Caracterização de espécies de Candida provenientes de ...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA ANDRESSA SANTANA SANTOS Caracterização de espécies de Candida provenientes de infecção da mucosa vulvovaginal de mulheres atendidas no Hospital das Clínicas em Goiânia-GO Goiânia 2018
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
ANDRESSA SANTANA SANTOS
Caracterização de espécies de Candida provenientes de infecção da
mucosa vulvovaginal de mulheres atendidas no Hospital das
Clínicas em Goiânia-GO
Goiânia
2018
ANDRESSA SANTANA SANTOS
Caracterização de espécies de Candida provenientes de infecção da
mucosa vulvovaginal de mulheres atendidas no Hospital das
Clínicas em Goiânia-GO
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical e Saúde Pública da Universidade
Federal de Goiás para obtenção do Título de
Mestre em Medicina Tropical e Saúde
Pública, área de concentração Microbiologia.
Orientadora: Prof.ª Dra. Maria do Rosário
Rodrigues Silva
Goiânia
2018
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE
PÚBLICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluna: Andressa Santana Santos
Orientadora: Prof.ª Dra. Maria do Rosário Rodrigues Silva
Membros:
1. Profa. Dra. Maria do Rosário Rodrigues Silva
2. Prof. Dr. Fábio Silvestre Ataídes
3. Profa. Dra. Rosália Santos Amorim Jesuíno
Data: 28/02/2018
DEDICO...
A todas as pessoas que Deus colocou em meu caminho,
e que de alguma maneira contribuíram para o meu
crescimento profissional e pessoal. Em especial a
minha família, que sempre será a razão de todas as
minhas batalhas e conquistas.
“Na vida não vale tanto o que temos, nem tanto importa o que
somos. Vale o que realizamos com aquilo que possuímos e,
acima de tudo, importa o que fazemos de nós. Está à tua
disposição a potência, o poder de bem realizar, de vencer
adversidades, reduzir atritos, convencer nos negócios honestos,
melhorar de emprego, ampliar amizades, obter a paz no lar e
tudo mais. Quanto mais te convences de que podes ser feliz, de
que tens em ti os atributos da paz, ação, resistência e amor, mais
as facilidades chegam a ti. No entanto, se preferes viver em
lamentações, na recusa à prática do bem, ou no cultivo de vícios,
ergues desnecessariamente, barreiras a ti mesmo.Crê em ti
mesmo, age e verá os resultados. Quando te esforças a vida
também se esforça para te ajudar.”
Chico Xavier
AGRADECIMENTOS
À Deus, pelo dom da vida, pelos milagres diários e por cada pessoa que colocou no
meu caminho. Pois, como disse o grande piloto brasileiro Ayrton Sena: “Eu sou parte de
uma equipe. Então, quando venço, não sou eu apenas quem vence. De certa forma termino
o trabalho de um grupo enorme de pessoas!”. Este trabalho é fruto da colaboração direta e
indireta de muitas pessoas as quais serei eternamente grata.
Aos meus pais, Adelson e Ilma, responsáveis por todas as minhas vitórias. Com
eles aprendi que trabalho, honestidade, respeito e dedicação são a chave para qualquer
conquista.
Aos meus familiares, por me apoiarem e incentivarem constantemente. Agradeço
de maneira especial a minha avó Joaquina, por todo amor e carinho. À minha irmã
Alessandra e a minha tia Neiva, por todo amparo e incentivo em todos os momentos da
minha vida.
À minha orientadora professora Dra. Maria do Rosário Rodrigues Silva, serei
sempre grata por essa oportunidade enriquecedora de aprendizagem que contribuiu não só
para o meu crescimento profissional, mas também pessoal. O seu apoio, respeito,
paciência, carinho, incentivo e ensinamentos diários possibilitaram a realização desse
trabalho.
Aos professores do laboratório de micologia do IPTSP/UFG, Dra. Carolina
Rodrigues Costa, Dra. Lucia Kioko Hasimoto e Souza, Dra. Orionalda de Fátima Lisboa
Fernandes e Dr. Benedito Rodrigues da Silva Neto, pela disposição em ajudar e
compartilhar conhecimentos.
À Prof.ª Dra. Rosália Santos Jesuino Amorim e as demais participantes da banca de
qualificação que contribuíram para o enriquecimento desse trabalho, por meio de suas
preciosas considerações.
Ao Dr. Washington Luiz Ferreira Rios, por nos auxiliar na realização desse estudo,
e a toda equipe do Ambulatório de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas que
colaboraram na coleta de dados deste trabalho. No período em que passei no ambulatório
tive a oportunidade de conhecer e conviver com pessoas incríveis as quais conservo uma
imensa gratidão.
Aos generosos amigos, Ana Laura de Sene Amâncio Zara, Elisangela Gomes da
Silva e Fábio Silvestres Ataídes, pela paciência e disponibilidade em compartilhar tantos
conhecimentos fundamentais para o desenvolvimento desse estudo.
Aos amigos da micologia, Fabyola, Fernanda, Lucas, Thaísa, Vivianny, Maysa,
Nathany, Rayssa, Cícero, sou muito grata a cada um de vocês, por todo auxílio,
conhecimento e momentos felizes compartilhados. À Hildene, pelo coração de mãe que
acolhe cada um que faz parte dessa equipe e por todos os ensinamentos micológicos e de
vida.
À todos os servidores do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, que
cooperaram de alguma maneira para a concretização desse trabalho.
Ao Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública do
IPTSP/UFG, pela excelente formação.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo
apoio financeiro.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA ..................................................... 16
1.1. Introdução ............................................................................................................ 16
1.2. Revisão da literatura ............................................................................................ 17
1.2.1. Epidemiologia da CVV ............................................................................... 17
1.2.2. Leveduras envolvidas na candidíase vulvovaginal ...................................... 18
1.2.3. Fatores relacionados à instalação de candidíase .......................................... 20
1.2.3.1 Aderência ................................................................................................. 21
1.2.3.2 Biofilme ................................................................................................... 22
1.2.3.3 Dimorfismo .............................................................................................. 22
1.2.3.4 Proteinases ............................................................................................... 22
1.2.3.5 Fosfolipase ............................................................................................... 23
1.2.3.6 Hemolisina ............................................................................................... 24
1.2.4. Fatores predisponentes ao desenvolvimento da CVV ................................. 24
1.2.5. Diagnóstico clínico-laboratorial da CVV .................................................... 25
1.2.6. Identificação das espécies de Candida ........................................................ 26
1.2.7. Tratamento da CVV .................................................................................... 28
1.2.8. Resistência de Candida spp à agentes antifúngicos .................................... 31
1.2.9. Métodos para determinação da suscetibilidade de espécies de Candida aos
antifúngicos ................................................................................................................. 32
2. JUSTIFICATIVA ........................................................................................................ 33
3. OBJETIVOS ................................................................................................................ 34
3.1. Objetivo Geral ..................................................................................................... 34
3.2. Objetivos Específicos .......................................................................................... 34
4. MÉTODOS .................................................................................................................. 35
4.1. Deliniamento do estudo ....................................................................................... 35
4.2. Considerações éticas ............................................................................................ 35
4.3. Coleta e isolamento das amostras ........................................................................ 35
4.4. Identificação fenotípica ....................................................................................... 36
4.4.1. Crescimento em meio cromogênico ............................................................ 36
4.4.2. Produção de tubo germinativo ..................................................................... 36
4.4.3. Produção de clamidoconídio ....................................................................... 36
4.4.4. Assimilação de carboidratos – auxanograma .............................................. 37
4.5. Idenficação genotípica ......................................................................................... 37
4.5.1. Extração do DNA ........................................................................................ 37
4.5.2. Reação em cadeia da polimerase – PCR ..................................................... 38
4.6. Teste de suscetibilidade in vitro .......................................................................... 38
4.6.1. Preparação do inóculo ................................................................................. 39
4.6.2. Procedimento do teste .................................................................................. 39
4.7. Aderência ............................................................................................................. 41
4.8. Atividade enzimática ........................................................................................... 41
4.8.1. Proteinase .................................................................................................... 41
4.8.2. Fosfolipase ................................................................................................... 42
4.8.3. Hemolisina ................................................................................................... 43
4.9. Análise dos dados ................................................................................................ 43
5. RESULTADOS ........................................................................................................... 44
5.1. Dados sociodemográficos e clínicos ................................................................... 44
5.2. Identificação ........................................................................................................ 46
5.2.1. Fenotípica .................................................................................................... 46
5.2.2. Genotípico ................................................................................................... 48
5.3. Teste de Suscetibilidade in vitro .......................................................................... 49
5.4. Aderência ............................................................................................................. 51
5.5. Produção de enzimas ........................................................................................... 51
6. DISCUSSÃO ............................................................................................................... 53
7. CONCLUSÕES ........................................................................................................... 58
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 59
QUADROS, TABELAS, FIGURAS, ANEXOS E APÊNDICES Figuras
Figura 1: Microscopia de esfregaço vaginal corado por Gram, onde é possível observar
leveduras, blastoconídios e pseudo-hifas (Aumento 400x). ............................... 19
Figura 2: Etapas do processo de patogenicidade de Candida sp. ........................................ 21
Figura 3: A-Membrana celular fúngica. B-Ligação dos agentes poliênicos ao ergosterol da
membrana formando poros que resulta no aumento da permeabilidade da
membrana com liberação de ions. ....................................................................... 29
Figura 4: Mecanismo de ação dos derivados azólicos sobre a enzima 14-α-demetilase,
impedindo a demetilação do lanosterol em ergosterol, formando esteróis tóxicos
para a membrana. ................................................................................................ 30
Figura 5: Mecanismo de ação das equinocandinas sobre a enzima de ß (1,3) D- glucano
sintase, provocando o rompimento da parede celular. ........................................ 31
Figura 6: Esquema do procedimento para a realização do teste de suscetibilidade in vitro
pelo método de microdiluição em caldo. ............................................................ 40
Figura 7: Determinação da zona de precipitação (Pz) que é a razão entre o diâmetro da
colônia (dc) pelo diâmetro da colônia mais o diâmetro da área translúcida (dcp),
ou seja, PZ = dc/dcp. ........................................................................................... 42
Figura 8: Calculo realizado para a determinação do valor preditivo positivo (VPP). ......... 43
Figura 9: Espécies de Candida cultivadas em CHROMagar. A - Colônias com coloração
azul-esverdeada característica de C. tropicalis. B- Colônias lilás e verdes
características de infecção mista por C.glabrata e C. albicans. C- Colônias
verdes características de C. albicans................................................................... 46
Figura 10: A-Produção de tubo germinativo por C albicans após crescimento em soro
animal (Aumento 400X). B- C. albicanscom produção de clamidoconídios em
meio de agar Cornmeal (Aumento 400X). .......................................................... 47
Figura 11: Auxanograma: Assimilação de glicose (GLI), sacarose (SAC), galactose (GAL),
xilose (XIL), trealose (TRE) e maltose (MAL) e não assimilação de lactose
(LAC), rafinose (RAF) e celobiose (CEL) por Candida albicans. ..................... 47
Figura 12: Frequência das espécies de Candida, segundo identificação genotípica, isoladas
de amostras vulvovaginais. ................................................................................. 48
Figura 13: Eletroforese em gel de agarose (1,2%), mostrando a amplificação de DNA de
espécies de C.albicans (1 e 3), C. glabrata (17R e 46) e C. topicalis (7 e 12). M:
Marcador molecular 100pb (Invitrogen). ............................................................ 48
Figura 14: Microscopia óptica da aderência das espécies de Candida à células epiteliais
bucais (Aumento 1000X). ................................................................................... 51
Figura 15: Halo de precipitação mostrando a produção de enzimas por espécies de Candida
sp. (1, 3, 4, 5, 18, 20, 14, 15, 52 - C. albicans; 13, 17V – C. tropicalis; 17R – C.
glabrata). A-Proteinase em meio contendo soro albumina bovina. B- Hemolisina
em meio de ágar sangue. C- Fosfolipase em meio meio contendo gema de ovo.
