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IBMR – LAUREATE INTERNATIONAL UNIVERSITIES

Letícia Lopes Cabral Guimarães da Fonseca

CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA CLÁSSICA E

MOLECULAR (FISH) EM PACIENTES COM SUSPEITA

CLÍNICA DE SÍNDROME DE PRADER-WILLI

Rio de Janeiro

2017

1

LETÍCIA LOPES CABRAL GUIMARÃES DA FONSECA




Trabalho de conclusão de curso apresentado ao

Curso de Biomedicina da IBMR/Laureate

International Universities, como parte dos

requisitos para obtenção do Título de Bacharel

em Biomedicina

Orientadora: Dra. Elenice Ferreira Bastos

Orientador: Dr. Maurício Cupello Peixoto

Rio de Janeiro

2017

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LETÍCIA LOPES CABRAL GUIMARÃES DA FONSECA




Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado como requisito para obtenção do

grau de Bacharel em Biomedicina do Instituto

Brasileiro de Medicina de Reabilitação – Uni-

IBMR.

Aprovada em: 16 de Novembro de 2017

BANCA EXAMINADORA

Profª. Glaucia Vilar Pereira

Prof. César Carriço da Silva

3

Aos meus pais, Leila e Lenilson, por todos os

sacrifícios que fizeram por mim e ainda fazem,

desde antes de saberem da minha existência e

por me apoiarem em todos os momentos;

Ao meu irmão Leoni, que por mais que eu o

perturbasse, como uma boa irmã deve fazer,

sempre se mostrou muito orgulhoso das

minhas conquistas e abriu mão do que queria

para me ajudar, como um irmão maravilhoso

deve ser;

À minha filha Leila, que é o maior presente

que poderia receber e que, embora não

compreenda agora, me deu forças para seguir

em frente.

4

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora Elenice, que me forneceu grande conhecimento, não somente no

campo da citogenética e soube me ensinar com muita paciência, mesmo quando apliquei a

técnica de bandeamento GTG em várias lâminas sem analisar se o tempo de tripsina estava

bom, em um dos primeiros dias do estágio.

Ao meu orientador Maurício, que eu apelidei carinhosamente de Malévolo, por ter

aceitado me orientar mesmo tendo 1001 funções na instituição e fora dela, sempre me

ajudando e me acalmando quando eu achava que não daria tempo de entregar no prazo ou

como deveriam ser aplicadas algumas regras no trabalho de conclusão de curso.

Aos meus colegas do Instituto Fernandes Figueira Carlos (que me ajudou demais,

tanto no laboratório, quanto fora dele), Ingrid (que embora eu tenha convivido pouco tempo,

se tornou uma ótima amiga), Vera (por quem tenho um carinho muito grande), Lúcia (que

sempre me ajudava quando eu precisava), Anna (que sempre me ofereceu ajuda e me fez

sentir melhor, mostrando que posso ser biomédica e mãe mesmo estando longe da prole), Cris

(com quem não convivi muito, mas que também sempre se colocou à disposição quando eu

precisasse), Leo (com quem tive o prazer de trabalhar, mesmo indiretamente, uma vez que

meu TCC está relacionado ao seu projeto), a Dra. Letícia Guida pela oportunidade de

participar do projeto de Prader e Dr. Juan Llerena (que, por mais que eu não tivesse tanto

contato, fez com que eu tivesse mais confiança quanto ao meu conhecimento).

5

Do or do not. There is no try. (YODA, 1980)

6

RESUMO

A Síndrome de Prader-Willi (SPW) é uma doença genética multisitêmica caracterizada

por hipotonia infantil, obesidade, mãos e pés pequenos, criptorquidismo, hiperfagia,

envolvida com obesidade mórbida e déficit intelectual ocasionalmente. É causada por

alterações epigenéticas envolvendo a região 15q11.2 que leva à ausência da expressão gênica

do cromossomo paterno. Essas alterações podem ser consequências de pequenas ou grandes

deleções da região 1511.2-q13 do cromossomo paterno, dissomia uniparental materna ou

mutações monogênicas do centro de imprinting (CI). Apesar de possuir uma característica

clínica sugestiva, o diagnóstico genético é essencial. Atualmente, diferentes metodologias têm

sido aplicadas, a partir da Citogenética clássica (convencional e bandeamento GTG de alta

resolução), técnica de Hibridização in situ por fluorescência (FISH) utilizando sondas de

regiões específicas, assim como técnicas genômicas como Amplificação Multiplex de Sondas

Dependente de Ligação (MLPA), e métodos moleculares para detecção de alterações no

centro de imprinting. Todavia, nem todas as metodologias estão disponíveis nos centros

diagnósticos, especialmente do Sistema Público de Saúde (SUS). Identificar o impacto da

análise citogenética no diagnóstico dos pacientes encaminhados por suspeita clínica da

síndrome de Prader Willi no âmbito do SUS. Todos os 30 pacientes foram clinicamente

avaliados e encaminhados ao Departamento de Genética Médica (IFF/FIOCRUZ). Amostras

de sangue periférico foram enviadas para estudo de Citogenética clássica (bandeamento GTG)

e FISH (com as sondas SNRPN e/ou GABRB3), de acordo com os protocolos apropriados. O

cariótipo final foi estabelecido de acordo com o ISCN, 2016. A extração de DNA e estudo de

metilação foram feitos de acordo com o padrão. De todas as amostras investigadas, a análise

do bandeamento GTG foi feita 27 delas. Quatro apresentaram padrão sugestivo de deleção,

que foi confirmado por FISH, além de mais um detectado por esta técnica, considerando o

nível de resolução observado. Dezesseis casos foram simultaneamente avaliados pelas

técnicas GTG, FISH e análise de metilação. O estudo de metilação diagnosticou 43,75% dos

casos, sendo que 71,43% destes casos forem identificados por FISH como causadas por

deleção, próximo do número encontrado na literatura, em que a deleção pode ocorrer em 75%

dos casos. A análise citogenética obteve um pequeno impacto na identificação da etiologia da

SPW, corroborando para a existência de evento epigenético como a causa etiológica mais

provável.

