MÉTODOS DE EXTRAÇÃO E CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA

Relatório apresentado à disciplina de Fitoqímica

do Curso de Farmácia do Centro Universitário

Hermínio Ometto.

Profº Fernanda Oliveira de Gaspari de Gaspi

ARARAS/SP11/2013

18022 Kátia de Pontes

68665 Flávia Gabriel

68244 Tawani Cristina Boscollo Ragassi

INTRODUÇÃO

A droga vegetal dessecada e triturada pode ser utilizada diretamente como fitoterápico

para a preparação de chás ou adicionada a alimentos, ou como pó fino para ser encapsulado.

Na maior parte das vezes a droga é processada de forma a resultar numa solução extrativa

contendo as substâncias de interesse terapêutico (FONSECA, 2013).

Antes de executar uma extração, deve-se levar em conta uma série de fatores que

interferem nesta operação, tais como as características do material vegetal, o seu grau de

divisão, o meio extrator (solvente) e a metodologia. Na escolha do método extrativo, deve-se

avaliar a eficiência, a estabilidade das substâncias extraídas, a disponibilidade dos meios e o

custo do processo escolhido, considerando a finalidade do extrato que se quer preparar

(SIMÕES, et al, 2004).

Em análises fitoquímicas, quando não se conhece o conteúdo do material a ser

analisado, costuma-se submeter o material a sucessivas extrações, com solventes de

polaridade crescente, obtendo-se uma extração fracionada em que as diferentes frações

apresentam compostos de polaridade crescente, como a composição química das plantas é

complexa, ocorre à extração conjunta de várias substâncias farmacologicamente ativas ou não,

portanto deve-se definir com precisão o que se deseja obter, levando-se em conta os fatores

envolvidos no processo extrativo, pode-se escolher o método e o solvente que serão

empregados (SIMÕES, et al, 2004).

Existem vários métodos de extração sólido/líquido tais como, a extração a frio que

compreende a turbolização, a maceração (simples e dinâmica) e a percolação, a extração a

quente em sistemas abertos que inclui a infusão e a decocção e a extração a quente em

sistemas fechados que são a extração sob refluxo e em aparelho de Soxhlet (SIMÕES, et al,

2004).

O processo de fracionamento de extratos vegetais com vistas ao isolamento de

substâncias ativas podem ser monitorados por ensaios direcionados para a avaliação da

atividade biológica, os métodos cromatográficos são os procedimentos de separação e

isolamento mais utilizados atualmente. Servem tanto para fins de identificação e análise de

misturas e de substâncias isoladas (SIMÕES, et al, 2004).

Em geral, a técnica cromatográfica envolve várias etapas como, montagem da

coluna ou placa (disposição adequada da fase estacionária ou suporte e preparação da fase

móvel); aplicação da amostra; desenvolvimento (passagem de um solvente escolhido (fase

móvel) através da fase estacionária); revelação/visualização (localização das diferentes zonas

de separação dos compostos) e/ou extração das substâncias retidas na fase estacionária

(SIMÕES, et al, 2004).

A cromatografia em camada delgada (CCD) consiste no sistema cromatográfico em

que a separação dos componentes de uma mistura ocorre através da migração diferencial

sobre uma fase estacionária composta por uma fina camada de adsorvente aplicado sobre um

suporte plano, o qual pode ser constituído de diversos materiais como vidro, alumínio ou

poliéster. A fase móvel é constituída por diversas misturas de solventes e permanece no

interior de um recipiente ou cuba de material transparente e inerte, geralmente vidro,

permanecendo vedada onde se deposita a placa cromatográfica em posição vertical sob uma

atmosfera saturada da fase móvel (BRASIL, 2010).

A CCD é uma técnica amplamente utilizada para fins de análise, tanto de extratos

vegetais brutos quanto para avaliar o resultado de um processo de separação. As placas para

CCD podem ser confeccionadas nos próprios laboratórios, o método de preparação manual é

bastante econômico, mas requer certa prática; pode ser bastante satisfatório em análises de

rotina, sobretudo naquelas que envolvem os suportes mais comuns, como o gel de sílica

(SIMÕES, et al, 2004).