............................................................................................................................. 52
Tabelas
Tabela 1: Prevalência de candidíase vulvovaginal (CVV) em estudos realizados em
diferentes regiões do Brasil entre o período de 2004 a 2015. ............................. 18
Tabela 2: Coloração apresentada pelas espécies de Candida quando cultivadas em meio de
CHROMagar Candida (Difco® Laboratories, EUA). ........................................ 36
Tabela 3- Oligonucleótideos específicos usados na PCR e seus respectivos amplicons..... 38
Tabela 4. Variação da concentração dos antifúngicos utilizados na metodologia de
microdiluição em caldo. ...................................................................................... 39
Tabela 5: Valores das CIMs estabelecidos para a interpretação do padrão de suscetibilidade
e de resistência para espécies de Candida. ......................................................... 41
Tabela 6. Distribuição da faixa etária, estado civil e especialidade de atendimento das
mulheres com suspeita clínica de candidíase vulvovaginal procedentes do
Hospital das Clínicas, em Goiânia-GO, 2016-2017. ........................................... 44
Tabela 7: Características clínicas das mulheres com suspeita de candidíase vulvovaginal
atendidas no Hospital das Clínicas em Goiânia-GO, 2016-2017. ....................... 45
Tabela 8: Tratamento clínico indicado para as mulheres com suspeita de candidíase
vulvovaginal atendidas no Hospital das Clinicas em Goiânia-GO, 2016-2017. . 46
Tabela 9: Variação da concentração inibitória mínima (µg/mL) dos diferentes antifúngicos
sobre os isolados de Candida obtidos de amostras vaginais de mulheres
atendidas no Hospital das Clínicas de Goiânia-GO. ........................................... 50
Tabela 10: Atividade enzimática para as espécies de Candida isoladas da mucosa vaginal
de mulheres atendidas no Hospital das Clínicas de Goiânia-GO. ....................... 52
Anexos
Anexo 1: Parecer do Comitê de Ética .................................................................................. 76
Anexo 2: Termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) .......................................... 78
Anexo 3: Ficha controle ...................................................................................................... 79
Anexo 4: Artigo á ser submetido ......................................................................................... 80
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome
ASD Agar Sabouraud Dextrose
ATCC American Type Culture Collection
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CIM Concentração Inibitória Mínima
CIM50 Concentração inibitória mínima em 50% dos isolados
CIM90 Concentração inibitória mínima em 90% dos isolados
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
CVV Candidíase vulvovaginal
CVVR Candidíase vulvovaginal Recorrente
DMSO Dimetilsulfóxido
Dpc Diâmetro da colônia + diâmetro da área translúcida
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
ERG Ergostherol biosynthesis gene
HC Hospital das Clínicas
ITS Internal Transcribed Spacer
MOPS Ácido 2-(N-morfolino)-propanosulfônico
pb Pares de base
PBS Phosphate buffered saline
PCR Polymerase Chain Reaction
pH Potencial hidrogeniônico
PZ Zona de precipitação
RAPD Randomly Amplified Polymorphic
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
RNase Ribonuclease
RPMI Roswell Park Memorial Institute
SAP Secretory Aspartyl Proteinase
SPSS Statistical Programme for Social Sciences
TEB Tris borato EDTA
UFG Universidade Federal de Goiás
VP Valor Preditivo
VPP Valor Preditivo Positivo
YCB Yeast Carbon Base
YEPD Yeast Extract Peptone Dextrose
YNB Yeast Nitrogen Base
RESUMO
Título: Caracterização de espécies de Candida provenientes de infecção da mucosa vulvovaginal de mulheres atendidas no Hospital das Clínicas em Goiânia-GO Introdução: a candidíase vulvovaginal (CVV) é caracterizada como a segunda infecção mais comum entre as infecções que acometem esta região. As leveduras do gênero Candida, como C. albicans, C. parapsilosis, C. topicalis, C. glabrata, C. krusei e C. guilliermondii são as principais causadoras desta patologia, podendo ser identificadas por métodos fenotípicos e moleculares. Objetivos: determinar o valor preditivo (VPP), do diagnóstico clínico de CVV em comparação à cultura, realiza a caracterização das espécies de Candida isoladas da mucosa vaginal através de métodos fenotípicos e moleculares, verifica a produção de enzimas hidrolíticas e o perfil de suscetibilidade in vitro aos antifúngicos usados na terapia da CVV. Metódos: Os métodos fenotípicos usados foram baseados em aspectos morfológicos e bioquímicos, enquanto os testes moleculares foram realizados usando–se a reação em cadeia da polimerase com oligonucleotídeos específicos para cada espécie. Para a verificação da atividade das enzimas proteinase, fosfolipase e hemolisina, foi realizado respectivamente, o crescimento das leveduras em meios contendo albumina bovina, gema de ovo e sangue, sendo a leitura determinada pela zona de precipitação (PZ). A aderência de Candida às células epiteliais foi determinada por microscopia óptica pela contagem do número de células aderidas a 100 células epiteliais. A suscetibilidade in vitro dos isolados de Candida para fluconazol, itraconazol, voriconazol, nistatina e anfotericina B foi realizada usando-se o teste de diluição em caldo visando á determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do antifúngico. Resultados: o VPP do diagnóstico clínico frente ao padrão-ouro de 61,8% (34/55). Dentre as 55 amostras coletadas foram obtidos 36 isolados identificados como C. albicans (27), C. glabrata (5) e C. tropicalis (4). Todos os isolados foram produtores de enzimas, a média de aderência à 100 células epiteliais bucais para as espécies de C. albicans, C. glabrata e C. tropicalis foi respectivamente de 402,5, 236,2 e 58. Alta resistência ao fluconazol (38,8%), elevada suscetibilidade a anfotericina B (94,4%) e baixos valores de MIC para nistatina (8 μg/mL a > 16 μg/mL) foram observados para os isolados.Conclusões: a cultura é fundamental para o diagnóstico de CVV e confirmam que C. albicans continua a espécie predominante como agente de CVV. Todas as espécies apresentam um alto poder patogênico visto a liberação de enzimas por todos os isolados. Este estudo permite sugerir ao clínico que a realização de testes de suscetibilidade in vitro anterior a prescrição do antifúngico traria maior êxito terapêutico.
Palavras-chaves: Candida, candidíase vulvovaginal, fatores de virulência, suscetibilidade
in vitro
ABSTRACT
Title: Characterization of Candida species from vulvovaginal mucosa infection of women attended at the Hospital das Clínicas in Goiânia-GO Introduction:Vulvovaginal candidiasis (VVC) is characterized as the second most common infection among infections affecting this region. Candida yeasts, such as C. albicans, C. parapsilosis, C. topicalis, C. glabrata, C. krusei and C. guilliermondii, are the main causes of this pathology and can be identified by phenotypic and molecular methods. Objectives: this study determines the predictive value (PPV) of the clinical diagnosis of VVC in comparison to the culture, characterizes Candida species isolated from the vaginal mucosa through phenotypic and molecular methods, and verifies the production of hydrolytic enzymes and the susceptibility profile in vitro to antifungal agents used in VVC therapy. Methods: the phenotypic methods used were based on morphological and biochemical aspects, while molecular tests were performed using the polymerase chain reaction with primes specific for each species. In order to verify the activity of the enzymes protease, phospholipase and hemolysin, yeast growth was carried out in media containing bovine albumin, egg yolk and blood, and the reading was determined by the precipitation zone (PZ). Adherence of Candida to epithelial cells was determined by light microscopy by counting the number of cells adhered to 100 epithelial cells. In vitro susceptibility of Candida isolates to fluconazole, itraconazole, voriconazole, nystatin, and amphotericin B was performed using the broth dilution assay to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of the antifungal. Results: Results: the PPV of the clinical diagnosis in relation to the gold standard was 61.8% (34/55). Among the 55 samples collected, 36 isolates identified as C. albicans(27), C. glabrata (5) and C. topicalis (4) were obtained. All isolates were enzyme producers with average adherence to 100 oral epithelial cells for the C. albicans, C. glabrata and C. tropicalis species were respectively 402.5, 236.2 and 58. High resistance to fluconazole (38.8%), high susceptibility to amphotericin B (94.4%) and low MIC values for nystatin (8 μg / mL at > 16 μg/mL) were observed for the isolates. Conclusions: the culture is essential for the diagnosis of CVV and confirm that C. albicans continues the predominant species as CVV agent. All species presented a high pathogenic power. Hydrolytic enzymes were produced by all the isolates. This study allow suggest to the clinician that the in vitro susceptibility tests prior to antifungal prescription would bring higher therapeutic success.
Keywords: Candida, vulvovaginal candidiasis, virulence factors, in vitro susceptibility
16
1.INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA
1.1. Introdução
As infecções fúngicas causadas por leveduras do gênero Candida aumentaram nos
últimos anos em razão de diferentes fatores, dentre eles o aumento de indivíduos
imunocomprometidos e a utilização indiscriminada de antibióticos de amplo espectro
(MAHMOUDI RAD et al., 2011; PANWAR; FAUJDAR, 2016). Essas leveduras são
normalmente encontradas em diversos sítios anatômicos incluindo o trato gastrointestinal
de 20 a 80% dos adultos saudáveis e a mucosa vaginal de 20 a 30% das mulheres
(OKUNGBOWA et al., 2003; SCHULZE; SONNENBORN, 2009). Embora seja grande o
número de espécies descritas, Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis,
Candida glabrata, Candida krusei e Candida guilliermondii são consideradas de maior
interesse clínico (COLOMBO et al., 2013).
As manifestações clínicas de candidíase variam desde infecções superficiais da pele
e mucosas até a penetração invasiva dos tecidos, podendo ocorrer disseminação por via
sanguínea para vários órgãos (PANWAR; FAUJDAR, 2016). A candidemia configura-se
como a mais comum candidiase invasiva, representando um problema de saúde pública
relevante. Investigações epidemiológicas realizadas nos Estados Unidos e na Europa
demonstraram que, desde a década de 1980, as leveduras do genêro Candida foram
responsavéis por 85% dos casos de fungemia, sendo a quarta causa mais comum
(QUINDÓS, 2014). No Brasil, segundo Doi et al.,(2016) Candida é a sétima causa mais
prevalente em casos de infecções sanguíneas.
A candidíase vulvovaginal (CVV) é um problema de saúde que afeta
aproximadamente três quartos da população feminina mundial. Segundo o Ministério da
Saúde, (2015) mesmo não sendo transmitida sexualmente, a CVV ocorre com maior
frequência em mulheres sexualmente ativas. O controle desta infecção vulvovaginal é
difícil, perturbando o bem-estar físico, mental e social com impacto negativo na qualidade
de vida destas mulheres (GE et al., 2012; JAEGER et al., 2013; SOBEL, 2016; ZHU et al.,
2016).
Por se tratar de uma micose cujo diagnóstico clínico correto implicará em uma
terapia mais adequada, os estudos dos métodos diagnósticos associados aos testes de
17
suscetibilidade in vitro aos antifúngicos podem contribuir sobremaneira, para uma
melhoria na qualidade de vida das mulheres com CVV.
1.2. Revisão da literatura
1.2.1. Epidemiologia da CVV
A candidíase vulvovaginal (CVV), infecção genital feminina é frequente no mundo.
Entre as infecções da região vaginal, figura após a vaginose bacteriana como a mais
comum (PANWAR; FAUJDAR, 2016; BRANDOLT et al., 2017). Cerca de 75% das
mulheres em idade fértil apresentam um episódio da doença durante a vida, sendo que
destas, 40% a 50% manifestam um segundo episódio (ZENG et al., 2011; AL-AKEEL et
al., 2013; EMERIBE et al., 2015; BHESANIA; NARAYANKHEDKAR, 2017). A
ocorrência de quatro ou mais episódios da infecção no período de um ano caracteriza a
candidiase vulvovaginal recorrente (CVVR) que representa um grande problema de saúde,
sendo estimado que 6% a 9% das mulheres em idade reprodutiva apresentam esse quadro
(FOXMAN et al., 2013).
Os dados a respeito das taxas de prevalência da CVV são escassos, uma vez que esta
não é uma doença de notificação compulsória e na maioria das vezes é diagnósticada na
ausência de testes confirmatórios (ACHKAR; FRIES, 2010). Em alguns dos estudos
realizados no Brasil, a prevalência de CVV variam de 4,7% a 47,9% nas diferentes
populações estudadas (Tabela 1) (DIAS et al., 2011; PEREIRA et al., 2012; SÁ et al.,
2014; CAMARGO et al., 2015; GOULART et al., 2016; GLEHN, 2016; BRANDOLT et
al., 2017).
18
Tabela 1: Prevalência de candidíase vulvovaginal (CVV) em estudos realizados em
diferentes regiões do Brasil entre o período de 2004 a 2015.
Referência Estado Período Número de
participantes
Prevalência
de CVV(%)
Ferrazza et al.,
(2005)
Santa Catarina 2004 130 19,2%
Ferrazza et al.,
(2005)
Paraná 2004 97 9,3%
Andrioli et al.,
(2009)
Bahia 2005-2007 286 47,9%
Dias et al., (2011) Mato Grosso 2005-2006 404 39.6%
Pereira et al.,
(2012)
Rio Grande do Sul 2005 - 2010 121.328 7,1%
Sá et al., (2014) Maranhão 2012 107 4,7%
Camargo et al.,
(2015)
Goiás 2012-2013 302 9,3%
Goulart et al.,
(2016)
Mato Grosso 2012-2013 166 35%
Brandolt et al.,
(2017)
Rio Grande do sul 2013-2014 263 13,3%
Glehn, (2016) Distrito Federal 2014-2015 201 20%
1.2.2. Leveduras envolvidas na candidíase vulvovaginal
Leveduras do gênero Candida pertencem ao filo Ascomycota, classe
Blastomycetes, ordem Cryptococcales, família Cryptococcaceae, caracterizando-se por
microrganismos unicelulares que se reproduzem por brotamento (Figura1). Cerca de 200
espécies compõem esse grupo, distribuídas em diferentes ambientes, como solo, alimentos,
água, homem e outros animais (OKUNGBOWA et al., 2003; COLOMBO et al., 2013;
CRISEO et al., 2015).
19
Figura 1: Microscopia de esfregaço vaginal corado por Gram, onde é possível observar
leveduras, blastoconídios e pseudo-hifas (Aumento 400x). Fonte: Acervo do autora, 2017
Candida albicans, fungo diploide, polimórfico, continua sendo espécie mais
prevalente como agente de CVV. Entretanto as espécies não-albicans tem emergido como
importantes causadoras desta infecção (KHAN et al., 2004; KENNEDY; SOBEL, 2010;
CRISEO et al., 2015).
Candida glabrata levedura haploide que não forma pseudo-hifa em condições
ambientais ou mesmo em meios de cultura que estimulam o aparecimento desta estrutura
(FIDEL et al., 1999; CRISEO et al., 2015) é encontrada frequentemente em processos de
candidíase sistêmica e vaginal, se destacando pela resistência aos fármacos azólicos.
Candisa nivariensis e Candida bracarensis passaram a fazer parte do complexo C.
glabrata. As três espécies são fenotipicamente idênticas e sua diferenciação pode ser
realizada por técnicas moleculares como Polymerase Chain Reaction (PCR) (ALCOBA-
FLÓREZ et al., 2005; CORREIA et al., 2006; SILVA; NEGRI; HENRIQUES;
OLIVEIRA; WILLIAMS, DAVID W; et al., 2012; CRISEO et al., 2015).
Candida parapsilosis, responsável principalmente por infecções da corrente
sanguínea em recém-nascidos, infecções relacionadas ao uso de cateter e hiperalimentação
intravenosa, pode ser encontrada em casos de CVV (TAVANTI et al., 2005; GARZILLO
et al., 2017). As leveduras deste complexo estão divididas em três espécies Candida
orthopsilosis, Candida metapsilosis e Candida parapsilosis stricto sensu (BRANDT;
LOCKHART, 2012; ZHU et al., 2014).
Blastoconídios Leveduras
20
Outras espécies associadas à CVV incluem Candida tropicalis e Candida krusei,
que são mais comuns em indivíduos com enfermidades hematológicas (COLOMBO et al.,
2013; JONES et al., 2014), além de Candida guilliermondii mais encontrada em pacientes
com neoplasias (SAVINI et al., 2011; BRANDT; LOCKHART, 2012; COLOMBO et al.,
2013).
Kumar et al., (2015) ,verificaram um caso de CVV por Candida auris, espécie que
se destaca pela resistência aos derivados azólicos e a anfotericina B (SATOH et al., 2009;
KATHURIA et al., 2015; SHERRY et al., 2017).
1.2.3. Fatores relacionados à instalação de candidíase
A integridade da pele e das mucosas é considerada de grande relevância na defesa
do hospedeiro. Circunstâncias que alteram a superfície da pele ou de mucosas favorecem a
aderência do fungo e sua invasão na mucosa propiciando, assim, a instalação da infecção
(MEER, VAN DER et al., 2010; CASSONE, 2015; HÖFS et al., 2016). O epitélio
representa a defesa inicial contra patógenos. As células epiteliais possuem ação
antimicrobiana sendo capazes de inibir a formação de hifas por C. albicans, impedir sua
proliferação e são responsáveis por ativação de células do sistema imune inato (NAGLIK
et al., 2014).
O sistema imunológico pode desempenhar um importante papel de defesa contra
infecções por fungos do gênero Candida (HAMAD, 2012). A defesa do hospedeiro,
realizada principalmente pelo sistema imune celular, ocorre pela ação microbicida de
neutrófilos e macrófagos. Merecem destaque as células T que apresentam grande
relevância na prevenção de candidíase mucocutânea crônica (MEER, VAN DER et al.,
2010; HAMAD, 2012; QUINTIN et al., 2014). Candidíase mucocutânea crônica é
frequente em crianças com problemas no timo, principal órgão formador de linfócitos T e
em pacientes com a síndrome da imunodeficiência humana adquirida (AIDS), em que se
observa uma acentuada diminuição dessas células (FIDEL, 2002a; QUINTIN et al., 2014).
