MARIANA RODRIGUES PEREIRA

ESTUDO DA EXPRESSÃO DE RECEPTORES DE ADENOSINA EM RETINA

DISSERTAÇÃO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL

FLUMINENSE VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM NEUROIMUNOLOGIA

Orientador: Roberto Paes de Carvalho

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE 2005

CENTRO DE ESTUDOS GERAIS INSTITUTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE NEUROIMUNOLOGIA

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MARIANA RODRIGUES PEREIRA

ESTUDO DA EXPRESSÃO DE RECEPTORES DE ADENOSINA EM RETINA

Trabalho desenvolvido no laboratório de Neurobiologia Celular do Departamento de Neurobiologia, Instituto de Biologia, UFF.

Orientador: Roberto Paes de Carvalho

Niterói 2005

Dissertação de Mestrado submetida à Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção de grau de Mestre em Neuroimunologia

P 434 Pereira, Mariana Rodrigues Estudo da expressão de receptores de adenosina em retina / Mariana Rodrigues Pereira. ______ Niterói: [s.n.], 2005. 108 f.:il. Dissertação. ______ (Mestrado em Neuroimunologia). _____ Universidade Federal Fluminense, 2005. 1. Anatomia animal. 2. Adenosina. 3. Vertebrados – Visão - Fisiologia. 4. Nervo ótico. I. Título.

CDD. 591.48

ESTE TRABALHO FOI DESENVOLVIDO NO LABORATÓRIO DE NEUROBIOLOGIA CELULAR, DO PROGRAMA DE NEUROIMUNOLOGIA DO INSTITUTO DE BIOLOGIA DA UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE SOB ORIENTAÇÃO DE ROBERTO PAES DE CARVALHO E NA VIGÊNCIA DE AUXÍLIOS CONCEDIDOS PELO CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO (CNPq), COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE ENSINO SUPERIOR (CAPES) E FUNDAÇÃO DE AMPARO A PESQUISA DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO (FAPERJ).

ii

SUMÁRIO Lista de Abreviaturas viii Resumo xi Abstract xii I) Introdução 1 1) Adenosina 1 1.1) Metabolismo 1 1.2) Transporte 3 1.3) Receptores 6 1.3.1) Distribuição dos receptores 9 1.3.2) Localização celular e subcelular no SNC 10 1.3.3) Estrutura dos receptores 11 1.3.4) Dimerização de receptores 13 2) Receptores A1 e A3 de adenosina 13 2.1) Sinalização via adenilil ciclase 13 2.2) Sinalização por fosfolipase C 15 2.3) Sinalização através de canais iônicos 16 2.4) Sinalização via MAP kinases 17 2.5) Dessensibilização 18 2.6) Principais funções 20 3) Receptores A2a e A2b de adenosina 21 3.1) Sinalização via adenilil ciclase 21 3.2) Sinalização através de fosfolipase C 22 3.3) Sinalização pelas MAP kinases 22 3.4) Dessensibilização 24 3.5) Principais funções 24 4) Modelo de estudo: a retina 26

II) Objetivos 29

vi

III) Materiais e métodos 31 3.1) Materiais 31 3.2) Métodos 32 3.2.1) Culturas complexas 32 3.2.2) Culturas de agregados 33 3.2.3) Tratamento com drogas 33 3.2.4) “Binding” em células viva 34 3.2.5) Dosagem de proteína pelo método de Bradford 35 3.2.6) Eletroforese em SDS-poliacrilamida SDS-(PAGE) 36 3.2.7) “Western Blotting” 37 3.2.8) Retirada dos anticorpos e “bloting” para actina 39 3.2.9) Análises estatísticas 40 IV) Resultados 41 4.1) Ligação de 3(H)CCPA ao receptor A1 em culturas complexas em monocamada e em culturas de agregados

41

4.2) O tratamento das culturas complexas em monocamada com análogos permeáveis de AMPc aumenta a ligação do 3(H)DPCPX ao receptor A1

43

4.3) A ativação do receptor A2a é capaz de aumentar a ligação do 3(H)DPCPX ao receptor A1

48

4.4) O bloqueio da atividade da PKA é capaz de bloquear o efeito do receptor A2a

52

4.5) O bloqueio ou a ativação do receptor A1 aumenta a sua ligação ao 3(H)DPCPX

54

4.6) O tratamento com adenosina deaminase promove aumento da ligação de 3(H)DPCPX ao receptor A1

57

V) Discussão 61 VI) Conclusões 71 VI) Referências Bibliográficas 73

vii

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar a Deus pelo dom da vida e por todas as oportunidades que cruzaram o meu caminho. Ao meu orientador Roberto, pela oportunidade e apoio, pelos ensinamentos e a confiança depositada em mim. Muito obrigada! À minha co-orientadora e grande amiga Jainne, por tudo o que me ensinou, por sempre ter acreditado que eu conseguiria desenvolver esse projeto, pelos momentos de alegria e descontração no laboratório e pela força e estímulo nos momentos difíceis. Aos colegas de laboratório que são tão importantes: Alexandre, a pessoa que consegue ser mais calma do que eu. Obrigada por toda a ajuda que me deu com o Western e pelas risadas garantidas. Daniel, um amigo para toda hora. Sempre disposto a ajudar tanto com o computador quanto na bancada. Octavia, o completo oposto de mim em todos os sentidos. Acho que é por isso que nos damos tão bem. Obrigada pela força e por todas as piadas geradas sobre você. Cristiane, amiga e companheira. Pela ajuda e apoio. Márcia, pelas discussões sobre os nossos trabalhos que me ajudaram muito. Marcelo, Camila, Renato, Raquel, Luciane e Vivian pela amizade. Os amigos que passaram pelo laboratório: Igor, Rochele, Rodrigo e Vanessa. Vanusa pelos experimentos iniciais. Elaine e Luzeli pela amizade e apoio técnico. À Aninha por tudo o que me ajudou, pela paciência em me esperar todas as vezes em que me atrasei para fazermos os experimentos. Você se tornou uma verdadeira amiga nesse tempo em que trabalhamos juntas. À Paulinha pelos ensinamentos, pela amizade e apoio e pela ajuda na câmara escura. À Karin pela contribuição, interesse e disposição para ajudar. À Ana Ventura pelos conhecimentos passados e por tudo o que eu já pedi emprestado no seu laboratório. Aos professores Beth e Cláudio pela ajuda e pelas ótimas aulas. À minha irmã Ana e ao meu cunhado Max que mesmo distantes sempre me apoiaram nas minhas decisões e à minha sobrinha Carolina, que mesmo ainda não ter vindo ao mundo, já é tão importante na minha vida. Ao meu noivo Diego, pelo carinho, ajuda e companheirismo. Não tenho palavras para dizer o quanto você é importante para mim. Obrigada pelo apoio e paciência e por estar sempre presente em todos os momentos.

iii

“Mestre não é quem ensina,

mas quem de repente aprende”

Guimarães Rosa

iv

v

Dedico este trabalho à minha família: Diego, Ana, Max e Carolina.

RESUMO

A adenosina é um importante neuromodulador no SNC e suas ações

são promovidas pela ativação dos receptores A1, A2a, A2b e A3. Trabalhos

anteriores do laboratório mostraram a presença de receptores A1 e A2 em

retina intacta de pinto. Em cultura, a detecção do receptor A1 depende do

estado de agregação das células. Culturas em monocamada mostraram uma

ligação baixa ou nula do agonista A1 3(H)CCPA ou antagonista 3(H)DPCPX. Incubação prolongada com análogos permeáveis de AMPc

como SpAMPc ou 8 BrAMPc foi capaz de aumentar a detecção do

receptor. Além disso, forskolina, um ativador direto da adenilil ciclase,

também aumentou marcadamente a ligação. Estes resultados sugeriam a

modulação da detecção dos receptores A1 via ativação de receptores A2a.

Os receptores A2a de adenosina estão expressos nas retinas de

embriões a partir de 7 dias de desenvolvimento (E7) onde o nível de

expressão é alto. Em E9 o nível cai cerca de 45% e se mantém constante

até E16. Este receptor também foi encontrado em culturas em

monocamada. O tratamento das culturas com o agonista A2a DPMA

aumentou a ligação de 3(H)DPCPX e este efeito foi bloqueado

completamente por H89, um inibidor da PKA. A incubação com o

antagonista A1 DPCPX ou com o agonista CHA aumentaram a ligação de 3(H)DPCPX. Do mesmo modo, os tratamentos com adenosina deaminase,

EHNA ou inosina aumentaram a ligação.

Os resultados indicam que a ativação de receptores A2a modula a

expressão de receptores A1 nas culturas. Além disso, os dados também

sugerem a possível participação de receptores A3 ativados por inosina.

xi

ABSTRACT

Adenosine is an important neuromodulator in CNS and its actions are

promoted by activation of A1, A2a, A2b and A3 receptors. Previous studies

from our laboratory have shown that A1 e A2 receptors are present in intact

chick embryo retina. In culture, the detection of A1 receptor depends on

cell aggregation. Monolayer cultures have shown a low or undetectable

binding of A1 agonist 3(H)CCPA or antagonist 3(H)DPCPX. Chronic

treatment with the permeable cyclic AMP analogs SpcAMP or 8 BrcAMP

was able to increase receptor detection. In addition, forskolin also

significantly increased the binding. These results suggest the modulation of

A1 receptor detection via A2a receptor activation.