A Mentha x piperita L. é uma planta conhecida como hortelã-pimenta, menta ou

hortelã-apimentada, pertence à família Lamiaceae, seu uso medicinal é recomendado para o

tratamento de náuseas, cólicas gastrointestinais, síndrome do intestino irritável, flatulências,

cálculos biliares, icterícia, ansiedade, expectoração e expulsão de vermes intestinais. As

propriedades medicinais desta planta estão relacionadas com o óleo essencial extraído de suas

folhas frescas (ASMAR, et al, 2013).

A hortelã-pimenta é um híbrido, originário do cruzamento de diversas espécies, é a

espécie de maior interesse econômico na obtenção de óleos voláteis, que são amplamente

empregados como flavorizantes, aditivo em alimentos, em produtos de higiene bucal e em

preparações farmacêuticas, no tratamento de problemas respiratórios e gastrintestinais, o óleo

apresenta ações antimicrobiana e espasmolítica e é considerado o responsável pelas atividades

carminativa e eupéptica da planta. Está presente na maioria das farmacopeias, que preconizam

um teor de mentol entre 30 e 55%, de mentona entre 14 e 32% e valores limites quanto aos

teores de pulegona e mentofurano, componentes indesejáveis pela ação hepatotóxica, entre

outras (SIMÕES, et al, 2004).

OBJETIVOS

Realizar diferentes métodos de extração como a maceração, maceração dinâmica e por

Soxhlet e, analisar as substâncias encontradas através de cromatografia em camada delgada

identificando-as através do Rf de cada mancha.

MATERIAIS E MÉTODOS

Métodos de extração

Maceração

Pesou-se 10 g de Porophyllum ruderale em um Béquer de 250 ml, adicionou-se 100

mL de solução hidroalcoólica 70% com o auxílio de uma proveta, envolveu o Béquer com

papel alumínio e cobriu com papel filme, identificou o mesmo com os dados do grupo.

Deixou em repouso por 7 dias, filtrou utilizando papel filtro e funil de vidro. Envasou em

vidro âmbar e identificou corretamente.

Maceração Dinâmica

Pesou-se 10g de Guaraná em pó em um Béquer de 250 mL, adicionou-se 50 mL de

solução hidroalcoólica 70% com o auxílio de uma proveta, submeteu a agitação constante por

15 minutos. Filtrou com auxílio de papel de filtro e funil de vidro, reservou-se o filtrado.

Adicionou-se ao resíduo 50 mL de solução hidroalcoólica 70% com o auxílio de uma

proveta, agitou constantemente por 15 minutos. Filtrou e reuniu-se os filtrados.

Repetiu-se os procedimentos de agitação e filtração com o resíduo. Reuniu-se os

filtrados. Concentrou em rotaevaporador, envasou em vidro âmbar e identificou corretamente.

Extração em aparelho de Soxhlet

Pesou-se 20 g de folhas frescas, acondicionou no cartucho próprio para aparelho de

Soxhlet , adicionou-se 200 mL de clorofórmio no balão de fundo redondo. Submeteu a

aquecimento por 40 minutos, retirou-se o extrato obtido. Concentrou em rotaevapordor,

envasou em vidro âmbar e identificou corretamente.

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

1ª Parte

Preparou-se três cubas cromatográficas, sendo duas com a fase móvel (FM)

tolueno:acetato de etila (93:7) e uma com a FM hexano:acetato de etila (96:4).

2ª Parte

Preparou-se a placa cromatográfica de fase fixa de sílica gel G, com o auxílio de uma

régua, conforme especificações que seguem: total de altura 12 cm; largura 5 cm; linha do

solvente 1 cm; linha de frente (LF) 10 cm; dividiu (acima da LF) em extrato de hortelã (Menta

x piperita), soxhlet, óleo volátil e mentol, mediu-se uma distância de aproximadamente 1 cm

entre eles.

3ª Parte

Preparou-se o revelador Anisaldeído, sendo ácido acético glacial:ácido

sulfúrico:aldeído anísico (50:1:0,5). Após preparado transferiu para um borrifador.

