Caracterização e estudos de expressão dos genes que codificam oxalato

descarboxilase e formato desidrogenase dependente de NAD+ no fungo Crinipellis

perniciosa.

Aluno: Bruno Vaz de OliveiraOrientador: Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães PereiraCo-orientadora: Johana Rinconez Pérez

Introdução

• Oxalato: composto intermediário do metabolismo de carboidratos

• Geralmente encontrado na forma de um sal de cálcio ou magnésio, visto que é um quelante de cátions bivalentes.

Na Vassoura-de-bruxa

• Ceita et al 2005– Plantas infectadas pelo fungo apresentaram,

inicialmente, um aumento no número de cristais de oxalato quando comparadas com plantas sadias;

– após cerca de 36 dias os cristais de oxalato apresentavam significativa redução e após 45 dias os cristais praticamente desapareceram.

– Tal consumo dos cristais de oxalato foi relacionado à produção de peróxido de hidrogênio, o qual se concentra ao redor destes cristais.

Na Vassoura-de-bruxa

• O oxalato poderia ser aproveitado pela planta para gerar EROs, as quais estariam envolvidas na sinalização intracelular que culminaria na morte celular programada da vassoura verde

• Cacaueiros resistentes à Vassoura-de-bruxa não apresentam a formação de cristais de oxalato, contrastando com a presença dos mesmos em plantas suscetíveis.

Na Vassoura-de-bruxa

Sclerotinia sclerotiorum

• Ascomiceto• Homotálico• Baixa especificidade de hospedeiro

– Soja– Feijão– Ervilha– Canola– Girassol– Tomate– Batata

www.potatodiseases.org

Oxalato durante o processo infeccioso: várias funções

Modelo de infecção por S. sclerotiorum

Sintomas

• Folhas murchas• Necrose• Podridão “úmida”• Micélio branco • Esclerótios

Pesq. agropec. bras., Brasília, v.34, n.6, p.1101-1106, jun. 1999

Voltando ao oxalato...

Fator de patogenicidade essencial

Fungos mutantes para a produção de oxalato incapazes de infectar hospedeiros

E se a planta fosse capaz de degradar o oxalato produzido pelo fungo???

Tomate e Tabaco Transgênicos

• Expressão de uma OXDC do fungo Flammulina velutipes em plantas de tomate e tabaco

Na Vassoura-de-bruxa

• Inspeção do genoma de Crinipellis perniciosa revelou a presença de um gene com similaridade a uma OXCD de Flammulinna velutipes

• Análise de ESTs obtidos a partir de bibliotecas cDNA acusou um alto nível de expressão de um gene com similaridade a uma formato desidrogenase dependente de NAD+

Objetivos

• Caracterização dos genes que codificam a oxalato descarboxilase (OXDC) e a formato desidrogenase dependente de NAD+ (FDH-NAD) – obtenção e análise de sua seqüência completa – análise de sua expressão em diferentes condições

de cultivo in vitro

Justificativa

• Evidências sugerindo o envolvimento do oxalato com a fitopatogenicidade por C. perniciosa

• Superexpressão do gene que codifica a formato desidrogenase dependente de NAD+ nas biliotecas do micélio crescido em extrato de cacau

• Ambas as vias estão de fato relacionadas?? • Possível desenvolvimento de cacau transgênico

resistente a C. perniciosa, expressando a oxalato descarboxilase.

Resultados - Sequenciamento

Resultados - Sequenciamento

Teste dos primers para os genes OXDC e FDH. 1) Ladder lamda; 2) Controle (primers para beta-actina); 3) Primers OXDC 1 e OXDC 3; 4) Primers OXDC1 e OXDC 4; 5) Primers FDH 1 e FDH 2; 6) Primers FDH 1 e FDH 4; 7) Primers FDH 2 e FDH 3; 8) Primers FDH 2 e FDH 4.

Resultados - Sequenciamento

Resultados - Sequenciamento

Resultados - Sequenciamento

Clones - OXDC

Clones - FDH

Resultados - Sequenciamento

Resultados - Sequenciamento

Resultados - Sequenciamento

PCR – Fragmentos da OXDC

Resultados - Sequenciamento

PCR – Fragmentos da FDH

• Purificação dos fragmentos• Reação de sequenciamento 3

tentativas sem sucesso• Clonagem no plasmídeo PGEM Teasy

e nova tentativa de sequenciamento • Seqüência a partir do cDNA

Resultados - Sequenciamento

Resultados

1. Meio Mínimo2. Oxalato 1 mM3. Oxalato 10 mM4. Formato 5 mM5. Formato 50

mM6. Formato 100

mM7. Metanol 0,5%8. Metanol 1 %9. Metanol 2%

Resultados

1) Meio mínimo; 2) oxalato 1 mM; 3) Indução com oxalato 50 mM por 2 horas; 4) formato 50 mM; 5) metanol 2%, 6) Peróxido 1 mM; 7) Extrato de cacau susceptível a C. perniciosa; 8) Extrato de cacau resistente a C. perniciosa;

Próximos passos

• Nova extração de RNA

• Hibridização do RNA com as sondas dos genes OXDC e FDH

• Sequenciamento a partir do plasmídeo PGEM Teasy

• Caracterização da oxaloacetase