Palavras-chave: SÍNDROME DE PRADER-WILLI. FISH. DIAGNOSTICO. IMPRINTING

GENÔMICO.

7

ABSTRACT

Prader-Willi Syndrome (PWS) is a multisystemic genetic disease characterized by

childhood hypotonia, obesity, small hands and feet, cryptorchidism, hyperphagia, evolving to

morbid obesity and occasionally intellectual deficit. It is caused by epigenetic changes

involving 15q11.2 region that lead to absence of gene expression of paternal genetic

contribution. These changes can be consequence of small or large deletions at 15q11.2-q13

region of paternal chromosome, maternal uniparental disomy or monogenic mutations at the

imprinting center (IC). Despite having a suggestive clinical characterization, genetic diagnosis

is essential. Nowadays, different methodologies have been applied, from classical cytogenetic

(conventional and high resolution GTG banding), Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)

technique using region-specific probes, as well as genomic techniques such as Multiplex

ligation-dependent probe amplification (MLPA), and molecular methods for detection of

imprinting genomic defects. However, not all methodologies are available in the main

diagnostic centers, especially those linked to public health system. This study aims were

identify the cytogenetics analysis impact on the pacient’s diagnosis whom were forwarded by

SUS about PWS clinical suspect. All the 30 patients were clinically evaluated and followed

up at the Medical Genetics Department (IFF/FIOCRUZ). Peripheral blood samples were sent

to perform the classical cytogenetic study (GTG banding) and FISH (with SNRPN and/or

GABRB3 probes), according to appropriate protocols. The final karyotype is established

according to ISCN, 2016. The DNA extraction and methylation study were performed by

pattern. From the total of investigated samples, the GTG analysis was performed in 27 of

them. Four presented a pattern suggestive of deletion, which were confirmed by FISH, and

one more case identified by this technique, considering the level of resolution observed.

Sixteen cases were simultaneously evaluated by, GTG, FISH and methylation techniques. The

methylation study confirmed the diagnosis in 43,75% of the cases, 71,43% of those cases was

identified by FISH as a deletion cause, close to the number finded on the literature, this

detection can reach 75%. The cytogenetics analysis got a small impact on PWS etiology

identification, contributing to the existence of an epigenetic event as the more probable

etiological cause.

Keywords: PRADER-WILLI SYNDROME. FISH. DIAGNOSTIC. GENOMIC

IMPRINTING

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1.Esquema das técnicas de obtenção de cromossomos e coloração....................... 14

Figura 2.Esquema da sonda utilizada para FISH –Sonda SNRPN.................................... 24

Figura 3.Esquema da sonda utilizada para FISH –Sonda UBEA3A................................. 24

Figura 4.Análise de bandeamento GTG apresentando região 15q11. 2 normal................ 27

Figura 5.Análise em alta definição sugerindo deleção da região 15q11. 2 l..................... 28

Figura 6.Análise de FISH normal...................................................................................... 28

Figura 7.Análise de FISH deleção..................................................................................... 29

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Casos investigados pelas técnicas de bandeamento GTG e FISH........................ 27

Tabela 2. Casos investigados pelas técnicas de citogenética bandeamento GTG e FISH,

e pelas técnicas de metilação PCR e HRM.

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CGH – Do inglês Comparative genomic hybridization - Hibridização genômica comparativa

DNA – Do inglês desoxyribonucleic acid - Ácido desoxirribonicleico

FISH – Do inglês Fluorescent in situ hibridization - Hibridização in situ por fluorescência

HRM – Do inglês High Resolution Melting - Análise da curva de dissociação em alta

resolução.

ISCN – Do inglês International System for Human Cytogenomic Nomenclature - Sistema

internacional de nomenclatura para a citogen humana

Mb – Megabases

MLPA – Do inglês Multiplex ligation-dependent probe amplification - Multiplex de sonda

dependente de ligação

MS-MLPA – Do inglês Methylation-specific multiplex ligation-dependent probe

amplification - Multiplex de sonda dependente de ligação sensível a metilação

PCR – Do inglês Polymerase chain reaction - Reação em cadeia da polimerase

SA – Síndrome de Angelman

SPW – Síndrome de Prader-Willi

SUS – Sistema Único de Saúde

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 12

1.1 CITOGENÉTICA CLÁSSICA ................................................................................ 12

1.2 CITOGENÉTICA MOLECULAR............................................................................ 15

1.2.1 Hibridização In Situ por Fluorescência - FISH................................................. 15

1.3 ALTERAÇÕES CROMOSSÔMICAS..................................................................... 16

1.3.1 Alterações numéricas .......................................................................................... 16

1.3.2 Alterações estruturais ......................................................................................... 16

1.4 SÍNDROME DE PRADER-WILLI ........................................................................ 17

2 OBJETIVOS .............................................................................................................. 20

2.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................ 20

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 20

3 METODOLOGIA ..................................................................................................... 21

3.1 TÉCNICA DE OBTENÇÃO DE CROMOSSOMOS METAFÁSICOS ................. 21

3.2 OBTENÇÃO DE CROMOSSOMOS PROMETAFÁSICOS A PARTIR DE

SANGUE PERIFÉRICO

22

3.2.1 Implante das culturas .......................................................................................... 22

3.2.2 Término das culturas .......................................................................................... 22

3.3 PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS ........................................................................... 22

3.4 TÉCNICAS DE COLORAÇÃO E BANDEAMENTO ........................................... 23

3.4.1 Técnica de bandeamento GTG ........................................................................... 23

3.5 ANÁLISE CROMOSSÔMICA CLÁSSICA............................................................ 23

3.6 TÉCNICA DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU POR FLUORESCÊNCIA (FISH) ....... 23

4 RESULTADOS .......................................................................................................... 26