4ª Parte

Preparou-se o revelador Vanilina sulfúrica. Dissolveu 1 g de vanilina em 100 ml de

metanol, adicionou-se 4 mL de ácido clorídrico e 5 mL de ácido sulfúrico. Após preparado

transferiu para um borrifador.

5ª Parte

Com o auxílio de um capilar aplicou-se as amostras e o padrão (extrato de hortelã

(Menta x piperita), soxhlet, óleo volátil e mentol, respectivamente) nos respectivos pontos de

partida. Colocou-se a placa na cuba cromatográfica e aguardou o desenvolvimento, observou

o momento em que o solvente atingiu a linha de frente.

Após o solvente percorrer a placa, observou-a diretamente e também na luz UV.

Encaminhou a placa para a capela e com o auxílio do borrifador, aspergiu de maneira

uniforme sobre a camada de sílica, cerca de 10,0 mL do revelador. Após a nebulização

aqueceu-se a placa cromatográfica em estufa a 105 o C, por 10 minutos.

Realizou-se esses procedimentos para os dois reveladores: Anisaldeído e Vanilina

sulfúrica.

Anotou-se os resultados obtidos.

RESULTADOS

Foi realizado o método de extração, através da maceração, maceração dinâmica e

extração em aparelho de Soxhlet e em seguida, foi feito a cromatografia em camada delgada,

com dois reveladores, a Vanilina sulfúrica e o Anisaldeído, onde os resultados obtidos foram:

Tabela 1: Distancia percorrida em Cromatografia em Camada Delgada com revelador Vanilina sulfúrica

Mceração Cor Rf Soxhlet Cor Rf Óleo Volátil

Cor Rf Mentol Cor Rf

Mancha 1

1,2 cm Amarelo 0,12 1 cm Amarelo 0,1 0,7 cm Cinza 0,07 - - -

Mancha 2

4,6 cm Azul 0,46 4 cm Azul 0,4 1 cm Lilás 0,1 - - -

Mancha 3

- - - 4,9 cm Azul 0,49 1,6 cm Amarelo 0,16 - - -

Mancha 4

- - - 9 cm Verde 0.9 3,7 cm Azul 0,37 - - -

Mancha 5

- - - - - - 5,1 cm Azul 0,51 - - -

Mancha 6

- - - - - - 7,2 cm Azul 0,72 - - -

Mancha 7

- - - - - - 8,6 cm Roxo 0,86 - - -

Mancha 8

- - - - - - 9,3 cm Azul 0,93 - - -

Tabela 2: Distancia percorrida em Cromatografia em Camada Delgada com revelador Anisaldeído

Maceração Cor Rf Soxhlet Cor Rf Óleo Volátil

Cor Rf Mentol

Cor Rf

Mancha1

0,8 cm Verde 0,08 0,15 cm

Verde 0,015 1,9 cm Verde 0,19 - - -

Mancha 2

1,3 cm Verde 0,13 1,1 cm Verde 0,11 2,1 cm Verde 0,21 - - -

Mancha 3

2,4 cm Verde 0,24 1,5 cm Verde 0,15 2,8 cm Amarelo 0,28 - - -

Mancha 4

2,7 cm Verde 0,27 2,1 cm Verde 0,21 4,3 cm Verde 0,43 - - -

Mancha 5

3,4 cm Azul 0,34 2,5 cm Verde 0,25 8,2 cm Verde 0,82 - - -

Mancha 6

3,8 cm Azul 0,38 4,2 cm Verde 0,42 - - - - - -

Mancha 7

4,5 cm Azul 0,45 4,9 cm Verde 0,49 - - - - - -

Mancha 8

- - - 8,8 cm Verde 0,88 - - - - - -

DISCUSSÃO

O termo extração significa retirar, da forma mais seletiva e completa possível, as

substâncias ou fração ativa contida na droga vegetal, utilizando, para isso, um líquido ou

mistura de líquidos tecnologicamente apropriados e toxicologicamente seguros. Na escolha de

um método extrativo, deve-se avaliar a eficiência, a estabilidade das substâncias extraídas, a

disponibilidade dos meios e o custo do processo escolhido, considerando a finalidade do

extrato que se quer preparar (MIYAKE, 2013).

