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CAROLINE PEREIRA DE SOUZA

ADEQUABILIDADE DO MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE ÁCIDO F ÓLICO NO

PRODUTO FOLIN

CANOAS, 2012.

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PRODUTO FOLIN

Trabalho de conclusão apresentado ao Curso de Química do Centro Universitário La Salle – Unilasalle, como exigência parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Química.

Orientação: Prof. Drª Ana Cristina Borba Cunha

CANOAS, 2012.

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PRODUTO FOLIN

Trabalho de conclusão aprovado como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Química pelo Centro Universitário.

Aprovado pelo avaliador em 11 de julho de 2012.

AVALIADOR:

__________________________________________ Prof. Drª Ana Cristina Borba Cunha

Unilasalle

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A Deus que me deu o dom da vida.

À minha querida mãe Lili, que amo muito.

Aos meus irmãos, Gabriela e Rafael,

pelo companheirismo.

Ao meu pai, Antônio Francisco (in

memorian).

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AGRADECIMENTO

Primeiramente agradeço a Deus por tudo que tem me concebido, mesmo não

sendo o que eu espero, mas sim aquilo que eu preciso.

A todos que acreditaram no meu potencial, e ajudaram a alcançar o meu

objetivo, de concluir a graduação em química.

Especialmente à minha mãe, Lili, por todo o seu amor e paciência, a minha

irmã Gabriela pelas excelentes críticas ao meu trabalho, ao meu irmão Rafael, que

mesmo longe sempre esteve perto, e ao meu namorado Roger por sempre me

incentivar.

Agradeço a ajuda das minhas colegas, Marilene Boni e Lígia Deresz, que

contribuíram muito na realização deste trabalho.

A minha orientadora, Ana Cristina Borba Cunha, agradeço pelo excelente

profissionalismo na orientação do meu trabalho, pela atenção e dedicação neste

momento tão importante, que é a conclusão da graduação.

Muito obrigada a todos!

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RESUMO

O presente trabalho apresenta o estudo da adequabilidade do método de

quantificação do teor de ácido fólico no produto Folin®, sendo utilizada para este a

metodologia analítica a prática de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).

Foram realizadas várias análises do produto e utilizou-se os dados obtidos para se

determinar os parâmetros de seletividade, linearidade, precisão e exatidão do

método analítico utilizado em questão. Com a análise de todos os resultados

analíticos verificou-se que os ensaios realizados estavam de acordo com o

especificado na Resolução RE 899/2003 (ANVISA, 2003), e o método apresenta-se

validado quanto à adequabilidade.

Palavras chave: Cromatografia líquida. Seletividade. Linearidade. Precisão.

Exatidão.

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ABSTRACT

The present work shows the suitability of the method of quantification of folic acid in

Folin® product, and is used for this analytical methodology to the practice of High

Performance Liquid Chromatography (HPLC). They performed several analyzes of

the product and used the data obtained to determine the selectivity parameters,

linearity, precision and accuracy of the analytical method in question. With the

analysis of all the results, it was found that the tests were carried out according to the

resolution specified in RE 899/2003 (ANVISA, 2003), and the method is presented

regarding the suitability valited.

Keywords: Liquid chromatography. Selectivity. Linearity. Accuracy. Exactly.

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 9

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................... ....................................................... 10

2.1 Ácido Fólico .................................. .......................................................................... 10

2.2 Validação de método analítico ................. ............................................................. 11

2.2.1 Seletividade/Especificidade ................................................................................... 12

2.2.2 Linearidade ............................................................................................................ 13

2.2.3 Precisão ................................................................................................................ 15

2.2.3.1 Repetibilidade ou repetitividade (repê) ............................................................... 15

2.2.3.2 Precisão intermediária ........................................................................................ 16

2.2.3.3 Exatidão ............................................................................................................. 16

2.3 Cromatografia Líquida de Alta Performance (CLAE ) .......................................... 17

2.3.1 Fase móvel ............................................................................................................ 18

2.3.2 Bombas ................................................................................................................. 18

2.3.3 Injetor .................................................................................................................... 18

2.3.4 Coluna ................................................................................................................... 18

2.3.5 Detector ................................................................................................................. 19

3 MATERIAIS E REAGENTES ........................... ........................................................... 20

3.1 Equipamentos .................................. ....................................................................... 20

3.2 Vidrarias ..................................... ............................................................................. 20

3.3 Reagentes e materiais.......................... .................................................................. 20

3.4 Método analítico para o teor de ácido fólico no produto .................................... 20

3.4.1 Preparo da fase móvel .......................................................................................... 21

3.4.2 Preparo da solução de diluição ............................................................................. 21

3.4.3 Preparo da solução system suitability ................................................................... 22

3.4.4 Preparo da solução padrão de ácido fólico ........................................................... 22

3.4.5 Preparo da amostra de ácido fólico ....................................................................... 22

3.5 Cálculo estatístico de linearidade ............ ............................................................. 22

3.6 Cálculo estatístico de repetibilidade e precisã o intermediária .......................... 23

3.6.1 Repetibilidade ........................................................................................................ 23

3.6.2 Precisão intermediária ........................................................................................... 23

3.6.3 Cálculo estatístico da exatidão .............................................................................. 23

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................... ........................................................ 25

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4.1Seletividade/Especificidade .................... ............................................................... 25

4.2 Linearidade ................................... .......................................................................... 27

4.3 Exatidão ...................................... ............................................................................ 28

4.4 Precisão ...................................... ............................................................................ 29

5 CONCLUSÃO ....................................... ...................................................................... 30

REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 31

ANEXO A: RESULTADOS DO ANALISTA 1 ................. ............................................... 33

ANEXO B: RESULTADOS DO ANALISTA 2 ................. ............................................... 34

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1 INTRODUÇÃO

O Ácido Fólico é uma vitamina do complexo B, indicada no tratamento de

anemias e na prevenção de malformações do feto durante a gestação. Também é

utilizado em pacientes com deficiência de vitamina B.