5 DISCUSSÃO .............................................................................................................. 30

6 CONCLUSÕES ........................................................................................................ 33

REFERÊNCIAS........................................................................................................... 34

12

1 INTRODUÇÃO

1.1 CITOGENÉTICA CLÁSSICA

A primeira descrição de estruturas parecidas com núcleo foi feita sobre células vegetais

em 1840 pelo botânico Nageli, recebendo o nome de “citoblastos transitórios”, posteriormente

sendo compreendidas como cromossomos (Hare e Singh, 1979). Porém, as primeiras imagens

de cromossomos humanos foram publicadas em 1882 pelo citologista Flemming, que também

denominou a porção corável do núcleo como cromatina e foi o primeiro a utilizar o termo

mitose para o processo de divisão celular (Maluf e Riegel, 2011).

Em 1888, uma técnica de coloração foi desenvolvida por Waldeyer, permitindo que

estruturas fossem melhor caracterizadas, sendo denominadas como cromossomos, além disso,

foi nessa época que muitos cientistas começaram a cogitar a possibilidade de que os

cromossomos transportam os determinantes da hereditariedade. Por volta do ano de 1900,

Sutton (e Boveri de forma independente) desenvolveram a teoria cromossômica da herança e

denominou o estudo dos cromossomos como citogenética. Depois disso, vários estudos foram

feitos em relação aos cromossomos e a quantidade que a espécie humana possui. Alguns

desses estudos tiveram resultados não condizentes com a realidade, como os que apresentaram

que os humanos, caracterizados como normais, possuem 48 cromossomos. Porém, esses

resultados puderam ser corrigidos, por volta de 1952, depois que foi percebido por Hsu que as

metáfases ficam mais espalhadas quando são lavadas com uma solução hipotônica antes do

processo de fixação, e não com uma solução isotônica como era feito até então. Isso se dá,

pois, devido ao processo de osmose que faz com que as membranas celulares aumentem e os

cromossomos sejam separados, facilitando sua visualização. Em 1955, Ford e Hamerton

modificam a parte do pré-tratamento celular desta técnica, tratando-as com colchicina para

que ocorresse o bloqueio do fuso mitótico, fazendo com que as células permanecessem na

metáfase mitótica. Em janeiro de 1956, Tijo, que havia feito estágio no laboratório de Ford e

Hamerton, juntamente com Levan otimizaram o método colchicina/hipotônica e expuseram

que a espécie humana possui 23 pares de cromossomos, o que foi confirmado por Ford e

Hamerton posteriormente (Maluf e Riegel, 2011).

Devido tais descobertas, um protocolo de cultura celular foi estabelecido, utilizando

leucócitos em mitose, obtidos a partir do sangue periférico, apresentando cromossomos

metafásicos ou prometafásicos (Moorhead et al, 1960 e Sharkey et al, 2005). O material passa

por tratamentos, cultura celular, até que as células cheguem à fase de divisão celular desejada,

13

para que seja empregada a técnica de bandeamento que cora os cromossomos (Figura 1)

(Borges-Osório e Robinson, 2013)

Algumas técnicas de bandeamento para identificação de cromossomos podem ser

empregadas, como: Bandeamento QFQ, que utiliza a quinacrina mostarda ou compostos

relacionados, padrão de bandas R, em que os cromossomos recebem um tratamento especial

antes do processo de coloração e apresentam um padrão de banda contrário ao de bandas Q,

padrão de bandas C, que cora a região do centrômero de cada cromossomo e de outras regiões

que possuem a heterocromatina constitutiva (Nussbaum, et al, 2009), padrão de banda NOR,

em que as regiões organizadoras de nucléolos são coradas e a padrão de bandas G ou

bandeamento GTG (Bandeamento G combinado com Tripsina e Giemsa), que utiliza a

tripsina, para que ocorra da desnaturação das proteínas do cromossomo e Giemsa, que fará

com que os cromossomos apresentem bandas claras, que possuem as bases nitrogenadas

guanina e citosina e são pouco condensadas, e escuras, que possuem timina e adenina e são

mais condensadas. A técnica de bandeamento GTG é considerada padrão ouro para a análise

citogenética clássica de rotina, pois faz com que as bandas do cromossomo fiquem mais

visíveis, para que seja feita a identificação do cromossomo e as possíveis alterações que

podem ocorrer (Regateiro, 2007 apud. Rossetto, 2015), sendo utilizada na maioria dos

laboratórios do mundo. Posteriormente o material é analisado ao microscópio e algumas

metáfases são selecionadas para a montagem do cariograma (cariótipo) (Figura 1) (Borges-

Osório e Robinson, 2013). Esta técnica avaliativa possui a resolução em torno de 3-5 Mb de

DNA dependendo do método utilizado (Sharkey et al, 2005).

14

Figura 1 – Esquema das técnicas de obtenção de cromossomos e coloração. (a) cultura celular; (b)

separação; (c) preparação da lâmina; (d) coloração; (e) bandeamento e análise. Fonte: Adaptado de

Genética Humana 3ª edição

15

1.2 CITOGENÉTICA MOLECULAR

O desenvolvimento das técnicas de bandeamento cromossômico (citogenética clássica)

possibilitou a identificação de anomalias cromossômicas estruturais como deleções,

duplicações, inversões e translocações, entretanto, para alterações menores que 5Mb (Liehr,

2008 e Smith & Hung, 2017) é necessário que técnicas mais sensíveis sejam empregadas,

como a técnica de Hibridização In Situ por Fluorescência (FISH) (Liehr, 2008).