A maceração destina-se a extração da matéria prima vegetal em recipiente fechado,

temperatura ambiente, durante um período prolongado, que pode ser horas ou até mesmo dias,

onde deve conter agitação ocasional e não há troca do líquido extrator, para o esta técnica

pode-se utilizar como extrator a solução hidroalcoólica 70%. A maceração dinâmica consiste

na extração da matéria prima, na qual há a renovação do líquido extrator durante o

procedimento, podendo-se utilizar também solução hidroalcoólica 70% (SIMÕES et al.,

2001).

A extração em aparelho de Soxhlet é utilizada na extração de sólidos com solventes

voláteis, onde há a utilização do aparelho de Soxhlet. Em cada ciclo da operação, o material

vegetal entra em contato com o solvente renovado; assim, o processamento possibilita uma

extração altamente eficiente, empregando uma quantidade reduzida de solvente, em

comparação com as quantidades necessárias nos outros processos extrativos, para se obter os

mesmos resultados qualitativos e quantitativos (MIYAKE, 2013).

Outro processo muito utilizado em separação e isolamento é a técnica de

cromatografia, a qual pode ser definida como a separação de dois ou mais compostos

diferentes por distribuição entre fases, onde uma das fases permanece estacionária enquanto a

outra se move através dela. Esse fenômeno é chamado de adsorção, que ocorre devido às

forças intermoleculares existentes entre os componentes envolvidos no processo. A fase

móvel passa pela fase estacionária e os componentes da mistura são distribuídos entre as duas

fases (BATISTA et al., 2013).

A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica muito utilizada para fins

de análise, tanto de extratos vegetais brutos, assim como para avaliar os resultados de um

processo de separação (SIMÕES et al., 2001). É uma técnica barata e simples de se fazer,

sendo também muito importante para a separação rápida e análise qualitativa de pequenas

substancias. apresenta-se como uma técnica simples, barata e muito importante para a

separação rápida e análise qualitativa de pequenas substâncias. Estabelece conceitos

importantes obtidos na teoria, como forças de interações entre as moléculas, pureza dos

compostos, e no caso de misturas, pode mostrar o número de componentes envolvidos nessa

substância (BATISTA et al., 2013).

Consiste em cobrir uma placa de vidro, alumínio ou plástico, com um adsorvente

adequado e com uma granulação especial. O adsorvente é misturado ou não com um

aglutinante (geralmente gesso ou amido), suspenso em água ou outro solvente adequado e

depositado uniformemente sobre a placa (manualmente ou por intermédio de aplicadores

apropriados). Ao secar, o adsorvente permanece aderido à placa que, em geral, deve ser

ativada por aquecimento em estufa (INSTITUTO DE QUÍMICA, 2013).

Um dos aspectos mais importantes da cromatografia é o de que em um determinado

sistema cromatográfico o movimento relativo de um composto em relação à frente do solvente

é uma propriedade característica e reprodutível. Nas cromatografias em papel e em camada

delgada se expressa este movimento como um valor de "Rf" (Rate of flow). Este é definido

como a razão entre a distância percorrida pela mancha e a distância percorrida pelo solvente,

esses valores são reprodutíveis em condições idênticas de trabalho (temperatura, solvente,

umidade constante) e caracterizam e identificam as substancias. A medida é feita desde a

linha de base (ponto onde foi aplicada a amostra) até o centro da mancha em estudo. O valor

obtido é comparado aos tabelados na literatura especializada podendo servir para identificar a

substância em questão (INSTITUTO DE QUÍMICA, 2013).

Um dos adsorventes mais utiluzados na CCD é a sílica, que é muito empregada na

separação de compostos lipofílicos como aldeídos, cetonas, fenóis, ácidos graxos,

aminoácidos, alcalóides, terpenóides e esteróides, No processo de adsorção, as moléculas da

fase móvel irão se unir à superfície do adsorvente (fase estacionária), através das interações

moleculares (FERREIRA; SARAIVA; PEDROSO, 2013).

