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Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Ciências Biomédicas Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas Caracterização diferencial das cardiomiopatias – Distribuição dos componentes da MEC (fibronectina, colágeno I e III ) e transglutaminase nas cardiomiopatias em humanos. Ana Patrícia Cabral de Lima Orientadora: Profa. Dra. Christina Maeda Takiya 2007 Ana Patrícia Cabral de Lima
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Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Ciências Biomédicas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas
Caracterização diferencial das cardiomiopatias – Distribuição dos componentes da MEC
(fibronectina, colágeno I e III ) e transglutaminase nas cardiomiopatias em humanos.
Ana Patrícia Cabral de Lima
Orientadora: Profa. Dra. Christina Maeda Takiya
2007 Ana Patrícia Cabral de Lima
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Caracterização diferencial das cardiomiopatias – Distribuição dos componentes da MEC
(fibronectina, colágeno I e III) e da transglutaminase nas cardiomiopatias em
humanos.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Morfológicas.
Orientador: Profª. Drª. Christina Maeda Takiya
Rio de Janeiro Fevereiro / 2007
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Caracterização diferencial das cardiomiopatias – Distribuição dos componentes da MEC( fibronectina,
colágeno I e III )e da transglutaminase nas cardiomiopatias em humanos.
Ana Patrícia Cabral de LIma
Orientador: Profa. Drª. Christina Maeda Takiya
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Morfológicas.
Examinadores:
__________________________________________ Prof. Dr. Claúdia Mermelstein – Departamento de Histologia e Embriologia-UFRJ _________________________________________ Prof. Dr. Evandro Tinoco Mesquita - UFF _________________________________________ Prof. Dr. Nazareth S. L. Meirelles – FIOCRUZ _________________________________________ Prof. Dr. Maria Eugênia Leite Duarte (Revisora e Membro suplente) Departamento de Histologia e Embriologia-UFRJ _________________________________________ Prof. Dr. Regina C. S. Goldenberg ( Membro suplente) Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho-UFRJ _________________________________________ Prof. Dr.Vivaldo Moura Neto - Coordenador do Curso de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas-UFRJ
Rio de Janeiro Fevereiro / 2007
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Lima,Ana Patrícia Caracterização diferencial das cardiomiopatias – Distribuição dos componentes da MEC( fibronectina, colágeno I e III )e da transglutaminase nas cardiomiopatias em humanos / Ana Patrícia Cabral de Lima. Rio de Janeiro, 2007. 91 p. Dissertação – (Mestrado em Ciências Morfológicas) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Ciências Biomédicas, 2007. Orientador: Christina Maeda Takiya 1.Cardiomiopatia. 2. MEC 3. Transglutaminase. – Teses. I. Takiya, Christina Maeda (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Pós-Graduação em Ciências Morfológicas. III. Título.
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À Regina, minha mãe.
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AGRADECIMENTOS
____________________________
A Deus, não só por ter estado ao meu lado como também por ter me carregado em seus braços em muitos momentos de minha vida.
À Minha família ( Regina, Fernando, Cristina, Francisco, Lenilde, Clara e Lívia) pelo amor, credibilidade e suporte ao longo de toda minha vida.
À Professora Christina Takiya, minha orientadora e responsável pelo meu conhecimento científico e por ter me acolhido em seu laboratório. Ao Professor Radovan Borojevic por ter recebido no laboratório.
Aos amigos Priscila Frazão, Isabella de Assis, Bernardo Oliveira Pascarelli, Leonardo Monção, Vivian Y. Samoto, Aline Cavaliere e Leandro Miranda por toda a ajuda, paciência e pelo enorme carinho oferecido a mim durante esses anos.
Á Professora e amiga Maria Eugênia Leite Duarte, não só pela revisão deste trabalho, como também pela dedicação e carinho nestas últimas semanas.
Aos amigos Cecília Vianna, Luciana Freitas, Fabiana , Fernanda, Cláudio Monteiro, Cristiane, Auxiliadora , Eliane Pedra, Maisa, Claudia e Rita Lauria por todo o apoio e incentivo.
Aos colegas de laboratório Túlio, Silvana, Guilherme, Daniel, Leonardo, Luciene, Lorena, Edna, Michel, Alex que compartilharam comigo meus momentos de alegria e tristeza.
Ao professor Luis Eurico Nasciutti por toda a ajuda e compreensão a mim dedicada neste trabalho.
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RESUMO
As cardiomiopatias compreendem um grupo de doenças cujo diagnóstico é
inespecífico e seu prognóstico é, predominantemente, baseado na clínica
dos pacientes e secundariamente nas alterações morfológicas do tecido
cardíaco. Nosso estudo verificou a distribuição diferencial dos elementos da
matriz extracelular (fibronectina e colágenos I e III) e da transglutaminase
(tTG) em biópsias de pacientes com cardiomiopatias dilatada (n=4) e
inflamatória (n=3), comparando-as com casos de miocardite (n=10), e com
um grupo controle (n=4) de pacientes sem doenças cardíacas. Sendo
utilizado o Picro Sírius Red para a identificação do colágeno, e a técnica de
imunoperoxidase para a identificação dos componentes da matriz e
transglutaminase. Foi observada maior reatividade para a transglutaminase
acompanhando a fibronectina no grupo das miocardites, seguida pelo grupo
das cardiomiopatias e pelo grupo controle (p<0,05). O colágeno total foi
maior no grupo das cardiomiopatias em relação ao grupo das miocardites
(p<0,05), com predominância do colágeno III. Não houve diferenças
significativas na distribuição e quantidade destes componentes entre os
grupos de cardiomiopatia dilatada e inflamatória. A presença de maiores
quantidades de tTG e a fibronectina nos casos de miocardite seguido pela
cardiomiopatia, reflete sua íntima ligação e confirma seu papel no processo
inflamatório e fibrose.
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ABSTRACT
Cardiomyopathy encompasses a group of diseases wich the diagnosis is
unspecific and the prognosis is mainly based on the clinical picture and in a
second instance on the morphological changes from the myocardial tissue.
In this study we aimed to verify the differential distribution of ECM
elements (fibronectin, types I and III collagen) and transglutaminase (tTG)
in endomyocardial biopsies from patients with dilated (n=4) and
inflammatory (n=3) cardiomyopathy. We also compare these findings with
myocarditis cases (n=10) and a control group (n=4)with normal heart
function. Histological sections were stained with Picro Sírius Red for
collagen detection and were immunostained for transglutaminase and ECM
components. It was observed a major reactivity for transglutaminase and for
fibronectin in the myocarditis group, followed by the cardiomyopathy and
control group (p<0,05) respectively. The amount of total collagen was
increased in the cardiomyopathy group in comparison with the myocarditis
group (p<0,05) due to an increase in type III collagen. Also, we didn’t
observe significant differences in the distribution and in the amount of these
components between the groups of dilated and inflammatory
cardiomyopathy. The presence of high amounts of tTG and fibronectin in
the myocarditis reflect their close connection and ensure their roles in the
inflammatory process and fibrosis.
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES E DE TABELAS Figura 1- Representação anatômica e histológica do coração normal ........................05 Figura 2- Células e fibras presentes na matriz extracelular intersticial.....................17 Figura 3- Distribuição estrutural de fibras colágenas................................................24 Figura 4- Prancha da apresentação histológica através da técnica de Hematoxilina-Eosina dos grupos controle, miocardite e cardiomiopatia ..............................................50 Figura 5- Prancha da identificação do colágeno total através da técnica de Picro Sírius Red nos grupos controle, miocardite e cardiomiopatia...................................................52 Figura 6- Prancha da reatividade do anticorpo anti-HLA-DR nos grupos controle, miocardite e cardiomiopatia............................................................................................54 Figura 7- Prancha da reatividade do anticorpo anti-transglutaminase nos grupos controle, miocardite e cardiomiopatia.............................................................................56 Figura 8- Prancha da reatividade do anticorpo anti-fibronectina nos grupos controle, miocardite e cardiomiopatia............................................................................................58 Figura 9- Prancha da reatividade do anticorpo anti-colágeno I nos grupos controle, miocardite e cardiomiopatia............................................................................................60 Figura 10- Prancha da reatividade do anticorpo anti-colágeno III nos grupos controle, miocardite e cardiomiopatia............................................................................................62 Figura 11- Gráfico da distribuição da transglutaminase nos grupos controle, miocardite e cardiomiopatia............................................................................................64 Figura 12- Gráfico da distribuição do colágeno I nos grupos controle, miocardite e cardiomiopatia.................................................................................................................64 Figura 13- Gráfico da distribuição do colágeno III nos grupos controle, miocardite e cardiomiopatia.................................................................................................................65 Figura 14- Gráfico da distribuição da fibronectina nos grupos controle, miocardite e cardiomiopatia.................................................................................................................65 Figura 15- Gráfico da distribuição da transglutaminase nos grupos de cardiomiopatia dilatada e inflamatória.....................................................................................................66 Figura 16- Gráfico da distribuição do colágeno I nos grupos de cardiomiopatia dilatada e inflamatória.....................................................................................................66 Figura 17- Gráfico da distribuição do colágeno III nos grupos de cardiomiopatia dilatada e inflamatória.....................................................................................................67 Figura 18- Gráfico da distribuição da fibronectina nos grupos de cardiomiopatia dilatada e inflamatória.....................................................................................................67 Figura 19- Gráfico da concentração do colágeno total nos grupos controle, miocardite e cardiomiopatia..............................................................................................................68 Figura 20- Gráfico da concentração do colágeno I nos grupos controle, miocardite e cardiomiopatia.................................................................................................................69 Figura 21- Gráfico da concentração da colágeno III nos grupos controle, miocardite e cardiomiopatia.................................................................................................................70 Figura 22- Gráfico da concentração da transglutaminase nos grupos controle, miocardite e cardiomiopatia...........................................................................................71 Figura 23- Gráfico da concentração da fibronectina nos grupos controle, miocardite e cardiomiopatia.................................................................................................................72 Figura 24- Gráfico da concentração da transglutaminase nos grupos de cardiomiopatia dilatada e inflamatória.....................................................................................................73
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Figura 25- Gráfico da concentração da fibronectina nos grupos de cardiomiopatia dilatada e inflamatória.....................................................................................................74 Figura 26- Gráfico da concentração do colágeno total nos grupos de cardiomiopatia dilatada e inflamatória.....................................................................................................74 Figura 27- Gráfico da concentração do colágeno I nos grupos de cardiomiopatia dilatada e inflamatória.....................................................................................................75 Figura 28- Gráfico da concentração do colágeno III nos grupos de cardiomiopatia dilatada e inflamatória.....................................................................................................75 Tabela 1- Classificação de Dallas para a miocardite...................................................10 Tabela 2- Características dos anticorpos utilizados ....................................................44 .
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SUMÁRIO
1- Introdução ......................................................................................01 2- Revisão da literatura.......................................................................03 2.1- Anatomia e histologia do coração.........................................03 2.2- Miocardite e cardiomiopatia .................................................05 2.2.1- Miocardite .......................................................................05 2.2.2- A imunidade na miocardite.............................................07 2.2.3- Aspectos morfológicos na miocardite ............................11 2.2.4- Cardiomiopatias ..............................................................12 2.2.5- Aspectos morfológicos da CMD ....................................14 2.3- Cardiomiopatia secundária à miocardite ...............................15 2.4- A matriz extracelular .............................................................17 2.4.1- A MEC e seus principais componentes no sistema cardiovascular .....................................................................................18 2.4.2- A MEC na reação inflamatória e na remodulação cardiovascular......................................................................................21 2.5- Colágenos tipo I e tipo III .......................................................23 2.5.1- Estrutura............................................................................23 2.5.2- Secreção ............................................................................24 2.5.3- O colágeno e o coração.....................................................26 2.5.4- O colágeno nas cardiopatias .............................................27 2.6- Fibronectina ............................................................................28 2.6.1- Fibronectina nas cardiopatias ...........................................30 2.7- Transglutaminase tecidual ......................................................31 2.7.1- A tTG na resposta inflamatória ........................................33 2.7.2- A tTG na cicatrização .......................................................34 2.7.3- Interação MMPs e tTG na cicatrização ............................35 2.7.4- A tTG e o tecido cardíaco .................................................36 3- Objetivos ........................................................................................38 4- Material e métodos........................................................................39 4.1- Obtenção das amostras de miocárdio .....................................39 4.2- Processamento das amostras...................................................40 4.3- Analise histopatológica...........................................................40 4.4- Imunohistoquímica .................................................................42 4.4.1- Protocolo ..............................................................................42 4.5- Análise descritiva da distribuição das proteínas transglutaminase, fibronectina, colágenos tipos I e III.....................................................45 4.6- Histomorfometria....................................................................45 4.7- Análise estatística ..................................................................45 5- Resultados ......................................................................................46 5.1- Análise histopatólogica...........................................................46 5.2- Análise qualitativa da imuno-marcação..................................47
5.2.1- HLA-DR...........................................................................47
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5.2.2- Proteínas da matriz e transglutaminase............................47 5.3- Estudo histomorfométrico.......................................................68 6- Discussão........................................................................................76 7- Conclusões .....................................................................................84 8- Perspectivas....................................................................................85 Referências bibliográficas ...................................................................86
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LISTA DE ABREVIAÇÕES 1 - ANOVA ............................................................Análise de variância 2 - CMD............................................................Cardiomiopatia dilatada 3 - CM.............................................................................Cardiomiopatia 4 - CTRL................................................................................... Controle 5 - DP............................................................................... Desvio padrão 6 - ECM ....................................................................Matriz extracelular 7 - HE.................................................................... Hematoxilina-Eosina 8 - HLA-DR.............................Antígeno leucocitário humano região D 9 - IL-1.............................................................................. Interleucina 1 10 - IL-2 ........................................................................... Interleucina 2 11 - MEC ..................................................................Matriz extracelular 12 - MHC..............................Complexo de histocompatibilidade maior 13 - MIOC .............................................................................Miocardite 14 - MMP ....................................................................Metaloproteinase 15 - mRNA ........................................... Ácido ribonucléico mensageiro 16 - OMS ............................................... Organização mundial de saúde 17 - OP............................................................................... Osteopontina 18 - TGF-β..........................................Fator de crescimento tumoral - β 19 - TIMP ....................................Inibidor tecidual de metaloproteinase 20 - TNF- α .................................................... Fator de necrose tumoral 21 - tTG ........................................................ Transglutaminase tecidual
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1- INTRODUÇÃO:
Mesmo nos dias atuais ainda existe uma grande dificuldade no
diagnóstico da miocardite, principalmente a de origem viral. Pela
inexistência de métodos moleculares para uso clínico, o diagnóstico é feito
por exclusão com outras causas de miocardites. Além disso, mesmo com a
realização de biópsias endomiocárdicas com fins diagnósticos, as análises
destas nem sempre são conclusivas pelo fato das miocardites serem lesões
multifocais, nem sempre representadas nos fragmentos examinados. Soma-
se a isto o fato de que o diagnóstico histopatológico deste tipo de material é
bastante subjetivo mesmo com a utilização de critérios já consagrados como
a classificação de Dallas. A associação de métodos imunohistoquímicos que
visam verificar a distribuição de proteínas do complexo de
histocompatibilidade maior do tipo II como o HLA-DR, tem servido como
adjuvante na caracterização da ativação celular inflamatória e de
autoimunidade (WOJNICZ e cols., 1998).
