PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃOMESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE.

Caracterização de Candida spp. isoladas da corrente sanguínea de pacientes internados em hospital terciário do Oeste Paulista.

Kelly Cristina Barzan Yabunaka

Presidente Prudente – SP2018

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Presidente Prudente – SP2018

Projeto apresentado à Coordenadoria de Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação (CPDI), da Universidade do Oeste Paulista.

Orientador: Profa. Dra. Daniela V. Moris de Oliveira

Co-Orientador: Marcus Vinicius Pimenta Rodrigues

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃOMESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE.

Caracterização de Candida spp. isoladas da corrente sanguínea de pacientes internados em hospital terciário do Oeste Paulista.

Kelly Cristina Barzan Yabunaka

Resumo

Atualmente a infecção por Candida está associada a um dos

principais quadros de infecção hospitalar. As taxas de incidência de candidemia

podem ser altas, e no Brasil chega a 3,9 casos por 1000 admissões hospitalares.

Já as taxas de mortalidades para aqueles que a desenvolvem são altas em torno

de 50-72%, se tornando nos últimos anos grande problema de saúde em

hospitais terciários. Este projeto tem por objetivo avaliar a incidência das

infecções de corrente s sanguínea por Candida spp isoladas de pacientes

internados na Associação Lar São Francisco de Assis da Providencia de Deus,

Hospital Regional de Presidente Prudente – São Paulo no período de dois anos;

identificar por técnicas morfológicas e bioquímicas as amostras de Candida spp.

isoladas; pesquisar a ocorrência do Complexo Candida parapsilosis - dentre os

isolados de hemocultura analisados; determinar o perfil de sensibilidade aos

antifúngicos das amostras isoladas. Este será um estudo prospectivo de

vigilância laboratorial e clínica com amostras de Candida spp. previamente

isoladas de hospital Regional de Presidente Prudente-São Paulo. O perfil de

sensibilidade antifúngica será realizado de acordo com a metodologia AFST-

EUCAST. A análise molecular do Complexo Candida parapsilosis será realizada

por PCR-RFL, amplificando-se o fragmento SADH -S1F: 5’

GTTGATGCTGTTGGATTGT-3’; S1R: 5’- CAATGCCAAATCTCCCAA-3’. Os

produtos do PCR serão digeridos com enzima de restrição BanI em tampão

específico da enzima por 90 minutos. A incidência de candidemia será calculada

por 1.000 admissões hospitalares, considerando-se um intervalo de confiança de

95%, assumindo-se a distribuição de Poisson dos casos. As variáveis

categóricas serão apresentadas como porcentagens e avaliadas pelo teste do χ2

ou, como alternativa, pela prova exata de Fisher; as variáveis contínuas serão

apresentadas como medianas e intervalos interquartis e avaliados pelo teste de

Mann-Whitney ou de Kruskal-Wallis. Todos os testes serão realizados utilizando-

se o programa SPSS 19.0 (IBM SPSS Statistics, IBM Corporation, Chicago, IL,

USA), admitindo-se p<0,005 para rejeitar a hipótese de nulidade.

Palavras-chave: Candidemia. Candida spp. Perfil de sensibilidade antifúngica.

Análise molecular.

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1. Introdução

I.1 Candidemia As infecções fúngicas de corrente sanguínea (ICS) incluem as

candidemias, denominadas também candidíases hematogênicas, desde que

seus principais agentes são espécies do gênero Candida. Espécies desse

gênero estão associadas a um dos principais quadros de infecção hospitalar,

tendo sido o quarto agente de ICS nos Estados Unidos(1).

As taxas de incidência, de modo geral, aumentaram no final da década de

80 e início dos anos 90; porém, trabalhos mais recentes indicam incidência

estável ou até decrescente em alguns estudos norte-americanos (2)

Trabalhos realizados em distintas regiões da América Latina mostram que a

Candida albicans é a espécie que predomina (3–5), com incidência geral de 1,18

casos por 1000 admissões hospitalares. Este valor varia de acordo com o país

como Chile com 0,33, Equador e Honduras com 0,90, Brasil com 1,38,

Venezuela com 1,72 (13), Argentina com 1,95 e Colombia com 1,96.