Na fase móvel, o solvente é usado para eluir a mistura e promover a separação dos

componentes, a escolha deste solvente depende dos materiais a serem preparados, um

solvente que faz com que todo o material aplicado se mova totalmente com a frente do

solvente é muito polar, já um que não movimenta o material através da placa não é

suficientemente polar (FERREIRA; SARAIVA; PEDROSO, 2013). A mistura mais usada é a

de acetato de etila com éter de petróleo ou hexano, solventes razoavelmente baratos, voláteis e

de regular ou baixa toxicidade (ADÃO, 2013).

O hexano é um solvente muito utilizado, uma de suas características principais é

possuir alto poder extrativo e rápida evaporação, uma de suas principais aplicações é a

extração de óleos vegetais ou animais, cujas vantagens são: elevado poder de solvência para

um grande número de sementes oleaginosas; é facilmente separado do óleo ou gordura,

facilitando o processo de recuperação do solvente; possui alta pureza e é livre de resíduos, não

afetando a qualidade dos produtos obtidos (SECRETARIA DA SAÚDE, 2013). É muito utilizado na

extração de substâncias lipofílicas e óleos voláteis (SIMÕES et al., 2001).

Uma das principais características do solvente tolueno é a sua rápida evaporação,

combinando com um alto poder de solvência. Estas características peculiares o recomendam

para uma gama variada de aplicações. Seu ponto de fulgor oferece relativa segurança, em

função de sua volatilidade moderada (SECRETARIA DA SAÚDE, 2013).

No final de todo o processo cromatográfico, é necessário a utilização de soluções

reveladoras, as quais permitirão a visualização dos compostos analisados. Dentre as mais

utilizadas estão às soluções ácidas alcoólicas de anisaldeído e vanilina, são reveladores

universais para a detecção de uma grande variedade de compostos orgânicos, promovendo

assim, diferentes cores, dependendo do analito (VIRGOLINO et al., 2013).

A associação vanilina/ácido sulfúrico ou vanilina/ácido clorídrico pode ser usada para

visualização de catequinas, alcalóides, flavonóides, componentes de óleos essenciais,

esteróides e fenóis. Já a associação anisaldeído/ácido sulfúrico pode ser usada para visualizar

antioxidantes, esteróides, prostaglandinas, carboidratos, fenóis, glicosídeos, parte aglicona de

saponinas, componentes de óleos essenciais ou terpenos, antibióticos (macrolídeos e

tetraciclinas) e micotoxinas – tricotecenos (ADÃO, 2013).

A principal substancia extraída da planta Mentha x piperita L., conhecida

popularmente como hortelão-pimenta são os óleos voláteis, amplamente empregados como

flavorizantes, aditivos em alimentos, em produtos de higiene bucal e em preparações

farmacêuticas, no tratamento de problemas respiratórios e gastrointestinais. O óleo apresenta

ações antimicrobianas e espamolíticas e é considerado o responsável pelas atividades

carminativa e eupéptica da planta (SIMÕES et al., 2001).

O mentol é o principal componente do óleo essencial responsável pelo agradável

aroma e pela ação terapêutica. Tanto o óleo essencial como os flavonóides são os

responsáveis pelos efeitos antiespasmódico, colerético, colagogo, antiflatulento,

antipruriginoso, antiemético e analgésico das mucosas proporcionados por esta espécie. Os

taninos da Hortelã proporcionam um efeito adstringente útil nos casos de diarreias

(FARMACAM, 2013)

CONCLUSÃO

A partir dos resultados obtidos, pode-se observar que na CCD onde se utilizou o

revelador Vanilina sulfúrica, a melhor extração foi a de óleos voláteis, onde obteve-se oito

manchas, com diferentes variações de cores e Rf com variação entre 0,07 á 0,93 cm. A

segunda melhor extração foi a de Soxhlet, representada por quatro manchas cores diferentes e

com Rf de 0,1 á 0,9 cm, e por último, a maceração com duas manchas nas cores azul e

amarela, com Rf de 0,12 e 0,46 cm respectivamente. Nessa análise não se obteve nenhum

resultado para o mentol.