Estudos experimentais levam a crer que a miocardite inflamatória ou
não, pode se apresentar ou evoluir para uma cardiomiopatia crônica.
Pretendemos com o presente trabalho verificar tanto do ponto de vista
qualitativo como quantitativo a presença e distribuição dos componentes da
matriz extracelular cardíaca (fibronectina, colágenos tipo I e tipo III) e da
transglutaminase tecidual. Estas proteínas foram selecionadas por
desempenhar um papel importante na cicatrização pós-inflamatória e
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xv
conseqüente fibrose que se estabelece na miocardite e cardiomiopatias,
caracterizando o perfil de cada uma delas.
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2- REVISÃO DE LITERATURA 2.1 - Anatomia e histologia do coração
O coração normal pesa aproximandamente 250 a 350g, com
espessura da parede livre do ventrículo esquerdo com 1,3 a 1,5 cm
(KUMAR e cols., 2005). Ele é constituído por quatro câmaras, os átrios
direito e esquerdo e ventrículos direito e esquerdo, através das quais o
sangue é bombeado. A saída das câmaras é guardada pelas valvas cardíacas
e os septos interatrial e interventricular separam o lado direito do lado
esquerdo do coração. O átrio direito recebe o sangue proveniente da
circulação através das veias cavas superior e inferior. O ventrículo direito
recebe o sangue do átrio direito e o envia para os pulmões. O átrio esquerdo
recebe o sangue proveniente dos pulmões através das veias pulmonares e o
ventrículo esquerdo recebe o sangue do átrio esquerdo e o envia para a aorta
(Figura 1A).
A parede cardíaca é constituída pelo músculo cardíaco, esqueleto
fibroso e um sistema de impulso-condução, sendo dividida em três camadas.
A camada mais externa é denominada epicárdio e é constituída por células
mesoteliais sobrepostas ao tecido conjuntivo. Nesta camada se encontram os
vasos sangüíneos e nervos, que são circundados por tecido adiposo. O
miocárdio representa a camada intermediária e é constituído pelo músculo
cardíaco, que representa o principal componente do coração. A terceira
camada é representada pelo endocárdio e é constituída por endotélio e
3
xvii
tecido conjuntivo subendotelial, uma camada média de tecido conjuntivo e
células musculares lisas e uma camada mais profunda de tecido conjuntivo,
contínua com o tecido conjuntivo do miocárdio. As valvas são estruturas
vasculares composta de tecido conjuntivo com endocárdio suprajacente
(ROSS e cols., 2005).
O miocárdio, que representa o principal componente do coração, é
composto por feixes de células musculares estriadas, os chamados
cardiomiócitos. Estes exibem cinco componentes principais: membrana
celular (sarcolema) e túbulos; retículo sarcoplasmático; elementos
contráteis; mitocôndrias e núcleo. A integração funcional dos
cardiomiócitos é feita através dos discos intercalares, estruturas que ligam
as células entre si através de junções intercelulares especializadas que
permitem o acoplamento mecânico e iônico (KUMAR e cols., 2005) (Figura
1B).
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2.2- Miocardite e cardiomiopatia
2.2.1- Miocardite
A doença cardíaca é a causa mais prevalente de morbidade e
mortalidade em países ricos (PENNINGER e cols., 2000). A miocardite,
definida como um processo inflamatório do miocárdio, que resulta no dano
dos cardiomiócitos (KUMAR e cols., 2005), nos últimos anos tem
despertado grande interesse dentre as cardiopatias, principalmente quanto a
sua terapêutica. Entretanto, para definição de um tratamento adequado, é
necessário que a patogênese seja bem definida e é, neste ponto, que se
Figura 1. (A) Representação anatômica do coração através de um corte coronal expondo suas câmaras e vasos principais. (B) Fotomicrografia de um corte longitudinal do miocárdio. Observar as fibras musculares (seta), o núcleo central (N) e discos intercalares (I). (Figuras retiradas do site www.corpohumano.hpg.tg.com.br (A) e página starklab.slu.edu/physio/circulation.htm (B)).
A B
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encontra um dos maiores obstáculos, devido à existência de pontos obscuros
na sua fisiopatologia.
A miocardite é uma doença insidiosa, em geral assintomática, onde
informações importantes sobre sua epidemiologia são dadas através de
estudos de necrópsias (FELDMAN e McNAMARA, 2000). Ela está
relacionada predominantemente a infecções, embora possa ocorrer devido a
reações alérgicas e doenças sistêmicas. Nas infecções o agente biológico
causaria o dano no coração segundo uma seqüência de eventos: invasão do
miocárdio, produção de toxinas e lesão mediada imunologicamente.
Acredita-se que esta última etapa seja o principal mecanismo, pois já foi
observado que a disfunção cardíaca por vezes aumenta após a erradicação
do agente que iniciou o processo (BRAWNWALD, 1992). Entretanto, a
resposta imune específica que leva ao dano miocárdico, não está
completamente definida (FUSTER e cols., 2001).
A seqüência de eventos e as bases moleculares da patogenia da
miocardite foram definidas em modelos murinos, utilizando na maioria
desses estudos o citomegalovirus B3. Os resultados mostraram que o
aparecimento da doença depende do painel genético, da idade e do sexo do
hospedeiro, do estado imunológico e nutricional e da resposta imunológica
(inata) à infecção (COOPER, 2003).
6
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2.2.2-A imunidade na miocardite
A evidência de que a auto-imunidade ocorre em muitas miocardites é
forte, e isto implica num número relativo de auto-antígenos, como miosina e
actina cardíaca, moléculas da membrana de células endoteliais, laminina e
glicoproteínas da matriz extracelular. O mimetismo molecular entre
moléculas do hospedeiro e dos agentes infecciosos contribui para o processo
patológico e pode ser dominante em alguns pacientes. O começo da
infecção pode ser por um processo de auto-sensibilização, através da
liberação de antígenos armazenados no coração. Por sua vez, este
mecanismo estimularia o reconhecimento de vírus e auto-antígenos por
células dendríticas, e posteriormente promoveria a apresentação do antígeno
no tecido linfóide secundário (COOPER, 2003). As células dendríticas
desempenham um papel importante nas miocardites auto-imunes, iniciando
e provocando a inflamação (YOKOYAMA, 2000). Entretanto, a maioria
desses estudos foram realizados em miocárdio de ratos, não tendo ficado
esclarecido se as células dendríticas são tão importantes na resposta imune
humana como nos roedores.
As células dendríticas são originadas na medula óssea e expressam
moléculas de complexo de histocompatibilidade maior (MHC) classe II,
sendo as células apresentadoras de antígenos mais potentes e as únicas
capazes de estimular as células T naive. Existem vários subtipos de células
dendríticas, mas dois tipos são bem reconhecidos até o presente momento:
uma subpopulação derivada da linhagem mielóide e outra da linhagem
7
xxi
linfóide, podendo se apresentar sob as formas madura e imatura. A forma
imatura captura de forma eficiente antígenos, mas tem capacidade de
processamento e de apresentação deficientes. Durante o processo de
maturação, desencadeado por um sinal inflamatório por patógenos ou por
dano tecidual, ela sofre alterações que a torna eficiente na apresentação de
antígenos capturados durante sua ativação, permanecendo inativa para o
processamento de antígenos encontrados posteriormente. No entanto os
mecanismos que levam a essas alterações são controversos (WILSON e
cols., 2003). Sabe-se que as células apresentadoras de antígeno no
miocárdio são o alvo principal das células T auto-reativas durante a fase
inicial da doença cardíaca auto-imune. Além disso, o aumento da expressão
do MHC classe II nas células intersticiais cardíacas precede a infiltração
celular de linfócitos T, com importantes conseqüências na patogênese da
reposta auto-imune no miocárdio (PENNINGER e BACHMAIER, 2000) .
A identificação das células dendríticas no coração é extremamente
difícil com a aplicação dos métodos de rotina. Mesmo com técnicas de
imunohistoquímica não é possível caracterizar este tipo celular em material
pós-fixado em formaldeído. Além disso, ainda não há um consenso quanto
aos marcadores ideais para serem utilizados em biópsias endomiocárdicas
humanas (BENVENUTI e cols,. 2000). Aparentemente a morfologia das
células dendríticas cardíacas é um pouco diferente das demais, assim como
sua marcação imunohistoquímica, variando inclusive dentro das fases aguda
e subaguda da miocardite (YOKOYAMA, 2000).
8
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WOJNICK e cols. (1998), baseados no fato da expressão do
complexo de histocompatibilidade maior (MHC) ser evidente em biópsias
endomiocárdicas de pacientes com suspeita clínica de miocardite,
realizaram um estudo que visava caracterizar nestes pacientes o aumento da
expressão do MHC classe I (HLA-ABC) e classe II (HLA-DR). A hipótese
para o estudo se baseou no fato das células dendríticas e endoteliais serem
reconhecidas por exibir no coração normal marcação mais intensa para
MHC e pelo fato da sua expressão estar aumentada nos pacientes com
miocardite e cardiomiopatia inflamatória. Na avaliação imunohistoquímica
da expressão do MHC classe I e classe II, utilizando como marcadores os
anticorpos HLA-ABC e HLA-DR, foi estabelecido um sistema de avaliação
semiquantitativo (0 a 4+) para a avaliar a expressão dos antígenos. O score
0 correspondia a ausência de marcação ou marcação fraca de células
endoteliais e intersticiais e o score 4+ correspondia a marcação difusa de
células endoteliais e de miócitos. Neste estudo os graus de expressão 3+ e
4+ foram considerados como tendo uma inflamação mediada
imunologicamente. Atualmente, o critério de avaliação mais utilizado nas
biópsias endomiocárdicas, com suspeita de miocardite, é o critério de Dallas
(ARETZ, 1987), Tabela 1.
Nesta classificação é feita uma avaliação subjetiva de uma primeira
biópsia e posteriormente de biópsias subseqüentes levando em consideração
a presença de infiltrado inflamatório descrito como leve, moderado ou
severo, e ainda focal, confluente ou difuso, do dano ao cardiomiócito
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xxiii
(miocitólise) relacionado ao infiltrado inflamatório e da fibrose, que quando
presente deve ser descrita como intersticial, endocárdica ou de substituição
e também como leve, moderada e severa. A identificação e quantificação de
células inflamatórias no interstício cardíaco, assim como a identificação de
focos de miocitólise são altamente dependentes da experiência do
observador. Alem disso a lesão tem ainda um caráter multifocal, o que faz
com que esta classificação seja considerada de baixa sensibilidade e alta
variabilidade diagnóstica, levando a necessidade de se estabelecer uma
forma de avaliação mais precisa.
Tabela 1: Classificação de Dallas (ARETZ, 1987)
Critérios Miocardite Miocardite Borderline
Ausência de Miocardite
Miocitólise Presente Ausente Ausente
Infiltrado inflamatório
Linfocitário presente
Linfocitário Esparso
Ausente
Fibrose Presente ou não
Presente ou não
Presente ou não
Ao contrário da investigação histológica, os marcadores imunológicos da
inflamação, como por exemplo o HLA-DR, estão amplamente distribuídos
no miocárdio. A utilização deste marcador possivelmente reduziria a
margem de erro e justificaria o seu uso como método adjuvante para a
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xxiv
caracterização do processo inflamatório no miocárdio (WOJNICK e cols.,
1998).