Embora, a imunidade celular seja mais eficaz na defesa contra o microrganismo, a
imunidade humoral efetuada pela formação de anticorpos associados ao sistema
complemento atuam como opsonizante para as células fagocitárias, ou ainda podem
impedir a aderência do microrganismo às células IgA secretoras (FIDEL, 2002b; MEER,
VAN DER et al., 2010).
21
A microbiota bacteriana regula o número de fungos por competição à utilização de
nutrientes e ainda por inibição de sua aderência à superfície celular por bloqueio de
receptores celulares. O uso de antibióticos pode, portanto, favorecer o crescimento de
fungos do gênero Candida, por redução de bactérias concorrentes de nutrientes (SOBEL,
2007; CASSONE, 2015; HÖFS et al., 2016).
Alguns fatores de virulência do microrganismo podem interferir na instalação de
candidíase. A aderência às células epiteliais, formação de biofilme, atividade de enzimas
extracelulares e dimorfismo (Figura 2) são características importantes para a instalação de
candidíase (ISHIDA et al., 2013; OLIVEIRA et al., 2013; HÖFS et al., 2016).
Figura 2: Etapas do processo de patogenicidade de Candida sp. Fonte: Adaptado de HÖFS et al. (2016)
1.2.3.1 Aderência
A capacidade que o microrganismo tem de se aderir à superfície das células do
hospedeiro, representa o primeiro mecanismo de patogênese (MODRZEWSKA;
KURNATOWSKI, 2015). A parede das leveduras do gênero Candida não possui apenas a
propriedade de estabelecer a forma estrutural à célula, mas também é o local onde se inicia
a interação entre o microrganismo e a célula do hospedeiro. Isso ocorre porque estas
leveduras apresentam proteínas denominadas adesinas, que permitem a sua aderência a
receptores extracelulares como fibrinogênio, fibronectina e laminina presentes nos tecidos
humanos (SCHULZE; SONNENBORN, 2009; MODRZEWSKA; KURNATOWSKI,
2015).
22
1.2.3.2 Biofilme
A interação da célula fúngica à célula do hospedeiro estimula a formação de
biofilmes por C. albicans e outras espécies de Candida, representando, provavelmente,
maior patogenicidade do microrganismo. Os biofilmes são constituídos por uma estrutura
tridimensional composta por uma comunidade de microrganismos envoltos em uma matriz
de substâncias poliméricas (PAIVA et al., 2012; SARDI et al., 2013; JONES et al., 2014).
A formação do biofilme se inicia a partir da aderência a um substrato, resultando em uma
camada de células que se dividem e produzem hifas ou pseudo-hifas, que se projetam para
a parte superior do biofilme produzindo uma matriz extracelular e a dispersão de leveduras
em torno do substrato (HARRIOTT et al., 2010; SARDI et al., 2013). O biofilme promove
uma barreira de proteção que defende as leveduras da ação do sistema imunológico e
confere maior resistência aos fármacos. A mortalidade por candidíase disseminada está
normalmente associada à produção de biofilmes (AHMADEY; MOHAMED, 2014;
MOREIRA et al., 2015).
1.2.3.3 Dimorfismo
Algumas espécies de leveduras do gênero Candida podem se apresentar sob a
forma ovalada com brotamentos e sob a forma filamentosa, o que é denominado de
dimorfismo (MAYER et al., 2013). Essa alteração de morfologia de levedura para hifa
pode ocorrer em resposta às condições ambientais, sendo que, em meio rico de nutrientes,
há a formação de blastoconídios, enquanto em locais mais pobres de nutrientes formam-se
os filamentos. Esse fenômeno permite a penetração e proliferação em uma grande
variedade de tecidos do hospedeiro (MAYER et al., 2013; HÖFS et al., 2016; CAUCHIE
et al., 2017). A formação de hifas além de promover a invasão celular também altera as
características de imunidade pela inibição da ação fagocítica por macrófagos e neutrófilos
(AHMADEY; MOHAMED, 2014; HÖFS et al., 2016; CAUCHIE et al., 2017).
1.2.3.4 Proteinases
As proteinases aspárticas secretadas (Saps) são exoenzimas com pesos moleculares
entre 35 e 50 kDa, produzidas pelos fungos do gênero Candida, que atuam no local da
23
lesão degradando várias proteínas importantes como albumina, queratina, colágeno,
mucina, lactoferrina, lactoperoxidase e imunoglobulinas como as da classe IgA, inativando
os fatores de defesa do hospedeiro (YANG, 2003; HUBE; NAGLIK, 2005; SCHULZE;
SONNENBORN, 2009; EMAM et al., 2012; HÖFS et al., 2016). A correlação de
virulência e atividade de proteinase aspartil secretora (Sap) pode ser notada pela maior
aderência às células do epitélio bucal e às células endoteliais por isolados altamente
proteolíticos (SILVA; NEGRI; HENRIQUES; OLIVEIRA; WILLIAMS, DAVID W; et
al., 2012).
A atividade das Saps está associada com uma família que compreende dez genes
Sap1-10 (SAP – Secreted Aspartyl Proteinase) (NAGLIK et al., 2003; MAYER et al.,
2013). As Saps 1-3 estão associadas às células na forma de leveduras com atividade ótima
em pH 3-5. As Saps 4-6 estão associadas à formação de hifas, com atividade em pH 5-7.
Por estas características, pode ser determinado que as Saps com atividade em intervalos de
pH entre 3 e 7 são importantes para a sobrevivência e infecção de espécies de Candida no
hospedeiro (SCHALLER, 2006; MAYER et al., 2013). Segundo Naglik et al., (2003) a
expressão dos genes SAP1, SAP3 e SAP6-SAP8 está relacionada com a infecção vaginal.
1.2.3.5 Fosfolipase
As fosfolipases constituídas por fosfolipases A, B, C, D, lisofosfolipase e
lisofosfolipase-transacilase, são enzimas hidrolíticas, que atuam no rompimento da
membrana de células epiteliais, permitindo que o citoplasma da célula do hospedeiro seja
invadido pelas hifas (NIEWERTH; KORTING, 2001; MAYER et al., 2013). Os
fosfolípideos são os maiores componentes da membrana biológica, podendo ser
encontrados em todos os seres vivos. As fosfolipases A e B são as de maior relevância. A
fosfolipase A catalisa a hidrolise de um dos ácidos graxos do fosfolipídeo da membrana
liberando a lisolecitina (produto tóxico) que tem o potencial de destruir as membranas dos
eritrócitos (hemólise). A fosfolipase B, catalisa a hidrólise dos dois ácidos graxos
simultaneamente liberando na reação, glicerofosforilcolina e ácidos graxos livres
(NIEWERTH; KORTING, 2001). A fosfatidilcolina (lecitina), um fosfolipídio
abundantemente presente na membrana citoplasmática funciona como substrato natural
para as quatro fosfolipases (NIEWERTH; KORTING, 2001).
24
A produção de fosfolipase está relacionada aos níveis de patogenicidade. Os
isolados que possuem altas quantidades de fosfolipase apresentam uma maior capacidade
de aderência e invasão aos tecidos do hospedeiro (NIEWERTH; KORTING, 2001; FULE
et al., 2015).
1.2.3.6 Hemolisina
A nanoproteina hemolisina, produzida pelas leveduras do gênero Candida, se liga à
membrana dos eritrócitos provocando sua lise e liberação da hemoglobina, proteína rica
em ferro e aminoácidos (PENDRAK; ROBERTS, 2007; ROSSONI et al., 2013). O ferro é
um elemento relevante para o metabolismo de muitos microrganismos sendo cofator de
diversas enzimas. Candida spp é capaz de assimilar o ferro presente na hemoglobina do
hospedeiro pela ação da heme-oxigenase codificada pelo gene CaHMX1 (SANTOS et al.,
2003; FRANÇA et al., 2017). A metabolização da hemoglobina por espécies de Candida
promove alteração na expressão gênica levando à adesão a matrizes de proteínas, estimula
a formação de hifas e disseminação do fungo no organismo (TANAKA et al., 1997;
PENDRAK; ROBERTS, 2007; ROSSONI et al., 2013).
1.2.4. Fatores predisponentes ao desenvolvimento da CVV
Na CVV, vários fatores podem influenciar na conversão de leveduras colonizadoras
em infectantes (SOBEL, 2007; BHESANIA; NARAYANKHEDKAR, 2017).
Os lactobacilos são bactérias predominantes na mucosa vaginal, sintetizando
substâncias com atividade antimicrobiana que inibem a adesão de microrganismos
patogênicos às células epiteliais (EHRSTRÖM et al., 2010; CAUCHIE et al., 2017;
BRADFORD; RAVEL, 2017). Tratamentos com antibióticos sistêmicos ou vaginais
estimulam o surgimento de infecções fúngicas, pois as bactérias são destruídas, permitindo
que os fungos cresçam melhor, uma vez que têm mais nutrientes disponíveis (AHMADEY;
MOHAMED, 2014; CAUCHIE et al., 2017; BRADFORD; RAVEL, 2017).
Alterações no pH vaginal constituem um importante fator de risco para instalação
da infecção. Candida sp é capaz de provocar infecção em um ambiente vaginal ácido com
pH entre 4,0 e 4,5, enquanto que as infecções vaginais provocadas por bactérias ocorrem
em um pH alcalino maior que 4,5 (SOBEL, 2007; BRADFORD; RAVEL, 2017).
25
Outro fator importante relacionado à CVV é a produção de hormônios. Altos níveis
de estrogênios resultam no aumento do glicogênio na mucosa vaginal, o que propicia o
crescimento e germinação das leveduras, contribuindo para a sua adesão às células
epiteliais. Uma maior atividade dos estrogênios é observada em mulheres gestantes,
diabéticas ou que fazem uso de contraceptivos orais à base de estrógenos (MEER, VAN
DER et al., 2010; AHMADEY; MOHAMED, 2014; GUNTHER et al., 2014; PETERS et
al., 2014). O estradiol, hormônio sexual feminino, interfere na diferenciação da célula
linfocitária Th17 e produção de citocinas antifúngicas IL17. O período que antecede o
climatério é marcado pela elevação dos níveis de estradiol e consequentemente no aumento
de manifestações de CVV (MEER, VAN DER et al., 2010; CHEN et al., 2015;
BRADFORD; RAVEL, 2017).
Considera-se ainda, que práticas de higiene como uso de duchas vaginais podem
causar alergias locais e reações de hipersensibilidade, facilitando a instalação de Candida
sp na mucosa vaginal (PATEL et al., 2004). Além do uso de roupas íntimas, pouco
ventiladas que aumentam a umidade na região vaginal pode estimular o crescimento de
leveduras do gênero Candida (PATEL et al., 2004; SOBEL, 2014b).
1.2.5. Diagnóstico clínico-laboratorial da CVV
O diagnóstico da CVV é realizado a partir dos sinais e sintomas apresentados pela
mulher que incluem corrimento, prurido, ardor, inchaço, dor durante relações sexuais ou ao
urinar. Esses sinais, entretanto não são específicos, podem estar presentes em outras
infecções vaginais, o que dificulta o diagnóstico clínico. (EMAM et al., 2012; GUNTHER
et al., 2014; APALATA et al., 2014). O corrimento vaginal pode ser observado na
vaginose bacteriana e na tricomoníase. Segundo protocolo estabelecido pelo Ministério da
Saúde a diferenciação dessas infecções deve ser realizada levando-se em consideração a
sintomatologia, os critérios descritos por Amsel (corrimento vaginal homogêneo,
geralmente acinzentado, pH vaginal > 4,5, teste de amina positivo, e presença de clue cells
na bacterioscopia corada por Gram) nos casos de vaginoses bacterianas, e o exame a fresco
da secreção vaginal para confirmação de Trichomonas e de Candida sp (LIMA et al., 2013;
MINISTÉRIO DA SÁUDE, 2015; CAMARGO et al., 2015).
Os testes sorológicos não são utilizados na rotina ginecológica para o diagnóstico
devido sua baixa sensibilidade. As espécies de Candida fazem parte da microbiota natural,
26
sendo que na infecção vaginal não ocorre aumento dos níveis de anticorpos (MENDLING,
2015).
O exame da secreção vaginal, adicionando-se KOH a 10% ou esfregaços corados
por Gram ou Giemsa não oferecem resultados seguros, visto que 50% das mulheres com a
doença exibem resultados falso-negativos. O diagnóstico laboratorial realizado a partir da
cultura é considerado como padrão-ouro, sendo utilizado como comparativo na avaliação
da precisão do diagnóstico clínico. As leveduras do gênero Candida crescem bem em todos
os meios, apresentando colônias com morfologia característica (SOBEL, 2007; ESIM
BUYUKBAYRAK et al., 2010; MENDLING; BRASCH, 2012).
1.2.6. Identificação das espécies de Candida
A identificação presuntiva de algumas espécies de Candida pode ser realizada em
meio específico como o Chromagar Candida (Difco® Laboratories, EUA). As colônias
tornam-se de diferentes colorações, dependendo da espécie. Essa mudança de cor ocorre
pela reação de substratos cromogênicos com as enzimas sintetizadas pelas células fúngicas.
A diferenciação da levedura em meios cromogênicos fornece um resultado entre 24 e 48
horas, que é considerado rápido em comparação com outros métodos de identificação de
leveduras (PFALLER et al., 1996; JABRA-RIZK et al., 2001; SENDID et al., 2007;
PIRES et al., 2015).
Métodos convencionais como produção de clamidoconídios, tubo germinativo e os
testes de assimilação e fermentação de hidratos de carbono e de nitrogênio são utilizados
na identificação dos fungos (SENDID et al., 2007; RAD et al., 2011; NURAT et al., 2016).
O tubo germinativo é um filamento fino, que se origina na levedura sem apresentar
nenhuma constrição. A presença desta estrutura pode ocorrer por diferentes espécies de
Candida, mas C. albicansé a única capaz de produzir tubo germinativo em até 3 horas após
incubação em soro animal (KURTZMAN et al., 2011).
As características morfológicas apresentadas pelas espécies quando cultivadas em
ágar fubá acrescido de Tween 80, podem auxiliar na distinção de algumas espécies como
C. albicanse C. dubliniensis. Este meio estimula a produção de pseudo-hifas,
blastoconídios e clamidoconídios. Os clamidoconídios são células arredondadas, de
volume aumentado, com paredes duplas e espessas, ricas em lipídios, sendo considerados
estruturas de resistência. Clamidoconídios podem estar localizados na parte intercalar ou
27
terminal do micélio, sendo que no caso de C. albicans, estas estruturas são terminais
(KURTZMAN et al., 2011).