A2a adenosine receptors are expressed in embryonic retinas starting

at 7 days of development (E7) when the levels of receptor expression are

higher. At E9 the level decreased about 45% and remained constant up to

E16. This receptor was also finder in monolayer cultures. Treatment of

cultures with the A2a agonist DPMA increased 3(H)DPCPX binding and

this effect was completely blocked by H89, a PKA inhibitor. Treatment

with A1 antagonist DPCPX or agonist CHA increased 3(H)DPCPX

binding. In the same way, treatment with adenosine deaminase, EHNA or

inosine increased the binding.

The results indicate that the activation of A2a receptors modulates

the expression of A1 receptors in chick retina cultures. In addition, the

results suggest the participation of A3 receptors activated by inosine.

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

8Br AMPc - 8 Bromoadenosina-3’,5’monofosfato cíclico, sal de sódio.

ADA – adenosina deaminase.

Akt – proteína kinase B.

AMP - adenosina 3’-5’ monofosfato.

AMPc - adenosina 3´-5´monofosfato cíclico.

ATP - adenosina 5´-trifosfato.

BME - meio básico de Eagle.

BSA - albumina sérica bovina.

C1 - primeiro dia de cultura.

C6 - sexto dia de cultura.

CAMKII - Proteína kinase II dependente de cálcio e calmodulina.

CCPA - 2-cloro-N6-ciclopentiladenosina.

CHA - ciclohexiladenosina.

CMF - solução sem cálcio e magnésio.

Cpm - contagens por minuto.

CREB – proteína ligante aelemento de resposta à AMPc.

DAG – diacilglicerol.

DMSO - dimetil sulfóxido.

DPCPX – 8- Ciclopentil-1,3- dipropilxantina.

DPMA - N6-[2-(3,5-Dimethoxifenil)-2-(metilfenil)-etil]adenosina.

E7 – sétimo dia de estágio de desenvolvimento embrionário.

E8 - oitavo dia de estágio de desenvolvimento embrionário.

E9 – nono dia de estágio de desenvolvimento embrionário.

E11 – décimo primeiro dia de estágio de desenvolvimento embrionário.

E14 – décimo quarto dia de estágio de desenvolvimento embrionário.

E16 – décimo sexto dia de estágio de desenvolvimento embrionário.

EHNA - eritro-9-(2-hydroxi-3-nonil) adenina.

ERK – proteína kinase ativada por sinais extracelulares.

viii

Go - proteína G sem ação sobre a enzima adenilil- ciclase.

GABA - ácido gama amino butírico.

Gi - proteína G inibitória.

mGlu1 – receptor metabotrópico de glutamato do tipo 1.

mGlu5 – receptor metabotrópico de glutamato do tipo 5.

GMPc- guanosina 3´-5´monofosfato cíclico.

GRK – kinase de receptor acoplado à proteína G.

GRK2 – kinase de receptor acoplado à proteína G do tipo 2.

Gs - proteína G estimulatória.

H89 – {N-(2-((p- Bromocinamil)amino)etil]-5-isoquinolinasulfonamida, 2HCl}.

IB-MECA – iodobenzilmetilcarboxiamidoadenosina.

IP3 – inositol trifosfato.

JNK – proteína kinase c-Jun NH2-terminal.

L-NAME - Nω – nitro-L-arginina metil éster.

MAPK – proteína kinase ativada por mitógeno.

MEK – MAP kinase kinase.

NBMPR - S-(Nitrobenzil)-6-tioinosina.

NECA – 5’ -N-Etilcarboxiamidoadenosina.

NFkB – fator nuclear kB.

NMDA – N-metil-D-aspartato.

NOS- óxido nítrico sintase.

PI3K – fosfatidil inositol 3 kinase.

PIP2 – fosfatidilinositol 4,5-bifosfato.

PLC – fosfolipase C.

PLCβ - fosfolipase C β.

PKA – proteína kinase dependente de AMPc.

PKC – proteína kinase dependente de Ca+2.

P2Y1 – receptores de purinas tipo 2Y1.

Raf – MAP kinase kinase kinase

Ras – subtipo monomérico de proteína ligante de nucleotídeos de guanina (proteína G).

RNAm – ácido ribonucléico mensageiro.

R-PIA – R-fenilisopropiladenosina.

ix

SAH - S-adenosilhomocisteína.

SAPK – proteína kinase ativada por stress.

SCH 58261 – 7-(2-feniletil)-5-amino-2-(2-furil)-pirazolo [4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-

c]piramida.

SDS - dodecil sulfato de sódio.

SFB – soro fetal bovino.

Sítio P – receptor intracelular de adenosina.

SNC- sistema nervoso central.

SOS – fator de troca de nucleotídeo.

Sp cAMP - Sp-Adenosina-3’5’ monofosforotioato cíclico.

Src- proteína tirosina cinase citoplasmática purificada do sarcoma da retina de pinto

TBS - solução tampão Tris.

TBS-T - solução tampão Tris acrescida de tween-20.

Tris - tris-(hidroximetil)-aminometano.

x

I- INTRODUÇÃO

1) Adenosina

Adenosina é um importante componente do sistema purinérgico e é

encontrada em todos os tecidos apresentando um papel modulatório de

diversos processos fisiológicos. Suas principais ações descritas são:

regulação das funções cardiovasculares como vasodilatação e diminuição

da pressão sanguínea e modulação do sistema nervoso central através da

regulação da liberação de neurotransmissores (Sato et al., 2005; Cunha,

2001 para revisão). Além disso, é capaz de produzir inibição da lipólise,

broncoconstrição e citoproteção em episódios de isquemia e hipóxia ou de

stress oxidativo (Van der Graaf et al., 1999; Fan et al., 2003; Wardas, 2002

para revisão).

1.1) Produção e metabolismo

A principal via de produção de adenosina no meio extracelular vem

da atividade da enzima ecto-5’-nucleotidase que converte 5’-AMP em

adenosina. O 5’-AMP pode vir de duas fontes: da conversão de

nucleotídeos ou pela liberação de AMPc. O AMPc é liberado pelas células

por um transportador e convertido no meio extracelular em 5’-AMP por

uma ecto-fosfodiesterase (Brunton & Mayer, 1979; Henderson & Strauss,

1991).

No meio intracelular, a adenosina pode ser formada através da

quebra de 5’-AMP pela 5’- nucleotidase. Outra via já descrita ocorre por

hidrólise de S-adenosilhomocisteína (SAH) pela S-adenosilhomocisteína

hidrolase (Lloyd et al., 1988). Entretanto, essa via não possui uma grande

importância na produção deste nucleosídeo (Pak et al, 1994).

A adenosina pode ser metabolizada intracelularmente em AMP pela

adenosina kinase ou em inosina pela adenosina deaminase. Já no meio

extracelular ela é metabolizada pela ecto-adenosina deaminase (figura 1)

(Latini & Pedata, 2001 para revisão).

Figura 1: Vias de produção, metabolismo e transporte de adenosina (Latini & Pedata,

2001 para revisão).

1.2) Transporte

A principal via para a regulação dos níveis de adenosina ocorre

através do seu transporte bi-direcional. Os transportadores são classificados

em dois grupos: transportadores equilibrativos que transportam adenosina

de acordo com o seu gradiente de concentração e os transportadores

concentrativos que transportam a adenosina contra o seu gradiente de

concentração e de forma dependente de Na+. Além disso, os

transportadores equilibrativos são divididos em sensíveis a NBMPR

(nitrobenziltioinosina) e insensíveis a NBMPR (Jarvis & Yong, 1986). No

sistema nervoso central foi demonstrado uma grande quantidade de RNAm

para os transportadores equilibrativos, principalmente RNAm de

transportadores sensíveis a NBMPR (Anderson et al., 1999).

O transporte de adenosina tem sido bastante estudado pelo nosso

laboratório usando tanto culturas mistas, como culturas purificadas de

neurônios e culturas purificadas de glia. Todas obtidas de embriões de

galinha.

Nas culturas purificadas de neurônios, cerca de 40% dos neurônios e

praticamente todos os fotorreceptores possuem o mecanismo de transporte

de adenosina. A captação mostra-se saturável e pode ser bloqueada por

NBMPR, além de muito reduzida pelo pré-tratamento da 3(H)adenosina

com adenosina deaminase. A análise do material intracelular pós-captação

indica a presença de 35% de adenosina e 65% de inosina, hipoxantina e

nucleotídeos mais ácido úrico. Além disso, essas células também liberam

adenosina em condições basais e estimuladas por altas concentrações de

K+, de uma maneira dependente de Ca2+ (Paes-de-Carvalho et al., 1990).

Em culturas mistas de embriões de galinha de 8 dias, glutamato

estimula a liberação de purinas e esse efeito é bloqueado por antagonistas

de receptores de NMDA e kainato. Esse estímulo é mimetizado por kainato

e NMDA e bloqueado pelos seus respectivos antagonistas indicando a

participação desses dois receptores na liberação de purinas. Já se observa

liberação após adição de 1 µM de glutamato e a resposta máxima é obtida

após tratamento com 100 µM de glutamato. Experimentos com kainato e

NMDA demonstraram que o estímulo não é capaz de liberar todo o “pool”

de purinas e que esse efeito é reversível. O transporte é bloqueado por

NBMPR e inibidores de CAMKII. Além disso, é dependente de Ca2+ mas

os canais de Ca2+ do tipo L não estão envolvidos. Os resultados indicam

que a ativação de receptores ionotrópicos de glutamato promove uma

liberação de purinas dependente de cálcio que é realizado pelo

transportador equilibrativo sensível ao NBMPR. Analisando-se a natureza

do material intracelular após a captação, encontrou-se 95% de nucleotídeos.