2.2.3- Aspectos morfológicos da miocardite
O curso clínico dos pacientes com miocardite é extremamente
variável e depende da extensão do envolvimento miocárdico (WINTERS e
cols.,2001). LIEBERMAN e cols. (1993) propuseram uma classificação
clínica na qual são identificados quatro subgrupos distintos de miocardite:
fulminante, aguda, crônica ativa e crônica persistente.
Na fase aguda, o aspecto macroscópico pode ser normal mas em geral
o coração está globalmente aumentado de volume e com dilatação de todas
as câmaras, principalmente dos ventrículos. As lesões nesta fase podem ser
difusas ou focais. O miocárdio dos ventrículos é flácido e permeado por
focos pálidos ou por diminutas lesões hemorrágicas. Trombos murais
podem ser encontrados, sobretudo no ápice dos ventrículos e nas aurículas
(KUMAR e cols., 2005).
O aspecto histológico varia segundo o agente etiológico, sendo
comum a presença de células inflamatórias mononucleares, tais como
monócitos, macrófagos e granulócitos, e degeneração ou necrose das
células, que tem aspecto diferente da lesão isquêmica ou miocitólise. Este
tipo de lesão tem, em geral distribuição focal, o que explica a negatividade
da biópsia endomiocárdica, mesmo em casos de doença ativa. A miocardite
aguda pode se curar sem deixar seqüelas ou resultar em focos de fibrose
(BOGLIOLO, 2000; CHEUNG e cols., 2006).
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2.2.4-Cardiomiopatias
As cardiomiopatias constituem um grupo heterogêneo de doenças,
que segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) são definidas hoje em
dia como doenças primárias do miocárdio associadas com disfunção
cardíaca (THIENE e cols., 2005). Elas são classificadas com base nos
aspectos fisiopatológicos e hemodinâmicos ou, quando possível, pelos
fatores etiopatogenéticos em: cardiomiopatia dilatada (congestiva),
cardiomiopatia hipertrófica, cardiomiopatia restritiva, arritmogênica do
ventrículo direito, não classificadas e específicas também denominadas
secundárias (RICHARDSON e cols., 1996). Entretanto BARRY e cols
(2006) propuseram um nova classificação que divide as cardiomiopatias em
dois grandes grupos: primárias (genéticas, não genéticas e adquiridas) e
secundárias (infiltrativa, de acúmulo, por toxicidade, endócrina, e
neuromuscular entre outras). Esta classificação segue uma orientação
basicamente genética e molecular, não sendo ainda amplamente utilizada.
O diagnóstico da cardiomiopatia dilatada (CMD) é inespecífico,
podendo se associar com aumento do volume cardíaco, sintomas e sinais de
insuficiência cardíaca congestiva e disfunção sistólica. O aspecto
dominante, dilatação de um ou de ambos os ventrículos pode ter diversas
causas, e este aspecto de dilatação bi-ventricular pode representar o estágio
final da doença, com conseqüente insuficiência cardíaca (CHEITLIN e
cols., 1996). Clinicamente, em 50% dos pacientes com insuficiência
cardíaca de etiologia desconhecida, não será demonstrada nenhuma causa
12
xxvi
específica após a investigação, inclusive biópsia endomiocárdica. Nos 50%
restantes a investigação clínica revelará outros agentes, tornando adequado
o uso desta terminologia de forma ampla. Em geral a doença acomete
prioritariamente homens (3:1), negros entre 20 e 60 anos. O principal
critério diagnóstico é a fração de ejeção menor que 45% - 55% e dilatação
ventricular. Os sintomas mais comuns são dispnéia e fadiga relacionadas à
insuficiência cardíaca. O prognóstico é variável, mas existe uma taxa de
sobrevida em 5 anos de cerca de 35% e em 10 anos de 15% (VIRMANI e
cols., 2001).
Segundo a OMS, dentro das cardiomiopatias específicas o termo
cardiomiopatia inflamatória está relacionado aos casos de miocardite
associada à disfunção cardíaca (THIENE e cols., 2005; MAISCH e cols.,
2005; RICHARDSON e cols., 1996). Entretanto, PAUSCHINGER e
colaboradores (1998) demonstraram que em metade dos pacientes com o
diagnóstico clínico de CMD foi evidenciado aumento no número de
linfócitos e macrófagos no intersticio cardíaco, sendo que nenhum deles
exibia miocardite aguda ou lesão borderline, segundo o critério de Dallas.
Por essa razão esses pacientes foram classificados como portadores de
cardiomiopatia inflamatória. Nos demais pacientes, com exame
histopatólogico negativo para inflamação, o diagnóstico foi de
cardiomiopatia dilatada idiopática.
13
xxvii
2.2.5- Aspectos morfológicos da CMD
O coração está aumentado de volume, pesando em torno 500-600g,
tem forma globosa e geralmente se encontra livre no saco pericárdico, que
pode conter quantidade aumentada de líquido. O achado dominante é a
dilatação das quatro câmaras, principalmente do ventrículo esquerdo, que
pode estar acompanhada de certo grau de hipertrofia. Em alguns casos, em
virtude da grande dilatação das cavidades, a espessura da parede está
diminuída podendo ser observadas também finas traves de fibrose
miocárdica. Os trombos murais são freqüentes especialmente no ápice dos
ventrículos, e pode haver ainda a formação de placas fibrosas endocárdicas
pós-cicatriciais e espessamento discreto das cúspides, sem fusão das
comissuras (BOGLIOLO, 2000). As artérias coronárias podem apresentar
até 75% de obstrução da luz. Histologicamente as alterações são
inespecíficas e pouco esclarecedoras consistindo-se de hipertrofia / atrofia
do cardiomiócito e fibrose intersticial em graus variáveis (VIRMANI e
cols., 2001). As fibras cardíacas exibem distribuição com arranjo
predominantemente regular podendo estar alongadas em função da dilatação
ventricular e apresentar diferentes graus de hipertrofia, caracterizada por
núcleos volumosos e hipercromáticos. Além dessas alterações a fibra pode
apresentar degeneração, hipotrofia, necrose ou apoptose focal. O infiltrado
intersticial é variável, constituído principalmente por macrófagos e
linfócitos e não está em contato com os cardiomiócitos (BOGLIOLO, 2000;
VASILJEVIC e cols., 1990).
14
xxviii
A fibrose é tipicamente intersticial podendo haver ainda fibrose de
substituição e perda de miócitos, e ela tende a aumentar do epicárdio para o
endocárdio, sendo maior no lado esquerdo do septo ventricular. A fibrose da
cardiomiopatia está associada com aumento seletivo do colágeno tipo I
(MANABE e cols., 2002; VIRMANI e cols., 2001).
2.3 Cardiomiopatia secundária à miocardite
Estudos experimentais demonstraram a possível evolução de
miocardite para um quadro caracterizado por fibrose intersticial e hipertrofia
do cardiomiócito, na ausência de inflamação miocárdica ou de miocitólise
(NEUMANN e cols., 1993). Existem indícios de que a cardiomiopatia
dilatada está relacionada com um episódio prévio de miocardite viral uma
vez que a sua prevalência na população geral é de 0,005% e nos pacientes
com história de miocardite viral é entre 4% e 9%. Esta possibilidade é
confirmada através da detecção por hibridização in situ, em 18-50% dos
pacientes, do RNA específico de enterovírus nas células miocárdicas
(CHEITLIN e cols., 1996), pela detecção por imunofluorescência do
antígeno viral (VASILJEVIC e cols., 1990) ou pela identificação por PCR
do RNA viral em lesões experimentais em camundongo, 90 dias após a
inoculação do vírus (KAVAI, 1999).
No caso da cardiomiopatia dilatada é improvável que esta seja
secundária à miocardite crônica. Provavelmente ela se origina de alterações
deflagradas pela miocardite viral (CHEITLIN e cols., 1996). A miocardite
15
xxix
induzida pelo vírus coxsackie B3 leva a alterações progressivas no
interstício cardíaco sugerindo que o processo autoimune possa contribuir
para a lesão do tecido conjuntivo (NEUMANN e cols., 1993). Alterações
tanto da imunidade celular quanto da imunidade humoral, em pacientes com
cardiomiopatia, confirmam o mecanismo imunológico como a base da lesão
(CHEITLIN e cols., 1996 ).
Algumas citocinas como o fator de necrose tumoral e interleucina-1
são capazes de regular a síntese e degradação do colágeno tendo sido
sugerido por alguns autores que a secreção local dessas citocinas no
miocárdio poderia contribuir para a seqüela auto-imune da miocardite viral
e também para alterações fibróticas associadas à cardiomiopatia
(NEUMANN e cols., 1993).
SPOTNITZ e LESCH (2006) propõem que a CMD seja uma
complicação da miocardite viral, já que componentes do genoma viral
infectante permanecem hibernados no miocárdio. Estes, quando ativados
codificam ou re-expressam enzimas intracelulares capazes de alterar a
função de proteínas do citoesqueleto. Assim, a disfunção dessas proteínas,
por um mecanismo de modificação pós-traducional resultante de processos
bioquímicos intracelulares específicos, se iniciam em resposta à ativação do
material genético hibernado. Além disso, deve-se levar em conta a
variabilidade genética do hospedeiro em relação à sua suscetibilidade à
persistência do genoma viral hibernante no miocárdio. Isto explicaria por
16
xxx
que apenas alguns pacientes com miocardite viral desenvolvem CMD
(SPOTNITZ e LESCH, 2006).
2.4 – A matriz extracelular
Uma porção substancial dos tecidos é constituída pelo espaço
extracelular, que é preenchido por uma rede de macromoléculas
denominada matriz extracelular (MEC). Esta MEC é constituída por uma
variedade de proteínas fibrosas e polissacarídeos, secretados localmente e
que se apresentam em associação com a superfície das células que os
produzem (ALBERTS e cols., 2002) (Figura 2). A MEC modula a estrutura,
fisiologia e a biomecânica dos tecidos em conjunto com os fatores de
crescimento e seus respectivos receptores, contribuindo assim para o
crescimento e diferenciação celular (CORDA e cols., 2000).
Figura 2. Células e fibras presentes na Matriz Extracelular Intersticial. Figura retirada da página www.histocitologia.com.br .
17
xxxi
2.4.1 - A MEC e seus principais componentes no sistema cardiovascular O interstício cardíaco é constituído por um sistema de componentes
diversos da MEC, organizados em uma rede tridimensional que circunda e
fornece suporte aos componentes celulares. A interação dos componentes
celulares com o interstício é dinâmica e ocorre em resposta a sinais
fisiológicos durante o desenvolvimento, homeostase normal e em estados
patológicos (KANEKAIR e cols., 1998).
A MEC cardíaca é constituída principalmente por proteínas
estruturais, como o colágeno e elastina; proteínas adesivas, como a
laminina, fibronectina e colágeno tipo IV; proteínas anti-adesivas, como
tenascina, trombospondina e osteopontina e proteoglicanos. O colágeno e
as proteínas de adesão se ligam a membrana celular através de uma família
de receptores transmembranares, denominadas integrinas. A interação entre
as proteínas de adesão e os receptores de membrana celular asseguram uma
comunicação entre os microambientes extracelular e intracelular. Os
proteoglicanos contribuem para a arquitetura da MEC, ligando fatores de
crescimento e promovendo o remodelamento tecidual e a migração celular
(CORDA e cols., 2000).
Os fibroblastos e as células musculares lisas produzem e liberam
colágeno tipo I e III e fibronectina, sendo que os fibroblastos são os
principais responsáveis pela produção dos colágenos tipo I e III, que vão
conectar os componentes celulares do coração. Miócitos e células
endoteliais produzem colágeno tipo IV. Já a laminina é produzida por
18
xxxii
células musculares lisas, cardiomiócitos e células endoteliais (KANEKAIR
e cols., 1998).
O colágeno é a proteína mais abundante dentre as proteínas
estruturais presentes no interstício cardíaco. A manutenção da estrutura
tecidual e a prevenção da deformação dos vasos sanguíneos é exercida pelos
colágenos tipos I e III, que representam mais de 90% do colágeno total
(CORDA e cols., 2000). Em estados fisiológicos, o turnover do colágeno na
MEC é de 5% a 9%, e sua síntese é mais lenta do que a síntese de proteínas
não colágenas. Já os colágenos tipos IV e VI são componentes da lâmina
basal, que expressam moléculas que permitem a interação com receptores
de membrana tais como integrina (RUTSCHOW e cols., 2005).
A fibronectina é uma glicoproteína extracelular de adesão, encontrada
sob a forma solúvel, sintetizada pelos hepatócitos e presente na circulação
sanguínea. A forma insolúvel, secretada no compartimento extracelular do
coração está associada à lâmina basal e componentes da matriz extracelular.
A osteopontina (OP) é um dos componentes não adesivos da MEC,
que se liga ao cálcio originando um complexo com os colágenos tipo I, II,
III e IV e integrinas além de induzir a síntese de proteínas da MEC por
fibroblastos, participando, assim, da fibrose. A OP, sintetizada por
fibroblastos e células musculares lisas, participa da adesão celular, controle
do crescimento e migração celulares (CORDA e cols., 2000). Algumas
destas células, como o fibroblasto, parecem responder também ao aumento
19
xxxiii
de contração (pressão), sintetizando e depositando elementos da MEC,
como o colágeno (KANEKAIR e cols., 1998).