Os métodos bioquímicos usados para a identificação de leveduras incluem o
auxanograma e o zimograma. O auxanograma é um teste que pode ser realizado em meio
sólido e avalia a capacidade da levedura de crescer aerobicamente tendo como única fonte
de energia um composto de carbono ou nitrogênio. O zimograma verifica a produção de
gás carbônico pelas leveduras a partir da fermentação de carboidratos, na ausência de
oxigênio (KURTZMAN et al., 2011).
A identificação das espécies de Candida pode ser realizada por sistemas diversos,
manuais e automatizados, baseados em provas de assimilação de carboidratos e nitrogênio,
que estão disponíveis para a comercialização. Dentre os sistemas manuais podem ser
citados o API (API 20C ou API/ATB ID 32C) e o Auxacolor® (Sanofi Diagnotics-Pasteur)
O VITEK® (BioMérieux), sistema automatizado, possui tiras ou cartelas contendo uma
série de galerias plásticas com carboidratos. O período de incubação varia de 2-3 dias.
Todos esses sistemas possuem banco de dados que permitem a identificação de várias
espécies de leveduras. Apesar de fornecerem um diagnóstico rápido e prático esse métodos
são pouco utilizados em laboratórios de rotina em razão de seu alto custo (RAMANI et al.,
1998; VERWEIJ et al., 1999; KURTZMAN et al., 2011; PIRES et al., 2015).
Devido à alta sensibilidade e especificidade, métodos de biologia molecular são
empregados na identificação de microrganismos, os quais analisam o genoma,
independente do estado fisiológico da célula e permitem a distinção de espécies
relacionadas (MAHMOUDI RAD et al., 2011; NURAT et al., 2016; DEVADAS, 2017).
As regiões ITS (International Transcribed Spacer) são consideradas o código
universal de DNA (deoxyribonucleic acid) fúngico. Essas regiões estão localizadas entre os
genes 18S, 5,8S e 28S do DNA ribossômico (rDNA) e divididas em ITS1 e ITS2. A região
ITS1, encontra-se entre os genes 18S e 5,8S, e a ITS2, separa entre 5,8S e 28S. Essa região
é altamente conservada intraespecificamente, mas variável entre diferentes espécies, o que
possibilita a distinção ao nível específico (KURTZMAN et al., 2011, 2015; SCHOCH et
al., 2012).
As técnicas moleculares baseadas na reação em cadeia da polimerase PCR
(polymerase chain reaction) são as mais utilizadas na identificação das espécies de
Candida. PCR é reconhecida como uma técnica muito empregada para detecção de todos
os tipos de microrganismos, sendo muito sensível e reprodutível (SOBEL; AKINS, 2015).
28
Existem diferentes variações de PCR. O PCR multiplex é um ensaio rápido que
combina vários iniciadores específicos permitindo identificação de mais de uma espécie
(ROMEO et al., 2009; MAHMOUDI RAD et al., 2011; SAEID et al., 2013; MAKENE,
2014). A análise do RAPD (random amplified polymorphic DNA) é baseada na utilização
de oligonucleotídeos de sequência arbitrária, não exigindo que haja um conhecimento
prévio a respeito do organismo que se deseja identificar (HOLMBERG; FEROZE, 1996;
IMRAN; AL-SHUKRY, 2014). O RFLP (Restriction fragment length polymorphism)
utiliza enzimas de restrição que fragmentam o DNA em pontos específicos permitindo a
diferenciação das espécies de Candida (MARTÍNEZ et al., 2010; BAGHDADI et al.,
2016). A técnica de PCR em tempo real apresenta alta sensibilidade e otimização do tempo
na identificação das espécies de Candida (KLEIN, 2002; TARDIF; SCHLABERG, 2017).
Nessa reação há a combinação de PCR convencional com mecanismo de detecção e
quantificação por fluorescência. Neste método a detecção e quantificação de DNA são
realizadas, em uma única etapa, obtendo-se resultados mais rápidos e reduzindo o risco de
contaminação da espécime clínico.
A identificação das espécies de Candida é relevante não só para compor dados
epidemiológicos, mas também para a perspectiva terapêutica uma vez que alguns desses
fungos são resistentes aos fármacos utilizados na terapia de rotina (KENNEDY; SOBEL,
2010; BRANDT; LOCKHART, 2012; UDAYALAXMI, SHANI JACOB, 2014).
1.2.7. Tratamento da CVV
A escolha do tratamento da CVV e a duração do mesmo devem ser realizadas de
acordo com histórico individual de cada individuo. Numerosos antifúngicos estão
disponíveis no mercado, os quais são encontrados para administração oral na forma de
comprimidos, ou ainda para uso tópico na forma de cremes, loções, comprimidos vaginais,
supositórios e tampões revestidos (SOBEL, 2007, 2014b). Esses medicamentos são
divididos em diferentes grupos como os poliênicos e azólicos que atuam na membrana
celular e as equinocandinas que atuam na parede celular (MENDLING; BRASCH, 2012;
COLOMBO et al., 2013).
Os agentes poliênicos, que incluem nistatina e anfotericina B, se ligam diretamente
ao ergosterol formando canais transmembranares, aumentando de forma significativa à
permeabilidade da membrana e provocando a liberação de ions monovalentes (K+, Na+, H+
29
e Cl−) e subsequente morte celular (Figura 3). Eles apresentam ação fungicida, baixa
resistência antifúngica mas, podem interagir com os colesterol, componentes da membrana
celular humana e provocar efeitos colaterais graves como a nefrotoxicidade (COLOMBO
et al., 2013; TUPE; DESHPANDE, 2013; SCHEIBLER et al., 2017).
Figura 3: A-Membrana celular fúngica. B-Ligação dos agentes poliênicos ao ergosterol da
membrana formando poros que resulta no aumento da permeabilidade da membrana com
liberação de ions. Fonte: Adaptado de Xie et al. (2014)
Os derivados azólicos, como fluconazol, itraconazol, cetoconazol, voriconazol,
feticonazol, isoconazol, posaconazol e ravuconazol, atuam na inibição da síntese do
ergosterol bloqueando a enzima 14-α-demetilase, presente no citocromo P-450 da célula
fúngica, impedindo a demetilação do precursor lanosterol em ergosterol (Figura 4). Os
azólicos são considerados bastantes efetivos para o tratamento de candidíase e são menos
tóxicos que a anfotericina B (COMO; DISMUKES, 1994; HEERES et al., 2010;
TOBUDIC et al., 2012; COLOMBO et al., 2013; TUPE; DESHPANDE, 2013; BOATTO
et al., 2016).
30
Figura 4: Mecanismo de ação dos derivados azólicos sobre a enzima 14-α-demetilase,
impedindo a demetilação do lanosterol em ergosterol, formando esteróis tóxicos para a
membrana. Fonte: Adaptado de Xie et al. (2014)
As equinocandinas constituídas por caspofungina, micafungina, anidulafungina,
substâncias derivadas do metabolismo de fungos como Glarea lozoyensis, Coleophoma
empetri e Aspergillus nidulans respectivamente, agem inibindo a enzima beta-1,3-D-
glucano sintase, impedindo a síntese da parede celular, e simultaneamente aumentando o
teor de quitina e rompimento desta estrutura (Figura 5) (CARRILLO-MUÑOZ et al., 2006;
KATHIRAVAN et al., 2012). As equinocandinas representam um tratamento eficaz contra
as leveduras do gênero Candida, mas seu uso no tratamento de CVV é inviável devido sua
forma de administração ser intravenosa. A formulação de uma nova equinocandina, a
CD101 tem se apresentado promissora para o tratamento da CVV, possuindo estabilidade e
solubilidade para uso tópico (BOIKOV et al., 2017)
31
Figura 5: Mecanismo de ação das equinocandinas sobre a enzima de ß (1,3) D- glucano
sintase, provocando o rompimento da parede celular. Fonte: Adaptado de Xie et al. (2014)
1.2.8. Resistência de Candida spp à agentes antifúngicos
Algumas espécies de Candida podem apresentar resistência ao tratamento para
candidíase, sendo que a resistência aos azólicos têm emergido em indivíduos com
infecções fúngicas oportunísticas como a candidíase (SANGUINETTI et al., 2015). As
leveduras podem ser resistentes aos derivados azólicos por diferentes mecanismos de ação.
Mutações ou superexpressão do gene ERG 11(Ergostherol biosynthesis gene 11) resultam
na alteração estrutural da enzima 14-α-demetilase, ou a sua síntese aumentada. Importante
forma de resistência aos azólicos ocorre também pela superexpressão das bombas de
efluxo ABC (ATP-binding cassette) e MFS (major facilitator superfamily), proteínas que
atuam na membrana celular expulsando o fármaco do meio intracelular. As bombas ABC
realizam o transporte de fármacos a partir da energia gerada na hidrólise do ATP e as MFS
utilizam a energia advinda do gradiente de prótons. As bombas ABC são codificadas pelos
genes CDR (Candida drug resistance), e as MSF são codificadas pelos genes MDR
(multidrug resistance) (SANGUINETTI et al., 2015).
A resistência aos agentes poliênicos como a anfotericina B não é vista como uma
dificuldade clínica, poucos casos de espécies resistentes a este antifúngico são relatados. A
resistência de Candida spp. à anfotericina B está relacionada com mutações nos genes da
família ERG (ERG2, ERG3 e ERG11), que são responsáveis pela codificação dos
A B
32
constituintes da via de biossíntese do ergosterol (XIE et al., 2014; ALCAZAR-FUOLI;
MELLADO, 2014; SANGUINETTI et al., 2015).
A suscetibilidade reduzida de Candida spp a equinocandinas está associada a
respostas de estresse adaptativo e a mutações intrínsecas e adquiridas no gene FKS,
responsáveis pela síntese de β–(1,3)-D-glucano (ALCAZAR-FUOLI; MELLADO, 2014;
SANGUINETTI et al., 2015).
1.2.9. Métodos para determinação da suscetibilidade de espécies de Candida aos
antifúngicos
A avaliação da suscetibilidade in vitro é um recurso fundamental utilizado na
investigação de novas substâncias antimicrobianas, na detecção de resistência antifúngica,
e escolha do fármaco com maior especificidade e eficácia (PFALLER; DIEKEMA, 2012).
Diferentes metodologias podem ser aplicadas para a determinação da suscetibilidade
antifungica. Os testes de diluição em caldo e metódos comerciais como, Etest®
(bioMérieux,Brasil), Sensititre YeastOne™ (Thermo Fisher Scientific), Fungitest™ (Bio-
Rad) ou Vitek® 2 (bioMérieux, Brasil) são os mais comumente utilizados (CUENCA-
ESTRELLA et al., 2005; ALASTRUEY-IZQUIERDO et al., 2015).
A avaliação da suscetibilidade in vitro por meio do método de diluição em caldo é
padronizada pelas organizações internacionalmente reconhecidas como o CLSI (Clinical
and Laboratory Standards Institute) e o EUCAST (European Committee on Antimicrobial
Susceptibility Testing) (PFALLER; DIEKEMA, 2012).
O método de microdiluição em caldo referenciado pelo CLSI e EUCAST é um teste
rápido e seguro aceito mundialmente e que permite determinar dos valores de concentração
inibitória mínima (CIM).
33
2. JUSTIFICATIVA
A CVV é uma temática abordada em pesquisas no mundo inteiro, atingindo um
enorme percentil de mulheres e interferindo no bem-estar físico e psicológico, causando
desconfortos o que irá refletir até mesmo em sua vida social. A infecção tem desafiado os
clínicos pelo seu alto índice de reincidência e de resistência às terapias.
O diagnóstico clínico da CVV é inespecífico com carência de testes laboratoriais
rápidos, simples e baratos resultando em um grande número de mulheres diagnosticadas e
tratadas erroneamente. A implantação do diagnóstico laboratorial é fundamental, sendo que
a cultura apesar de não muito utilizada nas rotinas ginecológicas, devido à demora do
resultado, é considerada padrão-ouro para o diagnóstico de CVV. Os métodos moleculares
que examinam os fragmentos de DNA tem sido uma ferramenta importante na
caracterização de leveduras associadas a processos infecciosos, pois possibilitam a
identificação das espécies, de forma específica, rápida e confiável. A implantação de testes
genotípicos nas rotinas laboratoriais poderia ser de grande valia no diagnóstico da CVV.
No Brasil, para a venda de antifúngicos como fluconazol não há necessidade de
prescrição médica, sendo que o uso indiscriminado desses fármacos pode resultar no
aumento dos índices de resistência. A constante emergência de Candida sp resistentes a
antifúngicos é um fato preocupante que exige a investigação dos padrões de suscetibilidade
das leveduras aos fármacos usados rotineiramente. O acompanhamento da eficácia da
terapia empregada por meio de observação da cura micológica, ou seja, da eliminação do
patógeno da mucosa vaginal é de extrema necessidade.
34
3. OBJETIVOS
3.1.Objetivo Geral
Isolar e caracterizar espécies de Candida em mulheres com diagnóstico clínico de
candidiase vulvovaginal, atendidas no Hospital das Clínicas em Goiânia –GO, entre 2016 e
2017.
3.2. Objetivos Específicos
Descrever as características clínicas e de fatores predisponentes para o desenvolvimento
de candidíase vulvovaginal;
Analisar o valor preditivo positivo (VPP) do diagnóstico clínico em comparação com a
cultura considerada padrão-ouro;
Identificar as espécies de Candida por meio de características fenotípicas e moleculares;
Verificar a virulência dos isolados de espécies de Candida, considerando a produção de
enzimas hidrolíticas e a aderência à células epiteliais.
Determinar a suscetibilidade in vitro dos isolados de Candida sp aos antifúngicos
fluconazol, itraconazol, voriconazol, anfotericina B e nistatina.
35
4.MÉTODOS
4.1. Delineamento do estudo
Este trabalho representa um estudo epidemiológico prospectivo, realizado a partir
de amostras de secreção vaginal provenientes de mulheres atendidas nos ambulatórios de
Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas em Goiânia durante o período entre
fevereiro de 2016 a fevereiro de 2017. Foram incluídas neste estudo as pacientes que
compareceram ao hospital para a realização de consultas e exames de rotinas
ginecológicas, apresentando sinais e sintomas de candidíase vulvovaginal.
4.2. Considerações éticas
Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa do Hospital das
Clínicas/UFG - CEP/HC/UFG, conforme o parecer: 1.374.728 (Anexo 1) sendo
observados os aspectos éticos do estudo envolvendo seres humanos (Resolução 466/12 do
Conselho Nacional de Saúde). Todas as voluntárias consentiram com estudo após
esclarecimento a respeito do mesmo e assinatura do termo de consentimento livre e
esclarecido (Anexo 2). Para cada mulher foi preenchida uma ficha controle (A) com dados
demográficos como nome, idade e estado civil, presença dos principais sinais e sintomas
da CVV, fatores predisponentes de candidíase e ainda o medicamento usado para a terapia
da doença. Todos os dados coletados das voluntárias estão mantidos em sigilo e
armazenados em local seguro.