No Brasil, estudos recentes mostram que as taxas de incidência de

candidemia variam de 0,83 a 3,9 casos por 1000 admissões (6–9). Essas taxas

são maiores que aquelas observadas na maioria dos estudos realizados no

Hemisfério Norte incluindo EUA (0,28 a 0,96) (1,10), Canadá (0,02 a 0,45)

(11,12) e na Europa (0,20 a 0,96) (13,14). E estudo realizado na Espanha

encontrou 1,09 casos por 1.000 admissões (15). Enquanto uma análise

realizada em hospitais terciários da Espanha e Itália revelou taxa de 1,55

(16,17). Ambos apresentam taxas elevadas de incidência similares às

encontradas no Brasil e outros países da América Latina, como Argentina,

Venezuela e Colômbia (18).

Acredita-se que as candidemias estão entre as principais infecções

nosocomiais, devido ao aumento no número de hospitalizações, cirurgias de alto

risco, depressão imunitária secundária à doença de base ou distúrbios

metabólicos do hospedeiro, fatores iatrogênicos relacionados aos procedimentos

médicos invasivos, quimioterapia, uso profilático de antifúngicos e abuso na

utilização de antibióticos de amplo espectro (18–21). Apesar dos avanços

observados nos tratamentos antifúngicos, a mortalidade por candidemia tem-se

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mantido elevada, da ordem de 50 a 72%, e admitindo-se que ICS causadas por

Candida spp. têm se tornado o maior problema em hospitais terciários em todo o

mundo (21–24). Durante a década de 1980, a infecção por Candida spp.

apresentava-se como a sétima causa mais frequente de infecções nosocomiais

nos Estados Unidos (EUA) (25). No período 1986 - 1990, este gênero

encontrava-se entre os cinco primeiros agentes isolados em hemoculturas de

pacientes internados (26). Já na década de 1990, de acordo com os dados

obtidos por (26) através do programa SCOPE (Surveillance and Control of

Pathogens of Epidemiological), realizado em 50 centros médicos dos EUA,

Candida spp. passou a ocupar a quarta posição na categoria de infecções

nosocomiais mais frequentes, responsável por 8% (379) dos 4.725 episódios de

ICS obtidos nessas instituições. Nesta casuística, C. parapsilosis foi encontrada

em 8% (30) dos pacientes com candidemia, posicionando-se entre as espécies

de Candida mais freqüentes.

Em estudo conduzido por Wisplinghoff et al. (2004) (10), reunindo dados de

40 hospitais terciários de várias regiões dos EUA, foram analisados 24.179

episódios de bacteremias e fungemias documentados entre março de 1995 e

setembro de 2002. Candida respondeu por 9% (1890) das ICS, posicionando-se

após os casos de bacteremia por Staphylococcus coagulase-negativo (31%),

Staphylococcus aureus (20%) e Enterococcus spp. (9%). Entre as espécies de

Candida mais comuns, C. parapsilosis foi a terceira mais prevalente, detectada

em 11% (208) dos casos de candidemia. Nos EUA, alguns estudos encontraram

grande variação na prevalência de C. parapsilosis como agente causador de

ICS, com taxas variando entre 7 e 21% (23,27–29)

O aumento progressivo na frequência de ICS por leveduras do gênero Candida

foi observado em muitos países que monitoram esse evento. O fato ocorre,

particularmente, entre pacientes que estão recebendo antibióticos, terapia

imunossupressora e nutrição parenteral, bem como, naqueles expostos a

procedimentos médicos invasivos como o uso de cateter venoso central e

cirurgias (19,30,31).

Dados do Sistema Nacional de Controle de Infecções Nocosomiais do

Centers for Disease Control and Prevention (CDC) dos Estados Unidos

mostraram que, durante a década de 90, os fungos foram agentes de 7,9% das

infecções nosocomiais, em hospitais de grande e pequeno porte, e a incidência

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desses quadros aumentou para 9% de 1990 a 1996, emergindo como o quinto

patógeno hospitalar.

Entre os microrganismos que causam ICS, os fungos ocuparam o quarto

lugar, à frente de outros microorganismos tão comuns como, Escherichia coli. As

espécies do gênero Candida causaram 78% das infecções fúngicas em

pacientes imunocomprometidos, ou gravemente enfermos, com taxa de

mortalidade superior a 55%; a incidência de candidemia aumentou

aproximadamente 500% em hospitais de alta complexidade (27,28), estimado-se

que 6-11% de todas as infecções invasivas nosocomiais podem ser atribuídas a

Candida spp. Países desenvolvidos dispõem de vários dados publicados

confirmando a magnitude do problema de espécies de Candida como agente de

ICS, além de maior quantidade de informação sobre a ocorrência de candidemia,

os dados trazem detalhes sobre a distribuição de espécies e suscetibilidade a

antifúngicos, diferentemente da América Latina, cujos dados ainda são

insuficientes para descrever a epidemiologia dessa grave infecção (6,18,21,32).