Estudos recentes sugerem que as células intersticiais cardíacas
produzem fatores de crescimento que influenciam o desenvolvimento e o
crescimento de cardiomiócitos imaturos. Esses fatores atuam como
provedores dos sinais de diferenciação e agem nas células produzindo uma
variedade de reações incluindo migração e adesão celular, síntese de
colágeno, produção de metaloproteinases e expressão de integrinas
(KANEKAIR e cols., 1998).
As metaloproteases da matriz (MMPs) constituem uma família de
proteínas que participam tanto do remodelamento tecidual normal quanto
patológico. Também atuam como moléculas reguladoras, funcionando como
enzimas e, através do processamento de proteínas da MEC, citocinas e
fatores de crescimento produzem moléculas com diferentes efeitos
biológicos. Elas são responsáveis pela clivagem dos colágenos assim como
degradação de outras moléculas como a fibronectina. A maioria das MMPs
são enzimas secretadas sob a forma inativa, que atuam após ativação no
meio extracelular (CORDA e cols., 2000).
A constituição da MEC cardíaca sofre alterações tanto durante o
desenvolvimento normal como na resposta a determinadas doenças,
resultando em alterações da forma das células cardíacas e,
conseqüentemente, na sua função. Manipulações da MEC afetam a
20
xxxiv
expressão dos colágenos, integrinas e MMPs levando a fenótipos diferentes
(KANEKAIR e cols., 1998).
2.4.2 – A MEC na reação inflamatória e na remodelação cardiovascular
Tanto a matriz extracelular como o citoesqueleto, desempenham um
papel de grande importância na manutenção da integridade celular e função
miocárdica. A inflamação e a indução de fibrose cardíaca são mediadas por
citocinas e fatores de crescimento derivados de fibroblastos ativados e da
ação de células B e T. Uma possível via de indução da fibrose é a
apresentação de antígenos miocárdicos ao sistema imune e sua resposta
celular e humoral auto-reativa subseqüente. Vários auto-anticorpos contra:
antígenos sarcolemais, laminina, proteínas da MEC, colágenos e miofibrilas
foram demonstrados tanto em biópsias endomiocárdicas, como também sob
a forma de auto-anticorpos circulantes no sangue periférico. A presença de
auto-anticorpos contra componentes do citoesqueleto e da MEC como a
beta-tubulina, fibronectina, laminina, desmina, vimentina e colágeno, já está
bem estabelecido na miocardite e o seu papel fisiopatológico é bem definido
assim como a alteração ou aumento de alguns destes componentes na
cardiomiopatia dilatada (WILKE e cols., 1995).
Na fase inicial da miocardite a principal modificação da MEC é
causada por alterações qualitativas na rede de colágeno. Há um
desequilíbrio no sistema de degradação da matriz à favor da degradação de
proteínas. Isso leva a redução da integridade da matriz e rompimento da
21
xxxv
rede tridimensional de colágeno, através da clivagem das ligações cruzadas
entre as moléculas de colágeno levando a disfunção e dilatação ventriculares
(RUTSCHOW e cols., 2005).
A hipertrofia e o remodelamento miocárdico patológicos resultam
tanto do crescimento adaptativo dos cardiomiócitos como da proliferação de
fibroblastos cardíacos. Este processo é acompanhado por alterações da
estrutura da MEC que modificam especificamente a morfogênese, a função,
proliferação, diferenciação e o processo de migração celulares. Entretanto,
tanto os efeitos de fatores de crescimento como dos componentes da MEC e
suas interações na hipertrofia e remodelamento cardíaco tem sido descritos
in vitro, mas ainda não são bem conhecidos in vivo (CORDA e cols., 2000).
O remodelamento cardíaco resulta do balanço entre a proliferação,
hipertrofia e perda celular por apoptose. Este processo envolve alterações na
expressão de vários genes, entre eles aqueles que codificam proteínas da
MEC, resultando em um aumento difuso da síntese e acúmulo de proteínas
da MEC e fibrose cardíaca. O acúmulo destes componentes, tanto no
coração como nos vasos sanguíneos contribui para a insuficiência cardíaca.
Por sua vez, o aumento de fatores de crescimento como o fator de
crescimento tumoral-β (TGF- β) pode estar relacionado com o aumento da
síntese de colágeno e fibronectina e, consequentemente, na deposição da
MEC (CORDA e cols., 2000).
O TGF-β regula o acúmulo de proteínas da MEC através da
modulação da expressão de proteínas constitutivas, tais como o colágeno,
22
xxxvi
fibronectina e metaloproteinases. Em estudos experimentais se verificou que
o aumento dos níveis de TGF-β, fibronectina e colágeno, em geral ocorre
paralelamente com o desenvolvimento da insuficiência cardíaca. O TGF-β
e o fator de crescimento fibroblástico (FGF) estimulam a expressão pelos
fibroblastos de outras proteínas da MEC como osteopontina e seus
receptores (integrinas) (CORDA e cols., 2000).
2.5- Colágenos tipo I e tipo III
2.5.1-Estrutura
As proteínas que constituem a família dos colágenos são os principais
componentes fibrilares dos tecidos conjuntivos e as principais proteínas
extracelulares do organismo humano. O protótipo dos colágenos é o tipo I,
que é o mais abundante em todos os tecidos conjuntivos. A molécula do
colágeno tipo I tem massa molecular de 290 kDa e é composta por três
cadeias de polipeptideos, conhecidas como cadeias α , cuja a apresentação,
confere à molécula do colágeno estrutura em tripla-hélice (Figura 3). Essa
conformação é responsável por muitas de suas propriedades específicas e é
essencial para a fibrilogênese normal. Mutações que afetam essa formação
impedem o colágeno de formar fibras, resultando em sérios defeitos da
função do tecido conectivo (FREEDBERG e cols., 2004).
23
xxxvii
De acordo com a arquitetura das fibras no tecido, os colágenos podem
ser divididos em duas grandes classes diferentes: os colágenos formadores
de fibrilas (I, II, III, V e XI) e os colágenos formadores de microfibrilas (VI
e VII) (ALBERTS e cols, 2002).
2.5.2- Secreção
O pró-colágeno tem um processo de síntese que passa pelo complexo
de Golgi, retículo endoplasmático rugoso e vesículas de secreção, e que
varia de acordo com o tipo de colágeno. Uma vez secretado no espaço
extracelular, o pró-colágeno é convertido por proteólise em colágeno. A
conversão do pró-colágeno I em colágeno I é catalisada por duas enzimas, a
proteinase–N e a proteinase-C, que removem a porção terminal amino e a
Figura 3. Elétronmicrografia monstrando a distribuição estrutural de fibras colágenas e suas estriações. No detalhe observa-se representação esquemática da estrutura em tripla-hélice da molécula de colágeno. Figura retirada da página bifi.unizar.es/.../6protfibrosas.htm.
24
xxxviii
porção terminal carboxil respectivamente. Assim, o processo de conversão
do pró-colágeno em colágeno é complexo e cuidadosamente controlado. A
ausência da remoção dessas porções terminais implica no prejuízo das
forças de tensão das fibras colágenas. Após essa remoção realizada no
espaço extracelular, as moléculas de colágeno se alinham espontaneamente
para formar as fibras. Essas fibras, no entanto, só passam a ter a força de
tensão necessária quando as moléculas se ligam entre si através de ligações
covalentes especificas conhecidas como cross-links. As formas mais
comuns de cross-links no colágeno são derivadas da lisina e hidroxilisina
(FREEDBERG e cols., 2004).
O acúmulo de colágeno nos tecidos pode ser controlado em diferentes
níveis de biossíntese e degradação. Os possíveis sítios de controle incluem:
controle na transcrição e na pós-transcrição da formação de moléculas de
mRNA de pró-colágeno; controle dos índices de montagem dos
polipeptídeos através da tradução de mRNA; controle pós-traducional da
formação, secreção e conversão das formas precursoras de colágeno,
degradação de pró-cadeias α recém sintetizadas e remoção de fibras
colágenas extracelulares (ALBERTS e cols., 2002).
Um dos mais poderosos moduladores da expressão dos genes de
tecido conjuntivo é o TGF-β, que aumenta expressão de vários genes de
proteínas da matriz extracelular, incluindo aqueles que codificam os
colágenos tipo I, III, IV, V, VI e VII (FREEDBERG e cols., 2004).
25
xxxix
2.5.3- O colágeno e o coração
O interstício do miocárdio inclui o tecido conjuntivo fibrilar, várias
células como fibroblastos, glicosaminoglicanos e glicoproteínas. Os
colágenos tipo I e tipo III são os componentes dominantes do tecido
conjuntivo fibrilar e tem como função: fornecer uma base de suporte para os
cardiomiócitos e vasos sanguíneos; funcionar como conexões laterais entre
as células e os feixes musculares determinando a arquitetura e distribuição
de forças e prover força de tensão e elasticidade para evitar a deformação
miocárdica (WEBER, 1989).
A matriz extracelular cardíaca é dividida em três componentes: o
epimísio, o perimísio e o endomísio. O epimísio é o colágeno que circunda
o miocárdio e que fica logo abaixo do endotélio tanto do endocárdio como
do epicárdio. O perimísio consiste em extensões do epimísio que se
ramificam agregando os miócitos em miofibras. Ele está localizado nos
espaços existentes entre os feixes musculares. O colágeno endomisial
consiste de fibrilas que conectam os miócitos entre si e aos capilares
vizinhos e a uma rede de fibrilas que circundam os miócitos
individualmente. No interior da célula elas se comunicam com o
citoesqueleto fornecendo suporte ao aparato contrátil actina-miosina que
pode influenciar a força tensil do cardiomiócito (WEBER, 1989).
O colágeno tipo I representa cerca de 80% - 85% e o tipo III
representa 11%- 20% do colágeno total (FEDAK e cols., 2005;
PAUSHINGER e cols., 1998; WEBER e cols., 1988). O colágeno tipo I
26
xl
normalmente se agrega em fibras densas, enquanto o tipo III forma fibras
delgadas. Estudos imunohistoquímicos revelaram que a trama endomisial é
composta tanto por colágeno tipo I quanto tipo III (WEBER e cols., 1988).
No coração a síntese de colágeno é feita pelos fibroblastos e não pelos
miócitos. Sua síntese é relativamente mais baixa do que a das proteínas não
colágenas e sua meia vida é dez vezes mais longa. Um outro aspecto é que,
sendo o fibroblasto uma célula quiescente para regular sua proliferação é
necessária a interação entre fatores de crescimento e receptores de superfície
(WEBER, 1989).
A degradação do colágeno no miocárdio parece ser equivalente a sua
síntese, dada a estabilidade de sua concentração e pelo fato dos fibroblastos
serem as células responsáveis pela sua secreção (WEBER, 1989) sendo que
as MMPs e os inibidores teciduais das metaloproteases (TIMPs) são os
principais reguladores da sua degradação (LI e cols., 2002). Outra
possibilidade é que pelo fato da colagenase ter sido identificada como
residente do perimísio e endomísio, é sugerido que ela permaneça no
miocárdio numa forma latente (WEBER e cols., 1988).
2.5.4- O colágeno nas cardiopatias
Na vigência de cardiopatias, a MEC também sofre alterações que
podem levar à disfunções cardíacas. LI e colaboradores (2002), não
observaram alterações significativas na quantidade de mRNA do colágeno
tipo I na fase inicial (1-10 dias) da miocardite, mas não podem descartá-lo
27
xli
na fase tardia. Já foi relatado o aumento no número e na espessura das fibras
de colágeno nos estágios finais de CMD e que esse aumento está
relacionado com as concentrações absolutas dos colágenos tipos I e III. Os
autores afirmam ainda que a razão entre o colágeno III e colágeno I é
diferente na CMD e na CMI, sendo a razão maior na CMD (PAUSHINGER
e cols., 1998).
O aumento do colágeno tipo I na CMD já foi demonstrado em vários
estudos, mas o aumento do colágeno tipo III ainda é controverso. A
dificuldade na detecção de colágeno tipo III, por técnicas de
imunohistoquimica, pode ser explicado pela disponibilidade dos epítopos
para anticorpos, uma vez que as fibras de colágeno tipo III são recobertas
pelas fibras de colágeno tipo I (PAUSHINGER e cols., 1998). No entanto,
WEBER e colaboradores (1988) também demonstraram que o aumento de
colágeno na CMD se deve ao colágeno tipo III.
2.6- Fibronectina
Já foi demonstrado em modelos experimentais que infecções virais
levam a respostas específicas que culminam com o desenvolvimento tardio
de fibrose miocárdica, embora o mecanismo responsável por essa lesão seja
desconhecido. Em diversos processos patológicos que resultam em fibrose,
como a cicatrização e produção de estroma tumoral, os depósitos
extravasculares de fibrina e fibronectina precedem a formação de colágeno e
de fibrose. Nesses processos o gel de fibrina-fibronectina funciona como
28
xlii
matriz para angiogênese, adesão de células inflamatórias, migração de
fibroblastos e, conseqüentemente, fibrose (KISHIMOTO e cols.,1998).