1.2.1 Hibridização In Situ por Fluorescência – FISH

Muitas técnicas de histoquímica foram desenvolvidas ao longo do tempo, contudo eram

utilizados vários tipos de corantes naturais que possuíam afinidade para diversas moléculas,

dificultando assim a diferenciação das estruturas. Contudo, no início da década de 1940, os

anticorpos foram combinados com fluorocromos permanecendo com a especificidade de

ligação ao epítopo, sendo possível detectar moléculas específicas durante a interação de

antígeno e anticorpo (Levsky e Singer, 2003).

Por volta de 1960, ocorreram as primeiras hibridações in situ, porém não eram

fluorescentes, e utilizavam sondas marcadas com radioisótopos (Levsky e Singer, 2003). No

final da década de sessenta, Joe Gall e Mary-Lou Pardue publicaram o primeiro trabalho

relacionado à hibridização in situ, descrevendo a hibridização de sondas de RNA no DNA de

células (Joe Gall e Mary-Lou Pardue, 1969 apud. Beesley, 2001). Aproximadamente sete anos

mais tarde, foi feita a primeira detecção relacionada à fluorescência dependente de anticorpos

de híbridos de ácido nucleico, sendo substituída logo depois por sondas de ácido nucleico

fluorescente (Levsky e Singer, 2003).

Em 1980, foi demonstrado que sequência de cópia única de genes individuais podem ser

detectados por hibridização in situ. Além disso, técnicas de sondas de DNA não radioativas

ganharam destaque. Mesmo assim, métodos que utilizavam químicos como

acetilaminofluorescência ou mercúrio, independentemente de não serem radioativos, eram

considerados perigosos. Já em 1986 um estudo demonstrou uma sinalização não isotópica

com biotina (uma substância mais segura) hibridizando a sonda no cromossomo humano e

detectada por marcação fluorescente. Tal técnica recebeu o nome de Hibridização In Situ por

Fluorescência (FISH – Fluorescent in situ hibridization) (Beesley, 2001).

A técnica FISH pode ser considerada como o avanço mais significativo da citogenética

clínica. Utilizando fragmentos de DNA incorporados a nucleotídeos acoplados a corantes

16

fluorescentes como sonda e expondo-os à luz ultravioleta para a visualização do material

presente na lâmina, o FISH tem como objetivo identificar alguma alteração envolvendo

determinada região de um cromossomo específico (Gersen e Keagle, 2008). Com isso, esta

técnica tem sido cada vez mais aplicada na rotina laboratorial, uma vez que pode ser utilizada

a diversas situações, desde aberrações complexas a estudos de células interfásicas. (Smeets,

2004).

1.3 ALTERAÇÕES CROMOSSÔMICAS

Para um desenvolvimento correto, é necessário que o número e estrutura dos

cromossomos estejam normais, uma vez que qualquer alteração nestes dois fatores pode

alterar a expressão gênica, já que os genes estão contidos nos cromossomos, dando origem a

um indivíduo anormal ou fenotipicamente inviável (Maluf e Riegel, 2011).

1.3.1 Alterações numéricas

Cariótipos que possuem a quantidade de cromossomos tanto maiores quanto menores

que 46 cromossomos recebem o nome de heteroplóide. Caso essa alteração seja um múltiplo

exato do número haploide de cromossomos, pode implicar em efeitos graves no indivíduo,

pois cada cromossomo possui vários genes. Seguindo este raciocínio, é possível compreender

que poucas alterações numéricas são compatíveis com a vida, se ocorrerem em todas as

células (Maluf e Riegel, 2011).

1.3.2 Alterações estruturais

As alterações que envolvem a estrutura do cromossomo podem ser divididas em

balanceadas e não balanceadas. As alterações balanceadas são as que não interferem na

quantidade de material genético, ou seja, não ocorrem perda nem ganho, havendo somente

uma redistribuição do material por quebra ou rearranjo (Maluf e Riegel, 2011).

Dentro do grupo de alterações balanceadas é possível encontrar a inserção (segmento

cromossômico encontrado em outro cromossomo), translocação recíproca (segmento

cromossômico substituído por um segmento de outro cromossomo), translocação

robertsoniana (dois cromossomos acrocêntricos perdem o braço curto e seus centrômeros se

unem ligando os braços longos), translocação de braço inteiro (as quebras ocorrem no

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centrômero, assim tornando possível a ligação do braço curto de um cromossomo com o braço

longo de outro ou a ligação entre dois braços curtos ou dois braços longos), translocação

complexa (similar a translocação recíproca, entretanto envolvendo três cromossomos ou

mais), inversão paracêntrica (duas quebras no mesmo braço do cromossomo e a parte inicial

do segmento troca de lugar com a final, fazendo com que haja uma rotação de 180º), inversão

pericêntrica (duas quebras e uma rotação de 180º do segmento cromossômico, porém as

quebras estão em braços diferentes, fazendo com que a posição do centrômero seja alterada,

entre outras alterações) entre outras alterações (Maluf e Riegel, 2011).

Quanto às alterações não balanceadas, o indivíduo apresenta maior ou menor quantidade

de material genético. Entre as causas podemos encontrar duplicação (um segmento

cromossômico é visto duas vezes no mesmo cromossomo), isocromossomo (um dos braços do

cromossomo não está presente e existe a duplicação do outro), anel cromossômico (ocorre

uma quebra no braço curto e outra no braço longo do cromossomo, passando a não existir as

porções terminais, assim as extremidades se ligam fazendo com que o cromossomo passe a

ter uma forma circular) e deleção (o cromossomo perde um segmento de material genético)

(Maluf, Riegel, 2011), e é a causa da síndrome estudada neste trabalho.