Entretanto, a maior parte do material extracelular liberado após estímulo

com glutamato era inosina (Paes-de-Carvalho et al., 2005).

Estudando-se culturas purificadas de glia obtidas de embriões de

galinha de 11 dias, observou-se que as células eram capazes de captar e

liberar adenosina. Esse transporte é bloqueado por NBMPR (de forma

menos potente quando comparado com as culturas de células mistas) e pelo

pré-tratamento da 3(H)adenosina com adenosina deaminase. O efeito menos

potente do NBMPR nas culturas de glia quando comparado ao seu efeito

nas culturas mistas, sugere a presença dos outros transportadores não

sensíveis a essa droga em maior concentração nessas células. A captação é

bloqueada pelos inibidores de CAMKII e PKC e ligeiramente bloqueada

pelo inibidor da PKA. Já a ativação dos receptores A1 ou A2a de adenosina

não apresenta nenhum efeito na captação. Entretanto, os agonistas desses

receptores induziram um pequeno aumento na liberação de purinas. Além

disso, a própria adenosina é capaz de promover um grande efluxo de

purinas sugerindo um mecanismo de “homoexchange” nessas células de

glia. Ao contrário das culturas mistas, kainato e NMDA não estimulam a

liberação de adenosina nestas culturas de glia excluindo o envolvimento de

receptores de glutamato estimulando o transporte (Ferreira et al., resultados

não publicados).

Esses resultados indicam que tanto as células de glia quanto os

neurônios têm a maquinaria para o transporte, síntese e metabolismo de

adenosina.

1.3) Receptores

A adenosina atua via 4 subtipos de receptores já clonados: A1, A2a,

A2b e A3 (figura 2). Classicamente os receptores de adenosina são

divididos em dois grupos: os receptores A1 e A3 que estão acoplados

negativamente à enzima adenilil ciclase diminuindo os níveis intracelulares

de AMPc, e os receptores A2a e A2b que estão acoplados positivamente à

enzima adenilil ciclase promovendo um aumento dos níveis intracelulares

de AMPc (van Calker et al., 1979; Zhou et al., 1992; Pierce et al., 1992).

Entretanto, esses receptores podem se acoplar a outros tipos de proteína G

ativando diferentes vias de sinalização (Biber et al., 1997; Abracchio et al.,

1995; Palmer et al., 1995; Offermanns & Simon, 1995; Gao et al., 1999).

Figura 2: Receptores de adenosina. Os receptores A1 e A3 de adenosina estão acoplados

às proteínas Gi/Go e os receptores A2 de adenosina estão acoplados à proteína Gs

(http://www.aderis.com/img/art_adenosine.gif).

A presença de receptores A1 e A2a de adenosina foi demonstrada em

retinas de diversas espécies (Blazynski & Perez, 1991 para revisão).

Paes-de-Carvalho e de Mello em 1982 mostraram um acúmulo de

AMPc induzido por adenosina durante o desenvolvimento. Entre 8 e 14

dias, a adenosina não promoveu aumento de AMPc. Após 14 dias, as

retinas passam a promover acúmulo de AMPc tendo como resposta

máxima em 17 e 18 dias. Após a eclosão, a produção foi muito reduzida.

Também foi observado um aumento de AMPc em culturas complexas com

apenas 1 dia tendo um efeito máximo com 4 dias que foi mantido até 8 dias

de cultura.

Em 1985, Paes-de-Carvalho e de Mello mostraram que dopamina e

2-cloroadenosina produziram acúmulo de AMPc em retinas de 16 dias. Em

concentrações saturantes ou sub-saturantes das drogas, os efeitos não foram

somatórios indicando a presença de um receptor inibitório para acúmulo de

AMPc. Esse fato foi demonstrado em retinas de 12 dias onde a adenosina

promoveu inibição do acúmulo de AMPc induzido por dopamina de forma

dose-dependente com uma inibição máxima de 70%.

Alguns anos depois, foi mostrado através da técnica de “binding” a

presença de receptores A1 em retinas intactas de embriões de galinha em

desenvolvimento. Este receptor já se encontra presente com 10 dias de

desenvolvimento do embrião alcançando níveis máximos em 17 dias. Após

a eclosão do ovo, o número de receptores cai, mas tende a se estabilizar

(Paes-de-Carvalho, 1990).

1.3.1) Distribuição dos receptores

O receptor A1 de adenosina possui uma distribuição por todo sistema

nervoso central com grande concentração no córtex, hipocampo e cerebelo.

Já o receptor A2 está mais presente no striatum e no bulbo olfatório (figura

3). O receptor A3 é encontrado em baixas concentrações no hipocampo,

córtex, cerebelo e striatum (Fredholm et al., 2000 para revisão).

Figura 3: Autoradiografia mostrando a presença do

receptor A1 no córtex e hipocampo (em cima) e do

receptor A2 no striatum (em baixo)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=b

nchm.figgrp.1262).

Entretanto, os receptores A1 também são expressos em outras

regiões como glândula adrenal, músculo esquelético, fígado, rins, tecido

adiposo, glândulas salivares, esôfago, pulmão e pâncreas. Os receptores

A2a são encontrados no timo, em leucócitos, em plaquetas, no coração e no

pulmão, enquanto que os receptores A2b estão em mastócitos, tecido

adiposo, glândula adrenal, rins e fígado. Já os receptores A3 encontram-se

presentes nos mastócitos, pulmão, tireóide, glândula adrenal, fígado, rins,

coração e intestino (Fredholm et al., 2001).

1.3.2) Localização celular e subcelular dos receptores no SNC

Os receptores A1 são encontrados tanto em neurônios quanto em

astrócitos, microglia e oligodendrócitos (Biber et al., 1997; Gebicke-

Haerter et al., 1996; Othman et al., 2003). Outros estudos demonstraram

que esses receptores são mais abundantes nas sinapses, tanto nos terminais

pré-sinápticos quanto nos pós-sinápticos (Tetzlaff et al., 1987). Entretanto,

a ativação do receptor A1 e o efeito produzido depende do tipo celular já

que este receptor controla a liberação de glutamato, acetilcolina e

serotonina mas não modula a liberação de GABA e noradrenalina (Cunha,

2001).

Os receptores A2a são encontrados nos neurônios, em astrócitos e

microglia (Li et al., 2001). Nos gânglios da base os receptores estão

localizados predominantemente nas espinhas dendríticas e nas regiões pós-

sinápticas (Hettinger et al., 2001; Rodrigues et al., 2005). Já os receptores

A2a do hipocampo estão mais localizados nas sinapses em particular nas

regiões pré-sinapticas (Rebola et al., 2005). Além disso, ao contrário do

receptor A1, o receptor A2a regula a liberação de glutamato, acetilcolina,

GABA e noradrenalina (Lopes et al., 2002; Rebola et al., 2002; Cunha et

al., 2000; Barraco et al., 1995).

Foi encontrado RNAm para receptor A2b em microglia

(Hammarberg et al., 2003) Além disso, esse receptor foi encontrado em

astrócitos (Allaman et al., 2003). Entretanto, mais estudos são necessários

para caracterizar a presença desse receptor em neurônios.

O receptor A3 é encontrado em neurônios (Brand et al., 2001),

astrócitos (Wittendorp et al., 2004) e microglia (Hammarberg et al., 2003)

1.3.2) Estrutura dos receptores

Os receptores de adenosina são acoplados a proteínas G. Assim

sendo, como todos os receptores metabotrópicos, eles apresentam 7

domínios transmembrana com 3 alças intracelulares e 3 alças

extracelulares. Além disso, apresentam uma cadeia carboxi terminal

intracelular e uma cadeia amino terminal extracelular (Olah et al., 1995

para revisão).

A cadeia carboxi terminal e a terceira alça intracelular possuem um

papel importante, pois elas contêm os sítios de interação do receptor com a

proteína G. Estudos onde o receptor A1 foi mutado demonstraram que o

terceiro e o sétimo domínio transmembrana contêm resíduos de

aminoácidos críticos para a ligação de agonistas e antagonistas. Além

disso, o quinto domínio transmembrana parece estar envolvido no

reconhecimento seletivo de agonistas sintetizados a partir de uma

substituição na posição 5’ da ribose da molécula de adenosina (Olah et al.,

1995 para revisão).

Já foi mostrado que o acoplamento do receptor A2a à proteína G

depende da terceira alça intracelular. Além disso, a porção amino terminal

da terceira alça intracelular é quem determina a seletividade desse receptor

à proteína Gs, enquanto que os resíduos de lisina e ácido glutâmico da

segunda alça intracelular são necessários para que haja um eficiente

acoplamento à proteína G (Olah, 1997).

Outros estudos mostram que o resíduo treonina na posição 298 da

cadeia C terminal é o responsável pela rápida dessensibilização do receptor

A2a (Palmer & Stiles, 1997).

Os receptores de adenosina, exceto o receptor A2a, possuem um

resíduo cisteína na região carboxi terminal que pode servir como um sítio

de palmitoilação envolvido na formação de uma quarta alça intracelular.