4.3. Coleta e isolamento das amostras
Para cada uma das participantes indicadas pelo clínico com suspeita de CVV, foi
realizada a coleta da secreção vulvovaginal. Na coleta, swab estéril foi introduzido no
intróito vaginal, girando suavemente e friccionando nas paredes da vagina. Os swabs foram
imediatamente colocados em tubos de ensaio contendo solução fisiológica a 0,85%
previamente esterilizada.
Os tubos de ensaio contendo as amostras foram encaminhados ao laboratório de
micologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de
Goiás (IPTSP/UFG), e cultivadas em meio de ágar Sabouraud dextrose (ASD, Difco®
Laboratories, EUA) com acréscimo de cloranfenicol, incubadas por 48 horas à temperatura
36
ambiente. Após o crescimento de colônias foram analisadas as suas características
macroscópicas e microscópicas.
4.4. Identificação fenotípica
4.4.1. Crescimento em meio cromogênico
As leveduras isoladas foram inoculadas em meio cromogênico de CHROMagar
(Difco® Laboratories, EUA), incubadas por 48 a 72 horas a 35°C. Após este período,
observou-se as colorações exibidas pelas leveduras, sendo que a caracterização das
espécies de Candida foi realizada conforme o manual proposto pelo fabricante (Tabela 2)
(KURTZMAN et al., 2011).
Tabela 2: Coloração apresentada pelas espécies de Candida quando cultivadas em meio de
CHROMagar Candida (Difco® Laboratories, EUA).
Espécie Cor
C. albicans Verde
C. dubliniensis Verde
C. topicalis Azul-esverdeada
C. krusei Rosa com borda esbranquiçada
4.4.2. Produção de tubo germinativo
Em um tubo de ensaio contendo 0,5 mL de soro animal foi adicionada uma alçada
de colônia previamente cultivada em ASD e incubada a 37ºC durante período de até no
máximo 3 horas. Após esse período, uma gota da suspensão foi colocada em uma lâmina, e
examinada ao microscópio óptico. Neste tempo de incubação apenas C. albicansconsegue
produzir esta estrutura. A cepa padrão C. albicans ATCC (American Type Culture
Collection) 90028 foi usada como controle positivo e C. parapsilosis ATCC 22019 como
controle negativo (KURTZMAN et al., 2011).
4.4.3. Produção de clamidoconídio
As leveduras de Candida sp foram primeiramente crescidas em ágar Sabouraud
dextrose e, em seguida, semeadas no meio ágar cornmeal (Sigma-Aldrich) suplementado
com 1% de tween 80, incubadas por 3 a 4 dias à temperatura ambiente. Após o período de
37
incubação as colônias foram examinadas por microscopia óptica para observação de
clamidoconídios terminais ou intercalares(KURTZMAN et al., 2011).
4.4.4. Assimilação de carboidratos – auxanograma
Uma suspensão de fungo contendo aproximadamente 1 x 106 células foi preparada e
distribuída em placas de Petri. Em seguida foi vertido sobre a suspensão, 20 mL de meio
Yeast Nitrogen Base (YNB-BDTM Difco) em uma temperatura de aproximadamente 45ºC e
realizado um “pour plate”. Depois da solidificação, foram adicionados 0,5 mg de dos
seguintes carboidratos: glicose, sacarose, lactose, galactose, rafinose, xilose, celobiose,
trealose e maltose. As placas foram incubadas a 35ºC por 48 horas e a assimilação do
carboidrato foi observada a partir do aparecimento de halo de crescimento na área
correspondente à cada fonte de carbono (KURTZMAN et al., 2011).
4.5. Idenficação genotípica
4.5.1. Extração do DNA
A extração do DNA foi realizada de acordo com Del Poeta et al., (1999) adaptado
por Casali et al., (2003). As leveduras previamente cultivadas em meio YEPD (Yeast
extract-peptone dextrose) a 370C por 24 a 48 horas foram suspensas em 0,5 mL de TENTS
(Tris HCL 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM pH 8,0, NaCl 200 mM, 2% de Triton, 1% de
SDS) contendo 0,2 mL de pérolas de vidro de 0,45 mm, 0,5 mL de fenol clorofórmio e
agitados em vórtex por 2 minutos. Após a centrifugação por 10 minutos a 13000 rpm, a
fase aquosa foi transferida para novo tubo e o mesmo volume de etanol absoluto foi
inserido e incubado a –200C por 1 hora para precipitação. O DNA precipitado foi
ressuspenso em 0,5 mL de TE (Tris HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM pH 8,0), adicionado
de 50 µg/mL de RNase, e incubado a 370C por 30 minutos. Após a adição de volume igual
de fenol clorofórmio e centrifugação por 15 minutos a 13000 rpm o DNA foi repreciptado
com 20 µL de NaCl 5 M e um volume de etanol a 100%, lavado com etanol 70%,
ressuspenso em 0,5mL de TE e armazenado a -20°C até sua utilização.
38
4.5.2. Reação em cadeia da polimerase – PCR
Os oligonucleotídeos para a realização da PCR específicos para a identificação de
C. albicans, C. parapsilosis, C. dubliniensis, C. glabrata e C. topicalis foram escolhidos de
acordo com Martínez et al.,(2010) (Tabela 3).
Tabela 3- Oligonucleótideos específicos usados na PCR e seus respectivos amplicons.
Espécies Tamanho do
amplicon (pb)
Oligonucleotídeos específicos
C. albicans 310 INT1 5’AAG TAT TTG GGA GAA GGG AAA GGG 3’
INT2 5’AAA ATG GGC ATT AAG GAA AAG AGC 3’
C. parapsilosis 113 CPf 5’AGG GAT TGC CAA TAT GCC CA 3’
CPr 5’GTG ACA TTG TGT AGA TCC TTG G 3’
C. dubliniensis 262 CDf 5’ GAT ATT GGG AGA GGG AAA GAC C 3’
CDr 5’ACA GGG AAG TCG ATT CTT GC 3’
C. glabrata 406 CGf 5’ ACA TAT GTT TGC TGA AAA GGC 3’
CGr 5’ ACT TTT TCT TAG TGT TCA GGA CTT CC 3’
C. topicalis 147 CTf 5’ TGA TAG TTA GGA AAG ATC AGG TG 3’
CTr 5’ AAC ATA TCC CAT GTG TGT GT 3’
A reação em cadeia da polimerase realizada segundo Noumi et al., (2015) consistiu
em um volume total de 25 µL, contendo 2,5 U de taq DNA polimerase (Invitrogen), 2,5
mmol de cada dNTP (Invitrogen), 4 µM de cada oligonucleotídeo (Invitrogen),
adicionados de 50 ng de DNA. A amplificação foi processada em uma máquina de
PCR/Thermal Cycler Bio-Rad PTC-100, da seguinte maneira: Um ciclo inicial de 95ºC por
30 segundos, em seguida 35 ciclos que incluem: 30 segundos de desnaturação a 95ºC, 30
segundos de anelamento a 56ºC e 90 segundos de extensão a 72ºC, com um passo final de
extensão a 72ºC por 10 minutos. Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese
em gel de agarose a 1,2%, fotografadas e as bandas resultantes foram analisadas segundo o
seu peso molecular.
4.6. Teste de suscetibilidade in vitro
A avaliação da suscetibilidade das espécies isoladas aos antifúngicos, fluconazol
(Pfizer®, Pfizer, Madrid, Spain), itraconazol (Janssen-Pharmaceuticals®, Estados Unidos),
voriconazol (Pfizer®, Madrid, Spain), anfotericina B (Sigma Aldrich® Química, Madrid,
39
Spain) e nistatina (Sigma Aldrich® Química, Madrid, Spain) foi realizada pelo método de
microdiluição em caldo, segundo os documentos M27-A3 (2008) e M27-S4 (2012)
propostos pelo CLSI.
4.6.1. Preparação do inóculo
A suspensão do fungo foi preparada a partir de leveduras subcultivadas em ASD,
por 24-48 horas a 28ºC. A concentração do inóculo ajustada em espectrofotômetro a 85%
de transmitância no comprimento de onda de 530 nm e diluída, á 1:50 e em seguida 1:20,
em RPMI 1640 de tal modo que se obtivesse uma concentração final de 1 a 5 x 10³
UFC/mL.
4.6.2. Procedimento do teste
Os antifúngicos, fluconazol, anfotericina B e nistatina foram dissolvidos em
dimetilssulfóxido (DMSO) e em seguida diluídos em caldo RPMI obtendo-se concentração
inicial diferente para cada um dos antifúngicos (Tabela 4).
Tabela 4. Variação da concentração dos antifúngicos utilizados na metodologia de
microdiluição em caldo.
Antifúngicos Concentração inicial
(µg/mL)
Concentração final
(µg/mL)
Fluconazol 64 0,12
Itraconazol 16 0,03
Voriconazol 16 0,03
Anfotericina B 16 0,03
Nistatina 64 0,12
Em uma placa de microtitulação de 96 orifícios de fundo chato foram
distribuídos 100 µL do meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium), a partir
da segunda até à 10ª coluna. Em seguida foram distribuídos 200 µL do antifúngico nos
orifícios da primeira coluna da placa e realizada diluições seriadas. Em seguida 100 µL
do inóculo foi adicionado em cada orifício, de tal modo que as concentrações dos
antifúngicos foram diluídas ao dobro (Figura 6).
40
Figura 6: Esquema do procedimento para a realização do teste de suscetibilidade in vitro
pelo método de microdiluição em caldo.
A leitura do teste de suscetibilidade foi realizada após 24 horas de incubação a
37ºC, sendo que para os derivados azólicos a CIM foi determinada como 50% de inibição
comparada ao controle do inóculo, enquanto que para os derivados poliênicos a
concentração foi correspondente a inibição total de crescimento. Os valores de
suscetibilidade e resistência (breakpoints) para fluconazol, itraconazol e voriconazol foram
analisados de acordo com os documentos M27-A3 (CLSI, 2008) e M27-S4 (CLSI, 2012).
Para anfotericina B esses valores foram determinados segundo Pfaller; Diekema, (2012)
(Tabela 5). Em todos os testes a cepa padrão C. parapsilosis ATCC 22019 foi utilizada
como controle, para assegurar a qualidade do teste.
41
Tabela 5: Valores das CIMs estabelecidos para a interpretação do padrão de
suscetibilidade e de resistência para espécies de Candida.
Antifúnficos Espécie Suscetível Resistente Referência Fluconazol (μg/mL) C. albicans ≤ 2 ≥ 8 CLSI, 2012
C. glabrata - ≥ 64 CLSI, 2012 C. topicalis ≤ 2 ≥ 8 CLSI, 2012
Voriconazol (μg/mL) C. albicans ≤ 0,12 ≥ 8 CLSI, 2012)
C. glabrata ≤ 1 ≥ 4 (CLSI, 2008) C. topicalis ≤ 0,12 ≥ 1 (CLSI, 2012)
Itraconazol (μg/mL) Candida sp ≤ 0,12 ≥ 1 (CLSI, 2008) Anfotericina B (μg/mL) Candida sp - ≥ 1 Pfaller; Diekema,
(2012)
4.7. Aderência
A avaliação da aderência foi realizada segundo Kimura; Pearsall,(1978) com
adaptações. As células epiteliais foram colhidas de indivíduos saudáveis suspensas em 10
mL de PBS (pH 7,2) e lavadas duas vezes, a fim de se obter um pool de células com uma
concentração de aproximadamente 5 x 105 células/mL, contadas em câmara de Neubauer.
Em seguida, 0,5 mL dessa suspensão foram misturados a 0,5 mL de suspensão de
leveduras contendo 2,5 x 107 leveduras/mL e incubadas sob agitação constante por uma
hora a 37ºC. Após incubação a mistura foi filtrada em papel filtro Whatman® número 41 e
lavada 2 vezes com PBS a fim de eliminar as leveduras não aderidas. As leveduras
aderidas foram transferidas para uma lâmina de vidro fazendo-se pressão do papel filtro,
sendo fixadas pelo calor e coradas usando a técnica de coloração de Gram Nicolle. Com
auxílio de um microscópio óptico foi realizada a contagem do número de leveduras
aderidas a 100 células epiteliais.
4.8. Atividade enzimática
4.8.1. Proteinase
A avaliação da atividade de proteinase foi realizada segundo Ruchel et al., (1982).
O meio base composto de 18 g de ágar (Difco® Laboratories, EUA) foi dissolvido em 950
mL de água destilada e autoclavado a 120ºC por 15 minutos. Após o resfriamento do meio
42
base a 50ºC adicionou-se 11,7 gramas de Yeast carbon base (YCB, Difco® Laboratories,
EUA), 2,0 gramas de albumina bovina fração V (Sigma Chemical), 2,5 mL de Protovit
(Roche), dissolvidos em 50 mL de H2O destilada e esterilizado em membrana millipore de
0,22µm. O meio foi distribuído em placas de Petri e inoculado em sua superfície de 10 μL
da suspensão de leveduras contendo 107 leveduras/mL, contadas por câmara de Neubauer.
As placas foram incubadas a 37ºC por quatro dias.
A leitura das placas foi realizada segundo Price et al., (1982) (Figura 7).
Figura 7: Determinação da zona de precipitação (Pz) que é a razão entre o diâmetro da
colônia (dc) pelo diâmetro da colônia mais o diâmetro da área translúcida (dcp), ou seja,
PZ = dc/dcp. Fonte: Adaptado de Price et al., (1982)
Segundo Ramos et al, (2015), Valor de Pz de 1 (-)= sem atividade enzimática, Pz
entre 0,99 e 0,7 (+) = baixa atividade enzimática, Pz entre 0,69 e 0,40 (++) = moderada
atividade e Pz entre 0,39 e 0,10 (+++) = alta atividade. Estes valores mostram que quanto
menor o Pz maior é a atividade enzimática.
4.8.2.Fosfolipase
O método de Price et al. (1982), foi utilizado para verificar a atividade da
fosfolipase. Em placas de Petri foi distribuído o meio de ágar Sabouraud dextrose a 1,2%
(ASD,Difco® Laboratories, EUA), contendo 0,11 g CaCl2, 11,7 g NaCl e água destilada
quantidade suficiente para 250mL o qual foi homogeneizado autoclavado e acrescido de
8% de emulsão de ovo. Uma fração de 10 μL do inóculo preparado de acordo com o item
4.8.1 foi inserido na superfície deste meio e incubados a 37°C durante quatro dias. A
leitura da atividade enzimática foi realizada de acordo com o descrito para proteinase.
43
4.8.3.Hemolisina
A atividade da hemolisina foi determinada conforme Mans et al, (1994). O meio
contendo agar Sabouraud dextrose suplementado com 3% de glicose e 7% de sangue de
carneiro desfibrinado (Newprov, Brasil) foi preparado e distribuído em placas de Petri.