1.5 SÍDROME DE PRADER-WILLI

A Síndrome de Prader-Willi (SPW), que possui a incidência de 1:15.000 e prevalência

de 60:1.000.000 (Damiani, 2008) é uma doença genética que se apresenta de forma

multissistêmica (Cassidy et al, 1997) descrita pela primeira vez em 1956 pelos cientistas

suíços Prader, Labhart e Willi (Prader et al, 1956). Esta síndrome foi a primeira a ser

relacionada ao imprinting genômico e causada por uma falha em determinada região do

cromossomo 15 de origem paterna (Donaldson et al, 1994) ou dissomia uniparental materna

(Kim et al, 2016). É possível identificar o cromossomo e a região em que ocorre a mutação

devido ao padrão de bandas que o cromossomo em questão possui (Alberts, 2010), neste

trabalho foi utilizada a técnica de bandeamento GTG. No caso da SPW, a alteração ocorre na

sub-banda 13, da banda 1, da região 1, do braço longo (q) do cromossomo 15 (15q11-13)

(Angulo et al, 2016).

Em torno de 70% de pessoas com Síndrome de Prader-Willi possuem deleção na

região 15q11. 2-13 no cromossomo paterno, 25% apresentam dissomia uniparental materna,

menos de 5% tem uma alteração na sequência do centro de imprinting, e menos de 1% possui

um rearranjo estrutural cromossômico envolvendo a região 15q11.2-13 (Cassidy et al, 1997).

18

Este rearranjo estrutural relaciona-se também a uma outra síndrome, conhecida por Síndrome

de Angelman (SA), condição esta que é clinicamente distinta da SPW mas que, juntamente

com esta, foi essencial para os primeiros estudos relacionados ao mecanismo genético de

impressão (imprinting) genômica, a partir da descrição de genes (locados em 15q11.2-13) que

possuem expressão monoalélica e cujas ausências determinam o fenótipo clínico dependendo

da origem parental (Pina-Neto et al, 1997).

O imprinting genômico está relacionado à origem parental dos cromossomos e os

padrões de expressão diferencial, não ocorrendo alteração nas sequências de base do DNA. Os

genes que sofrem o imprinting possuem o alelo silenciado, ou seja, somente um alelo passa a

ser expresso. As síndromes de Prader-Willi e Angelman estão relacionadas ao imprinting

genômico, uma vez que estudos feitos em pacientes que apresentam estas síndromes tendo

como causa dissomia uniparental apresentam o gene silenciado pelo imprinting, não

ocorrendo a expressão gênica, levando a crer que a expressão estaria relacionada ao gene

ausente (Fridman et al, 1997, Maris & Trott, 2011).

O diagnóstico desta síndrome baseia-se em aspectos clínicos que mudam de acordo com

a idade do indivíduo, como hipotonia que costuma ocorrer durante a infância e deficiência no

desenvolvimento na adolescência e fase adulta (Holm, et al, 1993). Os principais sintomas da

Síndrome de Prader-Willi são letargia infantil, deficiência no crescimento, hipogonadismo,

aparência facial característica, hiperfagia podendo causar obesidade mórbida, se não

controlada, baixa estatura, fenótipo comportamental típico (Cassidy, et al, 2008), saliva

espessa, aumento da razão circunferência cabeça / tórax, genitália pouco desenvolvida tanto

em homens quanto em mulheres, criptorquidia frequente no caso masculino, mãos e pés

pequenos, lábio superior fino, boca voltada para baixo (Butler, et al, 2006). Quanto às

características endócrinas, os indivíduos apresentam baixa resposta do hormônio de

crescimento (hr GH) em testes de estimulação (Cassidy et al, 1997, Partsch, et al, 2000),

deficiência na secreção das gonadotrofinas LH e FSH e esteroides sexuais gonadais (Cassidy

et al, 2012), proteína-3 de ligação ao fator de crescimento IGF baixo (Talebizadeh & Butler,

2005.) e fator de crescimento insulina-like (IGF)-I baixo (Cassidy et al, 1997, Partsch et al,

2000).

A utilização do hormônio de crescimento (hr GH) nas crianças com SPW faz com que

ocorra a mudança da composição corpórea, a melhora da atividade física e da qualidade de

homocisteina. Porém é necessária uma avaliação da apneia do sono e permeabilidade das vias

aéreas, uma vez que o tratamento com hr GH pode fazer com que o padrão respiratório piore.

(Damiani, 2008). Para que o tratamento seja feito corretamente, o diagnóstico deve ser

19

complementado através do estudo dos cromossomos dos indivíduos (Damiani, 2008),

utilizando técnicas de citogenética como bandeamento GTG (Seabright, 1971) e técnica de

Hibridização In Situ por Fluorescência (FISH) (Bauman, et al, 1980), além de técnicas

moleculares baseadas em reação em cadeia da polimerase (PCR) como: hibridização

genômica comparativa (CGH), análise de microarranjos (microarray) e Amplificação

Multiplex de Sondas Dependente de Ligação (MLPA) sensível a metilação (MS-MLPA)

(Smith e Hung, 2017).

20

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Identificar o impacto da análise citogenética no diagnóstico dos pacientes

encaminhados por suspeita clínica da síndrome de Prader Willi no âmbito do SUS.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Caracterizar através da citogenética clássica todos os casos encaminhados por suspeita

clínica de SPW;

Aplicar a técnica FISH para caracterização de possíveis micro deleções e/ou outras

eventuais alterações crípticas envolvendo a região 15q11-13;

Traçar um perfil citogenético dos pacientes encaminhados por suspeita clínica das

síndromes de Prader-Willi.

21

3 METODOLOGIA

Todos os 30 casos investigados estão cadastrados e acompanhados pela equipe médica

coordenada pelo Dr. Juan Clinton Lleren Jr. no Ambulatório de Genética Médica do Instituto

Fernandes Figueira (IFF) –Fiocruz.