Este sítio está envolvido com dessensibilização e internalização de

receptores (Palmer et al., 1996).

1.3.3) Dimerização de receptores

Os receptores A1 e A2a são conhecidos por formarem

homodímeros nas membranas celulares. Além disso, eles são capazes de

formar complexos com outros tipos de receptores podendo assim, em

alguns casos, modificar a atividade deles. Já foi demonstrado que o

receptor A1 forma heterodímero com receptores como o receptor P2Y1

(Yoshioka et al., 2002), receptor metabotrópico de glutamato mGlu1

(Ciruela et al., 2001) e receptor D1 de dopamina (Guinés et al., 2000). Já

o receptor A2a pode formar heterodímero com o receptor metabotrópico

de glutamato mGlu5 (Ferre et al., 2002) e com o receptor D2 de

dopamina (Canals et al., 2003).

2) Receptores A1 e A3 de adenosina

2.1) Sinalização via adenilil ciclase

Os receptores A1 e A3 podem se acoplar às proteínas Gi ou Go

inibindo a atividade da enzima adenilil ciclase (van Calker et al., 1979;

Zhou et al., 1992). Quando esses receptores são ativados por agonistas, eles

ativam as proteínas Gi ou Go que, por serem proteínas inibitórias sensíveis

à toxina pertussis, se ligam à enzima inibindo-a. Assim, a conversão de

ATP em AMPc é inibida e, consequentemente, os níveis intracelulares

desse nucleotídeo cíclico diminuem. Quando a produção desse segundo

mensageiro cai, a kinase que estaria abaixo na via de sinalização, no caso a

PKA, não é ativada (figura 4).

Figura 4: Esquema da sinalização do receptor A1 ou A3 via adenilil ciclase. Quando

ativado, o receptor inibe a atividade da enzima diminuindo a produção de AMPc e,

consequentemente, a sinalização deste segundo mensageiro (modificado de

http://www.starosta.com/technical/art/membrane_receptor.jpg).

2.2) Sinalização por fosfolipase C

O receptor A1, via proteína Gi/Go, ativa a PLCβ através da liberação

da subunidade βγ (Biber et al., 1997). Quando essa enzima é ativada, ela

quebra o PIP2 da membrana plasmática em IP3 e DAG. O IP3 se liga nos

canais de Ca2+ do retículo endoplasmático ativando-os. O Ca2+ armazenado

é liberado. Os níveis aumentados de Ca2+ induzem o ancoramento da PKC

inativa através de uma molécula de DAG. Então, o Ca2+ liberado se liga à

PKC ativando-a (figura 5). Entretanto, a DAG pode também ativar a PKC

de forma independente de cálcio (Osada et al., 1992).

Figura 5: Esquema demonstrando a ativação da fosfolipase C e conseqüente ativação da

PKC (http://homepages.strath.ac.uk/~dfs99109/BB329/PKC.jpg).

Em 1997, Biber e colaboradores demonstraram que em culturas de

astrócitos o receptor A1 ativa a PLCβ através da subunidade βγ da proteína

G. Entretanto, mais subunidades βγ são necessárias para ativar a PLC do

que subunidades α para inibir a adenilil ciclase. Parece que esse efeito

depende do nível de expressão do receptor nas culturas. Somente níveis

altos do receptor A1 são capazes de estimular a PLC enquanto que a

inibição da adenilil ciclase independe do nível de expressão do receptor.

O receptor A3 também pode ativar a PLC via proteína Gi ou Go

através da liberação da subunidade βγ ou através da proteína Gq

(Abbracchio et al., 1995; Palmer et al., 1995).

2.3) Sinalização através de canais iônicos

Quando o receptor A1 é ativado, ele é capaz de promover a abertura

de canais de K+ aumentando a condutância desse íon (Gerber et al., 1989).

Outro efeito é o fechamento dos canais de Ca2+ do tipo N (Mogul et al.,

1993). O fechamento dos canais de Ca2+ e abertura dos canais de K+

contribuem para a inibição da liberação de neurotransmissores promovido

pelos receptores A1 pré-sinápticos.

2.4) Sinalização via MAP kinases

As proteínas da família das MAPK estão envolvidas com sobrevida,

proliferação e diferenciação em todos os organismos. Essa família consiste

das proteínas kinases reguladas por sinal extracelular (ERK) e das proteínas

kinases ativadas por stress (SAPK) como a P38 e a JNK (Rane et al., 2000

para revisão; Roux & Blenis, 2004 para revisão).

Essas proteínas são kinases serina/treonina normalmente ativadas via

receptores tirosina kinase (Serger & Krebs, 1995). Entretanto, receptores

acoplados a proteína G também são capazes de ativar as MAPK (Luttrell et

al., 1997 para revisão).

Em células COS-7 os receptores A1 de adenosina podem ativar

ERK1/2 através da subunidade βγ da proteína Gi ou Go (Faure et al.,

1994). Essa ativação é tempo e dose dependente (Schulte & Fredholm,

2000) e sensível a PI3 kinase (Dickenson et al., 1998).

Dados do nosso laboratório demonstram que a ativação de receptores

A1 pode estimular a fosforilação das ERK 1/2 em culturas de glia de retina

(Rodrigues et al., dados não publicados).

O receptor A3 pode ativar a via das ERK 1/2 através da subunidade

βγ da proteína Gi ou Go. A sinalização foi mostrada ser dependente de

PI3K, Ras e MEK (Schulte et al., 2002). Mais recentemente, foi

demonstrado que a ativação do receptor A3 inibe a proliferação celular

através da inibição da fosforilação das ERKs em células A375 de

melanoma humano. Nesse caso, a ativação da via PI3K/Akt pelo receptor

A3 leva a uma fosforilação de um sítio inibitório na Raf inativando-a

(Merighi et al., 2005).

2.5) Dessensibilização

O receptor A1 possui uma cinética de dessensibilização e

internalização muito lenta. Ramkumar e colaboradores em 1991 mostraram

que após 8 horas de estímulo com agonista A1, células DDT1 MF-2

apresentaram uma redução de 40% do número de receptores na membrana.

Alguns receptores quando perdem o seu sítio de palmitoilação

passam a apresentar uma cinética de dessensibilização e internalização

mais rápida (Moffett et al., 2001). Entretanto, Ferguson e colaboradores

demonstraram em 2002 que o sítio de palmitoilação do receptor A1 não

interfere no mecanismo de dessensibilização e internalização desse receptor

e que a ativação prolongada leva a uma redistribuição da arrestina-3 em

“clusters”.

Escriche e colaboradores em 2003 demonstraram que a

dessensibilização e internalização dos receptores A1 em células DDT1MF-

2 são mediados por cavéola e não por clatrina. Após 40 minutos de

estímulo com R-PIA, grande parte dos receptores está internalizado em

vesículas. Também foi mostrado que o domínio carboxi terminal do

receptor interage com a caveolina-1.

Palmer e colaboradores em 1995 mostraram que receptores A3 de

rato transfectados em células CHO, possuem uma cinética de fosforilação e

dessensibilização extremamente rápida. Após 4 minutos de exposição a 10

µM de NECA, o receptor A3 alcançou o máximo de fosforilação que se

manteve por 20 minutos na presença do agonista. Esta fosforilação envolve

GRK2. Além disso, eles demonstraram que após 10 minutos na presença de

NECA, os receptores tiveram seus sítios de ligação reduzidos (34 ± 10 %

de redução de Bmax) o que caracteriza uma dessensibilização rápida.

Dados da literatura indicam que ERK 1/2 estaria envolvida na

ativação de GRK2 e, consequentemente, participando do processo de

dessensibilização do receptor (Trincavelli, 2002). O tratamento com

inibidor das ERKs impediu a translocação para a membrana da GRK2 e

bloqueou a dessensibilização e a internalização do receptor.

Ferguson e colaboradores em 2002 mostraram que o sítio de

palmitoilação do receptor A3 é importante para o processo de

dessensibilização e internalização. Quando o sítio de palmitoilação foi

mutado, esse receptor passou a ter uma fosforilação basal provavelmente

por facilitar a ação da GRK. Além disso, a internalização ocorreu em uma

proporção mais rápida quando comparado ao não mutado.

2.6) Principais funções

Já é bem conhecido na literatura que a ativação do receptor A1 inibe

a liberação de neurotransmissores por hiperpolarizar os terminais pré-

sinápticos através da abertura de canais de K+ e pelo fechamento de canais

de Ca2+. Assim, durante episódios de isquemia e hipóxia, a ativação de

receptores A1 leva a um bloqueio da liberação de neurotransmissores,

principalmente o glutamato, promovendo um efeito neuroprotetor para as

células (Sakamoto et al., 2004).

A ativação do receptor A3 produz efeitos neuroprotetores pois foi

mostrado que o tratamento crônico com o agonista seletivo IB-MECA

diminui a morte neuronal ocorrida durante a isquemia (von Lubitz et al.,

1994). Esse efeito protetor também foi observado em culturas de miócitos

(Liu et al., 1994).

O receptor A3 também está envolvido em processos inflamatórios. O

tratamento com inosina estimula, via receptor A3, a degranulação de

mastócitos (Jin et al., 1997).