Estudo retrospectivo de Wille et al. (2013) (6) realizado na região sudeste do

Brasil, durante um período de 11 anos em um hospital terciário, a incidência foi

de 1,20 episódios de candidemia por 1000 admissões hospitalares, identificados

na UTI de adultos com 21,9% dos casos e na UTI pediátrica com 17% de casos,

que totalizaram 388. Hinrichsen et al. (2008) (5) em um dos poucos estudos

realizados na Região Nordeste, indicou maior taxa de incidência (3,9

episódios/1000 admissões) em hospital terciário de Recife (PE).

De acordo com os últimos informes do Sistema de Vigilância

Epidemiológica do Estado de São Paulo, sobre os microrganismos isolados em

hemoculturas em Unidades de Terapia Intensiva (UTI), Candida spp. foi de

terceiro a quinto agente isolado, com freqüência próxima a 5%, no período de

2004 a 2008 (33) (Centro de Vigilância Epidemiológica, 2010). Já em 2014 a

Candida spp. apresentou frequência de 8%, sendo o terceiro agente mais

isolado da UTI estando atrás apenas das bactérias gram-negativas, em primeira

colocação e bactérias gram-positivas, em segundo lugar. Estes achados

demonstram o importante aumento dos casos de candidemia nesta população

de risco (34).

1. 2 Agentes de candidemia

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C. albicans, no presente considerada como o complexo Candida albicans,

constituído por C. dubliniensis, C. africana e C. stellatoidea, é a espécie mais

prevalente dentre as candidemias. No entanto, diversos estudos mostram

alteração na distribuição das espécies, com aumento de leveduras não-C.

albicans (6,9,35–37). Entre elas as mais comuns são: C. tropicalis, C. glabrata,

C.parapsilosis e C. krusei (5,18,32,35).

Em estudo multicêntrico realizado na França e denominado AmarCand

(Analyse Du Management en Anesthésie et Réanimation dês Candidoses

Invasives), do qual participaram 101 unidades de cuidados intensivos

(outubro/2005 a maio/2006), foram avaliados episódios de candidemia ocorridos

em 271 pacientes. Desse grupo, 305 amostras foram identificadas, resultando

em 57% de C. albicans, 16,7% de C. glabrata, 7,5% de C. parapsilosis, 5,2% de

C. krusei, 4,9% de C. tropicalis e 3,6% C. kefyr. Um aspecto diferente nesse

estudo, em relação a outros semelhantes, está na incidência de C. tropicalis, que

em regra é maior, com taxas em torno de 10% (38).

Na América Latina foi observada uma prevalência em torno de 40,9% para

C. albicans, seguido por 20,9% de C. parapsilosis, 20,5% de C. tropicalis e 4,9%

de C. glabrata (39). No entanto estudo mais recente realizado em 21 hospitais

terciários de sete países da América Latina, 37,6% de C. albicans, seguidos por

26,5% de C. parapsilosis, 17,6% de C. tropicalis, 6,5% C. guilliermondii, 6,3% de

C. glabrata e 2,7% de C. krusei (18).

A Brazilian Network Candidemia Study também identificou o aumento da

taxa de candidemia por C. glabrata, ao longo dos anos. No período de 1995 a

2003 ocorreram oito (3,5%) de 228 casos de candidemia. Já no período de 2005

a 2007 ocorreram 28 (10,6%) de 263 casos de candidemia, cenário que pode

estar relacionado ao maior uso profilático de fluconazol entre o pacientes

internados (39).

Moretti et al. (2013) (20) em estudo epidemiológico de episódios de

candidemia realizado em um hospital universitário de referência na região

sudeste do Brasil, durante o período de 2006 a 2010, verificou 313 episódios,

138 (44%) das quais foram identificados como C. albicans, 68 (21,7%) C.

tropicalis, 45 (14,4%) C. parapsilosis, 35 (11,2%) C. glabrata e 11 (3,5%) C.

krusei. Este trabalho revelou associação de C. glabrata a pacientes com

neoplasia, e entre 2008 e 2009 sua incidência foi maior, também relacionada à

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doenças malignas, entre os pacientes internados no serviço de gastrenterologia.