Cada vez mais as empresas estão buscando adaptarem-se as exigências

normativas sobre a validação dos métodos analíticos. De acordo com Albano (2009)

a validação de ensaios laboratoriais tem por objetivo a confiabilidade analítica do

método escolhido ou desenvolvido na execução do ensaio e na obtenção do

resultado. Este processo tem seu custo, pois gera mudanças, porém o mesmo deve

ser considerado como um investimento e não como despesa. Afinal a validação é

feita por exigência da fiscalização, de órgãos acreditados ou por uma visão futura de

mercado da própria empresa.

As empresas do ramo farmacêutico devem seguir as normas para validação

definidas pela Anvisa, atualmente RE 899/2003, que cita que os métodos devem

atender as exigências das aplicações analíticas, garantindo a confiabilidade dos

resultados. Neste documento (RE 899/2003), também contém a informação de que

os métodos farmacopeicos são considerados validados. Porém, na Resolução

Diretória Colegiada (RDC)17/2010 que dispões sobre Boas Práticas de Fabricação

de Medicamentos, esses métodos devem atender as exigências de adequabilidade

do método, garantindo que este cumpra as especificações do método validado.

Para avaliar a adequabilidade do método foram determinados os seguintes

parâmetros: seletividade, linearidade, precisão e exatidão, conforme a Agência

Nacional de Vigilância Sanitária prevê na Resolução RE 899/2003. Este trabalho

teve como objetivo analisar estes parâmetros do método de determinação de ácido

fólico no produto Folin®, por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).

10

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 Ácido Fólico

O ácido fólico também denominado ácido pteroilglutâmico, é uma vitamina do

complexo B (vitamina B9), a forma sintética do folato, com peso molecular de 441,40

g/mol, e que apresenta fórmula molecular: C19H19N7O6 – Ácido N-[4-[[(2-amino-3,4-

diidro-4-oxo-6-pteridinil) metil] amino] benzoil]-L-glutâmico

Figura 1: Estrutura do ácido fólico

Fonte: Farmacopéia Brasileira.

O produto é uma medicação vitamínica complementar essencial na gestação e

na lactação de humanos, contém 5 mg de ácido fólico em cada comprimido. É

utilizado nas situações clínicas de anemias hemolíticas e megaloblásticas não-

perniciosas causadas por deficiência de vitamina B12. O uso de ácido fólico no

período que antecede e durante a gestação diminui a incidência de malformações do

tubo neural.

O ácido fólico é uma vitamina essencial nos processos metabólicos

intracelulares, necessária para a síntese de DNA. Apesar da presença na

alimentação, os folatos são muito sensíveis ao calor, degradando com o cozimento

dos alimentos. O folato atua também no metabolismo da homocisteína, através da

doação do grupo metila para formação da metionina. O ácido fólico é absorvido no

trato intestinal, principalmente no duodeno e jejuno, após a dissolução inicial no

estômago. Após a absorção, o ácido fólico é rapidamente convertido no fígado e

plasma em sua forma metabólica ativa, 5-metiltetraidrofolato mediante a enzima

diidrofolato redutase. A eliminação do ácido fólico é por via renal. A quantidade em

11

excesso e excretada inalterada na urina. O folato é distribuído para o leite materno.

O ácido fólico é removido por hemodiálise (BULA PRODUTO FOLIN® - GEYER

MEDICAMENTOS S.A.).

2.2 Validação de método analítico

De acordo com a ANVISA, através da resolução da Diretória Colegiada (RDC) nº

17/2010, a validação é um ato documentado que atesta que qualquer procedimento,

processo, equipamento, material, atividade ou sistema realmente e consistente leva

aos resultados esperados.

A fim de garantir que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, é

feita a validação a partir de análises experimentais obtendo assim, resultados

confiáveis. (ANVISA, 2010). A validação é a comprovação, através do fornecimento

de evidência objetiva, de que os requisitos para uma aplicação ou uso específicos

pretendidos foram atendidos (NBR ISO 9000, 2000).

Para que seja feita uma validação é preciso um plano mestre de validação

baseado em estudos de todos os métodos para validação, pois não há um método

específico para cada análise. A partir de resoluções e guias, são feitas adaptações e

ajuste das recomendações às suas necessidades. (LEITE, 1998).

Segundo Harris (2008) e Skoog (2009) a validação do método é o processo que

prova que um método analítico é aceitável para os propósitos que ele se destina.

Pode ser aplicada a amostras, metodologias e dados, e determina a adequação de

uma análise a fim de fornecer a informação desejada.

Existem protocolos que são internacionalmente aceitos para a validação

completa (full validation), que são o Protocolo Harmonizado Internacional e o

procedimento ISO (International Standard Organization). O estudo interlaboratorial,

destes protocolos necessita de um número mínimo de laboratórios e materiais para

que seja feita a validação completa do método analítico. (RIBANI, 2004).

Porém, consta na RDC nº17/2010: “Parágrafo único. Os métodos analíticos

compendiais não requerem validação, entretanto antes de sua implementação,

devem existir evidencias documentadas de sua adequabilidade nas condições

operacionais do laboratório.” (ANVISA, 2010)

Portanto, o método utilizado para análise de teor de ácido fólico no produto, deve

ser testado quanto a sua adequabilidade, apesar de ser um método farmacopeico.