3) Receptores A2a e A2b de adenosina

3.1)Sinalização via adenilil ciclase

Os receptores A2a e A2b de adenosina estão acoplados a proteínas

Gs estimulando a produção de AMPc (van Calker, 1979). Quando esses

receptores são ativados, ocorre a ativação da enzima adenilil ciclase e

consequentemente aumento dos níveis intracelulares de AMPc. Esse

segundo mensageiro ativa a PKA que pode migrar para o núcleo da célula

ativando transcrição gênica via CREB (Gonzalez et al., 1989) (figura 6).

Figura 6: Receptor A2 ativa a enzima adenilil ciclase aumentando os níveis

intracelulares de AMPc o qual ativa PKA (modificado de

http://www.starosta.com/technical/art/membrane_receptor.jpg).

3.2) Sinalização através de fosfolipase C

Dados da literatura demonstram que receptores A2a são capazes de

ativar PLCβ quando transfectados em células COS-7 com Gα15 e Gα16.

Esse efeito não foi observado com Gαq, Gα11 ou Gα14 (Offermanns &

Simon, 1995).

O receptor A2b ativa a PLCβ via proteína Gq (Gao et al., 1999).

Entretanto, foi demonstrado que em células HEL (células de eritroleucemia

humana) a ativação do receptor A2b aumenta os níveis intracelulares de

Ca2+ de forma independente de PLC. Esse efeito é dependente de Gs que

poderia estar ativando diretamente canais de cálcio já que este efeito foi

demonstrado ser independente de AMPc (Feoktistov et al., 1994).

Nos neurônios piramidais da região CA3 do hipocampo, o receptor

A2b ativa canais de Ca2+ do tipo P mas não do tipo N. Esse mecanismo tem

sido proposto ser via ativação da adenilil ciclase já que inibidores de PKA

bloqueiam esse efeito (Feoktistov et al., 1994).

3.3) Sinalização pelas MAP kinases

Em células endoteliais, foi mostrado que a ativação de ERK 1/2 via

receptor A2a era independente de proteína Gs, AMPc, PKC e cálcio mas

dependente de Ras e MEK. Os autores sugeriram que o efeito poderia ser

via proteína G12/13 (Sexl et al., 1997). Em células HEK 293, a ativação

também é independente de Gs e AMPc mas envolve Ras e SOS. Entretanto,

em células CHO transfectadas com o receptor A2a e em células PC12, a

fosforilação é dependente de AMPc, PKA e Src (Seidel et al., 1999).

Estudos em mastócitos humanos demonstraram que o receptor A2b

ativa as três famílias de MAP kinases mas com cinéticas diferentes. A

fosforilação máxima da ERK 1/2 foi alcançada rapidamente e foi

sustentada por 30 minutos enquanto que a fosforilação da P38 foi rápida e

transiente (alcançou o nível máximo em 1 minuto e decaiu após 10

minutos). Já a fosforilação da JNK foi alcançada apenas após 10 minutos

de estímulo e voltou ao basal após 30 minutos (Feoktistov et al., 1999).

Essas cinéticas diferentes indicam que cada uma das fosforilações ocorre

por vias diferentes.

Em células HEK 293 foi mostrado que os níveis máximos de

fosforilação da ERK 1/2 são alcançados 5 minutos após estimulação com

NECA e que depende de PLC, Ras e MEK mas não de PKC (Gao et al.,

1999). Entretanto, outros autores demonstraram que a ativação das ERKs

em células CHO transfectadas com o receptor A2b era dependente de

AMPc e PI3K mas independente de PKA (Schulte & Fredholm, 2000).

Além disso, a ativação da P38 é dependente de AMPc e PKA mas

independente de PI3K.

3.4) Dessensibilização

Willets e colaboradores em 1999 demonstraram que a

desensibilização do receptor A2a é rápida e dependente de GRK2.

O receptor A2b também possui uma cinética de dessensibilização e

internalização rápida. Em células CHO transfectadas com o receptor, 50%

de dessensibilização foi obtida após uma hora de exposição ao agonista.

Além disso, a internalização se mostrou dependente de arrestina. A porção

carboxi terminal parece ser importante já que a sua deleção bloqueia tanto a

dessensibilização quanto a internalização (Matharu et al., 2001).

3.3) Principais funções

Vários estudos demonstram que o bloqueio do receptor A2a promove

a inibição da liberação de neurotransmissores principalmente o glutamato.

Esse fato é importante durante episódios de isquemia e hipóxia já que o

bloqueio do receptor A2a inibe a liberação de glutamato e confere proteção

às células (Latini et al., 1999).

Ferreira e Paes-de-Carvalho em 2001 mostraram que glutamato

promove morte celular em culturas purificadas de neurônios de retina. Esse

efeito é bloqueado por antagonistas de receptores de glutamato do tipo

AMPA/kainato e NMDA. Entretanto, a pré-incubação das culturas por 24

horas com adenosina é capaz de bloquear a morte induzida por glutamato.

Este efeito é mimetizado por agonista de receptor A2a mas não de A1.

Adenosina em presença de EHNA (inibidor de adenosina deaminase),

NBMPR e análogos permeáveis de AMPc como 8BrAMPc e SPAMPc

também bloqueiam a morte celular.

Nestas mesmas culturas foi demonstrado que a troca do meio causa

morte neuronal. Esse efeito é também bloqueado pela pré-incubação com

adenosina, NBMPR e agonista de receptor A2a, mas não por agonista de

receptor A1 (Paes-de-Carvalho et al., 2003).

Os receptores A2b participam do controle do tônus vascular. Dados

da literatura indicam que a ativação do receptor provoca vasodilatação

(Haynes et al., 1995; Rubino et al., 1995). Esse efeito parece ser

independente da produção de NO já que inibidor da NO sintase (L-NAME)

não produziu bloqueio. Entretanto, em artérias renais de ratos, o receptor

A2b também produziu vasodilatação de maneira dependente da produção

de NO (Martin & Potts, 1994).

Dados da literatura indicam que o receptor A2b pode estar envolvido

com aumento da contratilidade do miocárdio (Liang & Haltiwanger, 1995).

Entretanto, mais estudos necessitam ser feitos nessa área.

4) Modelo de estudo: a retina

A retina apresenta uma organização das células em camada. Ela

consiste da camada das células ganglionares que contém os corpos

celulares das células ganglionares. Em seguida aparece a camada

plexiforme interna que contém as sinapses das células ganglionares com as

células bipolares, amácrinas e horizontais. Logo abaixo, está a camada

nuclear interna que contém os corpos celulares das células bipolares,

horizontais e amácrinas. Depois encontra-se a camada plexiforme externa

que contém as sinapses entre as células da camada nuclear interna com os

fotoreceptores localizados na camada nuclear externa. Ao longo de todas as

camadas encontram-se a células da glia de Müller (figura 7).

Figura 7: Esquema mostrando a disposição da retina em camadas (http://wbmo.mpimf-

heidelberg.mpg.de/~teuler/Pics/retina1.jpg).

A retina é um modelo muito usado para estudos neuroquímicos. Ela

contém todos os sistemas de neurotransmissores e transdução de sinais

encontrados em outras partes do sistema nervoso central. Além disso, ela é

de fácil obtenção e é possível fazer culturas usando embriões de galinha.

No nosso laboratório, fazemos três tipos de culturas a partir de embriões de

galinha: culturas mistas (contendo neurônios e células de glia), culturas

purificadas de neurônios e culturas purificadas de glia.

Assim, neste trabalho, nós utilizamos culturas mistas para estudar a

presença dos receptores A1 e a modulação de sua detecção pelos receptores

A2a. Além disso, demonstramos a expressão dos receptores A2a durante o

desenvolvimento e em culturas em monocamada de retinas de embriões de

pinto.

II- OBJETIVOS

Dados anteriores do nosso laboratório mostraram a detecção de

receptores A1 em retinas intactas durante o desenvolvimento de embriões

de galinha (Paes-de-Carvalho, 1990). Entretanto, em culturas de retinas não

foi demonstrado se esses receptores estão presentes ou não e como a sua

expressão pode ser regulada. Apesar do acúmulo de AMPc induzido por

dopamina poder ser inibido por altas concentrações de adenosina nas

culturas através da interação com os chamados sítios P intracelulares, esta

inibição não pôde ser observada com os agonistas de receptores A1 (Paes-

de-Carvalho, 1987, tese).

Em relação ao receptor A2a, resultados prévios mostram que

agonistas de receptores A2a promovem acúmulo de AMPc em retinas

intactas. O acúmulo aumenta com o desenvolvimento do embrião atingindo

um máximo em 17 dias. Resultados similares foram obtidos em culturas de

retina (Paes-de-Carvalho & de Mello, 1982). Entretanto, não se tem

nenhuma informação sobre a expressão desses receptores durante o

desenvolvimento e em culturas de retinas de embrião de galinha.

Assim, os objetivos do nosso trabalho foram:

1- caracterizar a presença dos receptores A1 de adenosina em culturas

complexas;

2- verificar se a ativação de receptores A2a de adenosina podem regular

a detecção do receptor A1 nas culturas;

3- estudar a expressão dos receptores A2a de adenosina durante o

desenvolvimento e em culturas complexas de embrião de galinha.

III- MATERIAIS E MÉTODOS

3.1) Materiais

Ovos de galinha fertilizados da espécie White Leghorn foram obtidos

de um aviário local. Adenosina deaminase foi obtida da Calbiochem

(California, Estados Unidos). 8 Bromoadenosina-3’,5’monofosfato cíclico,

sal de sódio (8BrAMPc), Sp-Adenosina-3’5’monofosforotioato cíclico

(SpAMPc), forskolina e N-[2-(p-bromocinamilamino)etil]-5-

isoquinolinesulfonamida.2HCl (H89) foram obtidos da Biomol Res. Labs.