Este trabalho faz parte de um projeto intitulado “O PAPEL DO HORMÔNIO DO

CRESCIMENTO NA SÍNDROME DE PRADER-WILLI: ESTUDO DA REGULAÇÃO DA

EXPRESSÃO DE GH ATRAVÉS DA ESTRATÉGIA CRISPR/CAS9, RASTREAMENTO

NEONATAL E DIAGNÓSTICO MOLECULAR”, coordenado pela Dra. Letícia da Cunha

Guida e Dr. Juan Clinton Llerena Junior e registrado no Comitê de Ética do IFF/FIOCRUZ

sob o número 45767015.0.0000.5269.

3.1 TÉCNICA DE OBTENÇÃO DE CROMOSSOMOS METAFÁSICOS

O implante da amostra sanguínea foi feito em fluxo laminar, utilizando um tubo

cônico de 15 mL onde foram adicionados 6,0 mL de meio de cultura RPMI – 1640, 1,5 mL de

soro fetal bovino (cultilab), 0,2 mL de fitohemaglutinina (cultilab) e aproximadamente 1mL

de sangue total. Depois este tubo foi incubado na estufa a 37ºC por 72 horas, sendo que ao

completar 71 horas na estufa, em fluxo laminar, foram adicionados 45µl de colchicina

(Colcemid – Cultilab) em uma concentração de 10mg/mL e o material tornou a ser colocado

na estufa, a 37ºC, para completar o tempo, ou seja, permaneceu por mais 60 minutos. Quando

completaram 72 horas, o material foi centrifugado a 579g por 10 minutos (Centrífuga

FANEM – modelo 206 – Excelsa baby I), em temperatura ambiente. Quando a centrifugação

terminou, desprezou-se o sobrenadante, fazendo com que somente o pellet permanecesse no

tubo. Posteriormente adicionou-se 7,0 mL de solução de KCL hipotônica (0,075M) e então o

tubo voltou para estufa, onde permanecendo por 30 minutos a 37ºC.

Ao completar 30 minutos, a cultura foi retirada da estufa para ser feito o processo pré-

fixação. Adicionou-se 0,5 mL de fixador (metanol – ácido acético 3:1) ao tubo, e o material

foi centrifugado por 10 minutos a 579g. O sobrenadante foi desprezado após a centrifugação e

as células ressuspensas em 10 mL de fixador e depois o tubo tornou a voltar para a centrífuga,

10 minutos a 579g, este procedimento ocorreu mais duas vezes ou mais, em alguns casos, até

que o material se apresentasse límpido. As células foram ressuspensas em volumes menores

22

de fixador, cerca de 2 a 3 vezes o volume do pellet, para então serem feitas as lâminas

(Moorhead et al, 1960 modificada por Bender, 1965).

3.2 OBTENÇÃO DE CROMOSSOMOS PROMETAFÁSICOS A PARTIR DE SANGUE

PERIFÉRICO

3.2.1 Implante das culturas

Foi feita uma cultura de linfócitos de sangue periférico, da mesma forma que a

descrita anteriormente. Todavia, 02 horas antes do término da cultura foram adicionados

0,3mL de brometo de etídio (16mg/100 mL) e 15 minutos antes do término da cultura,

adicionou-se 0,05mL de colchicina (0,8µg/mL), levando a cultura para a estufa a 37ºC até

terminar o horário (Moorhead et al, 1960 modificada por Bender, 1965).

3.2.2 Término das culturas

O término das culturas seguirá o protocolo padrão de obtenção de cromossomos

metafásicos, como citado no subitem 3.1.

3.3 PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS

Depois do término da cultura as lâminas foram feitas utilizando uma pipeta Pasteur.

Com a suspenção do material (pellet celular mais aproximadamente três vezes o seu volume

de fixador metanol-ácido acético 3:1) foram pingadas duas gotas em lâminas de vidro

contendo lençol d’água, com o auxílio de uma pinça para segurar a lâmina. As lâminas foram

devidamente identificadas, secas em placa aquecida a 50°C, e observadas em microscópio

invertido para análise do índice mitótico e qualidade das metáfases, e depois foi feito o

bandeamento (Moorhead et al, 1960 modificada por Bender, 1965).

23

3.4 TÉCNICAS DE COLORAÇÃO E BANDEAMENTO

3.4.1 Técnica de bandeamento GTG

As lâminas contendo o material permaneceram em temperatura ambiente para que

envelhecessem, sem definição de tempo, contudo a maioria esperou cerca de cinco dias para

serem bandeadas. Foi feita uma solução de tripsina (100mg de tripsina em 100 mL de tampão

Dulbeco – 0,8g de Nacl; 0,2g de Kcl; 0,2g de KH2PO4; 1,44g de Na2HPO4-2H2O em

1000mL de água destilada) na qual as lâminas permaneceram durante 10 a 14 segundos à

temperatura ambiente, porém esse tempo pode variar dependendo do número de dias que a

lâmina foi feita. Ao retirar as lâminas da solução de tripsina, foram lavadas em tampão fosfato

(6,808 g de KH2PO4; 0,882g de NaOH em 1000 mL de água destilada, pH 6,8), para que a

ação da tripsina fosse interrompida, depois participaram da etapa de coloração,

permanecendo, durante 4 minutos e 20 segundos em solução de Giemsa a 3% ou 4% em

solução de tampão fosfato citado anteriormente, e por fim lavadas em água destilada, secas ao

ar e observadas sob microscópio óptico (Seabright, 1971).

3.5 ANÁLISE CROMOSSÔMICA CLÁSSICA

Os cromossomos que passaram pela técnica de bandeamento GTG foram analisados

sob objetiva de imersão em microscópio óptico, e classificados de acordo com o Sistema

Internacional de Nomenclatura para a Citogenética Humana (ISCN – 2016) e o cariótipo

montado com a utilização do programa de cariotipagem LUCIA Cytogenetics - Karyo™

(Laboratory Imaging).

3.6 TÉCNICA DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU POR FLUORESCÊNCIA (FISH)

A técnica de hibridização in situ por fluorescência foi realizada utilizando as sondas

comerciais descritas abaixo (Figuras 2 e 3).