12

Para a avaliação da adequabilidade do método nas condições real de uso não

será necessária repetir todos os parâmetros normalmente utilizados na validação de

métodos analíticos. Conforme a Resolução – RE n° 899, de 29 de maio de 2003, da

ANVISA, considerando que o produto em questão encontra-se classificado na

categoria I da Tabela 1 descrita nessa resolução, os parâmetros da adequabilidade

do método de determinação do teor de ácido fólico no produto Folin são:

a) Especificidade/seletividade;

b) Linearidade;

c) Precisão Repetibilidade;

d) Exatidão.

2.2.1 Seletividade/Especificidade

Na resolução RE 899/2003 (ANVISA, 2003) os termos especificidade e

seletividade são definidos como sendo a capacidade do método de medir

exatamente um composto em presença de outros componentes tais como impureza,

produtos de degradação e componentes da matriz.

Conforme Albano (2009), a seletividade é a capacidade do método de

diferenciar a substância a ser analisada e substâncias análogas. Este parâmetro

pode ser analisado a partir da comparação dos sinais advindos do processamento

da matriz, do extrato da matriz fortificado e do analito.

Segundo Barros (2002), a especificidade do método pode ser demonstrada

através do desvio dos resultados obtidos pela análise do analito de interesse em

amostras fortalecidas com todos os interferentes e os resultados obtidos com

amostras não fortalecidas, contendo somente o analito. Quando não se conhecem

os interferentes, a especificidade do método pode ser investigada pela comparação

dos resultados com outros métodos/técnicas independentes.

Porém, Ribani et. al. (2004) diferencia a seletividade da especifidadede

definindo a seletividade como sendo a capacidade que o método analítico tem de

avaliar, de forma inequívoca, as substâncias em exame na presença de

componentes que podem interferir com a sua determinação em uma amostra

complexa. Dessa forma a seletividade avalia o grau de interferência de espécies

como outro ingrediente ativo, excipientes, impurezas e produtos de degradação,

13

bem como outros compostos de propriedades similares que possam estar,

porventura, presentes.

Segundo o INMETRO (2010) (DOQ-CGCRE-008) a seletividade e a

especificidade estão relacionadas ao evento da detecção. Pois a seletividade de um

método instrumental de separação é caracterizada pela distinção de um único

analito em presença de outros. Já a especificidade está na produção de uma única

resposta para apenas um analito específico. Entretanto, os dois termos são

frequentemente utilizados indistintamente ou com diferentes interpretações. Porém,

IUPAC sugere que se utilize somente o termo seletividade.

De acordo com Ribani et. Al. (2004), a seletividade garante que o pico de

resposta seja exclusivamente do composto de interesse. Se a seletividade não for

assegurada, a linearidade, a exatidão e a precisão estarão seriamente

comprometidas. Por isto a seletividade deve ser o primeiro parâmetro a ser

determinado na validação de um método instrumental de separação, já que algumas

amostras podem sofrer degradação, gerando compostos que podem coeluir com a

amostra de interesse.

A ANVISA (2003), na resolução RE 899/2003, determina que em métodos

cromatográficos, devem-se tomar as precauções necessárias para garantir a pureza

dos picos cromatográficos, através da utilização de detector de arranjo de

fotodiodos, demonstrando que o pico cromatográfico é atribuído a um só

componente.

2.2.2 Linearidade

Segundo consta na resolução RE 899/2003 (ANVISA), a linearidade relaciona e

demonstra que os resultados analíticos são proporcionais a concentração do analito.

Já Leite (2002) explica o significado teórico de linearidade, como sendo a

região da curva resposta ou de quantificação onde há relação direta

sinal/concentração.

Para Albano (2009), Ribeiro (2008), Brito et. al. (2003) e Ribani et. al. (2004) a

linearidade expressa à capacidade do método em fornecer resultados diretamente

proporcionais à concentração da substância em análise, dentro de um intervalo

específico. Sendo que esta relação entre o sinal medido (área ou altura do pico) e a

14

massa ou concentração da espécie a ser quantificada, é definida empiricamente com

concentrações conhecidas do analito e o sinal de resposta obtido.

Então para se obter a linearidade é preciso que se alcance uma proporção

direta entre os resultados e as concentrações do analito. Para isso é necessário

construir uma curva de calibração, ou curva de resposta como cita Leite (2002). Esta

irá apresentar no eixo x a concentração do analito e no eixo y o sinal da resposta,

assim a equação da reta será: y=ax+b, onde a=coeficiente angular, que é a

inclinação da curva aos eixos, e b=coeficiente linear, que é a intersecção da curva

aos eixos. A figura 2 apresenta uma curva de calibração linear e a respectiva

equação da reta

Figura 2: Curva de Calibração linear e a respectiva equação da reta

Onde: Y = Área do padrão; a = coeficiente linear da reta; x = Concentração; b = coeficiente angular da reta = fator resposta; AA = área do analito na solução injetada; CC = concentração do analito na solução injetada (µg/L)

Fonte: Autoria própria, 2012.

De acordo com a ANVISA (2003) na RE 899/2003, a curva de calibração deve

ter no mínimo cinco pontos, porém consta nas considerações gerais da resolução

899/2003 que esta deve obter no mínimo seis concentrações do padrão do fármaco.

Também especifica um intervalo compreendido entre 80 – 120% da concentração

teórica para fármacos e medicamentos.