(Pensilvânia, Estados Unidos). N6-ciclohexiladenosina (CHA), 8-

ciclopentil-1,3-dipropilxantina (DPCPX), N6-[2-(3,5-dimetoxifenil)-2-(2-

metilfenil)-etil]adenosina (DPMA), inosina, eritro-9-(2-hidroxi-3-

nonil)adenina-HCl (EHNA), penicilina, streptomicina, glutamina, albumina

sérica bovina (BSA) e dimetil sulfóxido (DMSO) foram obtidos da

Sigma/RBI Chem.Co. (Missouri, Estados Unidos). 5-amino-7-(2-feniletil)-

2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina (SCH 58261), foi

uma gentileza de Rodrigo A. Cunha (Universidade de Coimbra, Coimbra,

Portugal) cujo composto foi doado por Scott Weiss (Vernalis, Inglaterra).

O anticorpo anti-A2a e peptídeo controle anti-A2a foram obtidos da

Chemicon International (California, Estados Unidos). Os anticorpos anti-

actina e o secundário anti-cabra foram doados pela professora Elizabeth

Giestal de Araujo (Universidade Federal Fluminense, Niterói) foram

obtidos da Santa Cruz (California, Estados Unidos). [propil-3H]8-

ciclopentil-1,3-dipropil-xantina ([3H]DPCPX), atividade específica de 130

Ci/mmol, anticorpo secundário anti-rabbit, glicina, SDS, Tris, acrilamida

PAGE, metilenobisacrilamida, mercaptoetanol, hyperfilm e kit ECL foram

obtidos da Amersham Pharmacia Biotech UK Limited (Buckinghamshire,

Inglaterra). [3H]-2-cloro-N6-ciclopentiladenosina ([3H]CCPA), de atividade

específica de 30 – 60 Ci/mmol, foi obtido da PerkinElmer (Boston, Estados

Unidos). BME, tripsina e soro fetal bovino (SFB) foram obtidos da GIBCO

(Nova York, Estados Unidos). Os outros reagentes utilizados eram de

pureza analítica.

3.2) Métodos

3.2.1) Culturas complexas

Retinas de embriões de 8 dias foram dissecadas em CMF (salina sem

Ca2+ e Mg2+) e incubadas por 15 minutos em 0,1% de tripsina a 37oC. Em

seguida, a solução foi retirada e as retinas dissociadas em pipeta Pasteur

com BME contendo 3% de soro fetal bovino (SFB), 100 U/mL de

penicilina, 100 µg/mL de streptomicina e 2mM de glutamina. As células

foram plaqueadas em placas de 24 poços de 16 mm de diâmetro ou em

placas de 40 mm de diâmetro na densidade de 5 x 106 células por mL. As

culturas foram incubadas a 37oC por 6 dias em atmosfera de 5% de CO2 e

95% de ar. O meio de cultura foi trocado no dia seguinte ao preparo da

cultura e depois a cada 48 horas.

3.2.2) Culturas de agregados

Retinas de embriões de 8 dias foram dissecadas em CMF e

tripsinizadas por 15 minutos em 0,1% de tripsina a 37oC. Após a retirada da

solução, as retinas foram dissociadas em pipeta Pasteur com BME

contendo 3% SFB. Então, as células foram adicionadas em frasco de

Erlenmeyer e mantidas em agitação no incubador orbital a 37oC em

ambiente de 5% de CO2 e 95% de ar por 6 dias. A troca do meio foi feita

no dia seguinte ao preparo e a cada 48 horas. Metade do volume de meio

contido no frasco de Erlenmeyer era retirado e se acrescentava o mesmo

volume de meio fresco.

3.2.3) Tratamento com drogas

Os tratamentos ocorreram em C1 e foram mantidos até C6 no caso de

drogas como SpAMPc (20 µM), 8BrAMPc (100 µM), forskolina (5 µM),

DPMA (100 nM), SCH (100 nM), H89 (5 µM), DPCPX (100 nM), CHA

(100 nM). Além disso, SCH ou H89 foram adicionados 30 minutos antes

da adição do DPMA aos poços.

No caso de drogas como ADA (0,1 U/mL), EHNA (10 µM) e inosina

(10 µM) os tratamentos ocorreram em C5 e foram mantidos até C6.

3.2.4) “Binding” em célula viva

Foram feitas incubações no volume final de 250 µL por poço de 16

mm de diâmetro a 37oC por 1 hora. No sexto dia de cultura, o meio foi

retirado e cada poço lavado 2 vezes com 400 µL de Hanks’. Em seguida,

todos os poços foram incubados com Hanks’ + adenosina deaminase 1

U/mL por 10 minutos a 37oC. Após isso, CHA (1mM) foi adicionado a

alguns poços para a determinação da ligação inespecífica por mais 10

minutos a 37 oC. Logo após, foi adicionado 3(H)DPCPX (50 nM) em todos

os poços e as células incubadas por 1 hora a 37oC. Terminada a incubação,

a solução foi retirada, cada poço lavado com Hanks’ e, em seguida, foi

adicionado água Mili-Q para a lise das células. A placa foi congelada por

24 horas. O material lisado foi colocado em filtros que foram secos em

estufa por 30 minutos a 100oC. Os filtros secos foram colocados nos vials

contendo líquido de cintilação e levados para contagem no cintilador. O

resultado foi expresso em cpm (cintilações por minutos). A proteína

contida na placa foi dosada pelo método de Lowry et al., 1951.

3.2.5) Dosagem de proteína pelo método de Bradford

As amostras de proteína de retinas intactas de embriões de 7, 9, 11,

14 e 16 dias ou de culturas complexas de embriões de 8 dias foram

recolhidas em tampão de amostra [SDS (0,3g), glicerol (1mL), 2-

mercaptoetanol (0,1mL) tris (0,5M, pH 6,8-1,25mL) e H2O (10mL)] e a

dosagem de proteína foi realizada de acordo com o método de Bradford.

Foram colocados em tubos de vidros, 2µL das amostras e, em seguida,

foram acrescentados 3mL de reagente de Bradford. Para realização da

curva padrão, foram adicionados nos tubos de vidro 0, 2, 4, 6 e 10 µg de

BSA (1mg/mL). Em seguida, foram adicionados 2µL do tampão de

amostra SDS (usado nos experimentos) e ainda 3mL de reagente de

Bradford. Posteriormente, as misturas foram agitadas em vortex e a leitura

da absorbância foi realizada no comprimento de onda de 595nm (Bradford,

1976).

3.2.6) Eletroforese em SDS-Poliacrilamida SDS-(PAGE)

Depois de 6 dias em placas de 40 mm , o meio de cultura das células

foi removido e as células lavadas com solução salina Hanks’ duas vezes.

Uma solução tampão SDS-PAGE foi adicionada a cada placa. As células

foram retiradas da placa, fervidas por 5 minutos a 1000C e estocadas a -

200C, a fim de solubilizar e desnaturar todas as proteínas celulares. No caso

das retinas intactas, os embriões foram dissecados em CMF e as retinas

lavadas em Hanks’ para a retirada da salina. Em seguida, foram

adicionadas em solução tampão SDS-PAGE, fervidas por 5 minutos a

100ºC e estocadas a -20ºC. Após a dosagem da proteína, foi aplicado no

topo do gel de poliacrilamida-SDS a 10%, volume de amostra equivalente a

60µg de proteína. O procedimento para a eletroforese em gel de

poliacrilamida foi baseado na técnica descrita por Laemmli et al., 1970. O

gel de separação, foi preparado para um volume de 9 ml e uma

concentração final de acrilamida de 10g%. O gel de concentração foi

preparado para um volume de 3 ml e uma concentração final de acrilamida

de 4,5g%. O tampão de corrida utilizado (1000 ml) tinha em sua

composição Tris (25 mM), glicina (192 mM) e SDS (0,1 g%). Durante a

corrida a amperagem foi mantida constante em 10 mA por 3 horas.

3.2.7) “Western Blotting”

O gel foi retirado da placa onde ocorreu a polimerização e em

seguida foi posto em contato com uma membrana de PVDF para onde as

proteínas eram transferidas. A transferência das proteínas para membranas

PVDF foi baseada na técnica descrita por Towbin et al., 1979.

Imediatamente após a corrida, o gel foi incubado em tampão de

transferência junto com a membrana por 30 minutos (Hybond-P,

Amersham), após esta ter sido hidratada por 10 segundos em metanol a

100%. Cinco folhas de papel de filtro, nas dimensões do gel a ser

transferido, foram também incubadas em tampão de transferência (solução

contendo Tris, 25 mM; glicina, 192 mM; metanol, 10% (V/V)). Em

seguida, o sistema de transferência foi montado de acordo com as

instruções do fabricante. Sobre a grade do aparelho foram colocados, nesta

ordem: 2 folhas de papel de filtro, membrana de PVDF, gel, 2 folhas de

papel de filtro. Durante a montagem, tinha-se o cuidado de remover todas

as bolhas entre os componentes do sistema. A transferência foi realizada a

4ºC durante 1 hora em voltagem constante de 45 V. Após a transferência,

as membranas foram mantidas a 4ºC em TBS (Tris, 50mM; NaCl,150mM)

até a incubação com anticorpos específicos.

