao, sendo esta provavelmente uma caracterstica no limitante para o uso de UFSM L1.3 na inoculao de L. albescens.

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Tabela 8 Crescimento de duas estirpes de rizbio em diferentes pH, concentraes de NaCl e temperatura em meio lquido LMA. Santa Maria, 2007.Caracterstica Fisiolgica pH 4 5 6 7 8 9 10 NaCl (%) 0,1 0,5 1,0 5,0 10,00 Temperatura (C) 28 32 37 40 UFSM L1.3 +/+ + + +/+ + + SEMIA 938 + + + + +/+ + + + -

+: crescimento positivo; -: crescimento negativo; +/-: pouca turbidez

Rovedder (2003), avaliou a temperatura do solo em diferentes profundidades em reas com ocorrncia de areal, registrando temperaturas de 22C de 0 a 3 cm de profundidade no ms de maio de 2002. A temperatura pode afetar estdios importantes da infeco, formao e funo dos ndulos, no entanto, estes efeitos podem variar de acordo com a espcie hospedeira e microsimbionte (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). Desta maneira, a estirpe de rizbio UFSM L1.3, que apresentou crescimento e