Conforme Leite (2002) e Ribeiro (2008), a regressão linear (método dos

mínimos quadrados) é uma forma de estimar qual a melhor reta que passa pelos

pontos obtidos experimentalmente. O coeficiente de correlação relaciona x e y na

curva sendo que os valores ideais esperados são 1 e -1, ou seja, quanto mais

próximo da unidade maior a relação, maior a probabilidade de existir uma relação

linear definida. Já se os valores ficarem próximo de zero indica que não há relação

15

linear. Para a ANVISA o coeficiente de correlação deve ser igual a 0,99, porém o

INMETRO determina com sendo um valor acima de 0,90.

2.2.3 Precisão

A dispersão dos resultados entre ensaios independentes é definida por Ribani

et. al. (2004) como sendo a precisão. Esta pode ser determinada através do cálculo

de desvio padrão de resultados ou coeficiente de variação, que é uma estimativa do

desvio padrão relativo.

A resolução RE 899/2003 (ANVISA) define a precisão como sendo a avaliação

da proximidade de resultados em uma série de repetições de uma mesma amostra

com múltiplas amostragens.

De acordo com o Instituto Nacional de Metrologia (2003) a precisão serve para

avaliar a dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma

mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, em condições definidas.

A precisão é pode ser definida em três níveis:

a) Repetitividade ou repetibilidade

b) Precisão intermediária

c) Reprodutibilidade

2.2.3.1 Repetibilidade ou repetitividade (repê)

Segundo Albano (2009), Skoog (2006), Rodrigues et al. (2008), Lima (2007) e

Leite (2002) repetibilidade é a máxima diferença aceitável entre resultados

independentes de repetições feitas no mesmo ensaio e no mesmo laboratório.

O termo repetibilidade é utilizado pela ANVISA, porém o INMETRO utiliza o

termo repetitividade, pois é adotado pelo vocabulário Internacional de Metrologia,

mas os dois termos são definidos como sendo a concordância entre os resultados de

medições sucessivas da mesma amostra com o mesmo analista.

Também é chamada de precisão intra-corrida, pois é feita no mesmo

instrumento, com o mesmo analista e no mesmo dia (FECHIO, 2009; CASSIANO,

2009). Esta pode ser verificada através da estimativa do desvio padrão relativo de 9

(nove) determinações, sendo 3 concentrações, baixa, média e alta, com 3 réplicas

cada a 100% da concentração do teste.

16

2.2.3.2 Precisão intermediária

De acordo com a resolução RE 899/2003 (ANVISA) a precisão intermediária é

também chamada de precisão inter-corridas, pois é a concordância de resultados

obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes, mas no mesmo laboratório. A

precisão pode ser expressa como o desvio padrão relativo ou coeficiente de variação

(CV%).

Ribani et.al.(2004), Pedott (2010) e Nascimento et al. (2008) evidenciam que o

principal objetivo deste parâmetro é verificar que no mesmo laboratório o método

fornecerá os mesmo resultados. Afinal, este indicará o efeito das variações dentro do

laboratório devido à mudança de dias e analistas.

2.2.3.3 Exatidão

Albano (2009) define exatidão como a tendência em apresentar resultado

maior ou menor que o valor real, ou seja, é a concordância entre o resultado de um

ensaio e o valor de referência aceito convencionalmente como verdadeiro.

Segundo Ribani et al. (2004) a exatidão é o grau de concordância entre os

resultados individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de

referência aceito como verdadeiro. Para avaliar a exatidão os processos mais

utilizados são:

a) Materiais de referência: são também chamados de CRM (materiais de

referência certificados), pois acompanham um certificado que possui um

valor de concentração de uma dada substância e uma incerteza

associada, que são comparados com os resultados obtidos no laboratório;

b) Comparação de métodos: avalia o grau de concordância entre o método

testado e o de referência, sendo que a incerteza do método de referência

é conhecida.

c) Ensaios de recuperação: é a quantidade de analito adicionada que pode

ser extraída e quantificada, ou seja, é o padrão da substância que é

adicionado à matriz isento desta substância.

A ANVISA (RE 899/2003) define a exatidão como sendo a proximidade dos

resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor verdadeiro. Esta

17

deve ser determinada após o estabelecimento da linearidade e da especificidade do

método, sendo verificada a partir de 9 determinações contemplando o intervalo linear

do procedimento, ou seja 3 concentrações, baixa, média e alta, com 3 réplicas cada

e é expressa pela relação entre a concentração média determinada

experimentalmente e a concentração teórica correspondente:

Exatidão = concentração média experimental x 100 concentração teórica

2.3 Cromatografia Líquida de Alta Performance (CLAE )

O método analítico de determinação de ácido fólico é realizado no Cromatógrafo

Líquido de Alta Eficiência (CLAE), também chamado de HPLC (High Pressure Liquid

Chromatography). Neste instrumento ocorre a separação de substâncias polares,

iônicas, ionizáveis e apolares, através de uma coluna, variando a composição da

fase móvel de acordo com a análise de interesse (SKOOG, 2009; CIENFUEGOS,

2000). Abaixo temos um esquema de um cromatógrafo líquido de alta eficiência com

todas as partes identificadas.

Figura 3: Esquema de um cromatógrafo líquido

Fonte: Cienfuegos, 2000

18

2.3.1 Fase móvel

Trata-se de uma solução, com pH específico para análise, que é filtrada antes

do uso por uma membrana, objetivando evitar que partículas sólidas obstruam o

sistema de bombeamento e a coluna. A fase móvel deve ser preparada no dia da

utilização para evitar degradação ou contaminação do solvente. Além disso, ela

deve ser desgaseificada, pois o ar dissolvido pode formar bolhas que prejudica a

bomba e faz com que a pressão diminua (CIENFUEGOS, 2000).