24

Figura 2: Esquema da sonda utilizada para FISH. Sinal vermelho corresponde à região 15q11. 2 e o sinal verde,

corresponde ao cromossomo 15 (utilizada como controle interno). Fonte: Adaptado de Cytocell, Prader-

Willi/Angelman (SNRPN) Region Probe.

Figura 3: Esquema da sonda utilizada para FISH. Sinal vermelho corresponde à região 1511.2-112 e o sinal

verde, corresponde ao cromossomo 15 (utilizada como controle interno). Fonte: Adaptado de Cytocell,

Angelman (UBE3A/D15S10).

Destaca-se que as deleções maiores que 3-4Mb da região 15q11-13 devem envolver os

genes relacionados as sondas SNRPN/IC e UBE3A/D15S10. Deleções menores que

incorporam o centro de imprinting e SNRPN, podem não provocar a deleção do gene

relacionado à sonda UBE3A/D15S10. Assim, um resultado tido como normal utilizando a

sonda UBE3A/D15S10 deve ser investigada, pois não exclui a possibilidade da Síndrome de

Prader-Willi, já que a marcação é para um gene diferente do envolvido com a SPW (Ming e

Cols, 2000)

Somente uma gota do material foi colocada na região central da lâmina de vidro com

pipeta Pasteur. A lâmina foi observada em microscópio invertido para ver se as condições do

material permitiam a técnica FISH, e então, depois de uma noite deixada em temperatura

ambiente para envelhecer, foi colocada em uma solução de 2x SSC (pH 7,0) a temperatura

25

ambiente por 30 minutos. Após isso a lâmina foi desidratada em etanol a 70%, 85% e 100%

respectivamente, por 2 minutos cada, e postas para secar naturalmente.

Depois do pré-tratamento foi realizada a codesnaturação, em que, depois da

homogeneização da sonda (SNRPN ou UBE3A), 8µl desta foram aplicadas sobre uma

lamínula e posta no centro da lâmina, sobre o material que ali havia. Sua borda foi selada com

cola especial (rubber cement), e esta lâmina colocada sobre uma placa aquecida a 72°C, por

10 minutos. Posteriormente ocorreu a fase de hibridação, em que a lâmina foi guardada em

uma câmara úmida e escura na estufa a 37°C durante uma noite (de 12 a 16 horas).

No dia seguinte, retirou-se a câmara úmida e escura da estufa, a cola especial posta ao

redor da lamínula e a própria lamínula foram removidas cuidadosamente. A lâmina foi lavada

em duas soluções: solução I (SSC 0,4x + tween 0,3% com pH 7,0) a 72°C por um minuto e

solução II (SSC 2x + tween 0,1% com pH7,0) a temperatura ambiente por 2 minutos. Após a

lavagem, a lâmina secou naturalmente. Então 10 µl de DAPI do mesmo kit da sonda foi

aplicado e a lâmina e coberta com outra lamínula, selada com esmalte e levada para geladeira

em uma caixa escura, por no mínimo 10 minutos. Por fim, o material presente na lâmina foi

analisado em microscópio de fluorescência (Olympus BX50) (Pinkel et al 1986).

26

4 RESULTADOS

No presente estudo foi realizada a análise citogenética clássica (bandeamento GTG) e

molecular (técnica FISH) em um total de 30 casos encaminhados para avaliação. Os

resultados da análise por bandeamento GTG e FISH estão dispostos na tabela 1. Em quatro

destes casos foi possível a identificação de uma possível deleção da região 15q11. 2 através

do padrão de alongamento em torno de 500 bandas por ser haploide.

Paciente GTG FISH

285/13 - Normal

430/13 46, XY Normal

559/13 46, XX Deletado

111/14 46, XX Normal




87/15 - Normal




331/15 46, XY, del 15q11.2 Deletado


339/15 46, XY, del 15q11.2 Deletado





351/16 46,XX, del 15q11. 2 Deletado






27

26/17 46, XX, del 15q11.2 Deletado

81/17 46, XX Normal

86/17 46, XY Normal



383/17 - Normal

Tabela 1: Casos investigados pelas técnicas de bandeamento GTG e Hibridização in situ por fluorescência-

FISH.

Na mesma tabela 1, podemos notar que aproximadamente 13,33% dos casos mostraram

deleção da região 15q11. 2 por GTG e 16,66% por FISH. Nas figuras 4 e 5 é possível

observar o cariograma de uma representação dos grupos normal e alterado respectivamente.

Note que na figura 5, a seta indica a ausência da região 15q11. 2-13, fazendo com que o

cromossomo 15 da direita se apresente um pouco mais curto que o da esquerda, confirmando

o diagnóstico de tal aberração cromossômica.

Figura 4: Análise de bandeamento GTG apresentando região 15q11. 2 normal – Cariótipo: 46,XX (ISCN,2016).

28

Figura 5: Análise em alta definição sugerindo deleção da região 15q11. 2 l – Cariótipo: 46,XX del(15)(q11.2 -

q11.3) (ISCN,2016)

A figura 6 mostra o resultado da análise num caso normal no qual podemos perceber a

presença de ambos os sinais verdes (controle interno da sonda) e ambos os sinais vermelhos

(região 11.2) caracterizando integridade da região investigada. Na figura 7 nota-se a ausência

de um dos sinais vermelhos, tanto no núcleo interfásico quanto na metáfase, caracterizando

deleção da região q11. 2 de um dos cromossomos 15.

Figura 6: Análise FISH detectou dois sinais (vermelho e verde) em ambos os cromossomos 15, caracterizando

integridade da região avaliada (setas). 46, XY. ish 15q11.2 (SNRPN x2) (ISCN,2016).