Posteriormente foram inoculadas neste meio 10 μL de uma suspensão de leveduras
ajustada em câmara de Neubauer para 108 leveduras/mL preparadas a partir de colônias
com um crescimento de 18 horas em agar Sabouraud dextrose. As placas foram incubadas
pelo período de 24 horas na ausência Da mesma forma como citada acima a atividade
enzimática foi determinada segundo Ramos et al. (2015) descrita em proteinase.
4.9. Análise dos dados
As informações sociodemográficas e clínicas das participantes foram inseridas em
um banco de dados e analisadas com auxílio do Software estatístico SPSS (versão 21.0).
As diferenças estatísticas foram consideradas significativas com o valor de p < 0,05. O
valor preditivo positivo (VPP) foi determinado considerando-se a razão entre o número de
casos confirmados pelo método de cultura, dividido pelo número total de casos com
diagnóstico clínico, multiplicado por 100 (Figura 8).
Figura 8: Calculo realizado para a determinação do valor preditivo positivo (VPP).
44
5.RESULTADOS
5.1. Dados sociodemográficos e clínicos
A amostra foi constituída por 55 mulheres com suspeita clínica de CVV, com
idades entre 14 e 64 anos e média de 32 anos ± desvio-padrão 12,0, de maioria casadas
65,5% (n=36), atendidas por diferentes especialidades: ginecologia geral, planejamento
familiar, pré-natal, adolescente e dor pélvica (Tabela 6). Entre as 55 mulheres, 34 tiveram
confirmação diagnóstica por cultura, representando um valor preditivo positivo (VPP) de
61,8% (Tabela 6). Das mulheres com culturas positivas, verificou-se que 16,4% tiveram
mais de quatro (04) episódios da doença, caracterizadas como recorrentes.
Tabela 6. Distribuição da faixa etária, estado civil e especialidade de atendimento das
mulheres com suspeita clínica de candidíase vulvovaginal procedentes do Hospital das
Clínicas, em Goiânia-GO, 2016-2017.
População do estudo Total (n=55)
Cultura positiva (n=34)
negativa (n=21) p-valor
Idade (em anos) Média ± desvio-padrão 32,0 ±12,0 29,7 ±9,7 35,6 ±14,5 0,074* Mediana (IIQ 25-75) 32 (21-38) 29 (21-35) 36 (22-43)
Mínimo-máximo 14-64 14-60 15-64 Estado civil n (%) n (%) n (%) Casada 36 (65,5) 23 (67,3) 13 (61,9) 0,430** Solteira 18 (32,7) 11 (32,4) 7 (33,3)
Divorciada 1 (1,8) 1 (4,8) Especialidade n (%) n (%) n (%)
Ginecologia geral 22 (40,0) 11 (32,4) 11 (52,4) 0,514** Planejamento familiar 18 (32,7) 13 (38,2) 5 (23,8)
Pré-natal 10 (18,2) 7 (20,6) 3 (14,3) Adolescente 4 (7,3) 2 (5,9) 2 (9,5)
Dor pélvica 1 (1,8) 1 (2,9) - Valor Preditivo Positivo 34/55 (61,8) *Teste T (p<0,05). ** Teste Qui-Quadrado (p<0,05).
Em relação aos sinais e sintomas utilizados para o diagnóstico da CVV, as
integrantes da pesquisa queixaram-se de prurido (74,5%), ardor (52,7%), leucorréia
(98,2%), disúria (49,1%) e dispareunia (47,3%). Encontrou-se maior proporção de
45
mulheres com prurido entre aquelas diagnosticadas com candidíase (p= 0,020) (Tabela 6).
Dentre os fatores predisponentes 18,2% das participantes eram gestantes, 3,6% eram
diabéticas, 16,4% faziam uso de contraceptivos oral e 9,1% haviam feito uso de
antibióticos de largo espectro por longo tempo (Tabela 7).
Tabela 7: Características clínicas das mulheres com suspeita de candidíase vulvovaginal
atendidas no Hospital das Clínicas em Goiânia-GO, 2016-2017.
Características clínicas Total Cultura (n=55)
positiva (n=34)
negativa (n=21) p-valor
Sinais e sintomas n (%) n (%) n (%)
Prurido 41 (74,5) 29 (70,7) 12 (29,3) 0,020*
Ardor 29 (52,7) 20 (69,0) 9 (31,0) 0,249*
Leucorreia 54 (98,2) 33 (61,1) 21 (38,9) 1,000**
Disúria 27 (49,1) 18 (66,7) 9 (33,3) 0,467*
Dispareunia 26 (47,3) 18 (69,2) 8 (30,8) 0,284*
Fatores predisponentes
Gestação 10 (18,2) 7 (70,0) 3 (30,0) 0,725**
Diabetes mellitus 2 (3,6) 2 (100,0) - 0,519**
Diabetes gestacional - - - -
Uso de contraceptivo oral 9 (16,4) 6 (66,7) 3 (33,3) 1,000**
Uso de antibióticos 5 (9,1) 4 (80,0) 1 (20,0) 0,639** * Teste Qui-Quadrado (p<0,05). **Teste Exato de Fisher (p<0,05).
Diferenças significativas em negrito.
O fluconazol foi o fármaco mais indicado para o tratamento, seguido de clotrimazol
miconazol, cetoconazol, secnidazol, nistatina. Para três participantes foi indicado o uso
combinado de medicamentos (Tabela8).
46
Tabela 8: Tratamento clínico indicado para as mulheres com suspeita de candidíase
vulvovaginal atendidas no Hospital das Clinicas em Goiânia-GO, 2016-2017.
Tratamento Total (n=55) Cultura
positiva (%) negativa (%)
Fluconazol 41 (74,5) 23 (56,1) 18 (43,9)
Clotrimazol 5 (9,1) 3 (60) 2 (40)
Miconazol 2 (3,6) 2 (100) -
Cetoconazol 1 (1,8) 1 (100) -
Secnidazol 1 (1,8) 1 (100) -
Nistatina 1 (1,8) - 1 (100)
Fluconazol/Cetoconazol 1 (1,8) 1 (100) -
Fluconazol/Miconazol 1 (1,8) 1 (100) -
Fluconazol/Secnidazol 1 (1,8) 1 (100) -
Itraconazol 1 (1,8) 1(100) -
5.2. Identificação
5.2.1.Fenotípica
As 34 amostras com cultura positiva semeadas em meio cromogênico de
CHROMagar (Difco® Laboratories, EUA), mostraram diferentes colorações. A
identificação presuntiva destas colônias mostrou o aparecimento de 27 colônias de cor
verde, quatro azuis e cinco lilás (Figura 9). Em duas amostras comprovou-se infecção
mista.
Figura 9: Espécies de Candida cultivadas em CHROMagar. A - Colônias com coloração
azul-esverdeada característica de C. tropicalis. B- Colônias lilás e verdes características de
infecção mista por C.glabrata e C. albicans. C- Colônias verdes características de C.
albicans Fonte: Acervo da autora, 2017
47
Quando submetidas a crescimento em soro fetal animal dentro do período de 3
horas, 16 isolados produziram tubo germinativo (Figura 10 A).
A microscopia das colônias em ágar cornmeal permitiu a visualização de pseudo-
hifas, e blastoconídios em 30 isolados, sendo que a produção de clamidoconídios foi
verificada para nove isolados de Candida (figura10 B), todos identificados como C.
albicans.
Figura 10: A-Produção de tubo germinativo por C albicans após crescimento em soro
animal (Aumento 400X). B- C. albicanscom produção de clamidoconídios em meio de
agar Cornmeal (Aumento 400X). Fonte: Acervo da autora, 2017
As leveduras isoladas submetidas ao teste de assimilação de carboidrato mostraram
que 31 espécies assimilaram glicose, sacarose, galactose, xilose, trealose e maltose (Figura
11) e 5 espécies assimilaram apenas glicose e trealose.
Figura 11: Auxanograma: Assimilação de glicose (GLI), sacarose (SAC), galactose
(GAL), xilose (XIL), trealose (TRE) e maltose (MAL) e não assimilação de lactose (LAC),
rafinose (RAF) e celobiose (CEL) por Candida albicans. Fonte: Acervo da autora, 2017
48
Estes métodos fenotípicos não permitiram a confirmação da espécie em 07 isolados
de Candida.
5.2.2.Genotípico
A genotipagem mostrou que entre os 36 isolados vaginais, 27(75%) foram
identificados como C.albicans, 5 (14%) como C. glabrata, e 4 (11%) como C.tropicalis
(Figura 12). Os produtos gerados da amplificação por PCR do DNA de diferentes isolados
de Candida utilizando oligonucleotídeos específicos foram de 310 pb, 406 pb, 147 pb para
C. glabrata de e C. topicalis, respectivamente (Figura 13).
Figura 12: Frequência das espécies de Candida, segundo identificação genotípica, isoladas
de amostras vulvovaginais.
Figura 13: Eletroforese em gel de agarose (1,2%), mostrando a amplificação de DNA de
espécies de C.albicans (1 e 3), C. glabrata (17R e 46) e C. topicalis (7 e 12). M: Marcador
molecular 100pb (Invitrogen). Fonte: Acervo da autora, 2017
49
5.3. Teste de Suscetibilidade in vitro
A suscetibilidade in vitro das espécies de Candida ao derivados azólicos mostrou-
se bastante variada, verificando-se alta resistência a estes antifúngicos (Tabela 9). O
percentual de suscetibilidade foi de 61,1% (n=22) para o fluconazol, 52,7% (n=19) para o
itraconazol e 55,5% (n=20) para o voriconazol. Para anfotericina B a CIM90 foi de 0,5
µg/mL para C.albicans e 1 µg/mL para C. glabrata e C. topicalis (Tabela 9). A CIM de
nistatina capaz de inibir 50% (CIM50) dos isolados foi de 4 µg/mL para C.albicans, 2
µg/mL para C. glabrata e 8 para C. topicalis.
50
Tabela 9: Variação da concentração inibitória mínima (µg/mL) dos diferentes antifúngicos
sobre os isolados de Candida obtidos de amostras vaginais de mulheres atendidas no
Hospital das Clínicas de Goiânia-GO.
Antifúngicos Espécies (n)
C. albicans(27) C. glabrata (5) C. topicalis (4) Fluconazol Variação 0,12-64 0,5-4,0 1,0-32 CIM90 64 4 32 CIM50 4 2 2 Suscetível (n = 22) 14 5 3 Resistente (n=14) 13 - 1 Itraconazol Variação 0,12-16 1,0-4,0 0,5-1,0 CIM90 16 4 1 CIM50 1 1 0,5 Suscetível (n=19) 12 3 4 Resistente (n=17) 15 2
Voriconazol Variação 0,03-16 0,25-8,0 0,25-4,0 CIM90 16 8 4 CIM50 1 0,25 0,25 Suscetível (n=20) 12 4 4 Resistente (n=16) 15 1 - Anfotericina B Variação 0,25-1,0 0,5-2,0 1,0-2,0 CIM90 0,5 0,5 2 CIM50 0,5 1 1 Suscetível (n=34) 27 5 2 Resistente (n=2) - - 2 Nistatina* Variação 0,06-8 1,0-16 4,0-16 CIM90 8 16 16 CIM50 4 2 8 CIM: Concentração Inibitória Miníma; CIM50:Concentração capaz de inbir o crescimento de 50% dos isolados; CIM90 – Concentração capaz de inibir 90% dos isolados
*Não há dados concretos na literatura sobre suscetibilidade e resistência para nistatina
51
5.4. Aderência
A contagem microscópica de 100 células epiteliais bucais (Figura 14) mostrou que a
média de leveduras aderidas por espécie foi de 402,5 ± 199,07 para C. albicans, 236,2 ±
180,2 para C. glabrata e de 58 ± 53,7 C. topicalis.
Figura 14: Microscopia óptica da aderência das espécies de Candida à células epiteliais
bucais (Aumento 1000X). Fonte: Acervo da autora, 2017.
5.5. Produção de enzimas
Com relação aos testes enzimáticos pode se verificar, que a proteinase e a
hemolisina foram produzidas por todos os isolados, enquanto a fosfolipase foi secretada
por 29 isolados (Tabela 10). Todos os isolados apresentaram formação de halos
correspondentes a produção de enzimas (Figura 15).
52
Tabela 10: Atividade enzimática para as espécies de Candida isoladas da mucosa vaginal
de mulheres atendidas no Hospital das Clínicas de Goiânia-GO.
Atividade ezimática (PZ)
C. albicans C. glabrata C. topicalis Total (N=27) (N=5) (N=4) (N=36)
Proteinase (-) - - - - (+) - 1 - 1
(++) 21 - 3 24 (+++) 6 4 1 11
Fosfolipase (-) 1 2 4 7 (+) 19 1 - 20
(++) 7 2 - 9 (+++) - - - -
Hemolisina (-) - - - - (+) - - - -
(++) 26 4 4 34 (+++) 1 1 - 2
Pz: Zona de precipitação.Valor de Pz de 1= sem atividade enzimática (-), Pz entre 0,99 e 0,7= baixa atividade
enzimática (+) , Pz entre 0,69 e 0,40= moderada atividade (++) e Pz entre 0,39 e 0,10= alta atividade (+++)
Figura 15: Halo de precipitação mostrando a produção de enzimas por espécies de
Candida sp. (1, 3, 4, 5, 18, 20, 14, 15, 52 - C. albicans; 13, 17V – C. tropicalis; 17R – C.
glabrata). A- Proteinase em meio contendo soro albumina bovina. B- Hemolisina em meio
de ágar sangue. C- Fosfolipase em meio meio contendo gema de ovo. Fonte: Acervo do autora, 2017
53
6. DISCUSSÃO
A candidíase é uma infecção vaginal de grande ocorrência, afetando 75% da
população feminina mundial, principalmente durante a idade fértil, onde cerca de 50%
apresentam mais de um episódio da doença (EMERIBE et al., 2015; ZHU et al., 2016).
Assim como confirmado pelo presente estudo, ocorre principalmente na segunda e terceira
década de vida, idade com maior atividade sexual.
A suspeita clinica de CVV foi baseada na presença dos sinais e sintomas
apresentados pelas participantes da pesquisa como prurido vaginal, leucorreia, disúria,
dispareunia e ardor que, mostraram em comparação com a cultura (padrão-ouro) um VPP
de 61,8%. A comparação entre a suspeita clínica e a cultura (padrão-ouro) foi realizada em
outras pesquisas. No Brasil, na cidade de Criciúma, Santa Catarina, Rosa e Rumel, (2004)
entre julho e setembro encontraram um VPP de 43%. Farhan et al.,(2017), encontraram um
VPP de 76,2% em mulheres com desordens vaginais, atendidas no Egito, enquanto
Vijayalakshmi et al., (2016) na cidade de Pune na Índia, verificaram um VPP de 88,9%.