2.3.2 Bombas

São necessárias para que a pressão seja alta e o fluxo possa sobrepor à

resistência das micropartículas da fase estacionária empacotadas na coluna, e

também evitar que se formem microbolhas no sistema (CIENFUEGOS, 2000).

2.3.3 Injetor

É a parte do equipamento por onde se introduz a amostra, sem alterar a

vazão do sistema, pois ocorre a diluição da solução injetada antes do contato com o

solvente, evitando o alargamento da banda do cromatograma (CIENFUEGOS,

2000). A reprodutibilidade do equipamento é melhor já que utilizamos um

equipamento com injeção automática (auto-sampler), diminuindo o intervalo entre as

injeções garantindo assim maior eficiência na análise.

2.3.4 Coluna

São construídas de tubos de aço inoxidável com comprimentos que variam de

10 a 30cm, na forma reta evitando perda da eficiência. O diâmetro interno de

colunas para líquidos geralmente é de 4 a 10mm e o tamanho de partícula mais

comum da fase estacionária é de 5 a 10µm. Este tipo de coluna possui de 40 mil a

60 mil pratos/metro (SKOOG, 2006).

19

Para aumentar a vida útil de uma coluna utilizam-se as chamadas pré-

colunas, que tem a função de proteger a coluna evitando que o sistema seja

danificado (CIENFUEGOS, 2000).

2.3.5 Detector

Responsável por receber e fornecer o sinal que representa a quantidade do

analito no eluente da coluna (CIENFUEGOS, 2000). Utilizamos um equipamento

com detector de malha de fotodiodos também conhecido como Diode Array Detector

(DAD). Estes detectores possuem um sistema ótico invertido, em relação aos

equipamentos UV convencionais, pois a célula é iluminada com luz policromática e a

luz emergente da célula chega a uma rede de difração através da qual é dispersada

até o elemento fotossensível. Utiliza-se um conjunto de fotocélulas ou fotodiodos ao

invés de uma única célula como nos demais detectores.

20

3 MATERIAIS E REAGENTES

Para o estudo desenvolvido, foram utilizadas vidrarias certificadas, equipamentos

qualificados, padrões farmacopeicos e reagentes preparados conforme métodos

farmacopeicos, de forma a minimizar possíveis variáveis que possam interferir na

confiabilidade do método empregado.

3.1 Equipamentos

Para a realização dos ensaios foi utilizado os seguintes equipamentos: balança

analítica - Shimadzu, pHmetro - Hanna instruments, bomba de vácuo - Tecnal,

ultrassom – Unique e Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência – Shimadzu.

3.2 Vidrarias

Para o preparo das soluções utilizadas, assim como a realização da análise de

teor do ácido fólico, foram utilizadas as seguintes vidrarias: balões volumétricos de

10 mL/5 mL/25 mL/50 mL e 100 mL, pipetas volumétricas de 2 mL/5 mL e 10 mL,

Kitasato, erlenmeyer 25 mL, funil de vidro, vials 2 mL.

3.3 Reagentes e materiais

Para a análise de teor do ácido fólico foram utilizados os seguintes reagentes:

água purificada, perclorato de sódio P.A, hidróxido de amônio P.A, metanol grau

HPLC, hidróxido de potássio 1 N, fosfato de potássio monobásico P.A, Ácido fólico

padrão USP, Compostos relacionados A do ácido fólico – padrão USP, filtro

quantitativo faixa preta – diâmetro 12,5 mm, membrana filtrante hidrofílica 0,45

micras, filtro de seringa 0,45 micras.

3.4 Método analítico para o teor de ácido fólico no produto

O método analítico utilizado está descrito na Farmacopéia Americana (2009). A

análise foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência. O cromatógrafo

possui um detector de 254 nm e a coluna utilizada foi de 4,6 mm x 25 cm (coluna

21

L1). O fluxo de escoamento é de aproximadamente 1 mL/minuto. A cromatografia da

solução system suitability e do padrão respondem de acordo com o procedimento: a

resolução, R, entre os compostos relacionados A do ácido fólico

(formiltetrahidrofolato de cálcio) e o ácido fólico não é menor que 3,6 e o desvio

padrão relativo das replicações injetadas não é maior que 2,0%.

Foram injetados, separadamente volumes iguais (cerca de 25 µL) das soluções

padrão e solução amostra no cromatógrafo, registraram-se os cromatogramas, e

mediram-se as respostas do pico maior. A quantidade, em mg, de ácido fólico foi

calculada (C9H19N7O6) na porção de comprimidos usando a fórmula: (CV) (ru/rs),

Onde:

c= concentração (mg/mL), de ácido fólico padrão na solução padrão

v= volume (mL) de solução amostra

ru= pico de resposta obtido na solução amostra

rs= pico de resposta obtido na solução padrão

3.4.1 Preparo da fase móvel

Foi preparada em um balão volumétrico de 1000 mL, uma solução em que

foram colocados 70 g de perclorato de sódio, 40 mL de metanol e 14 mL de

hidróxido de potássio 1N. Verificou-se e corrigiu-se o pH no valor de 7,2. Após foi

completado o volume do balão com água ultrapura e a solução foi homogeneizada e

filtrada com o auxilio de uma bomba de vácuo, kitasato e papel filtro de 0,45µm.

3.4.2 Preparo da solução de diluição

Foi preparada em um balão volumétrico de 1000 mL, uma solução em que

foram colocados 10 g de perclorato de sódio e 20 mL de hidróxido de amônio.