A espécie de C. krusei foi mais isolada de pacientes com doenças

hematológicas. Dentre a população pediátrica verificaram-se 25 episódios de

candidemia, 40% das quais causadas C. albicans, seguida por C. parapsilosis e

C. tropicalis, ambas com sete episódios e um isolado de C. glabrata.

A importância do conhecimento da prevalência relativa das distintas

espécies de Candida e a ocorrência de outros gêneros de leveduras, além de

Candida spp., está nos diferentes perfis de sensibilidade a antifúngicos e nas

características epidemiológicas das infecções causadas pelos distintos agentes

(6,22,35). O fato de o gênero Candida fazer parte da microbiota humana, este

está relacionado às infecções humanas como um patógeno oportunista: C.

tropicalis, por exemplo, está relacionada a infecções endógenas pós-cirúrgicas

pois habita o trato intestinal, a pacientes neutropênicos e imunossuprimidos (40).

Enquanto a C. parapsilosis, é comensal da pele humana e menos de superfícies

mucosas, está associada à ICS por manipulação do paciente, sendo bem

conhecida por causar infecções em crianças e neonatos (9,29) (41) e está,

quase sempre relacionada à presença de catéteres e sua grande habilidade em

formar biofilmes, o favorece sua patogênese. C parapsilosis que era antes

considerada espécie única é, desde os anos 90, considerada um complexo

englobando três espécies: C. parapsilosis (strictu sensu), C. metapsilosis e C.

orthopsilosis (42,43). A espécie C. glabrata, por sua vez, também está hoje

muita relacionada a outras duas espécies fenotipicamente semelhantes (C.

bracarensis e C. nivariensis), separadas, apenas, por análise molecular do DNA

e assimilação da trealose. A C. nivariensis é considerada um microrganismo

multirresistente a antifúngicos, enquanto que C. bracarensis tem patogenia e

resistência a antifúngicos pouco conhecidos (44,45). A ocorrência de C. glabrata

foi associada ao uso prévio de fluconazol e sua freqüência é maior em

população acima de 60 anos(6,9,24).

A importância da tipagem molecular destas novas espécies permite

melhor definição da prevalência, distribuição e susceptibilidade antifúngica dos

agentes de infecções invasivas. A causa possível para a alteração da proporção

entre as espécies poderia estar associada ao uso profilático ou empírico amplo

de fluconazol, (46–48). No entanto, esse argumento para explicar o aumento

considerável de infecções por espécies antes menos frequentes, não é

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compartilhado por todos os especialistas, os quais consideram que a utilização

ampla de fluconazol não foi proporcional ao aumento das espécies resistentes à

droga (49–51). Para estes e outros estudiosos, o aumento de espécies de

Candida não-albicans é resultante do uso crescente de procedimentos

hospitalares invasivos com artefatos que, a partir de fontes abióticas ou mãos de

profissionais, veiculam esses agentes para a corrente sanguínea de pacientes

internados (22).

1.3 Resistência de agentes de candidemia a antifúngicos e métodos para sua determinação

A resistência aos antifúngicos pode ser classificada em resistência

microbiológica e resistência clínica. A resistência microbiológica subdivide-se em

três tipos: intrínseca ou inata, primária e secundária ou adquirida. Diz-se que é

intrínseca é dita quando nenhum membro de uma espécie é sensível ao

antifúngico. A resistência primária se caracteriza pela transformação de uma

espécie normalmente sensível a resistente a determinado antifúngico, encontra-

se uma cepa com resistência natural contra o mesmo, sem necessidade de

haver estado em contato com a droga. Denomina-se resistência secundária, ou

adquirida, quando uma cepa, previamente sensível desenvolve resistência à

droga após a exposição a ela que pode ser devido a alterações fenotípicas, ou

genotípicas, que se manifestam de forma estável ou transitória (52,53).

A resistência clínica é definida como crescimento, ou falta de inibição, de

um microorganismo no foco de infecção, embora estando o fármaco em

concentração terapêutica no local da infecção. A resistência clínica está

relacionada com fatores dependentes do fármaco, do paciente ou de ambos

como redução da biodisponibilidade do fármaco, aumento do seu metabolismo,

doenças de base ou redução da imunidade (53,54)

A determinação de resistência em laboratório é feita por testes de

sensibilidade a antifúngicos que visam à correlação entre atividade in vitro e

evolução clínica do caso tratado com a droga. Além disso, os testes visam a

comparação da eficácia relativa de duas ou mais drogas e, ainda, dar

parâmetros para monitorar o aparecimento de cepas resistentes (55–57).