29

Figura 7: Análise FISH detectou ausência do sinal vermelho em um dos cromossomos 15, caracterizando

deleção da região 15q11. 2 (setas). 46, XX, del(15)(q11.2-q11.3).ish 15q11.2 (SNRPN x2) (ISCN, 2016).

30

5 DISCUSSÃO

O Departamento de Genética do Instituo Fernandes Figueira (FIOCRUZ) realiza o

atendimento (diagnóstico e acompanhamento) multidisciplinar dos pacientes encaminhados

por diferentes condições genéticas incluindo pacientes com suspeita clínica de Síndrome de

Prader-Willi, estes indicados principalmente por obesidade e atraso no desenvolvimento. No

início do ano de 2015, tivemos aprovado um projeto de doenças raras que inclui dentre os

objetivos a avaliação diagnóstica destes pacientes.

Considerando a complexidade no diagnóstico e diversos trabalhos sugerindo a

utilização de métodos de biologia molecular (especialmente as análises de padrão de

metilação da região 15q11. 2), ficamos responsáveis por realizar o estudo de caracterização

citogenética clássica e molecular, através da técnica FISH, dos pacientes incluídos no projeto.

Foram analisados então 30 casos pelas técnicas de citogenética bandeamento GTG e

FISH. Estes casos também foram avaliados através das técnicas de biologia molecular, que

incluem entre outras, as análises do padrão de metilação por PCR e por análise da curva de

dissociação em alta resolução (HRM do inglês High Resolution Melting). Como estes últimos

métodos não foram realizados pela autora deste trabalho, os mesmos foram considerados

apenas para comparação e não serão abordados e/ou discutidos no momento.

De todos os casos analisados através da citogenética clássica, em 90% foi possível a

realização do cariótipo. Em 10% tivemos problemas para obtenção de cromossomos

metafásicos. A falha na obtenção de cromossomos metafásicos pode se dar em decorrência de

diversas causas como: coleta inapropriada (utilização de anticoagulante não adequado),

quantidade insuficiente de amostra, manutenção da amostra sob condição de temperatura

inadequada, validade e/ou qualidade alterada de reagentes, manuseio inadequado, condições

de assepsia, entre outros. Para estes casos sem crescimento foi realizada a técnica FISH em

núcleos interfásico, assim, todos os casos foram analisados ou por bandeamento e/ou por

FISH.

Sempre que possível, a análise foi realizada em um padrão de resolução entre 500 e

850 bandas por conjunto haploide, que nos daria uma segurança em termos da detecção de

pequenas deleções citogenéticas. Em 13,33% casos, foi possível a identificação da deleção

em nível de 500 bandas.

A técnica de FISH confirmou a deleção (figura 7) de 100% dos casos cuja deleção

citogenética foi sugerida (figura 5) e caracterizou a deleção em 3,7% dos casos cuja análise

por banda G foi considerada normal (Figura 4).

31

Paciente Parentesco Padrão de Metilação

GTG FISH Sonda PCR HRM

285/13

------- ------ Sem metáfases Normal SNRPN

430/13

PWS PWS 46, XY Normal SNRPN

559/13

------ ------ 46, XX Deletado SNRPN

111/14

------ ------ 46, XX Normal UBE3A

160/14

PWS PWS 46, XY Normal SNRPN

339/14

------ ------ 46, XY Normal UBE3A

490/14

------ ------ 46, XY Normal SNRPN

87/15

------ ------ Sem metáfases Normal SNRPN

323/15

Normal Normal 46, XX Normal SNRPN

332/15 Irmãs


333/15 PWS PWS 46, XX Normal UBE3A

331/15

PWS PWS 46, XY, del 15q11.2 Deletado SNRPN

334/15

------ ------ 46, XX Normal SNRPN

339/15

PWS PWS 46, XY, del 15q11.2 Deletado SNRPN

173/16

------ ------ 46, XX Normal SNRPN

229/16


306/16


311/16

------ ------ 46, XY Normal SNRPN

351/16

------ ------ 46, XX, del 15q11.2 Deletado SNRPN

387/16

Normal Normal 46, XY Normal SNRPN

410/16


468/16


501/16


511/16

------ Normal 46, XX Normal UBE3A

26/17

PWS PWS 46, XX, del 15q11.2 Deletado UBE3A

81/17

------ ------ 46, XX Normal UBE3A

86/17

------ ------ 46, XY Normal UBE3A

137/17

------ ------ 46, XY Normal UBE3A

174/17

PWS PWS 46, XX Normal SNRPN

383/17

------ ------ Sem metáfases Normal UBE3A

Tabela 2: Casos investigados pelas técnicas de citogenética bandeamento GTG e Hibri FISH, e pelas técnicas de

metilação PCR e HRM.

32

Comparando nossos achados com os métodos de biologia molecular realizado no

projeto maior (tabela 2), podemos considerar que o método de metilação nos parece mais

adequado para auxílio diagnóstico também em nossa casuística, mesmo não indicando a causa

da anomalia cromossômica.

33

6 CONCLUSÕES

A caracterização através da citogenética clássica (bandeamento GTG) foi realizada em

90 % dos casos propostos;

A técnica FISH foi eficiente na caracterização dos casos portadores de deleção na

região 15q11. 2-q13;

A análise citogenética obteve um pequeno impacto na identificação da etiologia da

Síndrome de Prader-Willi em nossos pacientes, mostrando um perfil cuja maioria dos

casos é normal em nível de resolução citogenética, corroborando para a existência de

evento epigenético como a causa etiológica mais provável;

A análise citogenética continua tendo importância significativa, uma vez que outros

tipos de alteração cariotípica podem ser excluídos/identificados, além de ser o mais

acessível atualmente, considerando nosso sistema único de saúde (SUS). Entretanto, a

utilização de métodos avaliando o padrão de metilação poderia selecionar melhor os

casos, auxiliando no diagnóstico clínico/molecular principalmente em condições cujas

características clínicas se sobrepõem.

34

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