Completou-se o volume com água ultrapura e a solução foi homogeneizada. A

solução de diluição foi utilizada como solvente no preparo das amostras e dos

padrões.

22

3.4.3 Preparo da solução system suitability

Foi preparada uma solução contendo 0,2 mg /mL de ácido fólico padrão e 0,2

mg/mL de compostos relacionados A do ácido fólico contendo 20 mL de solvente

aquoso. Antes do uso a solução foi filtrada (filtro 1 µm) e transferida para vial

apropriado para injeção no cromatógrafo.

3.4.4 Preparo da solução padrão de ácido fólico

Dissolveu-se cerca de 30 mg de ácido fólico padrão, corrigido com o conteúdo

de água, em 20 mL de solvente aquoso. O volume foi ajustado quantitativamente

para obter uma solução de concentração conhecida de aproximadamente 0,20

mg/mL. Antes do uso a solução foi filtrada (filtro 1 µm) e transferida para vial

apropriado para injeção no cromatógrafo.

3.4.5 Preparo da amostra de ácido fólico

A seguinte amostra foi utilizada nos ensaios: Folin® 5 mg - lote: 11.018.13

Validade: 12/13. Cada comprimido revestido contém 5 mg de ácido fólico e

excipientes. Foram pesados individualmente 20 comprimidos e calculado o peso

médio. Estes foram triturados com auxílio de gral e pistilo e transferiu-se quantidade

do pó, exatamente pesado equivalente a 10 mg de ácido fólico, para um balão

volumétrico de 50 mL e foram adicionados 20 mL de solvente aquoso. Após 5

minutos no ultrassom para dissolver o ácido fólico, completou-se o volume com água

ultrapura. A solução foi misturada e filtrada para um erlenmeyer, com papel filtro

faixa preta e descartada a primeira porção do filtrado. Antes do uso a solução

resultante foi filtrada (filtro 1 µm) e transferida para vial apropriado para injeção no

cromatógrafo.

3.5 Cálculo estatístico de linearidade

Antes de iniciar o cálculo estatístico de linearidade foi aplicado em todas as

análises, o teste Q, que indicou qual resultado deveria ser descartado por apresentar

discrepância nos resultados.

23

A linearidade foi determinada através da construção da curva analítica da área

do pico resultante versus a concentração do padrão de Ácido Fólico. Os padrões

foram preparados com solução de diluição com aproximadamente 130, 120, 110,

100, 90, 80, 70% da concentração de trabalho do padrão (200µg/mL), pois conforme

consta na Resolução 899/2003 da ANVISA a faixa de concentração deve ser de 25 a

150% da concentração de trabalho que se quer validar. Para os resultados serem

aceitos o coeficiente de correlação deve ser maior ou igual a 0,990.

3.6 Cálculo estatístico de repetibilidade e precisã o intermediária

3.6.1 Repetibilidade

A repetibilidade foi demonstrada pelo ensaio de sete preparações de amostra

do mesmo lote, preparados conforme item 3.4.5, as amostras foram quantificadas

pelo método CLAE, no mesmo dia, pelo mesmo analista e a mesma instrumentação,

a metodologia utilizada para o ensaio foi o procedimento operacional padrão da

empresa.

3.6.2 Precisão intermediária

A precisão intermediária foi demonstrada pelo ensaio de sete preparações de

amostra do mesmo lote, preparados conforme item 3.4.5, as amostras foram

quantificadas pelo método CLAE, em dias diferentes, com analistas diferentes e a

mesma instrumentação, a metodologia utilizada para o ensaio foi o procedimento

operacional padrão da empresa.

3.6.3 Cálculo estatístico da exatidão

A exatidão foi determinada através de uma amostra, na qual quantidade

conhecida de ácido fólico padrão foi adicionada ao placebo (lactose monohidratada,

dióxido de silício, amidoglicolato de sódio, lactose monohidratada aglomerada,

celulose microcristalina, estearato de magnésio, metacrilato dimetilamino etila

copolímero, trissilicato de magnésio, dióxido de titânio, amarelo de quinolina laca (D

24

& C n°10), polietilenoglicol). Estas concentrações foram de 25, 100 e 125% da

concentração teórica analisada (200µg/mL), cada concentração foi feita em triplicata.

25

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1Seletividade/Especificidade

A seletividade ou especificidade foi determinada através da comparação dos

cromatogramas do placebo (amostra isenta de ácido fólico), da amostra e do padrão

de ácido fólico. Também podemos demonstrar a pureza do pico (peak purity index =

1) através do detector de arranjo de diodos. A figura 4 apresenta o cromatograma do

placebo (amostra isenta de ácido fólico). Já a figura 5 apresenta o cromatograma do

padrão de ácido fólico e a figura 6 a amostra de comprimido que contém ácido fólico.

Figura 4: Cromatograma do placebo


26

Figura 5: Cromatograma do padrão ácido fólico


Figura 6: Cromatograma da amostra


O método pode ser considerado seletivo (específico) pois comparando as figuras

2, 3 e 4, podemos observar que a figura 2, referente ao cromatograma do placebo

(isento de ácido fólico), não apresentou nenhum pico. Entretanto, as figuras 3 e 4

apresentaram um único pico referente ao ácido fólico. Também pode-se observar

que a pureza do pico das figuras 3 e 4 é demonstrado através do detector de arranjo

27

de diodos, onde apresenta peak purity index = 1.00, que representa 100% de pureza

do pico. Comparando as figuras 3 e 4 podemos evidenciar que não existem

diferenças entre eles, ou seja, trata-se do mesmo pico característico do ácido fólico.