A membrana de PVDF foi incubada inicialmente em solução tampão

TBS-T (TBS contendo 0,1% de Tween 20) contendo leite em pó desnatado,

5 g%, durante 1 hora e 30 minutos à temperatura ambiente, com agitação

suave. Com este procedimento era prevenida a ligação de anticorpos a

sítios não específicos na membrana de PVDF. Após este período, a

membrana foi lavada uma vez por cinco minutos com tampão TBS-T. Em

seguida, a membrana foi incubada “overnight” a 4ºC com o anticorpo anti-

A2a (anticorpo policlonal anti-rato feito em coelho) diluído na proporção

de 1:2500. Todos os anticorpos foram diluídos em solução tampão TBS-T

contendo leite em pó desnatado (5g%).

A membrana, previamente incubada com anticorpo primário foi

lavada em solução TBS-T três vezes por 10 minutos e então incubada com

o anticorpo secundário (anti-coelho diluído na proporção de 1:3000 em

solução TBS-T, conjugados à peroxidase, contendo leite em pó desnatado

5g%) por uma hora, à temperatura ambiente. Em seguida, as membranas

eram lavadas da seguinte maneira: 2 lavagens com TBS-T por 10 minutos e

por último uma lavagem com TBS apenas por mais 10 minutos.

A imunodetecção foi promovida pela reação quimioluminescente do

sistema ECL para western blotting. Após a incubação da membrana com

uma mistura de soluções de detecção por 4 minutos a temperatura

ambiente, o excesso do reagente foi retirado com cuidado e a membrana

era, então, envolvida em filme de PVC e exposta imediatamente a filme

Hiperfilm, por curtos intervalos de tempo, que era revelado para obtenção

de uma imagem autorradiográfica adequada.

3.2.8) Retirada dos anticorpos e “blotting” para actina

Após a revelação as membranas foram lavadas em TBS. Em seguida,

foram incubadas com glicina 0,2M pH=2,2 e deixadas em agitação

constante em “shaker” para a retirada da ligação dos anticorpos primário e

secundário. Depois, elas foram lavadas em TBS e incubadas em solução

tampão TBS-T contendo leite em pó desnatado, 5 g%, durante 1 hora e 30

minutos à temperatura ambiente para bloquear as ligações inespecíficas.

Após o bloqueio, as membranas foram incubadas com o anticorpo primário

anti-actina na diluição de 1:300 (anticorpo policlonal anti-coelho feito em

cabra) “overnight”. Depois, as membranas foram lavadas em TBS-T e

incubadas com o anticorpo secundário conjugado a peroxidase na

proporção de 1:5000 (anticorpo policlonal anti-cabra) por 1 hora. Logo

após, as membranas foram lavadas 2 vezes com TBS-T por 10 minutos e 1

vez em TBS por 10 minutos. Em seguida, as membranas eram incubadas

com ECL e reveladas do mesmo modo já descrito.

3.2.9) Análises Estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas por ANOVA seguido pelo

teste de Newman-Keuls usando o software Graph Pad Prism. Os resultados

foram expressos como média ± EPM (erro padrão da média) para n ≥ 3 ou

como média ± desvio da média para n = 2.

IV- RESULTADOS

4.1) Ligação de 3(H)CCPA ao receptor A1 em culturas complexas em

monocamada e em culturas de agregados.

Resultados anteriores do laboratório mostram que em culturas

complexas em monocamada que apresentam as células bem dissociadas e

sem grumos de células (figura 8A), a ligação de 3(H)CCPA (agonista de

receptor A1 de adenosina) aos receptores A1 é muito baixa ou nula.

Entretanto, quando as culturas em monocamada apresentam células pouco

dissociadas e com muitos grumos de células (figura 8B), a ligação do

3(H)CCPA é bem expressiva (Hang & Paes-de-Carvalho, resultados não

publicados). Esses resultados sugerem que a ligação do receptor A1

depende do estado de agregação das células em cultura.

A) B)

Figura 8: A) Culturas complexas em monocamada apresentando células bem

dissociadas (cultura não agregada) onde a ligação do 3(H)CCPA é baixa. B) Culturas

complexas em monocamada apresentando células não dissociadas (cultura agregada)

onde a ligação do 3(H)CCPA é alta. A barra representa 100 µm (A) e 200 µm (B).

Para confirmar esses resultados foram feitos experimentos de

“binding” em culturas complexas em monocamada não agregadas e em

culturas de agregados. Nas culturas de agregados o meio é mantido sob

agitação constante. Assim, as células tendem a se associar novamente

formando pequenos grumos de células em camadas de forma muito

semelhante às camadas da retina. Os resultados obtidos mostram que a

ligação do 3(H)CCPA ao receptor A1 é maior nas culturas de agregados do

que nas culturas em monocamada (figura 9).

0

10

20

30

40

**Lig

açã

o3(H

)CC

PA

(fm

ole

s/m

g p

tn)

Monocamada Agregado

Figura 9: Ligação de 3(H)CCPA ao receptor A1 em culturas complexas em

monocamada ou de agregado de embriões de 8 dias. As culturas em C6 foram incubadas

com 10 nM de 3(H)CCPA na presença ou ausência de 100 µM de CHA. Os resultados

representam a média ± EPM de 3 experimentos realizados em duplicatas (p < 0,01).

4.2) O tratamento das culturas complexas em monocamada com análogos

permeáveis de AMPc aumenta a ligação do 3(H)DPCPX ao receptor A1.

Em experimentos subseqüentes utilizamos o antagonista 3(H)DPCPX

para estudar a expressão dos receptores A1 nas culturas.

Para verificar quais os possíveis mecanismos de regulação da

expressão do receptor A1, incubamos as culturas em monocamada com

análogos permeáveis de AMPc (SpAMPc ou 8BrAMPc). Tanto o SpAMPc

(figura 10) quanto o 8BrAMPc (figura 11) foram capazes de aumentar a

ligação do 3(H)DPCPX ao receptor A1 em experimentos de “binding” em

célula viva. Pode-se observar uma certa variação dos níveis controle de

“binding”, provavelmente devido a pequenas variações no estado de

agregação das células nas culturas. No entanto, os análogos de AMPc

invariavelmente produziam aumento marcante da detecção dos receptores.

Resultados obtidos em experimentos de “binding” em

homogeneizados de células tratadas com SpAMPc ou 8BrAMPc foram

muito similares aos de célula viva (resultados não mostrados).

Além disso, o tratamento com forskolina que ativa diretamente a

enzima adenilil ciclase também foi capaz de aumentar a ligação do receptor

em experimentos de “binding” em célula viva (figura 12). Assim, a via

desse segundo mensageiro parece estar envolvida na regulação da

expressão do receptor A1.

Controle SpAMPc

Figura 10: Ligação de 3(H)DPCPX ao receptor A1 em culturas complexas de embriões

de 8 dias tratadas com SpAMPc. As culturas foram tratadas com 20 µM de SpAMPc

desde C1. Em C6 as culturas foram incubadas com 5 nM de 3(H)DPCPX na presença ou

ausência de 100 µM de CHA. No controle a não detecção da ligação foi expressa como

nd (não detectável). Os resultados representam a média ± desvio da média de 2

experimentos realizados em duplicatas.

0

25

50

75

100

ND

Lig

açã

o3(H

)DP

CP

X(f

mole

s/m

g p

rote

ína)

Controle 8 BrAMPc0

25

50

75

100

***

Lig

açã

o3(H

)DP

CP

Xfm

ole

s/m

g p

rote

ína

Figura 11: Ligação de 3(H)DPCPX ao receptor A1 em culturas complexas em

monocamada de embriões de 8 dias tratadas com 8BrAMPc. As culturas foram tratadas

com 100 µM de 8BrAMPc desde C1. Em C6 as células foram incubadas com 5 nM de

3(H)DPCPX na ausência ou presença de 100 µM de CHA. Os resultados representam a

média ± EPM de 3 experimentos realizados em duplicatas (p < 0,001).

A)

0

25

50

75

100

Lig

açã

o3(H

)DP

CP

Xfm

ole

s/m

g p

tn

nd

Controle Forskolina

B)

0

40

80

120

160

200

Lig

açã

o3(H

)DP

CP

Xfm

ole

s/m

g p

tn

Controle Forskolina

Figura 12: Ligação de 3(H)DPCPX ao receptor A1 em culturas complexas em

monocamada de embriões de 8 dias tratadas com forskolina. As culturas foram tratadas

com 5 µM de forskolina desde C1. Em C6 as células foram incubadas com 5 nM de

3(H)DPCPX na ausência ou presença de 100 µM de CHA. A) e B) são experimentos

independentes realizados em triplicatas.

4.3) A ativação do receptor A2a é capaz de aumentar a ligação do

3(H)DPCPX ao receptor A1.

Já que o tratamento com análogos permeáveis de AMPc aumentaram

a ligação do 3(H)DPCPX, o receptor A2a também poderia regular a

detecção do receptor A1 pois a sua ativação leva ao aumento do níveis

intracelulares de AMPc.