A ocorrência de quatro ou mais episódios da doença no período de um ano
caracteriza candidíase vaginal recorrente (CVVR). Desta forma o presente trabalho mostra
que 16,4% foram caracterizados como CVVR. Os costumes e as condições ambientais ao
qual as mulheres estão expostas, possivelmente, influenciam nessa situação uma vez que
verifica-se variações nas porcentagens de CVVR em populações de diferentes regiões no
mundo. Kandeel e Elmitwalli, (2017) verificaram que 11% das participantes de um estudo
na Arábia Saudita apresentavam CVVR. Mahmoudi Rad et al., (2011), no Iran, relataram a
recorrência de CVV em 47% da população estudada, enquanto Foxman et al., (2013), na
Europa e Estados Unidos verificaram uma prevalência de 6 a 9%.
Alguns fatores importantes nas mulheres com suspeita de candidíase, como
gravidez, diabetes, o uso de contraceptivos orais e antibióticos de amplo espectro,
largamente relacionados com o desenvolvimento da CVV, não apresentaram associação no
presente estudo. O fator predisponente mais prevalente entre as participantes com CVV,
foram a gestação seguida de uso de contraceptivo oral. A candidíase vulvovaginal durante
a gestação é uma condição preocupante, pois exige um grande cuidado na escolha do
tratamento, principalmente no primeiro trimestre gestacional, pois alguns antifúngicos são
contra-indicados para gestantes estando associados à formação inadeguada do feto
(PAPPAS et al., 2015). O uso de contraceptivos orais, por mulheres em idade fértil é
54
considerado um fator relevante, relacionado à colonização da levedura na região vaginal e,
consequentemente, à instalação da infecção, em decorrência de uma maior produção dos
esteróides, hormônios importantes que aumentam a colonização por leveduras do gênero
Candida (SOBEL, 2014).
A carência de sinais e sintomas específicos apresentados na doença mostram que é
necessário a realização de testes laboratoriais para a confirmação do diagnóstico. As
práticas de diagnóstico inconsistentes das infecções vaginais, resultam em gastos
desnecessários, e tratamento inadequado (principalmente no caso de infecções mistas ou
co-infecções), além de aumentarem as taxas de resistência microbiana (SOBEL et al.,
2013). A ausência de um teste de diagnóstico rápido e confiável para CVV, conduz o
clínico a prescrição de terapia empírica à mulheres que, apesar de sintomáticas, não
apresentam a doença (SOBEL, 2013). Essa problemática é verificada no presente estudo
onde 38,2% (n=21) das participantes consideradas sintomáticas e medicadas, apresentaram
cultura negativa para Candida sp. Outro fator preocupante é que, o autodiagnóstico de
CVV é uma prática comum entre as mulheres, e a compra de antifúngicos é livre, não
necessitando de prescrição médica (FERRIS et al., 2002).
Similar aos resultados encontrados neste trabalho, onde 75% dos isolados
causadores de CVV foram identificados como C. albicans, Brandolt et al., (2017)
verificaram o predomínio dessa espécie em 74,3% dos casos de CVV no Rio Grande do
Sul. Da mesma forma, Mahmoudi Rad et al (2011) demonstraram a presença dessa espécie
em 65,1% dos isolados vaginais no Iran e Gamarra et al., (2014) na cidade de Santa Fé na
Argentina, mostraram a prevalência de C. albicans em 85,9 % dos casos.
Outras espécies de Candida têm surgido como agentes de CVV, sendo que C.
glabrata é considerada como a segunda causa mais comum dessa doença. Neste trabalho,
C. glabrata foi verificada em 14% das amostras causadoras de CVV. Percentuais
semelhantes foram encontrados por Brandolt et al., (2017), e Rad et al., (2011) que
verificaram a identificação desta espécie em 14,3% e 13,1% respectivamente. Essa espécie
é considerada resistente ao fluconazol, mostrando que a identificação é de grande
importância. Nesse estudo, dois isolados de C. glabrata foram associados em infecção
mista, essa espécie é encontrada apenas na forma arredondada com blastoconídos não
sendo capaz de produzir hifas e invadir células epiteliais, causando poucos danos ao tecido.
Nos casos de infecções mistas, C. glabrata se liga as hifas produzidas por C. albicans, se
55
aprofundando no epitélio, e provocando danos extensivos nas células epiteliais (SILVA et
al., 2011; SWIDERGALL; FILLER, 2017).
O métodos de diluição em caldo padronizados pelo CLSI e pelo EUCAST são
ferramentas importantes no acompanhamento epidemiológico da resistência de Candida sp
aos antifúngicos (ALASTRUEY-IZQUIERDO et al., 2015).
A resistência aos azólicos como observada em nossos resultados tem sido relatada
em diversos estudos. Brandolt e colaboradores, (2017) no Estado do Rio grande do Sul,
Brasil relataram que a resistência de C. albicansfoi de 56,8% para fluconazol e de 54,1%
para o itraconazol. Wang et al. (2016), na China, verificaram durante o período de oito
anos, que resistência dos isolados de CVV ao fluconazol variou anualmente entre 4,8% a
21,0%. Kandeel e Elmitwalli (2017), relataram a resistência ao fluconazol para 17,3% das
amostras na Arábia Saudita. Da mesma forma, Elfeky e colaboradores (2016), verificaram
em isolados de Candida provenientes da cidade do Cairo, uma resistência para fluconazol
de 11,1%. Entre os fármacos de primeira escolha para o tratamento da CVV, utiliza-se o
fluconazol na dosagem única de 150 mg por uso oral, (PAPPAS et al., 2015). Neste
trabalho, embora com cultura negativa a maioria das participantes recebeu tratamento com
fluconazol. Assim as elevadas taxas de resistência aos derivados azólicos demonstrada no
presente estudo são preocupantes.
Os valores de suscetibilidade e resistência (breakpoints) dos isolados de Candida
para anfotericina B e nistatina não estão disponíveis nos documentos do CLSI, sendo que
os breakpoints para anfotericina B foram baseados em diferentes trabalhos, que
consideram resistência à anfotericina B os isolados que, apresentam concentração inibitória
miníma ≥ 1 µg/mL (DIEKEMA et al., 2009; PFALLER; DIEKEMA, 2012; FORNARI et
al., 2016; LOVERO et al., 2017). Para nistatina não se observou concordância entre os
autores, sendo determinado apenas se a CIM se apresentou com baixos ou elevados
valores. Basendo-se nesse parâmetro, dois dos isolados (5,5%) de CVV avaliados nesse
estudo foram resistentes a anfotericina B. Na cidade do Cairo, Elfeky et al., (2016)
verificaram resistência de 1,6% dos isolados de Candida a anfotericina B. No entanto, na
Arábia Saudita todos os isolados vaginais avaliados por Kandeel; Elmitwalli, (2017),
foram suscetíveis a esse poliênico.
A nistatina segundo alguns pesquisadores é um fármaco fungicida eficiente no
tratamento de CVV (MARTINS et al., 2012; CHOUKRI et al., 2014; FAN et al., 2015).
No presente estudo, este fármaco apresentou CIM variando entre 0,06µg/mL a 8µg/mL
56
para C. albicans. a espécie mais prevalente de CVV. Brandolt et al., (2017) mostraram
valores de CIM para diferentes espécies de Candida variando de 2 a >16 µg/mL.
Os agentes poliênicos, anfotericina B e nistatina estão disponíveis apenas para uso
tópico no tratamento da CVV (JOHAL et al., 2016). A nistatina seja medicamento baixo
custo disponível gratuitamente no Sistema Único de Sáude (SUS) (MARTINS et al.,
2012), além de ser uma opção segura para o tratamento de mulheres gestantes ou que estão
em processo de amamentação, pois é de menor toxicidade do que os derivados azólicos
(HALE; POMERANZ, 2002; MARTINS et al., 2012).Os fármacos tópicos requerem uma
administração prolongada de 7 a 14 dias, além de gerarem desconfortos na aplicação, dessa
forma as mulheres preferem antifúngicos de uso oral (MENDLING; BRASCH, 2012;
JOHAL et al., 2016)
As altas taxas de resistência aos derivados azólicos dos isolados associados aos
fatores de virulência detectados evidenciam o potencial patogênico das espécies de
Candida. A adesão às células do hospedeiro representa uma função importante na
instalação da infecção (MODRZEWSKA; KURNATOWSKI, 2015). C. albicans apresenta
grande aderência às células epiteliais, sendo considerada a mais patogênica entre as
espécies (CALDERONE; BRAUN, 1991; SWIDERGALL; FILLER, 2017). A capacidade
dos isolados de aderirem à superfície de células epiteliais variou de acordo com a espécie,
sendo que a capacidade de aderência de C.albicans às células epiteliais bucais foi
significativamente maior do que as demais espécies.
Da mesma forma que a aderência, a produção de proteinase por Candida sp
representa um fator de grande importância para que ocorra a infecção. Esta exoenzima
auxilia na invasão aos tecidos do hospedeiro, e na proteção da levedura contra a ação dos
antifúngicos e do sistema imunológico do hospedeiro (SILVA, 2014; RAPALA-KOZIK et
al., 2017).A elevada atividade enzimática verificada neste estudo apresenta similaridade a
encontrada por diferentes pesquisadores. Na cidade de Niterói no Rio de Janeiro, Ramos et
al., (2015), demonstraram que 60,3% dos isolados de Candida sp obtidos de pacientes com
candidíase cutânea eram produtores de proteinase. Alta produção dessa enzima também foi
verificada por Shirkhani et al., (2016) em isolados de secreção vaginal. Segundo Rapala-
Kozik et al., (2017), o maior conhecimento à respeito do papel das proteínases, torna-se
fundamental, uma vez que, essas enzimas representam um alvo promissor para o
tratamento de infecções fúngicas, principalmente, causadas por espécies de Candida
resistentes.
57
A fosfolipase age em fosfolipídios da membrana do hospedeiro animal para
aquisição de nutrientes pelo fungo. Esta enzima também auxilia na aderência às células
epiteliais do hospedeiro e é capaz de iniciar o processo inflamatório, pois atinge as células
do sistema imune. As espécies agentes de CVV nas mulheres estudadas, mostraram uma
atividade enzimática variando de moderada a alta. Atualmente, descreve-se a produção
desta exoenzima em várias espécies de Candida (ROCHA OLIVEIRA et al., 2013;
SHIRKHANI et al., 2016). Ramos et al., (2015), Fatahinia et al., (2017) e Fule et al.,
(2015) observaram respectivamente, a produção desta enzima em 100%, 91,8 % e 81,1%
de isolados de C. albicans. Shirkhand et al., (2016) observaram a produção desta enzima
em 9,1% dos isolados de C. topicalis.
Embora a atividade hemolítica das espécies de Candida tenha sido pouco relatada,
a habilidade dessas leveduras de usarem o ferro derivado da hemoglobina a partir da
produção de lise de eritrócitos, representa um importante fator de virulência, na patogênese
(MANNS et al., 1994). Similar aos resultados apresentados neste trabalho, Fatahinia et al.,
(2017) em Khuzestan, sudoeste do Irã e Riceto et al., (2015), em Uberlândia, Minas Gerais
também verificaram esta enzima em todas as espécies de Candida isoladas. A importância
desta enzima tem sido associada a resistência das espécies de Candida ao fluconazol, uma
vez que a depleção do ferro facilita a fluidez e difusão do fármaco tornando as células
fúngicas suscetíveis. Novas estratégias para o tratamento de candidíase envolvendo a
depleção de ferro, encorajam o desenvolvimento de agentes antifúngicos baseados neste
fator (PRASAD et al., 2006; KIM et al., 2012; FIGUEIREDO-CARVALHO et al., 2017).
58
7.CONCLUSÕES
O diagnóstico de CVV usando-se sinais e sintomas não caracterizaram a doença.
A melhor forma de diagnóstico, a cultura, confirmou o diagnóstico de CVV, o que mostra
a importância deste método. Tratamentos desnecessários como o uso indiscriminado de
antifúngicos e gastos indevidos com a terapia poderiam ser evitados, quando esta
metodologia fosse requisitada.
C. albicans, permanece sendo a espécie com maior prevalência, mas espécies
não-albicans também foram identificadas como agentes de CVV, mostrando a emergência
de C. topicalis e C. glabrata.
A resistência dos isolados ao fluconazol mostra a necessidade de testes de
suscetibilidade in vitro para as espécies de Candida. Este medicamento é o mais usado nos
casos de CVV podendo estimular o aumento de resistência de espécies de Candida.
A elevada suscetibilidade in vitro à anfotericina B, mostra-se de particular
importância, sendo esta uma boa opção terapêutica nos casos de espécies resistentes aos
azólicos.
De forma similar à anfotericina B, a nistatina apresentou CIM de baixos valores.
Este fármaco é de custo acessível e apresenta menor toxicidade do que os derivados
azólicos sendo uma boa opção no tratamento de gestantes.
A detecção de fatores de virulência como aderência e a produção de enzimas
hidrolíticas por todos os isolados mostra o poder patogênico de C. albicanse espécies não-
albicans, demonstrando que a compreensão desses fatores pode ser a chave para criação de
terapias mais eficazes de candidíase.
59
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76
ANEXOS
Anexo 1: Parecer do Comitê de Ética
77
78
Anexo 2: Termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE)
79
Anexo 3: Ficha controle
80
Anexo 4: Artigo á ser submetido
Original Article
Vulvovaginal candidiasis and susceptibility profile
Vulvovaginal candidiasis: evaluation of clinical diagnosis and in vitro susceptibility
profile
Andressa Santana Santosa; Ana Laura Sene Amâncio Zaraa; Fábio Silvestre Ataídesd,
Elisangela Gomes da Silvab; Vivianny A. Queiroz Freitasa, Carolina Rodrigues Costaa,
Thaísa Cristina Silvaa, Washington Luiz Ferreira Riosc, Maria do Rosário Rodrigues Silva1
aInstituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, Goiânia,
Goiás, Brazil bInstituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brazil cHospital das Clínicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brazil dPontifícia Universidade Católica- PUC, Goiânia, Goiás, Brazil
Correspondence: AS Santos, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública,
Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brazil. E-mail:
[email protected]. Phone 55-62-32096127.
81
Abstract
Objectives: To determine the predictive value (PPV) of the clinical diagnosis of VVC in
comparison to culture, and t verify in vitro susceptibility profile to antifungal agents used
in VVC therapy for Candida species isolated from the vaginal mucosa
Design: Prospective epidemiological study
Setting: Ambulatory of gynecology and obstetrics of Clinical Hospital, in Goiânia, Goiás.
Population: Samples of vaginal secretion from 55 women with clinical suspicion of
vulvovaginal candidiasis.