4.2 Linearidade

A linearidade foi realizada a fim de garantir que os resultados obtidos são

proporcionais à concentração do padrão de ácido fólico, de acordo com o intervalo

definido no item 3.5.

De acordo com a RE 899/2003 o coeficiente de correlação deve ser maior que

0,990.

Foi construída a curva analítica de padrão de ácido fólico (figura 5) a partir da

tabela 1, que apresenta os resultados obtidos através das análises de teor de ácido

fólico pelo método CLAE.

Tabela 1: Resultados obtidos através dos ensaios para obtenção da linearidade

(µg/mL) 140 160 180 200 220 240 250 Área 1 6146237 7082562 7909159 8761223 9617061 10535698 10984336 Área 2 6173105 7072196 7914227 8779811 9612986 10545220 10990232 Área 3 6183468 7111695 7921276 8777069 9620657 10549284 10989106 Média 6167603,33 7088817,67 7914887,33 8772701 9616901,33 10543400,7 10987891,3


Figura 6: Curva analítica da linearidade

Curva de Calibração

y = 43511x + 87475

R2 = 0,9998

6000000

7000000

8000000

9000000

10000000

11000000

12000000

130 150 170 190 210 230 250 270

Concentração µg/mL

Áre

a


28

A figura 6 apresenta a curva analítica da área do pico resultante versus a

concentração para a concentração do padrão de ácido fólico. Os padrões foram

preparados conforme item 3.4.4 em aproximadamente 130, 120, 110, 100, 90, 80,

70% da concentração de trabalho do padrão (200 µg/mL).

A linearidade do método pode ser validada pois a curva analítica obtida

apresentou coeficiente de correlação (R2) igual a 0,99, conforme solicita a ANVISA

na resolução RE 899/2003.

4.3 Exatidão

A exatidão foi determinada conforme consta no item 3.7, através do cálculo de %

de recuperação.

Tabela 2: Resultados análise exatidão

Concentração (µg/mL) 50 200 250

Área 1 2239703 9046643 11313614

Área 2 2240186 8995500 11330966

Área 3 2243518 9011750 11278750

Média 2241136 9017964 11307776

DPR (%) 0,092687 0,289772 0,235172

[ ] padrão (mg/ml) 51,0934 205,5915 257,7946

% recuperação 102,1868 102,7958 103,1179

Média 102,7 Fonte: Autoria própria, 2012.

De acordo com os critérios de aceitação, que constam na resolução (RE

899/2003) da ANVISA, o percentual de recuperação deve estar entre 95 e 105%.

Sendo que estas determinações foram feitas conforme consta no item 3.5. Assim,

calculamos a média das concentrações de 50, 200 e 250 µg/mL e obtivemos o valor

de 102,7% que é um valor considerado aceito para a exatidão do método.

29

4.4 Precisão

Para determinar a precisão, conforme consta no item 3.6, as análises foram

feitas por dois analistas diferentes em dias diferentes obtendo os resultados a seguir.

As tabelas específicas referentes às áreas do pico da amostra comparando dois

analistas encontram-se no anexo 1e 2, respectivamente.

A tabela 3 apresenta os resultados do analista 1 no primeiro dia, as análises

foram feitas em 7 réplicas pois o ácido fólico trata-se de um fármaco. Calculando o

desvio padrão relativo obtemos o valor de 0,73%, este valor é aceitável para validar

a repetibilidade do método, pois consta na resolução RE 899/2003 (ANVISA) que

este valor deve ser menor que 5%.

Tabela 3: Resultados do analista 1 no primeiro dia

Analista 1 Amostra

1 Amostra

2 Amostra

3 Amostra

4 Amostra

5 Amostra

6 Amostra

7 Média 9685704 10022456 9915877 9811916 9856365 9790851 9841510

DPR (%) 0,985784 0,333618 0,206733 0,130454 0,417758 0,396412 0,326267 [ ] padrão (mg/ml) 0,220593 0,228333 0,225883 0,223494 0,224515 0,22301 0,224174

Resultado (%) 109,28 111,04 111,34 111,12 111,57 111,27 111,76 Média 111,05

DPR (%) 0,7378 Fonte: Autoria própria, 2012.

A tabela 4 apresenta os resultados do analista 2 no segundo dia, as análises

foram feitas em 7 réplicas pois o ácido fólico se trata de um fármaco. Calculando o

desvio padrão relativo obtemos o valor de 0,46%, este valor é aceitável para validar

a precisão intermediária do método, pois consta na resolução RE 899/2003

(ANVISA) que este valor deve ser menor que 5%.

Tabela 4: Resultados do analista 2 no segundo dia

Analista 2 Amostra

1 Amostra

2 Amostra

3 Amostra

4 Amostra

5 Amostra

6 Amostra

7 DPR (%) 0,204626 0,046969 0,058162 0,089381 0,32306 0,320184 0,070878 [ ] padrão (mg/ml) 0,219782 0,226811 0,217565 0,222677 0,22133 0,217537 0,222063

Resultado (%) 107,8 108,63 107,39 107,46 107,26 108,26 107,86 Média 107,81 DPR (%) 0,4615


30

5 CONCLUSÃO

O objetivo deste trabalho foi suprir uma necessidade da empresa em atender as

normas da legislação vigente, a RDC 17/2010 na qual cita que os métodos

farmacopeicos não necessitam ser validados, porém é necessário que existam

evidências documentadas de sua adequabilidade nas condições operacionais do

laboratório.