A fibronectina é uma proteína extracelular de adesão amplamente
distribuída pelos tecidos, e é composta por um dímero com duas cadeias
unidas por pontes s-s. Cada cadeia possui várias unidades globulares ligadas
entre si por seqüências flexíveis. As cadeias são constituídas por 3 tipos de
módulos homólogos - tipos I, II e III - que se repetem. O módulo tipo II
está exclusivamente envolvido com a ligação do colágeno tipo I (BRIGGS,
2005). A fibronectina possui sítios de ligação com receptores celulares
(integrinas), colágeno, fibrina e heparina, sendo importante na organização
da matriz e deslocamento das células no interstício, como a migração de
fibroblastos (CLARK e cols., 2003). A molécula de fibronectina existe sob
duas formas principais: na matriz extracelular como glicoproteína insolúvel
e no plasma sanguíneo na forma solúvel (BRIGGS, 2005). Na forma
tecidual ela forma agregados fibrilares através de interações diretas com
receptores de superfície, sendo importante para o crescimento e adesão
celular normais e na cicatrização (MAO e SCHWARZBAUER, 2005). A
forma plasmática se liga a fibrina, formando um coágulo sanguíneo que
preenche espaços vazios e serve como substrato para deposição de matriz
(KUMAR e cols, 2005).
As funções da fibronectina estão intimamente relacionadas à sua
estrutura molecular. De uma forma geral suas principais funções são a
29
xliii
mediação da adesão celular, migração celular como realizado pelos
fibroblastos (CLARK e cols., 2003), quimiotaxia de monócitos e regulação
do crescimento celular e expressão gênica (BRIGGS, 2005). Tanto a
expressão diminuída como a degradação elevada de fibronectina tem sido
responsabilizada por algumas alterações morfológicas observadas em
tumores e linhagens celulares derivadas de tumores (MAO e
SCHWARZBAUER, 2005).
A fibronectina é codificada por um único gene que contêm múltiplos
exons que são processados de forma a gerar suas duas isoformas. A forma
plasmática é secretada por hepatócitos e enriquecida no sangue e a segunda
é secretada principalmente por fibroblastos e células endoteliais, é
relativamente estável, tem baixo turnover e é incorporada na forma de
matriz fibrilar na superfície da célula. A produção de fibronectina na matriz
é um processo complexo, regulado por vias de sinalização intracelular. A
ligação com integrinas, organização do citoesqueleto, estimulação da
contratilidade celular e a ativação da cascada de quinases, contribuem no
processo de produção (MAO e SCHWARZBAUER, 2005).
2.6.1- Fibronectina nas cardiopatias
A fibronectina é responsável pela formação de pontes entre as células
e a trama de colágeno intersticial. O aumento da deposição de fibronectina
no coração precede a deposição de colágeno tipo I e contribui para a adesão
30
xliv
célula-matriz extracelular no remodelamento. Além disso, a fibronectina
funciona como base para a deposição de colágeno durante o reparo na
inflamação (AMMARGUELLAT e cols., 2002). KISHIMOTO e cols.
(1998) observaram em seu modelo murino de miocardite viral, que a
deposição do complexo fibrina-fibronectina no interstício, resultava da
necrose dos cardiomiócitos induzida pelo vírus e mediada por linfócitos T.
O aumento do colágeno miocárdico no estágio crônico seria indicativo de
fibrose miocárdica. O conjunto dos resultados permitiu sugerir que a
deposição de fibrina e fibronectina associada com um processo inflamatório
mediado por células T, precede a fibrose intersticial e alterações na rede de
reticulina na miocardite. A deposição de colágeno e fibronectina pode
comprometer ainda mais a força de tensão e contratilidade cardíacas
(AMMARGUELLAT e cols., 2002). Fatores mecânicos e fatores locais,
como o TGF-β, ativam a expressão do gene da fibronectina. Na
insuficiência cardíaca humana, os níveis de mRNA de fibronectina
encontram-se aumentados, precedendo a deposição de colágeno tipo I e III
nas áreas de fibrose (JANE-LISE e cols., 2000).
2.7- Transglutaminase tecidual
Como dito anteriormente a cicatrização das feridas é caracterizada por
três fases interrelacionadas e concomitantes: inflamação, formação
/estabilização tecidual e remodelamento. Participam destes processos fatores
de crescimento e citocinas que controlam e regulam o remodelamento
31
xlv
coordenado da matriz extracelular e o reparo da lesão. Várias
metaloproteases matriciais e TIMPs são expressas durante a cicatrização de
feridas. Elas são responsáveis pelo remodelamento da matriz através da
degradação da matriz preexistente no interior e ao redor dos bordos da
ferida e também criando uma via para a migração de células enquanto a
nova matriz é depositada (VERDERIO e cols., 2004).
Um outro componente da resposta celular/tecidual ao dano e estresse
celular é a transglutaminase tecidual (tTG). Ela é uma proteína
multifuncional que modula interações matriz-célula, fornece estabilidade
tecidual e uma variedade de funções celulares. A tTG é uma enzima que
catalisa a modificação pós-traducional de proteínas (GRIFFIN e cols., 2002)
e foi o primeiro membro descrito de uma família multigênica de enzimas
que realizam transaminação dependente do cálcio e modificam cadeias de
glutamil em proteínas (ZEMSKOV e cols., 2006). A família das
transglutaminases humanas, inclui atualmente oito membros (WU e ZERN,
2004).
A tTG é expressa ubiquamente e seus níveis dependem do tipo do
tecido. Altos níveis de tTG podem ser encontrados naturalmente em células
submetidas à injúria tais como células endoteliais e mesangiais. Ela está
localizada nos três principais compartimentos celulares (citosol, membrana
plasmática e núcleo) sendo secretada e depositada na matriz extracelular.
Sua liberação está dramaticamente exarcerbada em situações de dano e
estresse celular, quando então se acumula na MEC inicialmente formando
32
xlvi
complexos com a fibronectina. Devido as suas múltiplas atividades e
distribuição celular, a tTG pode potencialmente atingir o processo de reparo
tecidual em vários níveis e muitas de suas atividades envolvidas no reparo
dependem de sua interação com a fibronectina. Após a liberação celular, a
tTG forma um complexo com a fibronectina, por ligação de alta afinidade.
Este tipo de ligação, protege a tTG da degradação proteolítica (VERDERIO
e cols., 2004).
A função da tTG não é apenas estabilizar as proteínas, aumentando a
resistência mecânica, química e proteolítica, mas também facilitar a adesão
e motilidade celular. Como a tTG funciona como co-receptor para
fibronectina para ligação e adesão com integrinas, essa função parece ser
importante não somente para a adesão mas também para a produção de
fibronectina (GRIFFIN e cols., 2002). Ela participa de interações matriz-
célula, fundamentais para a adesão, distribuição e motilidade de células
como os fibroblastos. Estudos in vitro demonstraram que o colágeno I
quando ligado a tTG, na presença ou ausência de fibronectina, aumenta a
estabilidade da matriz. Além do colágeno I, a tTG se liga também a outros
tipos de colágeno (II, III, V, XI), assim como a outras proteínas da MEC
(VERDERIO e cols., 2004).
2.7.1- A tTg na resposta inflamatória
O antígeno da tTG foi encontrado expresso particularmente em
macrófagos e recentemente foi descrito que a falta de tTG em macrófagos
33
xlvii
impede a fagocitose eficaz de células mortas. A ligação cruzada de proteínas
intracelulares, que ocorre se a lesão promover perda da homeostase do
cálcio, pode também ser significativa para evitar o vazamento e a lise de
células lesadas irreversivelmente. Desta forma a integridade estrutural é
mantida no tecido onde as células lesadas estão morrendo, favorecendo a
contenção da reposta inflamatória (VERDERIO e cols., 2004). Em um
modelo experimental utilizando camundongos transgênicos foi verificado
que a superexpressão da tTg em miócitos ventriculares leva a um aumento
da cicloxigenase-2 (COX-2), síntese de tromboxano (TxS) e resulta em
insuficiência cardíaca (VERDERIO e cols., 2004).
2.7.2- A tTG na cicatrização
Se a agressão é mantida ou parte da resposta de resolução falha
inicialmente, sucede um período de cronificação que pode levar a cicatriz
progressiva e fibrose. A lesão tecidual, seguida do acúmulo de tTG,
possibilita maior formação de ligações cruzadas intermoleculares de muitos
componentes da MEC, especialmente colágeno e fibronectina,
provavelmente numa maior velocidade de deposição (VERDERIO e cols.,
2004).
Em órgãos nobres como o fígado, coração e rins essa cicatrização
progressiva, em mais de 95% dos casos, é a principal causa de disfunção
orgânica e falência do órgão (VERDERIO e cols., 2004). A observação de
que a tTG poderia estar envolvida na cicatrização progressiva foi primeiro
34
xlviii
descrita no pulmão, embora observações similares tenham sido descritas
posteriormente no fígado, coração, vasos sanguíneos e rins (GRIFFIN e
cols., 2002).
O mecanismo pelo qual a inibição da tTG leva a redução da
cicatrização, representada pela redução da deposição de colágeno seguida de
remodelamento tecidual, ainda não está esclarecido. É possível que a tTG
modifique o padrão de deposição do colágeno, que pode ser crucial para o
processo de cicatrização já que 95% das moléculas de colágeno são
degradadas antes da sua deposição. Assim, qualquer fator que altere o
equilíbrio da deposição de matriz, como essa provável ação da tTG, é
considerado como tendo uma grande influência na homeostase da MEC
(VERDERIO e cols., 2004).
2.7.3- Interação MMPs e tTG na cicatrização
Com a agressão tecidual, há acúmulo de tTG na matriz das áreas
circunjacentes, parecendo ocorrer ligação cruzada intermolecular de muitos
componentes da MEC, que provavelmente tem a sua deposição acelerada.
Além disso, a tTG extracelular pode controlar o armazenamento de TGF-β1,
influenciando sua ativação, que além de ser o principal fator na resposta
inflamatória, é crucial na regulação da homeostase da MEC regulando a
síntese de MMPs e TIMPs. Se a agressão ao tecido é mantida, ocorre
acúmulo maciço de tTG tanto no meio intracelular como extracelular, na
tentativa de preservação da integridade do tecido. Assim, haverá maior
35
xlix
deposição de colágeno e aumento do cross-linking levando ao acúmulo da
MEC e cicatrização tecidual excessiva (VERDERIO e cols., 2004).
2.7.4- A tTG e o tecido cardíaco
Através de estudos por imunofluorescência indireta foi verificado que
a distribuição extracelular da tTG ocorre principalmente em tecidos ricos
em fibras colágenas, como a adventícia vascular e o perimísio no coração.
Essa observação dá relevância ao fato que o colágeno III é um substrato in
vitro para a tTG. Além disso, a co-distribuição da tTG com a fibronectina
também é vista de forma particularmente clara na matriz peri-celular do
músculo cardíaco (AESCHLIMANN e PAULSSON, 1991).
A atividade da tTG está aumentada em várias condições
inflamatórias, inclusive nas miocardites (VERDERIO e cols., 2004).
SMALL e colaboradores (1999) demonstraram em camundongos
transgênicos com expressão cardíaca aumentada de tTG, o desenvolvimento
de cardiomiopatia. Recentemente, a superexpressão de tTG foi observada
em modelos experimentais em estágios finais de insuficiência cardíaca,
como também a ativação de tTG cardíaca em casos de isquemia miocárdica
ou em lesão por reperfusão. Alguns estudos preliminares sugerem ainda o
envolvimento da tTG na apoptose de cardiomiócitos (PERACCHI e cols.,
2002).
As cardiomiopatias constituem objeto de estudo de vários trabalhos
nos dias atuais devido à dificuldade no diagnóstico morfológico. Na
36
l
maioria dos casos o diagnóstico se baseia mais em critérios clínicos do que
morfológicos. Muitos casos definidos como cardiomiopatia dilatada podem
exibir um componente inflamatório, sem, no entanto, preencher critérios
para a miocardite. Devido à importância no prognóstico e tratamento das
cardiomiopatias dos elementos da MEC, visamos neste estudo caracterizar a
distribuição diferencial de proteínas da MEC cardíaca e da transglutaminase
tecidual utilizando estes padrões de distribuição no tecido como elementos
adjuvantes no diagnóstico morfológico.
37
li
3- OBJETIVOS:
A- Geral
Caracterizar a distribuição da transglutaminase, fibronectina, colágeno
tipo I, colágeno tipo III, comparativamente na miocardite e
cardiomiopatias humanas, verificando a associação destas proteínas com
os perfis histopatológicos.
B- Específicos
• Caracterização histopatológica de miocardite utilizando a associação
da classificação de Dallas (ARETZ, 1987) e o perfil de distribuição
da HLA-DR por imunohistoquímica (WOJNICZ e cols., 1998);
• Caracterização histopatológica das cardiomiopatias inflamatória e
dilatada;
• Distribuição e quantificação histomorfométrica da transglutaminase
verificada através de métodos imunohistoquímicos;
• Distribuição e quantificação histomorfométrica do colágeno tipo I
verificada através de métodos imunohistoquímicos;
• Distribuição e quantificação histomorfométrica do colágeno tipo III
verificada através de métodos imunohistoquímicos;
• Distribuição e quantificação histomorfométrica da fibronectina
verificada através de métodos imunohistoquímicos.
38
lii
4- MATERIAL E MÉTODOS
4.1- Obtenção das amostras de miocárdio
As amostras constituídas por biópsias endomiocárdicas do ventrículo
direito foram obtidas de 10 pacientes com suspeita clínica de miocardite e
de 07 pacientes com cardiomiopatia dilatada (ambos os sexos e com idade
variando de 40-60 anos). Todas as biópsias foram realizadas no Hospital
Pró-Cardíaco ou na Santa Casa de Misericórdia do Rio de Janeiro, com o
paciente sob efeito de anestesia local e com o objetivo de definição
diagnóstica e terapêutica.