Na CCD com revelador Anisaldeído, o método mais satisfatório foi o de Soxhlet,

representado por oito manchas, todas de coloração verde e com Rf nas variações de 0,15 á

0,88 cm. A maceração foi a segunda mais satisfatória, pois obteve sete manchas de cores azul

e verde, com variação de Rf de 0,08 á 0,45 cm. Na extração de óleos voláteis, pode-se

observar o aparecimento de cinco manchas, nas cores verde e amarelo, e com Rf de 0,19 á

0,82 cm. Assim como na revelação por Vanilina sulfúrica, o mentol não obteve resultado

algum.

Os testes foram satisfatórios quando utilizados as técnicas de maceração, extração por

Soxhlet e óleos voláteis, o que não ocorreu com o método de mentol, o qual não obteve

nenhum resultado com os reveladores utilizados.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

ADÃO, Daniele. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS. Disponível em: <http://200.195.174.230/Materiais/1969_781.pdf>. Acesso em: 23 nov. 2013.

ASMAR, S. A.; RESENDE, R. F.; ARARUNA, E. C.; MORAIS, T. P.; LUZ, J. M. Q. Citocininas na multiplicação in vitro de hortelã-pimenta (Mentha x Piperita L.). Disponível em: <http://www.sbpmed.org.br/download/issn_11_5/v13_esp_05.pdf>. Acesso em: 09 nov. 2013.

BATISTA, Magna Tavares et al. UTILIZAÇÃO DA TECNICA DE CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) COMO OBJETIVO DE IDENTIFICAR A PUREZA E POLARIDADE DOS COMPOSTOS ORGÂNICOS. Disponível em: <http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:_ZAc7AR9an8J:ces.ufcg.edu.br/portal/index.php?option=com_docman&task=doc_download&gid=250&Itemid=49+&cd=12&hl=pt-BR&ct=clnk&gl=br>. Acesso em: 16 nov. 2013.

BRASIL. Farmacopeia Brasileira, volume 1 / Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Brasília: Anvisa, 2010. 546p.

FARMACAM. Hortelã. Disponível em: <http://www.farmacam.com.br/monografias/hortelafarmacam.PDF>. Acesso em: 23 nov. 2013.

FERREIRA, Livia Fernanda B.; SARAIVA, Livia Miron; PEDROSO, Nicole. Cromatografia em camada delgada. Disponível em: <http://www.cempeqc.iq.unesp.br/Jose_Eduardo/Cromatografia em Camada Delgada.pdf>. Acesso em: 19 nov. 2013.

FONSECA, Said Gonçalves da Cruz. Farmacotécnica de Fitoterápicos. Disponível em: <http://www.farmacotecnica.ufc.br/arquivos/Farmacot_Fitoterapicos.PDF>. Acesso em: 09 nov. 2013.

Instituto de Química. - TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS. Disponível em: <http://www.iq.ufrgs.br/dqo/poligrafos/Poligrafo_QUI_02004_2011_1.pdf>. Acesso em: 16 nov. 2013.

MIYAKE, Thaila. MÉTODOS DE EXTRAÇÃO E FRACIONAMENTO DE EXTRATOS VEGETAIS. Disponível em: <http://www.uepg.br/fitofar/dados/tecnicasextrativas.pdf>. Acesso em: 16 nov. 2013.

Secretaria da Saúde. Sanitaria - Produtos - Saneantes - Inalantes e Solventes - Inalantes e Solventes. Disponível em: <http://www.saude.pr.gov.br/modules/conteudo/conteudo.php?conteudo=742>. Acesso em: 24 nov. 2013.

SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVIK, P. R. Farmacognosia da planta ao medicamento. Porto Alegre: UFRGS, 5 ed, 2004.

SIMÕES, Cláudia Maria Oliveira et al. Farmacognosia da planta ao medicamento. 3. ed. Porto Alegre: Editora Universidade/ufrgs/ed. da Ufsc, 2001.

VIRGOLINO, Mariana de Mates et al. REAÇÕES COMPOSTOS GERADOS NA REVELAÇÃO POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA COM ANISALDEÍDO E VANILINA. Disponível em: <http://www.prp.unicamp.br/pibic/congressos/xxcongresso/resumos/000242.pdf>. Acesso em: 20 nov. 2013.