A partir destas considerações efetuou-se a adequabilidade do método

determinação de teor de ácido fólico. Os parâmetros verificados foram: seletividade

(especificidade), linearidade, precisão e exatidão.

Todas as análises foram realizadas pela metodologia analítica CLAE

(cromatografia líquida de alta eficiência ou HPLC).

Para verificar o parâmetro da seletividade (especificidade) foram comparados os

cromatogramas da amostra, padrão e o placebo. Para avaliar a linearidade foi

construída uma curva analítica e avaliado o coeficiente de correlação, já a precisão

foi determinada através da análise da variação dos resultados da análise de 7

amostras preparadas por dois analistas diferentes em dias diferentes.

A exatidão foi obtida pelo cálculo do percentual de recuperação de 7 amostras

preparadas pelo mesmo analista no mesmo dia.

Observando os resultados obtidos pode-se concluir que os parâmetros avaliados

neste trabalho estão de acordo com a RE 899/2003 (ANVISA, 2003) e serão

utilizados como comprovação da adequabilidade do método de determinação do teor

de ácido fólico no produto. Sendo assim método é seletivo, preciso e exato nas

condições reais de uso do laboratório nas análises de rotina desse produto.

31

REFERÊNCIAS

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32

LANÇAS, Fernando M. Aumentando a eficiência das colunas de HPLC por meio da diminuição do diâmetro das partículas da fase estacionária: até onde? Scientia Chromatographica , v. 3, n. 1, 2011. LEITE, Flávio. Validação em análise química. Campinas: Átomo, 2002. LEITE, Flávio. Impurezas de degradação. Scientia Chromatographica , v. 1, n. 2, 2011. NETO, Álvaro José dos Santos. Uma visão técnica para a compreensão e resolução de problemas em sistemas de cromatografia líquida. Scientia Chromatographica, v. 1, n. 2, 2011. PEDOTT, Alexandre Homsi. Análise de Dados Funcionais Alicada ao Estudo de Repetitividade e Reprotubilidade : a nova das Distâncias. Porto Alegre: [s.n], 2010. RIBANI, Marcelo, et. al. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Química Nova, São Paulo, v. 27, n. 5, set/out 2004. RIBEIRO, Fabiane Alves de Lima. Planilha de validação: uma nova ferramenta para estimar figuras de mérito na validação de métodos analíticos univariados. Química Nova, v. 31, n. 1, 2008. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-40422008000100029&script=sci_arttext>. Acesso em: 21 maio 2012. RODRIGUES, Braz Antonio. et al. Análises do Sistema de Medição “MSA” aplicado no ensaio de dobramento de agulhas cirúrgicas. Ciências Exatas, Taubaté, v. 2, n. 1, 2008. SKOOG, Douglas A.; HOLLER, F. James; NIEMAN, Timothy A. Princípios de Análise Instrumental. Porto Alegre: Bookman, 2006. SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J; CROUCH, S. R.; Princípios de Análise Instrumental -6. ed, Porto Alegre: Bookmann, 2009. SIMÃO, Valesca Costa. Estudo do Desenvolvimento de Metodologia para Linearidade e Precisão, no Etabonato de Loteprednol . Trabalho de conclusão – Centro Universitário La Salle, Canoas, 2011.

33

APÊNDICE A: RESULTADOS DO ANALISTA 1

Analista 1 Amostra

1 Amostra

2 Amostra

3 Amostra

4 Amostra

5 Amostra

6 Amostra

7 Área 1 9576330 9986505 9921898 9820967 9810021 9750921 9810480 Área 2 9728372 10052624 9893041 9802865 9888736 9828439 9874600 Área 3 9752410 10028239 9932691 9806543 9870338 9793194 9839451 Média 9685704 10022456 9915877 9811916 9856365 9790851 9841510

DPR (%) 0,985784 0,333618 0,206733 0,130454 0,417758 0,396412 0,326267 Peso médio

(mg) 138,4 138,4 138,4 138,4 138,4 138,4 138,4 Massa (mg) 279,1 284,5 280,8 278,4 278,5 277,4 277,6 [ ] padrão (mg/ml) 0,220593 0,228333 0,225883 0,223494 0,224515 0,22301 0,224174

Resultado (%) 109,28 111,04 111,34 111,12 111,57 111,27 111,76 Média 111,05

DPR (%) 0,7378 Fonte: Autoria própria, 2012

34

APÊNDICE B: RESULTADOS DO ANALISTA 2

Analista 2 Amostra

1 Amostra

2 Amostra

3 Amostra

4 Amostra

5 Amostra

6 Amostra

7 Área 1 9646852 9961649 9559786 9774982 9709607 9541911 9748966 Área 2 9632749 9953697 9553380 9785750 9691285 9529052 9743169 Área 3 9671749 9953409 9548718 9768445 9752456 9587275 9756933 Média 9650450 9956251 9553961 9776392 9717782 9552746 9749689

DPR (%) 0,204626 0,046969 0,058162 0,089381 0,32306 0,320184 0,070878 Peso médio

(mg) 135,1 135,1 135,1 135,1 135,1 135,1 135,1 Massa (mg) 275,2 282 273,8 279,9 278,8 271,5 278,1 [ ] padrão (mg/ml) 0,219782 0,226811 0,217565 0,222677 0,22133 0,217537 0,222063

Resultado (%) 107,8 108,63 107,39 107,46 107,26 108,26 107,86 Média 107,81 DPR (%) 0,4615

Fonte: Autoria própria, 2012

CAROLINE PEREIRA DE SOUZA - … · anemias e na prevenção de malformações do feto durante a...

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