Methods: Eligible participants were asked standardized questions regarding demographic
data. Presence or absence of major CVV signs and symptoms, predisposing factors as well
as the drug used for disease were informed by each participant. Candida species were
identified by morphological and physiological methods. In vitro susceptibility of Candida
isolates to different antifungal agents was performed using the broth dilution assay to
determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of the antifungal agent.
Main outcome measures: evaluation of clinical diagnosis and susceptibility of Candida
species
Results: Among the 55 women, 34 had diagnostic confirmation by culture, representing a
positive predictive value (PPV) of 61.8%. The isolates were identified mainly as C.
albicans, followed by C. glabrata and C. tropicalis. High resistance to fluconazole, and
low MIC values for nystatin were observed for the isolates.
Conclusions: C. albicans was identified as the most common species as cause of CVV.
Laboratory confirmation by culture of Candida isolates is important for reliable diagnosis
of CVV. The high resistance observed to antifungal agents, allowed to conclude that
antifungal susceptibility testing should be performed before prescribing treatment.
Key words: Candida, Vulvovaginal candidiasis, In vitro susceptibility
82
Introduction
Vulvovaginal candidiasis (VVC) is a common fungal infection among women of
childbearing age. VVC represents a problem of global importance in public health because
it is estimated that two-thirds of adult women experience at least one episode of
vulvovaginal candidiasis during their lifetime and 50% of them experience VVC more than
once 1. Recurrent infections (RVVC), which is characterized by four or more infections
during one year affect about 9% of females 2. The infection is associated with vaginal
redness, soreness, burning, dyspaurenia, dysuria, vulvar dryness, itching, but these
symptoms are not sufficient for the clinician to reliably determine the cause of vaginitis.
Although itching is present in approximately 90% of patients, is not the most reliable
symptom, because only 35 to 40% of women with this symptom have CVV3–5.
Uncontrolled diabetes, use of oral contraceptives, genetic predisposition, deficiencies in
the immune system, hormone replacement therapy and microbiota alterations are known
predisposing factors for VVC 6.
The lack of a test, fast, reliable and inexpensive to confirm the diagnosis of VVC, can
make the clinicians adopt an empiric treatment, where unfortunately women with
symptoms and who do not present the disease are treated. Although the antifungal agents
as nystatin and azole derivatives as fluconazole and itraconazole are available for CVV has
been observed various degree of susceptibility of Candida species to frequently used
antifungal drugs 7. This characteristic emphasizes the importance of identification of
Candida in clinical specimens.
The present study uses the culture as a gold standard to evaluate the positive predictive
value (PPV) of the clinical diagnostic of VVC, and also verifies the in vitro susceptibility
to fluconazole, itraconazole, voriconazole, nystatin and amphotericin B of Candida yeasts
isolated from the vaginal mucosa of women suspected candidiasis
Materials and Methods
Study design
A prospective epidemiological study was conducted during the period from February 2016
to February 2017 at the Gynecology and Obstetrics outpatient clinic of the Clinical
Hospital in Goiânia/GO, Brazil. The study included samples of vaginal secretion from 55
women with clinical suspicion of vulvovaginal candidiasis. Demographic data and
presence or absence of major CVV signs and symptoms (burning, itching, dysuria,
83
dyspareunia and curd like discharge), predisposing factors as well as the drug used for
disease were informed by each participant.
Ethical considerations
The study was reviewed and approved by the Ethics Committee of Hospital das Clínicas of
Universidade Federal de Goiás. The women approved their participation in the study by
signing the informed consent form.
Collection, culture and identification
The collection of cervical-vaginal secretions was performed during the clinical
examination with the aid of sterile swabs, packed in a tube containing 0.85% physiological
solution previously sterilized. Vaginal swab specimens were then inoculated for culture on
sabouraud dextrose agar plus chloramphenicol, incubated at 37° C for 24-72 hours. The
isolates were identified using carbohydrate assimilation (glucose, sucrose, lactose,
galactose, maltose, xylose, raffinose, cellobiosis and trehalose) growth in CHROMagar
Candida (Difco® Laboratories, EUA), germ tube test production and presence de
chlamydospore on corn meal test.
Antifungal susceptibility testing
Susceptibility testing of the isolated species for antifungal agents, fluconazole (Pfizer®),
itraconazole (Janssen-Pharmaceuticals®), nystatin (Medley ™), amphotericin B (National
Chemical Pharmaceutical Union®), voriconazole (Pfizer®) were performed using broth
microdilution, proposed by CLSI, documents M27-A3 (2008) and M27-S4 (2012)
Each isolate was tested in duplicate and the visual readings were obtained after 48 hours
of incubation by turbidity, compared with the growth control. The minimal inhibitory
concentration (MIC) of azole derivatives was defined as one that inhibited 50% of yeast
growth and for the polyene derivatives as the lowest concentration that inhibited growth of
the microorganisms.
According to the MIC results for fluconazole, itraconazole, voriconazole and
amphotericin B, the isolates were classified as S for sensitive and R for resistant CLSI
2008, 2012 , Pfaller; Diekema8–10. The MIC50 and the MIC90 that inhibits 50% and 90%,
respectively, of the isolates tested were calculated. Quality control was performed using
standard strain, C. parapsilosis ATCC 22019.
84
Statistical analysis
The sociodemographic and clinical information of the participants were inserted in a
database and analyzed using the statistical program SPSS (version 21.0). To assess the
signs, symptoms and predisposing factors of the women, chi-square or Fisher's exact tests
were used. Statistical differences were considered significant with p <0.05. The positive
predictive value (PPV) of diagnosis was calculated taking into consideration the culture
analysis, which is considered the gold standard as a diagnosis of the disease.
Results
The sample consisted of 55 women with clinical suspicion of CVV, with ages between 14
and 64 years and mean±SD: 32,0 ±12,0 years (Table 1). Among the 55 women, 34 had
diagnostic confirmation by culture, representing a positive predictive value (PPV) of
61.8% (Table 1). Of the women with positive cultures, it was found that 16.4% had more
than four (4) episodes of the disease, characterized as recurrent. The distribution of
Candida species showed that C. albicans was the predominant species (75%) followed by
C. glabrata (14%) and C. tropicalis (11%).
Regarding the signs and symptoms used to diagnose CVV, the participants complained
of pruritus (74.5%), burning (52.7%), leukorrhea (98.2%), dysuria (49, 1%) and
dyspareunia (47.3%). A higher proportion of women with pruritus was found among those
diagnosed with candidiasis (p = 0.020) (Tabela 2). Among the predisposing factors, 18.2%
of the participants were pregnant, 3.6% were diabetic, 16.4% used oral contraceptives and
9.1% had used broad-spectrum antibiotics for a long time (Table 1). There is no significant
relation between the predisposing factors and CVV.
All patient received treatment. Fluconazole was the most indicated drug (80%) for
treatment, followed by clotrimazole (9.1), and miconazole ketoconazole, secnidazole,
nystatin and itraconazole (3.6%). The combined use of drugs was indicated for three (3)
participants. The results showed that only 26 (59.1%) of women that used fluconazole and
eight (30.9%) that used other antifungal were culture positive for Candida.
In vitro activity of antifungals showed that Candida species had high resistance to azole
derivatives. The rates of resistance to fluconazole and itraconazole were of 38.8% and
47.2% respectively. The results revealed that amphotericin B exhibited excellent in vitro
85
activity with only two isolates resistant to this drug. MICs with low values were verified to
nystatin against Candida albicans (Table 2).
Discussion
Candidiasis is a major vaginal infection, affecting mainly women during their reproductive
age at least once in their life span 11. The present study revealed high prevalence rate
among the appropriate symptomatic patients in the age group of second and third decade.
Samal et al, 12 showed that the age group 24-34 years, had a frequency of 49.5% of vaginal
candidiasis, indicating women of childbearing age groups are more vulnerable to this
infection.
The comparison between clinical suspicion and culture, gold standard of diagnostic of
VVC was performed in some studies. In Brazil, Rosa and Rumel, 13 found a PPV of 43%,
in Egypt Farhan et al., 14 of 76.2% and Vijayalakshmi et al., 15 in the city of Pune in India,
found a PPV of 88.9% when compared symptoms and microbiologic diagnostic of VVC.
The results of our research, showed a PPV of 61.8% when compared the signals and
symptoms as vaginal pruritus, leukorrhea, dysuria, dyspareunia and burning, to the gold
standard. World health organization recommends that all women with abnormal vaginal
discharge could be treated empirically 16. Microbiologic diagnosis is the best method and
thus many women would receive antifungal therapy unnecessarily. Antifungal therapy is
associated with renal and hepatic complications and hypersensivity reactions, in addition to
increasing rates of microbial resistance 17. Besides in this present study, 38.2% (n=21) of
participants were treated with antifungal agents, but presented negative culture for Candida
sp.
The occurrence of 16.4% of RVVC, characterized by four or more episodes of the
disease in the period of one year was found in our study. RVVC could occur in
consequence of the widespread availability of over the counter (OTC) antifungal agents 18.
According to Sobel, 2016, the physician diagnostic inaccuracies also could be cause of
RVVC. The probability that VVC will progress to RVVC is high. The analyses from 6000
women, performed by Foxman et al.,2 showed that more than one fifth of women reporting
CVV also reported RVVC (overall 9%)
C. albicans, the species most common in our work, is considered as the most pathogenic
of the gender, related to CVV. Mahmoudi Rad et al 19 demonstrated the presence of this
species in 65.1% of the vaginal isolates in Iran. Gamarra et al., 20 in the city of Santa Fe in
86
Argentina, showed the prevalence of C. albicans in 85.9% of VVC cases. Other species of
Candida have appeared as CVV agents 21. It should also be highlighted that, C. glabrata is
known as the second most common cause of this disease, and have greater resistance to
antifungals 22. In this work, C. glabrata was verified in 14% of CVV, highlighting the
importance of correct identification of the etiologic agent. Similar percentages were found
by Brandolt et al., 21, e Mahmoudi Rad et al., 23 which verified the identification of this
species in 14.3% and 13.1%, respectively. Interestingly, two isolates of C. glabrata
obtained in our work were associated in co-infection, being one with C. albicans and the
other with C. tropicalis. C. glabrata is found only as yeast in vivo not being able to
produce hyphae. However, in cases of mixed infections, C. glabrata binds the hyphae of C.
albicans, causing extensive damage to epithelial cells 24,25.
Although azole derivatives have been used in the treatment and prophylaxis of VVC,
studies in vitro have shown resistance of Candida spp to these drugs. In our work, high
resistance to azole derivatives were found. Brandolt et al., 21 in the State of Rio Grande do
Sul, Brazil in 2013 reported resistance of 42% of the isolates to fluconazole, and of 48% to
itraconazole. Kandeel e Elmitwalli, 26, reported resistance to fluconazole for 17.3% of
Candida isolates in Saudi Arabia. Due to inter individual variation, drug characteristics and
the variable behavior of each individual, the results in vitro tests of susceptibility do not
always reflect what occurs in vivo. Even so the in vitro susceptibility of an infecting
organism to the antifungal agent constitutes an important role in tracking for successful
therapy, because high values of minimum inhibitory concentration may be associated with
resistance, indicating that a different treatment is necessary 27. In this study, although with
negative culture, most participants received fluconazole treatment. Unfortunately we did
not follow the patients. Thus the high rates of resistance to the azole derivatives
demonstrated in the present study are worrisome.
Based on our findings, and considering resistance to amphotericin B, values of
minimum inhibitory concentration ≥ 1 μg / mL as resistant, only two isolates were resistant
to this drug. Amphotericin is the most effective drug against Candida isolates 26,28. The
susceptibility parameters of Candida species associated with VVC to nystatin, are not
established being determined only if the MIC have low or high values. Low MICs values
were found to Candida albicans, while to non albicans species we found MICs value of 16
µg/mL. According to Consolaro et al., 29, nystatin has excellent in vivo activity against C.
albicans, but with low cure rates against non-albicans species. This drug has been used as
87
one of the principal topical treatments of VVC in Brazil, it is freely available in the Unified
Health System (SUS) in this country and besides relatively safe option for the treatment of
pregnant women or who are in the process of lactation 21,29,30.
Conclusion
In conclusion, the results of this study showed C. albicans as the most common species as
cause of CVV. The clinical diagnosis of CVV has high sensitivity and low specificity, thus
laboratory confirmation by culture of Candida isolates is important for reliable diagnosis
of CVV. The high resistance observed to antifungal agents, allowed to conclude that
antifungal susceptibility testing should be performed before prescribing treatment.
Conflict of interest
None of the authors have declared any conflict of interest.
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90
Tables
Table 1: Characteristics of women with suspicion of vulvovaginal candidiasis at the
Hospital das Clínicas in Goiânia-GO, 2016-2017.
Total Culture (n=55)
positive (n=34)
negative (n=21) p-value
Signals and symptoms n (%) n (%) n (%) Itching 41 (74.5) 29 (70.7) 12 (29.3) 0.020* Burning 29 (52.7) 20 (69.0) 9 (31.0) 0.249* Like-curd discharge 54 (98.2) 33 (61.1) 21 (38.9) 1.000** Dysuria 27 (49.1) 18 (66.7) 9 (33.3) 0.467* Dyspareunia 26 (47.3) 18 (69.2) 80 (30.8) 0.284* Predisposing factors Gestation 10 (18.2) 7 (70.0) 3 (30.0) 0.725** Diabetes mellitus 2 (3.6) 2 (100.0) - 0.519** Use of oral contraceptives 9 (16.4) 6 (66.7) 3 (33.3) 1.000** Use of antibiotics 5 (9.1) 4 (80.0) 1 (20.0) 0.639** * Chi-Square Test (p<0,05). ** Fisher's Exact Test (p<0,05). Significant differences in bold
91
Table 2: Variation of the minimum inhibitory concentration (μg / mL) of the different
antifungals on Candida isolates obtained from vaginal samples of women attended at
Hospital das Clínicas, Goiânia, 2016-2017.
Antifungals Species (n)
C. albicans(27) C. glabrata (5) C. topicalis (4) Fluconazole (µg/mL) Variation 0.12-64 0.5-4.0 1.0-32 MIC 90 64 4 32 MIC 50 4 2 2 Susceptible(n = 22) 14 5 3 Resistant (n=14) 13
1
Itraconazole (µg/mL) Variation 0.12-16 1.0-4.0 0.5-1.0 MIC 90 16 4 1 MIC 50 1 1 0,5 Susceptible (n=19) 12 3 4 Resistant (n=17) 15 2
Amphotericin B (µg/mL) Variation 0.25-1.0 0.5-2.0 1.0-2.0 MIC 90 1 2 2 MIC 50 0.5 1 1 Susceptible (n=32) 26 4 2 Resistant (n=4) 1 1 2 Nystatin (µg/mL) Variation 0.06-8 1.0-16 4.0-16 MIC 90 8 16 16 MIC 50 4 2 8 Susceptible (n=26) 21 4 1 Resistant (n=10) 6 1 3