O grupo controle foi constituído por amostras de miocárdio retiradas
do ventrículo direito durante a necrópsia de quatro pacientes (ambos os
sexos e com idade variando de 50-70 anos) livres de doença cardiovascular,
alterações metabólicas ou de doença auto-imune. Foram excluídos do estudo
pacientes cujo diagnóstico histopatológico não confirmou o quadro de
miocardite aplicando-se o critério de Dallas (ARETZ, 1987) e pacientes
cujas biópsias eram constituídas por pequena quantidade de tecido que não
permitiam a avaliação precisa de imuno-marcações.
Este projeto foi realizado segundo o estabelecido na resolução de №
196/96 e suas complementares para estudo em humanos.
39
liii
4.2- Processamento das amostras
Os fragmentos de miocárdio obtidos por biópsia ou por necrópsia
foram fixados em solução de formaldeído tamponado a 10% por 12 a 24
horas e posteriormente desidratados e incluídos em parafina. Cortes de 5 µm
foram obtidos em micrótomo rotatório e corados pelo método de
hematoxilna e eosina (HE) e Picro-Sirius Red modificado (DOLBER e
SPACH, 1993).
4.3 – Análise histopatológica
Todo o material foi observado por dois patologistas de forma
independente e sem o conhecimento prévio da procedência da amostra. Nos
casos em que houve discordância entre os diagnósticos, foi feita uma
reavaliação e definição conjunta.
Para a definição do diagnóstico histopatológico das miocardite foi
utilizado o critério de Dallas que avalia as alterações dos miócitos, a
presença de infiltrado inflamatório e de fibrose. Esta classificação define
três categorias de miocardite: presente, ausente ou lesão borderline
(ARETZ, 1987).
A avaliação do anticorpo anti- HLA-DR foi feita utilizando-se a
classificação proposta por WOJNICZ e cols. (1998). O índice de reatividade
foi baseado no padrão da positividade ao HLA-DR segundo o escore
abaixo:
40
liv
Grau 0- Ausência ou reatividade fraca de células endoteliais e
intersticiais;
Grau 1- Reatividade focal em células endoteliais e outras células
intersticiais;
Grau 2- Coloração multifocal restrita a células intersticiais;
Grau 3- Reatividade em células endoteliais associada à reatividade focal
em cardiomiócitos;
Grau 4- Reatividade endotelial e cardiomiocitária difusas
Apenas os pacientes classificados como graus 3 e 4 foram
considerados portadores de miocardite.
Para a classificação das cardiomiopatias inflamatórias foi utilizada a
metodologia definida por PAUSCHINGER e cols. (1998) no qual o
diagnóstico de inflamação é baseado na presença de mais de dois linfócitos
por campo de maior aumento (40x) e/ou pelo aumento do infiltrado
macrofágico com contagem superior a 1,5 células por campo de maior
aumento (40x).
41
lv
4.4- Imunohistoquímica
4.4.1- Protocolo
Foram feitas as seguintes imunomarcações para a identificação dos
componentes da matriz extracelular e o marcador de ativação (HLA-DR),
segundo o protocolo descrito a seguir:
I-Desparafinização e hidratação dos cortes;
II-Lavagem com tampão PBS, pH 7,4 (3 vezes, por 5 minutos);
III-Recuperação antigênica:
Tratamento das lâminas com solução de hialuronidase 0,2% (H3506,
Sigma) em PBS pH = 7,4 por 3 horas em estufa á 37°C.(para anticorpo
anti-colágeno I e III)
Tratamento das lâminas na panela a vapor, em tampão citrato pH6, por
20 minutos na temperatura de 96 °C (para anticorpo anti-fibronectina,
anti-transglutaminase e anti-HLA-DR);
IV-Lavagem com tampão PBS, pH 7,4 (3 vezes, por 5 minutos);
V-Incubação com PBS-BSA 5%, por 1 hora, para inibir as ligações
inespecíficas dos anticorpos;
VI-Incubação com anticorpo primário diluído em PBS-BSA 3% com
0,5% de soro normal de cabra, durante a noite, em câmara úmida. As
lâminas de controle negativo foram mantidas com a solução de soro
normal de cabra (para os anticorpos anti-colágeno I e III) ou em PBS-
42
lvi
BSA 1% (para os anticorpos anti-fibronectina, anti-transglutaminase e
anti-HLA-DR);
VII-Lavagem com tampão PBS, pH 7,4 (3 vezes, por 5 minutos cada);
VIII-Inibição da peroxidase endógena com solução de H2O2 a 70% em
metanol, por 10 à 20 minutos;
IX-Lavagem com tampão PBS, pH 7,4 (3 vezes, por 5 minutos cada};
X-Incubação com anticorpo secundário, Kit Envision-HRP (DAKO) por
1 hora para colágeno I, colágeno III e transglutaminase. Para a
fibronectina e HLA-DR foi utilizado o Kit LSAB (DAKO) por 2 horas;
XI-Lavagem com tampão PBS-Tween 0,25%, pH 7,4 por 5 minutos;
XII-Lavagem com tampão Tris-HCl, pH 7,6 (2 vezes, por 5 minutos);
XIII-Revelação com a DAB (DAB líquida, DAKO, Carpinteria, CA,
USA) de 10 a 20 minutos; ou AEC (DAKO), por 20 minutos (HLA-DR);
XIV-Lavagem com tampão PBS-Tween 0,25%, pH 7,4 (2 vezes, por 5
minutos);
XV-Lavagem com água destilada, 3 vezes, por 5 minutos cada;
XVI-Contracoloração com Hematoxilina de Harris e de Mayer, somente
para o HLA-DR;
XVII-Azular em água corrente por 5 minutos;
XVIII-Diferenciação na água ácida (solução de HCl 0,5%);
XIX-Lavagem em água destilada por 5 minutos;
XX-Passagem em soluções crescentes de álcool e xileno para
desidratação;
43
lvii
XXI- Montagem em Entellan® (Merck, Alemanha) e em Aquatex®
(Merck, Alemanha), somente para o HLA-DR.
Nota: Todas as lâminas foram previamente tratadas com poly-l-lysina.
As características dos anticorpos utilizados se encontram na Tabela 2.
Tabela 2: Características dos anticorpos
Especificidade Clone Isotipo Diluição Origem
Fibronectina (A0245)
Policlonal Coelho 1:100 Dako
Colágeno I (20151)
Policlonal Coelho 1:500 Novotec
Colágeno III (60311)
Policlonal Camundongo 1:500 Novotec
Transglutaminase (AP9003)
Monoclonal Camundongo 1:100 Neomarkers
HLA-DR (M0746)
Monoclonal Rato 1:30 Dako
Foram utilizados como controles positivo e negativo pele humana
para as reações de colágeno I e III, tecido renal de camundongo com
inflamação para a fibronectina e tecido miocárdico humano com fibrose
para a transglutaminase. Em todos os controles negativos foi omitido o
anticorpo primário.
44
lviii
4.5 – Análise descritiva da distribuição das proteínas transglutaminase,
fibronectina, colágenos tipos I e III.
A análise descritiva das proteínas da MEC e da transglutaminase
levou em consideração a sua distribuição no interstício sendo que para tTG
foi considerada também a distribuição nos cardiomiócitos e no endotélio.
Cada um dos dois observadores avaliou individualmente a distribuição e a
intensidade da marcação de cada um dos anticorpos. O resultado das
análises semiquantitativas foi representado graficamente.
4.6 - Histomorfometria
Para o estudo quantitativo foi utilizado o programa de análise de
imagens Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Houston, TX, USA)
quantificando a densidade da superfície de reatividade dos anticorpos
estudados (PECLY e cols., 2006). Para a análise de densidade foram
capturadas 10 imagens de cada corte histológico (Câmera Evolution VF,
acoplada ao microscópio Eclipse E800, Nikon, Japão), de forma aleatória
utilizando o aumento de 40X.
4.7– Análise estatística
Os resultados foram descritos sob a forma de média ± desvio padrão.
A verificação das diferenças entre os grupos foi detectada pelo teste
ANOVA seguido do teste t de Student para a comparação entre duas
amostras, considerando significativo os valores com p <0,05 (Sigma Stat 3).
45
lix
5-RESULTADOS
5.1 - Análise histopatológica
A análise histopatológica realizada nos cortes histológicos, na
coloração pela H&E, das amostras do grupo controle demonstrou que
nenhum dos pacientes preenchia os critérios diagnósticos de miocardite
segundo a classificação de Dallas (Figs. 4A e 4B). Entre os 10 casos com
diagnóstico clínico de miocardite, 9 foram classificados como miocardite
aguda moderada e 1 como miocardite aguda acentuada sendo esta
classificação baseada na presença de miocitólise e infiltrado inflamatório
tecidual (Figs. 4C e 4D).
Os pacientes diagnosticados como portadores de cardiomiopatia
(Figs. 4E e 4F) foram subdivididos em duas categorias de acordo com a
presença de infiltrado inflamatório mononuclear (linfócitos e macrófagos)
porém, sem preencher os critérios para miocardite de acordo com a
classificação de Dallas. O grupo que apresentava estas características foi
denominado cardiomiopatia inflamatória (n=3) enquanto o grupo que não
exibia inflamação recebeu a designação de cardiomiopatia dilatada (n=4).
Na avaliação da distribuição do colágeno, utilizando a técnica do
Picro Sírius Red, foi observado em duas amostras do grupo controle fibrose
discreta e focal localizada em região perivascular (Figs. 5A e 5B). Nos
pacientes com diagnóstico de miocardite foi observada fibrose leve e focal
de localização intersticial e perivascular em 9 casos e fibrose moderada em
46
lx
uma amostra (Figs. 5C e 5D). Na cardiomiopatia, a fibrose era difusa sendo
moderada em 5 casos (Figura 5E) e acentuada em 2 casos (Figura 5F).
5.2 –Análise qualitativa da imuno-marcação
5.2.1 - HLA-DR
Todos as amostras do grupo controle foram negativas para marcação
de HLA-DR e foram classificadas como grau 0 (Figs. 6A e 6B). Nas
amostras diagnosticadas como miocardite foi evidenciado positividade em 6
casos sendo um deles (miocardite acentuada) classificado como grau 4. Os 5
casos positivos restantes se apresentaram como grau 3 (Figs. 6C e 6D). Nas
cardiomiopatias todos os casos foram classificados como negativos com a
graduação oscilando entre 0 e 2 (Figs. 6E e 6F).
5.2.2 - Proteínas da Matriz e Transglutaminase
Grupo Controle (n=4)
Foi verificado reatividade para a transglutaminase em três casos do
grupo controle. A positividade para este anticorpo foi observada somente
em células endoteliais (Figs. 7A e 7B). Foi observada marcação intersticial
difusa e uniforme para colágeno I (Figs. 9A e 9B) e fibronectina (Figs. 8A
e 8B) em 4 dos casos estudados. O colágeno III foi observado difusamente
no interstício em três casos (Figs. 10A e 10B).
47
lxi
Grupo Miocardite (n=10)
A reatividade para transglutaminase foi intensa no interstício (n=7),
endotélio (n=8) e nos cardiomiócitos (n=10) (Figs. 7C e 7D). A marcação
para o colágeno tipo I foi uniforme e moderada (n=10) (Figs 9C e 9D). A
marcação da fibronectina foi uniforme e intensa (n=10) (Figs. 8C e 8D).
O padrão de marcação do colágeno tipo III foi intersticial, não uniforme e
geralmente moderada (n=7). Os demais casos (n=3) foram negativos para
este anticorpo (Figs. 10C e 10D).
Grupo Cardiomiopatia (n=7)
A transglutaminase foi fortemente positiva no interstício (n=6),
endotélio (n=5) e cardiomiócitos (n=7) (Figs. 7E e 7F). Para o colágeno
tipo I (Figs. 9E e 9F) foi observado reatividade intersticial fraca e focal
(n=4) e negatividade para os demais casos (n=3). A marcação da
fibronectina foi moderada (Figs. 8E e 8F) e o colágeno tipo III foi
acentuada. Em ambos a marcação foi intersticial e difusa em todos os casos
(Figs. 10E e 10F).
A distribuição das proteínas nos três grupos estudados está
representada graficamente nas Figuras 11-14.
48
lxii
Cardiomiopatia inflamatória (n=3) A marcação para transglutaminase foi evidenciada em localização
intersticial e endotelial (n=2) e foi negativa no outro caso. Todos os casos
exibiram positividade em cardiomiócitos (Figura 15). Para o colágeno tipo
I não houve marcação em um caso sendo observada marcação intersticial
nos demais casos (n=2) (Figura 16). O mesmo padrão de distribuição
intersticial foi vista em todos os casos para a colágeno tipo III (Figura 17) e
fibronectina (Figura 18).
Cardiomiopatia dilatada (n=4)
A positividade para transglutaminase em cardiomiócitos e no
interstício estava presente em todos os casos (n=4) e foi observada no
endotélio em três das amostras (Figura 15). O colágeno tipo I exibiu
reatividade intersticial em 2 casos (Figura 16). Tanto o colágeno tipo III
(Figura 17) como a fibronectina (Figura 18) foram identificadas em todas
as amostras (n=4).