Estudos realizados com metodologia de referência e publicados em todo

o mundo demonstram que C. albicans tem alta sensibilidade não somente a

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fluconazol, mas também a outros azólicos, anfotericina B e equinocandinas

(48,57,58). Os raros casos de resistência estão associados ao uso prévio de

fluconazol em pacientes com doenças hematológicas (58). A resistência a

fluconazol em isolados de Candida spp. é encontrada, quase que

exclusivamente em espécies de Candida não-albicans (29,48) e de modo

particular, Candida krusei que possui resistência intrínseca ao fluconazol.

2. Objetivos

Geral: Avaliar a incidência das infecções de corrente sanguínea por Candida

spp isoladas de pacientes do Hospital Regional de Presidente Prudente – São

Paulo, no período de dois anos.

Específicos: a) Identificar as espécies de Candida spp. isoladas de corrente sanguínea,

por técnicas morfológicas e bioquímicas;

b) Determinar a prevalência de espécies do complexo Candida parapsilosis

isoladas de infecções de corrente sanguínea;

c) Determinar o perfil de sensibilidade aos antifúngicos das amostras

isoladas de infecções de corrente sanguínea.

3. Justificativa do estudo

Até o momento existem poucas informações epidemiológicas na Região

Centro-Oeste do Estado de São Paulo, em relação às candidemias.

A maioria das pesquisas realizadas no Brasil e em outros países da

América do Sul (3,4,39,40,59) confirmam que C. albicans supera o conjunto de

outras espécies, ainda que em taxas distintas. Em estudos realizados em

hospitais terciários brasileiros, incluindo o de Chang et al (2008) (60) em Campo

Grande (MS), abrangendo 96 casos e o de da Matta et al. (2007) (61) em São

Paulo, com 1000 amostras de ICS, C. albicans foi agente, respectivamente de

45,8% e 40% dos casos. Também em São Paulo, Colombo et al. (2006) (7)

publicaram trabalho com 712 isolados de Candida, sendo 40,9% amostras de C.

albicans. Na cidade de Botucatu, Estado de São Paulo, Ruiz et al. (2005) (3),

estudando 75 amostras de leveduras causadoras de ICS, confirmaram C.

albicans (38,7%) como a espécie dominante. Em estudo de 200 casos de

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candidemia, realizado no Hospital das Clínicas da Universidade Estadual de

Campinas (UNICAMP), São Paulo, foi observado frequência de 49% de C.

albicans (62). No estudo realizado por Matta et al. (2007) (61), em que foram

avaliadas amostras de período de nove anos, as taxas de C. parapsilosis

subiram de 19% (1995) para 25% (2003) e ressaltam a importância de monitorar

as taxas de freqüência dessa espécie. Pereira et al., (2010) (63) observaram que

C. albicans (18%) não foi a espécie prevalente como agente de candidemia em

hospital público terciário, situando-se depois de C. parapsilosis (26%) e C.

tropicalis (26%). Ainda mais relevante foi a ausência de isolados de C. albicans

no último ano do estudo, realizado entre 2004 e 2008. Em outro estudo

brasileiro, realizado também em hospital público terciário, mas no estado de

Ceará, Medrano et al. (2006) (4) observaram que C. parapsilosis foi o agente

mais isolado (64%) dos casos de candidemia. A posição de destaque de C.

parapsilosis, (34,4%), logo após C. albicans (45,8%) dentre os agentes de

candidemia, foi ressaltada também por Chang et al. (2008), (60) em hospital

público terciário no estado de Mato Grosso do Sul, com 96 casos (55,2% adultos

e 44,8% crianças), ocorridos entre 1998 e 2006. Chama a atenção o estudo

realizado por Bruder-Nascimento et al., em 2010 (64) que confirma também a

importância de C. parapsilosis, como a espécie não-C. albicans mais prevalente

(76,5%) em 102 casos de candidemia na cidade de Botucatu, interior de São

Paulo. Todos estes estudos fornecem informações valiosas sobre a etiologia das

candidemias, uma vez que, dados oficiais são inexistentes.