Resultados prévios do laboratório demonstraram que a ativação do

receptor A2a era capaz de aumentar os níveis intracelulares de AMPc tanto

em retina intacta quanto em culturas complexas em monocamada (Paes-de-

Carvalho & de Mello, 1982). Além disso, resultados obtidos com a técnica

de Western Blot também mostram a presença da proteína do receptor A2a

tanto em retina intacta de embrião de galinha quanto nas culturas

complexas (figura 13). Durante o desenvolvimento os níveis de expressão

do receptor A2a estão mais altos em E7. Entretanto, em E9 os níveis estão

mais baixos permanecendo constantes até E14 e diminuindo em E16.

A)

E7 E9 E11 E14 E16

B)

E7 E9 E11 E14 E16

C)

Figura 13: A) Imunobloting para receptor A2a em retina intacta durante o

desenvolvimento. A figura representa o resultado de um experimento separado de dois

que apresentam o mesmo resultado. B) Quantificação do imunobloting representado em

A para receptor A2a em razão da actina. C) Imunobloting para receptor A2a em cultura

complexa de 6 dias. A figura representa o resultado de um experimento separado de

dois que apresentam o mesmo resultado.

A2a (55 KD) →

Actina (43 KD) →

0.0

0.4

0.8

1.2

Razã

o A

2A/A

ctina

(DO

)

A2a (55 KD) →

Para confirmar a especificidade do anticorpo anti-A2a, usamos um

peptídeo controle contra o anticorpo usado. Como resultado, o peptídeo

controle inibiu a ligação do anticorpo ao receptor A2a tanto na amostra de

rato (controle positivo do experimento) quanto na amostra de embrião de

pinto (figura 14).

A) B)

Rato (P70) Pinto (E7) Rato(P70) Pinto (E7)

Figura 14: Imunobloting para receptor A2a. A) Imunobloting de amostras de colículo de

rato de 70 dias (P70) e embrião de pinto de 7 dias. B) Bloqueio da marcação com o

peptídeo controle (diluição 1:2500) contra o anticorpo anti-A2a. O peptídeo controle foi

pré-incubado durante 30 minutos antes da incubação com o anticorpo anti-A2a.

Esses resultados demonstram a presença do receptor A2a e o seu

acoplamento à proteína Gs levando a um aumento dos níveis intracelulares

de AMPc no nosso modelo de estudo e suportam a hipótese de que a

ativação desse receptor poderia regular a expressão do receptor A1 nas

nossas culturas.

A2a (55 KD) →

Para testar a nossa hipótese, tratamos as culturas com DPMA, um

agonista de receptor A2a de adenosina, e o que observamos foi o aumento

da ligação do 3(H)DPCPX ao receptor A1 (figura 15).

0

25

50

75

100

**

Lig

açã

o3(H

)DP

CP

Xfm

ole

/mg p

tn

*

Controle DPMA

Figura 15: Ligação de 3(H)DPCPX ao receptor A1 em culturas complexas em

monocamada de embriões de 8 dias tratadas com DPMA. As culturas foram tratadas

com 100 nM de DPMA desde C1. Em C6 as células foram incubadas com 5 nM de

3(H)DPCPX na presença ou ausência de 100 µM de CHA. Os resultados representam a

média ± EPM de quatro experimentos realizados em triplicatas (p < 0,001).

4.4) O bloqueio da atividade da PKA é capaz de bloquear o efeito da

ativação do receptor A2a.

Para verificar se a ativação do receptor A2a estaria levando a um

aumento dos níveis intracelulares de AMPc e este levando a uma ativação

da PKA e conseqüentemente aumentando a ligação do 3(H)DPCPX ao

receptor A1, inibimos a atividade da PKA com H89. A inibição da enzima

levou ao bloqueio do aumento da ligação promovida pelo DPMA

confirmando o envolvimento da PKA nessa via (figura 16).

Controle DPMA H89 DPMA + H890

40

80

120

Lig

ação

3(H

)DP

CP

Xfm

ole

s/m

g p

tn

Figura 16: Ligação de 3(H)DPCPX ao receptor A1 em culturas complexas em

monocamada de embriões de 8 dias tratadas com 100 nM de DPMA e 5 µM de H89. As

culturas foram tratadas com DPMA e H89 desde C1. Em C6 as culturas foram

incubadas com 5 nM de 3(H)DPCPX na ausência ou presença de 100 µM de CHA. Os

resultados representam a média ± desvio da média de 2 experimentos realizados em

triplicatas.

4.5) O bloqueio ou a ativação do receptor A1 aumenta a sua ligação ao

3(H)DPCPX.

Aumento ou diminuição do número de receptores de

neurotransmissores é considerado como um dos principais mecanismos de

adaptação da célula alvo à presença crônica de antagonistas ou agonistas

destes receptores. Para verificar se os receptores A1 também sofriam esse

tipo de regulação nas nossas culturas, resolvemos incubá-los com o

antagonista DPCPX ou o agonista CHA por 5 dias.

O bloqueio do próprio receptor A1 com o antagonista DPCPX

aumenta a ligação do 3(H)DPCPX ao receptor A1 provavelmente por um

mecanismo de “up regulation” do receptor (figura 17).

Controle DPCPX0

25

50

75

100

125

Lig

ação

3(H

)DP

CP

Xfm

ole

s/m

g p

tn

***

Figura 17: Ligação de 3(H)DPCPX ao receptor A1 em culturas em monocamada de

embriões de 8 dias tratatadas com DPCPX. As culturas foram tratadas com 100 nM de

DPCPX desde C1. Em C6 as células foram incubadas com 5 nM de 3(H)DPCPX na

presença ou ausência de 100 µM de CHA. Os resultados representam a média ± EPM de

três experimentos realizados em triplicatas (p < 0,001).

Entretanto, inesperadamente a ativação do receptor A1 com o

agonista seletivo CHA também aumenta a ligação ao 3(H)DPCPX (figura

18).

Controle CHA0

25

50

75

100

ND

**

Lig

ação

3(H

)DP

CP

Xfm

ole

s/m

g p

tn

Figura 18: Ligação do 3(H)DPCPX ao receptor A1 em culturas em monocamada em

embriões de 8 dias tratadas com CHA. As culturas foram tratadas com 100 nM de CHA

desde C1. Em C6 as células foram incubadas com 5 nM de 3(H)DPCPX na presença ou

ausência de 100 µM de CHA. No controle a não detecção da ligação foi expressa como

nd (não detectável). Os resultados representam a média ± EPM de três experimentos

realizados em triplicata (p < 0,01).

4.6) O tratamento com adenosina deaminase promove aumento da ligação

de 3(H)DPCPX ao receptor A1.

O fato das culturas complexas em monocamada apresentarem pouca

ligação, ou até mesmo nenhuma ligação do 3(H)DPCPX ao receptor A1,

poderia ser causado por um mecanismo de dessensibilização promovido

pela adenosina endógena presente no meio extracelular. Para verificar esta

possibilidade, as culturas foram pré-tratadas com adenosina deaminase

(ADA) para metabolizar a adenosina endógena. Como resultado,

observamos um aumento da detecção do receptor (figura 19).

0

25

50

75

100

Lig

açã

o3(H

)DP

CP

Xfm

ole

s/m

g p

tn

***

Controle ADA

Figura 19: Ligação de 3(H)DPCPX ao receptor A1 em culturas complexas em

monocamadas de embriões de 8 dias tratadas com ADA. As culturas foram pré-tratadas

por 24 horas com 0,1 U/mL de ADA. Em C6 as células foram incubadas com 5 nM de

3(H)DPCPX na presença ou ausência de 100 µM de CHA. Os resultados representam a

média ± EPM de 5 experimentos realizados em triplicatas (p < 0,001).

Para verificar se o efeito produzido pela adenosina deaminase é

dependente da sua atividade metabólica, tratamos as culturas com EHNA

(inibidor da atividade metabólica da adenosina deaminase).

Interessantemente, EHNA sozinho produziu aumento da detecção do

receptor A1 (figura 20).

0

25

50

75

100

125

150

Lig

açã

o3(H

)DP

CP

Xfm

ole

s/m

g p

tn

**

Controle EHNA

Figura 20: Ligação de 3(H)DPCPX ao receptor A1 em culturas complexas em

monocamadas de embriões de 8 dias tratadas com EHNA. As culturas foram pré-

tratadas por 24 horas com 10 µM de EHNA. Em C6 as células foram incubadas com 5

nM de 3(H)DPCPX na presença ou ausência de 100 µM de CHA. Os resultados

representam a média ± EPM de 3 experimentos realizados em triplicatas (p < 0,01).

O principal metabólito produzido pela deaminação da adenosina pela

adenosina deaminase é a inosina. Surpreendentemente, o tratamento das

células por 24 horas com inosina também aumenta a ligação do receptor A1

(figura 21) de forma muito semelhante ao efeito produzido pela adenosina

deaminase. Esse resultado mostra que, provalvelmente, o efeito produzido

pela adenosina deaminase é promovido pela inosina formada pelo

metabolismo e não pela retirada da adenosina endógena.

0

25

50

75

100

Lig

ação

3(H

)DP

CP

Xfm

ole

s/m

g p

tn

Controle Inosina Figura 21: Ligação de 3(H)DPCPX ao receptor A1 em culturas complexas em

monocamadas de embriões de 8 dias tratadas com inosina. As culturas foram pré-

tratadas por 24 horas com 10 µM de inosina. Em C6 as células foram incubadas com 5

nM de 3(H)DPCPX na presença ou ausência de 100 µM de CHA. Os resultados

representam a média ± desvio da média de 2 experimentos realizados em triplicatas.

VII- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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