49
lxiii
FIGURA 4- Fotomicrografia dos grupos controle, miocardite e cardiomiopatia. Fig.4A e Fig.4B: Tecido miocárdico normal no grupo controle. Observa-se cardiomócitos sem alterações em detalhe (cabeça de seta). Fig.4C: Visão geral do tecido miocárdico em caso de miocardite. Fig.4D: Infiltrado inflamatório mononuclear em relação com miocitólise (cabeças de seta). Fig.4E: Hipertrofia difusa do miocárdio na cardiomiopatia. Fig.4F: Cardiomiócitos exibindo aumento do volume e irregularidade nuclear, sem inflamação associada (cabeças de seta). Coloração: Hematoxilina-eosina. Barras: A, C e E- 100µm, B, D e F - 30µm.
50
lxiv
51
lxv
FIGURA 5 – Tecido miocárdico dos 3 grupos estudados corados pela técnica de Picro sírius red para dectecção do colágeno total. Fig.5A e 5B: Caso do grupo controle exibindo distribuição intersticial habitual do colágeno. Fig.5C e 5D: Casos de miocardite com fibrose leve em localização intersticial (cabeça de seta) e perivascular (seta). Fig.5E: Fibrose moderada intersticial e perivascular na cardiomiopatia. Fig.5F: Fibrose intersticial acentuada no maior aumento em cardiomiopatia (cabeças de seta). Barras: A, C e E- 100µm, B, D e F - 30µm.
52
lxvi
53
lxvii
FIGURA 6 – Imunomarcação para HLA-DR. Fig.6Ae 6B: Ausência de reatividade para HLA-DR no grupo controle. Fig.6C: Marcação difusa endotelial e em cardiomiócitos na miocardite. Fig.6D: Reatividade endotelial (seta) e em células intersticiais na miocardite (cabeça de seta). Fig.6E: Tecido miocárdico de um caso de cardiomiopatia exibindo marcação multifocal endotelial e em células intersticiais. Fig.6F: detalhe da marcação para HLA-DR da figura 6E(seta-vaso, cabeça de seta- intersticial). Barras: A, C e E- 100µm, B, D e F - 30µm.
54
lxviii
55
lxix
Figura 7 – Imunomarcação da transglutaminase. Fig.7A: Miocárdio do grupo controle exibindo marcação endotelial (cabeça de seta). Fig.7B: vaso exibindo células endoteliais reativas para tTG no grupo controle. Fig.7C: Marcação difusa em cardiomiócitos (cabeça de seta), endotelial (seta) e intersticial na miocardite. Fig.7D: Marcação em cardiomiócitos na miocardite. Fig.5E: Marcação difusa em cardiomiócitos na cardiomiopatia (cabeça de seta). Fig.5F: Presença de marcação para transglutaminase de localização endotelial e em cardiomiócitos. Fig.7G: Controle negativo da reação imunohistoquímica para transglutaminase em tecido cardíaco com fibrose. Nota-se a ausência de marcação tecidual. Fig.7H: Controle positivo da reação imunohistoquímica para transglutaminase em tecido cardíaco com fibrose, exibindo marcação intensa em cardiomiócitos e interstício. Barras: A, C, E, G e H - 100µm, B, D e F - 30µm.
56
lxx
57
lxxi
Figura 8 – Imunomarcação para fibronectina. Fig.8A: Distribuição intersticial e em área perivascular da fibronectina no tecido miocardico do grupo controle. Fig.8B: Detalhe da marcação perivascular e intersticial no grupo controle. Fig.8C: Presença de intensa marcação para fibronectina no interstício e perivascular em caso de miocardite. Fig.8D: Imunomarcação intersticial na miocardite (cabeça de seta). Fig.8E: Marcação moderada e difusa intersticial na cardiomiopatia. Fig.8F: Detalhe da marcação intersticial (cabeças de seta) na cardiomiopatia. Fig.8G: Controle negativo da reação imunohistoquímica para fibronectina em tecido renal. Observa-se a ausência de marcação tecidual. Fig.8H: Controle positivo da reação imunohistoquímica para fibronectina em tecido renal. Presença de intensa marcação intersticial difusa. Barras: A, C, E, G e H - 100µm, B, D e F - 30µm.
58
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59
lxxiii
Figura 9 – Imunomarcação para colágeno I. Fig.9A: Marcação intensa em área perivascular e intersticial no grupo controle. Fig. 9B: Detalhe da marcação intersticial da fig.7A (cabeças de seta). Fig.9C: Marcação difusa e moderada em localização intersticial na miocardite. Fig.9D: Visualização em maior aumento da marcação intersticial para colágeno I na miocardite (cabeça de seta). Fig.9E: Reatividade discreta para colágeno I em localização intersticial na cardiomiopatia. Fig.9F: Marcação perivascular (seta) e intersticial (cabeça de seta) na cardiomiopatia em maior aumento. Fig.9G: Controle negativo da reação imunohistoquímica para colágeno I em cortes histológicos de pele exibindo ausência de marcação tecidual. Fig.9H: Controle positivo da reação imunohistoquímica para colágeno I em cortes histológicos de pele. Nota-se a marcação positiva para fibras colágenas presentes no derma superficial. Barras: A, C, E, G e H - 100µm, B, D e F - 30µm.
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lxxv
Figura 10 – Imunomarcação para colágeno III. Fig.10A: Área focal de positividade para colágeno III em região perivascular (cabeça de seta) e intersticial no grupo controle. Fig.10B: Detalhe da marcação perivascular para colágeno III. Fig.10C e D: Marcação intersticial na miocardite (cabeça de seta). Fig.10E e F: caso de cardiomiopatia exibindo reatividade intersticial intensa e difusa para colágeno III (cabeças de seta). Fig.10G: Controle negativo da reação imunohistoquímica para colágeno III em cortes histológicos de pele exibindo ausência de marcação tecidual. Fig.10H: Controle positivo da reação imunohistoquímica para colágeno III em cortes histológicos de pele. Observa-se marcação positiva intersticial e em parede de estruturas vasculares no derma. Barras: A, C, E, G e H - 100µm, B, D e F - 30µm.
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lxxvi
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lxxvii
Marcação para Transglutaminase
0
2
4
6
8
10
12
1 2 3
Grupos CTRL=1; CM=2; MIOC=3
Núm
eros
de
caso
s
IntesrtícioEndotélioCardiomiócitos
Marcação para Colágeno I
0
2
4
6
8
10
12
1 2 3
Grupos CTRL=1; CM=2; MIOC=3
Núm
eros
de
caso
s
Interstício
Figura 11: Gráfico da distribuição da transglutaminase no tecido miocárdico dos três grupos estudados (CTRL: Controle, CM: Cardiomiopatia e MIOC: Miocardite).
Figura 12: Gráfico da distribuição do colágeno I no tecido miocárdico dos três grupos estudados (CTRL: Controle, CM: Cardiomiopatia e MIOC: Miocardite).
64
lxxviii
Marcação para Colágeno III
012345678
1 2 3
Grupos CTRL=1; CM=2; MIOC=3
Núm
ero
de c
asos
Interstício
Marcação para Fibronectina
0
2
4
6
8
10
12
1 2 3
Grupos CTRL=1; CM=2; MIOC=3
Núm
ero
de c
asos
Interstício
Figura 13: Gráfico da distribuição do colágeno III no tecido miocárdico dos três grupos estudados (CTRL: Controle, CM: Cardiomiopatia e MIOC: Miocardite).
Figura 14: Gráfico da distribuição da fibronectina no tecido miocárdico dos três grupos estudados (CTRL: Controle, CM: Cardiomiopatia e MIOC: Miocardite).
65
lxxix
Marcação para Transglutaminase Cardiomiopatia
0
1
2
3
4
5
1 2
Grupos Inflamatória= 1; Dilatada= 2
Núm
ero
de c
asos
interstícioendotéliocardiomiócitos
Marcação para Colágeno I Cardiomiopatia
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1 2
Grupos Inflamatória= 1; Dilatada= 2
Núm
ero
de c
asos
interstício
Figura 15: Gráfico da distribuição da transglutaminase no tecido miocárdico dos dois grupos estudados.
FFigura 16: Gráfico da distribuição do colágeno I no tecido miocárdico dos dois grupos estudados.
66
lxxx
Marcação para Colágeno III Cardiomiopatia
0
1
2
3
4
5
1 2
Grupos Inflamatória= 1; Dilatada= 2
Núm
ero
de c
asos
interstício
Marcação para Fibronectina Cardiomiopatia
0
1
2
3
4
5
1 2
Grupos Inflamatória=1; Dilatada= 2
Núm
ero
de c
asos
interstício
Figura 17: Gráfico da distribuição do colágeno III no tecido miocárdico dos dois grupos estudados.
Figura 18: Gráfico da distribuição da fibronectina no tecido miocárdico dos dois grupos estudados.
67
lxxxi
5.3 – Estudo histomorfométrico
Na análise histomorfométrica da distribuição de colágeno total nos
cortes corados pela técnica do Picro Sírios Red foi evidenciada maior
quantidade de colágeno no grupo de cardiomiopatia em relação aos demais
grupos (Figura 19). Entretanto, somente foi observada diferença
significativa entre os grupos de cardiomiopatia e miocardite (p<0.05).
X Data
CONT4 CMD4 MIOCARD4
Y D
ata
0
10
20
30
40
50
Figura 19: Representação gráfica da concentração do colágeno total nos grupos controle, cardiomiopatia (CM) e miocardite. A quantidade de colágeno total foi maior (*=p<0.05) no grupo CM em relação ao grupo Miocardite. Os valores foram expressos sob a forma de média ± DP.
*
Controle CM Miocardite
M É D I A
68
lxxxii
A quantidade de colágeno tipo I foi maior no grupo controle em
relação aos demais grupos (p<0.05), com a menor reatividade observada no
grupo com cardiomiopatia. Não houve diferença significativa entre os
grupos com miocardite e com cardiomiopatia (Figura 20).
Figura 20: Representação gráfica da concentração colágeno tipo I nos
grupos controle, cardiomiopatia (CM) e miocardite. A quantidade de colágeno tipo I foi maior no grupo controle (p<0.05) em relação aos demais grupos. Não houve diferença entre os dois grupos de pacientes com CM e miocardite. Os valores foram expressos sob a forma de média ± DP. *p<0.05
X Data
CONT2 CMD2 MIOCARD2
Y D
ata
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle CM Miocardite
*
M É D I A
69
lxxxiii
A quantidade de colágeno tipo III foi maior no grupo de
cardiomiopatia tanto em relação ao grupo controle (p<0.05) como em
relação ao grupo com miocardite (p<0.01). Não houve diferença
significativa entre os grupos controle e com miocardite (Figura 21).
Figura 21: Representação gráfica da concentração colágeno tipo III nos grupos controle, cardiomiopatia (CM) e miocardite. A quantidade de colágeno tipo III foi maior no grupo CM em relação aos outros dois grupos. Os valores foram expressos sob a forma de média ± DP.*p<0.05 vs controle, **p<0.01 vs miocardite
X Data
con col III CMD col III MIO col III
Y D
ata
0
5
10
15
20
25
30
Controle CM Miocardite
M É D I A
*,**
70
lxxxiv
A avaliação da marcação da transglutaminase mostrou a maior
reatividade no grupo com miocardite, sendo esta progressivamente menor
nos grupos com cardiomiopatia e no grupo controle respectivamente. Nos
dois grupos de pacientes (CM e miocardite) a reatividade foi
significativamente maior (p< 0.001) do que no grupo controle. A
comparação entre os grupos de pacientes (miocardite vs cardiomiopatia)
também evidenciou diferença estatisticamente significativa (p <0.05)
(Figura 22).
Figura 22: Representação gráfica da concentração de transglutaminase nos grupos controle, cardiomiopatia (CM) e miocardite. A quantidade de transglutaminase foi maior nos pacientes com CM e miocardite em relação ao grupo controle (p<0.001). A comparação entre os dois grupos de pacientes mostrou maior reatividade nos portadores de miocardite (p<0.05). Os valores foram expressos sob a forma de média ± DP. * p<0.001, **p<0.05
X Data
cont CMD miocard
Y D
ata
0
10
20
30
40
50
Control CM Miocardite
M É D I A
*
*,**
71
lxxxv
Para a fibronectina foi evidenciado um aumento crescente de sua
reatividade nos grupos controle, cardiomiopatia e miocardite, com diferença
significativa entre o grupo miocardite e os grupos controle (p<0.005) e
cardiomiopatia (p<0.01). Não houve diferença significativa entre os grupos
cardiomiopatia e controle (Figura 23).
Figura 23: Representação gráfica da concentração de fibronectina nos
grupos controle, cardiomiopatia (CM) e miocardite. A quantidade de fibronectina foi maior no grupo miocardite em relação aos outros dois grupos. Os valores foram expressos sob a forma de média ± DP. *p<0.005 vs controle, **p<0.01 vs CM.
X Data
CONT1 CMD1 MIOCAR1
Y D
ata
0
10
20
30
40
Controle CM Miocardite
M É D I A
*,**
72
lxxxvi
Avaliando-se separadamente os grupos de cardiomiopatia dilatada e
cardiomiopatia inflamatória não se observou diferença significativa
(p>0.05) entre os dois grupos na quantidade da transglutaminase,
fibronectina, colágeno total, colágeno I, colágeno III (Figs. 24 a 28).
Figura 24: Representação gráfica da concentração de transglutaminase nos grupos cardiomiopatia (CM) inflamatória e dilatada. Os valores foram expressos sob a forma de média ± DP.