As diferenças acentuadas na distribuição de espécies e susceptibilidade

às drogas antifúngicas entre isolados de diferentes países, ressaltam a

necessidade de vigilância contínua em cada país e em cada região brasileira

para acompanhar as tendências da distribuição de patógenos e sua

suscetibilidade a drogas. O monitoramento também é importante pelo alerta de

emergência de cepas resistentes a antifúngicos (9,18,21,58).

4. Casuística e Métodos

4.1 População de estudo

Será realizado um estudo de vigilância laboratorial e clínica com amostras

de Candida spp. isoladas do primeiro episódio de infecção da corrente

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sanguínea - ICS em pacientes do Hospital Regional de Pres. Pte, localizado na

Região Centro-Oeste do Estado de São Paulo, Brasil, durante período de 2018 a

2019.

As amostras serão isoladas e identificadas pelo laboratório de análise

clínica São José IRELI do Hospital Regional, e posteriormente serão

encaminhadas ao Laboratório de Microbiologia e Imunologia do bloco G, da

Universidade do Oeste Paulista- UNOESTE, onde serão armazenadas até o

momento do estudo.

4.2 Definição de caso: Será considerado caso de candidemia o paciente com pelo menos um

isolado de Candida spp. do sangue periférico e sinais e sintomas de infecção,

temporariamente relacionados (30). Pacientes com cultura positiva de ponta de

cateter, porém com hemocultura negativa, serão excluídos do estudo. Os

episódios serão considerados independentes se forem causados por diferentes

espécies de Candida ou ocorrerem com pelo menos 30 dias de intervalo, após

resolução das manifestações clínicas e pelo menos uma cultura negativa.

4.3 Coleta de dados. Características demográficas e fatores que possam predispor a candidemia

serão coletados dos prontuários médicos. Entre estes últimos serão avaliados:

idade, presença de comorbidades, uso de quimioterápicos, diálise ou

hemodiálise, cirurgia gastrintestinal e presença de cateteres intravasculares,

terapia profilática com fluconazol e uso de antibacterianos.

4.4 Confirmação da identificação das Amostras. A recuperação das culturas será realizada pela inoculação das leveduras

no meio cromogênico CHROMagar Candida (CHROMagar Microbiology,

França). As placas serão incubadas à temperatura de 35º C e as leituras serão

realizadas após 24 e 48h de incubação. A identificação das amostras será

confirmada por métodos micológicos (morfológicos e bioquímicos)

convencionais.

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4. 5 Teste de sensibilidade a antifúngicos.

As amostras serão submetidas a testes de sensibilidade ao fluconazol,

itraconazol, voriconazol, caspofungina e anfotericina B, com determinação da

concentração inibitória mínima (CIM), empregando-se metodologia de

microdiluição consideradas de referência, o método europeu AFST-EUCAST

(65,66), o meio líquido RPMI 1640 com L-glutamina, sem bicarbonato de sódio e

tamponado com MOPS, pH 7,0, com 0,2% de glicose. As drogas sob forma p.a.,

serão diluídas em dimetilsulfóxido (DMSO). As soluções de antifúngicos serão, a

seguir, diluídas no meio líquido RPMI-1640 até as concentrações finais de 0,03 a

16μg/mL, para anfotericina B, voriconazol, itraconazol e caspofungina, e para o

fluconazol serão de 0,125 a 64 μg/mL, de acordo com o AFST-EUCAST (65).

Serão incluídas, em cada ensaio, duas cepas-controle, a saber: C.krusei ATCC

6258 e C.parapsilosis ATCC 22019 (65).

O inóculo de cada amostra será feito em 5,0 mL de água deionizada e

esterilizada, ajustada à turbidez igual a 0,5 da escala de MacFarland, que

equivale de 1x106 a 5x106 ufc/mL e em seguida, será diluído 100 vezes, para ser

usado nos testes de sensibilidade. O inóculo de cada amostra será adicionado às

mesmas fileiras das placas contendo os antifúngicos, em alíquotas de 100 L, as

placas serão incubadas a 35o C, por 24h (65). As CIMs de fluconazol, voriconazol,

caspofungina e anfotericina B serão as menores concentrações das drogas

capazes de inibir, pelo menos, 50% do crescimento do microrganismo, quando

comparada ao controle positivo. Para anfotericina B e caspofungina a CIM será a

menor concentração capaz de inibir 90% do crescimento. Os pontos de corte que

serão utilizados nos testes de sensibilidade in vitro para diferentes antifúngicos,

seguirão as orientações do AFST-EUCAST (65).