X Data
CMD ID CMD IN
Y D
ata
0
10
20
30
40
50
Dilatada Inflamatória
M É D I A
73
lxxxvii
Figura 25: Representação gráfica da concentração de fibronectina nos
grupos cardiomiopatia (CM) inflamatória e dilatada. Os valores foram
expressos sob a forma de média ± DP.
Figura 26: Representação gráfica da concentração de colágeno total nos
grupos cardiomiopatia (CM) inflamatória e dilatada. Os valores foram expressos sob a forma de média ± DP.
X Data
CMD ID f CMD IN f
Y D
ata
0
5
10
15
20
25
30
Dilatada Inflamatória
M É D I A
X Data
CMD ID PS CMD IN PS
Y D
ata
0
10
20
30
40
50
Dilatada Inflamatória
M É D I A
74
Figura 27: Representação gráfica da concentração de colágeno tipo I nos
grupos cardiomiopatia (CM) inflamatória e dilatada. Os valores foram expressos sob a forma de média ± DP.
Figura 28: Representação gráfica da concentração de colágeno tipo III nos
grupos cardiomiopatia (CM) inflamatória e dilatada. Os valores foram expressos sob a forma de média ± DP.
CMD ID CI CMD IN CI
Y D
ata
0
5
10
15
20
25
Dilatada Inflamatória
M É D I A
X Data
CMD ID CIII CMD IN CIII
Y D
ata
0
5
10
15
20
25
30
35
Dilatada Inflamatória
M É D I A
75
lxxxix
6 - DISCUSSÃO
Sabe-se que independente da origem, qualquer agressão ao tecido
miocárdico pode desencadear respostas celulares diversas que levarão a
alteração da MEC cardíaca e, se a agressão é sustentada, irá culminar em
um processo de remodelamento patológico do miocárdio (MANABE e
cols., 2002).
A MEC desempenha um papel ativo na regulação do
comportamento das células na miocardite e em outras doenças miocárdicas
como as cardiomiopatias (KISCHIMOTO e cols., 1998), pois sua
homeostase determina a integridade estrutural do coração (RUTSCHOW e
cols., 2005). Alterações na síntese e degradação da MEC cardíaca
prejudicam a função ventricular, característica clínica observada tanto na
miocardite quanto na cardiomiopatia inflamatória. Dentre as alterações
vistas na matriz, o turnover patológico do colágeno é observado em
associação com a perda da integridade estrutural do coração e disfunção
ventricular (RUTSCHOW e cols., 2005).
A maioria dos estudos realizados até hoje determina que no coração
há uma predominância do colágeno tipo I sobre o colágeno tipo III
(WEBER, 1989; PAUSCHINGER e cols., 1998; MANABE e cols., 2002,
PETROVIC, 2004; FEDAK, e cols., 2005). Nas cardiomiopatias há um
aumento da quantidade do colágeno total, devido ao aumento absoluto nas
concentrações de colágenos tipos I e III, com predominância do colágeno
76
xc
tipo I sobre o colágeno tipo III (MANABE e cols., 2002; PAUSCHINGER
e cols., 1999; 1990; MARIJIANOWSKI e cols., 1995; BRUCKNER e
cols., 2001). LI e cols. (2002), demonstraram em seu estudo, através da
quantificação por imunohistoquímica, que não havia diferença significativa
na expressão do colágeno tipo I em camundongos com miocardite quando
comparados com o grupo controle.
Em nosso estudo, a análise do colágeno total através do Picro Sírius
Red não mostrou alteração significativa entre o grupo da miocardite e o
grupo controle, sendo que neste último grupo a distribuição, embora não
significativa, foi discretamente maior. Para tentar explicar este resultado
podemos levantar uma hipótese baseada na informação de que no processo
inflamatório do miocárdio a perda de colágeno e o aumento das MMPs se
inicia logo após o início da injúria (MANABE e cols., 2002). Como não
dispomos das informações referentes à evolução clínica desses pacientes,
não podemos afirmar em qual fase do remodelamento estes tecidos se
encontravam. A possibilidade de que MMPs possam estar atuando na
miocardite, promovendo maior degradação do colágeno, aliado ao fato de
que sua síntese ocorre de forma mais lenta do que as outras proteínas não
colágenas (WEBER, 1989), poderia explicar a menor deposição na MEC
cardíaca na miocardite.
O aumento do colágeno total na cardiomiopatia em relação aos
demais grupos, embora com significância apenas em relação ao grupo
77
xci
miocardite, está de acordo com a literatura (PAUSCHINGER e cols.,
1999). É provável que o aumento da expressão de TGF-β1 e TFG- β2 na
cardiomiopatia seja responsável pela maior síntese de colágeno. Outra
possibilidade, oriunda da observação em modelos murinos de miocardite,
que poderia ser responsável pelo remodelamento patológico do colágeno
seria o aumento da expressão de IL-1 β, fator de necrose tumoral α(TNF-
α), TGF-β1 e IL-4 associada ao aumento das MMPs e redução das TIPMs
(LI e cols., 2002).
Analisando a constituição do colágeno total intersticial através do
estudo imunohistoquímico na cardiomiopatia, evidenciamos que sua maior
distribuição ocorreu pelo aumento do colágeno III. Este padrão não foi
identificado nos demais grupos, onde colágeno I se encontrava em uma
proporção maior que o colágeno III. Entretanto a maior distribuição de
colágeno I foi evidenciada no grupo controle em relação a miocardite.
Estes resultados diferem de alguns autores (MANABE e cols., 2002;
PAUSCHINGER e cols., 1999; MARIJIANOWSKI e cols., 1995;
BRUCKNER e cols., 2001). Em outros estudos, cujos resultados estão de
acordo com o nosso estudo, verificou-se aumento do colágeno III em
relação ao colágeno I nas cardiomiopatias de várias etiologias, tais como
cardiomiopatia dilatada, hipertrófica e isquêmica (PAUSCHINGER e cols.,
1998; WEBER, 1989; LOMBARDI e cols., 2003; HERPEL e cols., 2005)
e diminuição do colágeno tipo I (WEBER e cols., 1988; LOMBARDI e
78
xcii
cols., 2003 ). A maioria destes autores não foi capaz de justificar ou sugerir
uma hipótese para essa inversão de padrão de deposição de colágeno.
HERPEL e cols. (2006) tentaram explicar o padrão, com predomínio do
colágeno tipo III, pelo fato da quantificação, como no nosso estudo, ter
sido realizada na fibrose intersticial. Nos trabalhos onde se observou o
predomínio do colágeno tipo I, a quantificação foi feita tanto na fibrose
intersticial como na fibrose segmentar e de substituição (cicatriz).
Sabe-se que o processo de remodelamento do colágeno se inicia
com a sua degradação seguida de síntese, três a cinco dias depois.
Inicialmente ocorre aumento do colágeno tipo III que, ao final de alguns
meses, é substituído pelo colágeno tipo I (WEBER, 1989). No presente
trabalho não foi possível determinar o tempo de evolução desse processo de
remodelamento em condições patológicas e os fatores clínicos que
pudessem influenciar ou confrontar com os dados obtidos.
Ao compararmos a distribuição da fibronectina nos três grupos
observamos maior deposição no grupo com miocardite em relação aos
demais grupos. Entre os grupos cardiomiopatia e controle não houve
diferença significativa. O aumento da quantidade de fibronectina observado
no nosso estudo nos pacientes com miocardite está de acordo com os
achados da literatura. O aumento inicial e sustentado da deposição de
fibronectina no coração está relacionado e pode preceder, à deposição de
colágeno contribuindo também para a ligação matriz-célula no
79
xciii
remodelamento (AMMARGUELLAT e cols., 2002; KISHIMOTO e cols.,
1998). Também já foi evidenciado que há deposição de fibronectina no
interstício em áreas de miocardite ativa persistente. Esta deposição persiste
em áreas sem fibrose até 30 dias após o início do processo, podendo ser
observada tardiamente, até 60 dias, nas em áreas com fibrose
(KISHIMOTO e cols., 1998).
A deposição de fibronectina associada com células inflamatórias
precede o desenvolvimento da fibrose intersticial na miocardite e o
infiltrado inflamatório está intimamente relacionado à fibrose miocárdica
que se desenvolve posteriormente (KISHIMOTO e cols., 1998). Este
mecanismo pode explicar o maior acúmulo de fibronectina observado nos
pacientes com miocardite em relação aos demais grupos.
A associação da fibronectina com a tTG forma um complexo muito
importante necessário para que esta enzima exerça seu papel no
remodelamento tecidual. Esta ligação protege a tTG da degradação
proteolítica como também altera sua atividade de transaminação. A TGt
também colabora com integrinas para a produção de fibronectina da matriz
e promove ligação cruzada com colágenos tipos I, II, III, V e XI
(VERDERIO e cols., 2004).
A função da tTG dependente estritamente da associação com a
fibronectina. A tTG está aumentada em várias condições inflamatórias
podendo estar envolvida no processo de fibrose cardíaca, já tendo sido
80
xciv
observado o aumento de sua expressão no miocárdio de camundongos com
cardiomiopatia (VERDERIO e cols., 2004). Isto justifica no nosso estudo o
seu aumento no grupo da miocardite, seguido pelo grupo de cardiomiopatia
e grupo controle respectivamente, acompanhando respectivamente a
distribuição da fibronectina.
VERDERIO e cols. (2004) sugeriram em seu estudo que a tTG é
capaz de modificar o mecanismo causal da deposição do colágeno. Seu
acúmulo leva à ligações cruzadas com elementos da matriz, especialmente
colágeno e fibronectina, resultando na sua deposição acelerada. Somando-
se a estes resultados, LARRETA-GARDE e BERRY (2002) afirmam que a
influência da tTG na MEC parece ser o inverso da ação das proteinases,
tornando o colágeno mais resistente à sua ação. No nosso estudo foi
evidenciado que o aumento da tTG e fibronectina estava associado ao
aumento do colágeno total no grupo das cardiomiopatias. Entretanto, a
maior deposição da tTG acompanhada da fibronectina, foi observada na
miocardite, grupo no qual foi detectada a menor deposição de colágeno
total. Entretanto sabe-se que a tTG também participa do processo
inflamatório, limitando a resposta inflamatória através da indução da
apoptose. Este mecanismo poderia explicar a nossa observação de aumento
de tTG no grupo com miocardite.
A persistência da agressão estimula a manutenção dos níveis
elevados de tTG que levam ao acúmulo excessivo de MEC e fibrose
81
xcv
(VERDERIO e cols., 2004). Nos pacientes com cardiomiopatia este
mecanismo pode ter sido responsável pelo aumento do colágeno total,
secundário ao aumento de tTG. Mais uma vez seria necessário estabelecer a
fase do remodelamento na qual o tecido cardíaco desses pacientes se
encontrava para determinar uma correlação definitiva com nossos dados.
A tentativa de comparar a distribuição dos componentes da MEC e
transglutaminase nos dois grupos de pacientes originados pela subdivisão
do grupo de cardiomiopatia - cardiomiopatia dilatada e cardiomiopatia
inflamatória - não mostrou diferença na distribuição destes elementos.
Apesar da falta de significância estatística, consideramos que há uma
tendência a maior deposição de colágeno total no grupo com
cardiomiopatia dilatada em relação a cardiomiopatia inflamatória, com
predomínio de colágeno tipo III nos dois grupos estudados em relação ao
colágeno I.
Nossos resultados concordam parcialmente com os achados de
PAUCHINGER e cols. (1998). Estes autores demonstraram diferença na
razão do colágeno tipo III / colágeno tipo I nestas duas cardiomiopatias,
sendo essa razão maior na cardiomiopatia dilatada. No entanto, a maior
distribuição do colágeno III em relação ao colágeno I nos dois grupos está
de acordo com os nossos resultados. Uma das razões que podemos levar em
consideração para justificar nossos resultados é o pequeno tamanho da
amostra em ambos os grupos.
82
xcvi
Na avaliação da transglutaminase e da fibronectina observamos
discreta elevação de ambas no grupo da cardiomiopatia inflamatória, porém
sem diferença significativa. Mais uma vez o tamanho da amostra poderia
explicar estes resultados.
83
xcvii
7 - CONCLUSÕES 1. O presente estudo identificou a distribuição dos componentes da MEC
cardíaca (colágeno I, colágeno III e fibronectina) e da transglutaminase, na
miocardite e cardiomiopatias em biopsias endomiocárdicas.
2. Foi detectado aumento da distribuição intersticial do colágeno tipo III e
diminuição do colágeno I nas cardiomiopatias em relação a miocardite.
3. A deposição tanto da fibronectina como da transglutaminase é maior na
miocardite em relação as cardiomiopatias.
4. Não houve correlação entre a distribuição do colágeno total com as
proteínas fibronectina e tTG nas cardiomiopatias. A transglutaminase
seguiu o padrão de apresentação da fibronectina.
5. Não foram observadas diferenças na distribuição dos componentes da
MEC e tTG entre as cardiomiopatias dilatada e inflamatória.
84
xcviii
8 – PERSPECTIVAS FUTURAS
● Tentar estabelecer uma correlação entre os achados morfológicos e o
quadro clínico nas miocardites e cardiomiopatias.
● Reproduzir este estudo numa maior amostra de pacientes, na tentativa de
identificar perfis diferentes de distribuição desses componentes na doença
dilatada e inflamatória.
● Acrescentar ao estudo a identificação e caracterização da distribuição de
MMPs nos grupos estudados, visando obter informações quanto a
degradação dos colágenos nestes casos.
85
xcix
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