4.6 Análise Molecular do Complexo Candida parapsilosis.As amostras identificadas como C. parapsilosis ´por métodos fenotípicos

serão submetidas à análise molecular para a classificação das espécies do C.

parapsilosis, C. metapsilosis e C. orthopsilosis.

4.6.1 Extração do DNA.

As amostras do Complexo C. parapsilosis serão repicadas em tubo de

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Sabouraud dextrose com cloranfenicol e incubadas a 30ºC por 24h para a

extração do DNA genômico que será realizada de acordo com Sambrook et al.,

(67)

4.6.2 Quantificação do DNA.

As alíquotas de DNA serão submetidas a quantificação em Nonodrop, a

absorbância será medida em comprimento de onda de 260 nm, absorbância

igual a 1 contém uma concentração de 50 µg/mL de oligonucleotídeos de fita

simples. O aparelho também mede a absorbância em comprimento de onda de

280 nm para verificar a presença de proteínas e calcular a pureza do DNA. A

razão entre as leituras DO260 / DO280 do aparelho permitirá uma estimativa da

pureza do DNA, cujo ideal encontra-se entre 1,8 e 2,0. A razão abaixo de 1,6

indica grande quantidade de proteína e contaminantes, e na sua ocorrência, a

extração será realizada novamente (67).

4.6.4. Análise molecular para classificação das espécies do Complexo Candida parapsilosis.

Para diferenciação entre C. parapsilosis, C. metapsilosis e C. orthopsilosis

serão utilizadas as técnicas de PCR-RFLP segundo TAVANTI et al., 2005 e

2007 (68,69). Para a PCR-RFLP será amplificado o fragmento SADH utilizando

par de primer S1F: 5’ GTTGATGCTGTTGGATTGT-3’; S1R: 5’-

CAATGCCAAATCTCCCAA-3’ nas seguintes condições: desnaturação inicial de

94ºC por 2’, 30 ciclos de 94ºC por 1’; 50ºC por 1’; 72ºC por 1’ e extensão final de

10’ a 72ºC. Os produtos do PCR serão digeridos com enzima de restrição BanI

em tampão específico da enzima por 90 minutos.

4.7. Análise estatísticaA incidência de candidemia será calculada por 1.000 admissões

hospitalares, considerando-se um intervalo de confiança de 95%, assumindo-se

a distribuição de Poisson dos casos. A distribuição de espécies de Candida será

analisada em função do ano da admissão hospitalar, da idade do paciente e da

unidade em que o paciente foi internado. Pacientes com candidemia mista serão

excluídos da análise estatística. Em casos de vários episódios de candidemia no

mesmo paciente, apenas a primeira ocorrência será considerada. As variáveis

12

12

categóricas serão apresentadas como porcentagens e avaliadas pelo teste do χ2

ou, como alternativa, pela prova exata de Fisher; as variáveis contínuas serão

apresentadas como medianas e intervalos interquartis e avaliados pelo teste de

Mann-Whitney ou de Kruskal-Wallis. Todos os testes serão realizados admitindo-

se um erro tipo α de 5% para rejeitar a hipótese de nulidade.

4.8. Comitê de ÉticaEste projeto de pesquisa será submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa

da Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE.

5. Cronograma de Atividades1º semestre 2018

- cursar disciplinas

- reidentificação das amostras previamente identificadas pelo Laboratório

de Análises Clínicas São José IRELI do Hospital Regional.

2º semestre 2018- cursar disciplinas

- execução dos ensaios laboratoriais

- levantamento dos dados clínicos

- apresentação dos resultados parciais em congressos da área

1º semestre 2019- cursar disciplinas

- execução dos ensaios laboratoriais

- levantamento dos dados clínicos

- apresentação dos resultados parciais em congressos da área

2º semestre 2019- análise estatística dos resultados

- atualização bibliográfica

- exame geral de qualificação

- preparação do manuscrito para publicação em periódico especializado

(pelo menos quatro meses)

13

13

1° semestre 2020- apresentação e defesa da dissertação.

14

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6. Referências bibliográficas1. Wisplinghoff H, Ebbers J, Geurtz L, Stefanik D, Major Y, Edmond MB, et al.

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